JP3690550B2 - 抗菌性付与抗血栓性材料 - Google Patents
抗菌性付与抗血栓性材料 Download PDFInfo
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、ムコ多糖類と第４級ホスホニウムのイオン性複合体、無機系抗菌剤および有機高分子材料を必須成分として少なくとも含有して成る抗菌性付与抗血栓性材料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
加工性、弾性、可撓性に優れた人工材料は、近年医療用材料として広く利用されるようになってきているが、人工腎臓、人工肺、補助循環装置、人工血管等の人工臓器や、注射器、血液バッグ、心臓カテーテル等のディスポーザブル製品として今後ますます利用が拡大することが予想される。これらの医用材料としては充分な機械的強度や耐久性に加えて、生体に対する安全性、特に血液と接触した場合に血液が凝固しないこと、すなわち抗血栓性が要求される。
【０００３】
従来医療用材料に抗血栓性を付与する手法としては、（１）材料表面にヘパリン等のムコ多糖類やウロキナーゼ等の線溶活性因子を固定させたもの、（２）材料表面を修飾して陰電荷や親水性などを付与したもの、（３）材料表面を不活性化したものの３通りに大別できる。このうち（１）の方法（以下、表面ヘパリン法と略記する）はさらに（Ａ）ポリマーと脂溶化したヘパリンのブレンド法、（Ｂ）脂溶化したヘパリンでの材料表面被覆法、（Ｃ）材料中のカチオン性基にヘパリンをイオン結合させる方法、（Ｄ）材料とヘパリンを共有結合させる方法に細分類される。
【０００４】
上記の方法のうち（２）、（３）の方法は長期的に体液と接触した場合には材料表面にタンパクが吸着して生体膜類似表面を形成し、安定した抗血栓性を得ることが可能である。しかし材料を生体内（血液接触部位）に導入した初期段階では、生体内において種々の凝固因子等が活性化された状態にあるため、ヘパリン投与などの抗凝血療法を施すことなしに充分な抗血栓性を得るのは困難である。
【０００５】
これに対して（１）は導入初期段階には表面上のヘパリンやウロキナーゼによって抗血栓性または生成した血栓の溶解性能が発揮されるが、長期間の使用によって一般的に性能が低下する傾向にある。すなわち（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）では通常生理条件下での長期の使用によってヘパリン類が脱離し易く、生体内に固定して用いる医療用材料としては充分な性能が得られにくい。（Ｄ）で得られる材料ではヘパリンが共有結合されているため脱離しにくいという利点を有するが、従来の結合方法では往々にしてヘパリン構成成分であるＤ−グルコサミンやＤ−グルクロン酸のコンフォメーションに変化を与えてしまい、抗凝血効果を低下させてしまうという欠点がある。
【０００６】
また（Ｃ）、（Ｄ）の方法では、ヘパリンの固定化に利用できる官能基を含む材料を選択するか、あるいは新たに導入する必要がある。このため、材料の選択の幅が狭められたり、官能基の導入によって材料の機械的強度が低下したりする可能性がある。また操作の煩雑化によって医療用材料を得る工程数が増加するという問題もある。
【０００７】
このように材料の抗血栓化の容易さ、適用できる材料の選択の幅の広さから考えると、（Ａ）ポリマーと脂溶化したヘパリンのブレンド法もしくは（Ｂ）脂溶化したヘパリンでの材料表面被覆法が最も優れた方法であると言える。しかしながらこの方法の致命的欠点は既述の通り、生理条件下での長期の使用によってヘパリン類が脱離し易いという点である。逆に言えばこの欠点を克服することによって簡便性、汎用性に富む優れた抗血栓化を提供することが可能になる。
【０００８】
この問題を解決する手段として、特開平２−２７０８２３に開示されている方法がある。この方法は天然ムコ多糖類と天然脂質もしくは合成脂質との複合体を形成させることを特徴としており、ヘパリンと生体内リン脂質の複合体で材料表面を被覆する技術が好ましい例として挙げられている。
【０００９】
しかしながら、この方法はヘパリン溶出に伴って同時に溶出されるカチオン性物質（脂溶化剤）が天然脂質もしくは合成脂質であるため、生体に悪影響を及ぼしにくい点においてのみ有用であると言える。すなわちこの方法により、長期間使用時のヘパリンの溶出による抗凝血性の低下が解決されたとは言い難い。
【００１０】
また高栄養輸液カテーテル（以下ＩＶＨと略記する）など、長期間体内に留置する必要のある医用デバイスでは、生体−材料界面からの感染が問題であった。血液と材料の接触によって生成した血栓に菌が繁殖し、これが体内に入り込んで感染を引き起こす。したがって、このような医用デバイスに使用される材料には抗血栓性と抗菌性を同時に持つことが必要である。抗菌性付与抗血栓性素材が強く望まれていたにもかかわらず、この分野に応用可能な素材はほとんど報告されていないのが現状である。
【００１１】
一方、抗菌性材料に関しては種々の技術が報告されている。抗菌剤としてアンモニウム塩を含有する抗菌性材料については、例えば特公平４−２５３０１、特公平３−６４１４３、ビグアニドを含有する抗菌性材料に関しては例えば、特公平５−８０２２５、特公平２−６１２６１、特公平３−１０３４１、アクリジン化合物を含有する抗菌性材料については、例えば特公平３−７６３４３などによって開示されている。また特開平７−８２５１１、特開平７−５３３１６、特開平４−２６６９１２、特開平５−３１０８２０などではホスホニウム塩を含有する抗菌性材料について開示されている。さらに特公平６−５５８９２ではプロテイン銀を抗菌有効成分として含有する抗菌性材料が開示されている。
【００１２】
これらの技術では抗菌性は１種の抗菌性物質によって発揮されているため、数多くの菌種に対して十分な抗菌性を発揮するのは困難である。特にアンモニウム、ホスホニウムを有効成分とする有機系の抗菌剤では、グラム陰性菌に対する効果が不十分であることが多い。またこれらの素材は抗血栓性に対する配慮がなされていないため、長期留置用医用デバイス等に応用可能な抗菌性付与抗血栓性素材として利用するのは困難である。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記従来技術の欠点を解決し、簡便性、汎用性に加え長期間の抗血栓性を発揮することが可能であると同時に、広い抗菌スペクトルを持ち、優れた抗菌性を発揮する抗菌性付与抗血栓性材料を提供することを目的としている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は、少なくとも１種のムコ多糖類と第４級ホスホニウムのイオン性複合体、無機系抗菌剤および有機高分子材料を少なくとも含有することを特徴とする。
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は、ムコ多糖類としてヘパリンもしくはヘパリン金属塩が少なくとも含有されていることを特徴とする。
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は、第４級ホスホニウムが前記化１の構造であることを特徴とする。
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は、有機高分子材料がポリハロゲン化ビニル、ポリハロゲン化ビニリデン、ポリウレタン、ポリウレタンウレア、ポリエステルもしくはポリアミドのうちのいずれかであることを特徴とする。
【００１５】
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料の必須成分である第４級ホスホニウムは前記化１の構造を有することを特徴としているが、この第４級ホスホニウムは１種類だけ使用しても、何種類かを同時に併用してもよい。第４級ホスホニウムのリン原子に結合する４つの炭化水素鎖のうち、一つは炭素数１〜２５、好ましくは３〜２０、さらに好ましくは６〜２０のアルキル基である。他の３つの炭化水素鎖は、炭素数１〜１２、好ましくは１〜８のアルキル基、または炭素数６〜１２、好ましくは６〜１０のアリール基、または炭素数７〜２０、好ましくは７〜１２のアラルキル基である。
【００１６】
第４級ホスホニウムとしては具体的に、例えばトリブチルラウリルホスホニウム、トリブチルミリスチルホスホニウム、トリブチルセチルホスホニウム、トリブチルステアリルホスホニウム、トリフェニルラウリルホスホニウム、トリフェニルミリスチルホスホニウム、トリフェニルセチルホスホニウム、トリフェニルステアリルホスホニウム、ベンジルジメチルラウリルホスホニウム、ベンジルジメチルミリスチルホスホニウム、ベンジルジメチルセチルホスホニウム、ベンジルジメチルステアリルホスホニウムなどが例示されるが、化１によって示される構造の化合物であれば、これらに限定されない。
【００１７】
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料はムコ多糖類の使用を必須としているが、このムコ多糖類としては例えばヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸等が挙げられるが、中でもヘパリンもしくはヘパリン金属塩が特に抗血栓能に優れており、また実施例も多く報告されており好ましい。
【００１８】
ムコ多糖類と第４級ホスホニウムとのイオン性複合体（以下脂溶化ムコ多糖と略記する）を得る方法は特に限定されないが、例えばムコ多糖類の水溶液もしくは水分散液と、第４級ホスホニウム塩の水溶液もしくは水分散液を混合し、得られた沈澱を回収、凍結乾燥する方法などが挙げられる。この際に使用する水に替えて、弱酸性緩衝液を使用することも可能である。
緩衝液に使用される溶質としては、例えば２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸が好ましく、特に好ましくは２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（以下ＭＥＳと略記する）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（以下ＰＩＰＥＳと略記する）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以下ＭＯＰＳと略記する）である。
【００１９】
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は脂溶化ムコ多糖のほか、無機系抗菌剤が必須成分として含有されて成る。無機系抗菌剤としては、例えば銀、銅、亜鉛等の金属を有効成分とする抗菌剤や抗菌性ガラス等が使用できる。銀を有効成分とする抗菌剤として具体的には、例えば銀ゼオライト、銀−リン酸ジルコニウム複合体、銀セラミックスなどを利用することが可能である。またプロテイン銀やスルファジアジン銀など、金属の有機化合物錯体も本発明において無機系抗菌剤として使用することが可能である。これらの無機系抗菌剤のうち、本発明においては銀系抗菌剤もしくは抗菌性ガラスが好ましく用いられ、中でも銀ゼオライトがさらに好ましく用いられる。
【００２０】
本発明においては添加された無機系抗菌剤と脂溶化剤として機能する第４級ホスホニウムとの相乗効果によって、優れた抗菌性、広い抗菌スペクトルを材料に導入することが可能である。
【００２１】
本発明においては、脂溶化ムコ多糖、無機系抗菌剤および有機高分子材料を必須成分として少なくとも含有することを特徴とする。脂溶化ムコ多糖と無機系抗菌剤が有機高分子材料に導入されることにより高分子材料表面が不活性化すると同時に、一部は高分子材料から徐放することよって抗血栓性、抗菌性が発揮されるものと考えられる。本発明の抗血栓性および抗菌活性をもつ医用材料では重合体と脂溶化ムコ多糖および無機系抗菌剤の親和性により、生体成分との接触によっても脂溶化ムコ多糖、無機系抗菌剤の徐放が制御され、長期間の溶出後も非常に優れた抗血栓性と抗菌性を維持することが可能である。
【００２２】
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料に使用される有機高分子材料は、具体的には例えばポリハロゲン化ビニル、ポリハロゲン化ビニリデン、ポリウレタン、ポリウレタンウレア、ポリエステル、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリエチレン等の従来より使用されている材質、また将来使用されるであろう材質が広く利用できるが、中でもポリハロゲン化ビニル、ポリハロゲン化ビニリデン、ポリウレタン、ポリウレタンウレア、ポリエステル、ポリアミドが好ましく、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリウレタン、ポリウレタンウレアがさらに好ましい。
【００２３】
通常、ポリ塩化ビニルやポリ塩化ビニリデンには可塑剤として芳香族カルボン酸エステル、または脂肪族カルボン酸エステルが添加されている。特にポリ塩化ビニルにおいてはジオクチルフタレート（以下ＤＯＰと略記する）の使用が一般的であるが、このような添加剤の共存は本発明によって制限されない。むしろ、医用材料として要求される加工性、弾性、可撓性等の機械的特性を考慮した場合には、可塑剤を添加するのが好ましい。さらに我々の研究によると、可塑剤を添加した場合にはより一層抗血栓性、抗菌性が発揮されやすくなる傾向が確認された。詳細な機構は明かではないが、可塑剤の共存によって重合体内での脂溶化ムコ多糖のモービリティーが向上し、より活性を発揮しやすいコンフォメーションを取りながら材料−生体成分界面に滲出するためであろうと考えられる。添加量は特に制限されないが重合体に対して５〜１００phr であり、好ましくは１０〜８０phr である。
【００２４】
本発明において、脂溶化ムコ多糖および無機系抗菌剤を有機高分子材料に導入する場合の添加量は、基材１００重量部に対して脂溶化ムコ多糖を好ましくは０．１重量部〜１００重量部、さらに好ましくは１重量部〜５０重量部程度の量で添加するのが推奨される（以下、基材１００重量部に対して添加剤１重量部を加えた場合、添加剤添加量は１phr であると表現する）。また無機系抗菌剤の添加量は基材に対し好ましくは０．１〜５０phr 、さらに好ましくは１〜３０phr 程度の量で添加するのが推奨され、脂溶化ムコ多糖と無機抗菌剤の添加量比は４０：１〜１：４が好ましく、２０：１〜１：１がさらに好ましい。
【００２５】
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料はさらに、基材となる他の構造体に導入することも可能である。構造体の素材としては特に限定されるものではなく、例えばポリエーテルウレタン、ポリウレタン、ポリウレタンウレア、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート等従来より使用されている材質、また将来使用されるであろう材質が広く利用できる。また既存および新規の材質からなる血液透析膜、血漿分離膜、吸着剤等の血液処理剤に抗血栓性を付与する目的で導入することも可能である。
【００２６】
基材への導入方法も特に限定されないが、通常のブレンド法、コーティング法が適用可能であり、コーティング方法についても、塗布法、スプレー法、ディップ法等、特に制限なく適用できる。これらの方法のうち、生理活性物質であるムコ多糖類に熱履歴を与えることのない方法を選ぶことが好ましい。
【００２７】
詳細な機構は明らかではないが、本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は生体成分との接触初期段階ではもちろん、接触が長期にわたった後も良好な抗血栓性が維持できる。また第４級ホスホニウムと無機系抗菌剤の相乗効果によって抗血栓性と同時に優れた抗菌性をも導入することができる。
【００２８】
このような利点を活かして、本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は各種の医療用器具あるいは機器類に使用される素材の抗血栓化に広く適用できる。具体的には、血液透析膜や血漿分離膜およびこれらのコーティング剤、血液中老廃物の吸着用コーティング剤に適用できる。また人工肺用の膜素材（血液と酸素の隔壁）や人工心肺におけるシート肺のシート材料、大動脈バルーン、血液バッグ、カテーテル、カニューレ、シャント、血液回路等広範な分野に用いられ得る。本発明の抗菌性付与抗血栓性材料が抗菌性を同時に有する特長を利用し、従来生体−材料界面からの感染が問題であったＩＶＨなどに適用することも特に好ましい。
【００２９】
以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明は特にこれらに限定されるものではない。
【００３０】
〈実施例１〉
ヘパリンナトリウム塩１０．００ｇをイオン交換水に溶解させ、全量で１００mlとした。塩化トリ（ｎ−ブチル）セチルホスホニウム（以下ＴＢＣＰ・Ｃｌと略記する）１９．０７ｇをイオン交換水に溶解させ、全量で１９１mlとした。双方の溶液を氷冷下で混合し、そのまま４℃で１５時間静置して懸濁液を得た。この懸濁液を３３００rpm で遠心沈降させて回収し、さらに蒸留水を加え懸濁させた後遠心分離によって沈殿を洗浄する操作を３回繰り返し、その後沈殿を乾燥させてＴＢＣＰ・Ｃｌとヘパリンの複合体（以下ＴＢＣＰ−Ｈｅｐと略記する）を得た。このＴＢＣＰ−Ｈｅｐはベンゼン、ＤＭＦ、ＴＨＦ、クロロホルム等の有機溶媒に可溶であった。
【００３１】
市販ポリウレタン（Pellethane（商品名）、以下ＰＵと略記する）をＴＨＦに溶解して５％溶液とした。このＰＵ溶液１０００ｇに対し、上記で得たＴＢＣＰ−Ｈｅｐ５．００ｇ、および市販抗菌剤である銀ゼオライト（品川燃料株式会社製、ゼオミック（商品名）、以下ＡｇＺｅｏと略記する）１．００ｇを加えて、一様な懸濁液とした。このＴＢＣＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ＰＵブレンド懸濁液２０ｇを水平に保った１２cm×１２cmのガラス板上に均一に載せ、４０℃で８時間窒素気流下で乾燥後、４０℃で減圧乾燥を１５時間行い、厚さ約６０μｍのフィルムを得た（以下このＴＢＣＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ＰＵブレンド材料を材料Ａ、材料Ａから得たフィルムをフィルムＡと略記する）。フィルムＡには、ＴＢＣＰ−Ｈｅｐが１０phr 、ＡｇＺｅｏが２phr 添加されていることになる。
【００３２】
上記で得たフィルムＡ上での血漿相対凝固時間について以下の方法で評価を行った。
フィルムＡを直径約３cmの円形に切り抜き、直径１０cmの時計皿の中央にはりつけた。このフィルム上にウサギ（日本白色種）のクエン酸加血漿２００μｌを取り、０．０２５mol ／ｌの塩化カルシウム水溶液２００μｌを加え、時計皿を３７℃の恒温槽に浮かせながら液が混和するように穏やかに振盪した。塩化カルシウム水溶液を添加した時点から血漿が凝固（血漿が動かなくなる時点）までの経過時間を測定し、同様の操作をガラス上で行った場合の血漿凝固に要した時間で割り、相対凝固時間として表した。ただし、ガラス板上での凝固時間の１２倍を超えても血漿が凝固しない場合には評価を中断し、相対凝固時間は＞１２と表した。結果は後記表１に示した。
【００３３】
材料Ａ懸濁液をＴＨＦで希釈して２％とし、この溶液に４０〜６０メッシュのガラスビーズを３０分浸漬した後ガラスフィルターで濾過し、窒素気流下４０℃で８時間、４０℃で減圧乾燥を１５時間行ってガラスビーズ表面に材料Ａをコートした。ヒト血清のＰＢＳ(-) ２倍希釈液１mlにこのコーティングビーズ１００mgを浸漬し、穏やかに振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした。この液をサンプルとしてＭａｙｅｒ法（Mayer,M.M.，”Complement and Compliment fixation”Experiment Immunochemistry 2nd Ed.，p133〜240 ，C.C.ThomasPublisher ，1961）により溶血補体価（ＣＨ５０）を測定した。結果はビーズを加えない上記希釈血清１mlにおける補体価を１００％とし、百分率によって表１に示した。
【００３４】
フィルムＡの抗菌性を以下の方法で評価した。なお、一連の操作は全て無菌的に行った。
ブロース液（滅菌生理食塩水で５０倍希釈）により、約１×１０7 個／mlの濃度とした緑膿菌液（以下この菌液を菌原液と呼ぶ）を調製した。この菌原液の濃度は、次のように測定した。菌原液を１０4 倍に希釈した後１００μｌを普通寒天板にまき、２４時間後に形成された緑膿菌のコロニー数を計測した。このコロニー数をＮ個とすると、菌原液の濃度Ｃは
Ｃ＝１０4 ×Ｎ／０．１＝１０5 ×Ｎ［個／ml］
と示される。
この菌原液１００μｌをブロース液（滅菌生理食塩液で４０倍希釈）で希釈して全量で４０mlに調製した（以下この液を浸漬原液と呼ぶ）。浸漬原液に、あらかじめ５cm×５cmに裁断してＥＯＧ滅菌したフィルムＡ上を浸漬し、３７℃で２４時間培養した。培養後、浸漬原液を滅菌生理食塩水で１０倍系列で１０4 倍まで希釈した（以下１０n 倍希釈液と略記する）。それぞれの希釈液１００μｌを普通寒天培地上にまき、２４時間後普通寒天板上に形成された緑膿菌のコロニー数が３０ないし３００個のプレートについて計測した。計測して得られたコロニー数をＮn 個とすると、２５cm2 フィルムＡとの接触後の菌数Ｎa は次の式で与えられる。
Ｎa ＝４０×１０n ×Ｎn ／０．１
フィルムＡと接触する前の菌原液の濃度は前記Ｃの通りであり、使用した原液量は１００μｌであるから、フィルムＡ接触前の菌数Ｎb は次式で示される。
Ｎb ＝１０5 ×Ｎ
浸漬原液４０ml中での２５cm2 の大きさのフィルムとの接触によるＮb →Ｎa の個数変化を表１に示した。接触によって菌数が減少するということはフィルムの抗菌性が発揮されていることを示す。
【００３５】
材料ＡのＴＨＦ４％懸濁液を調製し、これに既存の人工肺用ポリプロピレン製多孔質ホローファイバーを浸漬して引き揚げ、４０℃で１２時間乾燥することによってホローファイバーへのコーティングを行った。このホローファイバーを使用しin vivo で抗血栓性を評価した。実験方法は次の通りである。
ペントバルビタール麻酔下でウサギ（日本白色種、♂、２．５〜３．０kg）の大腿静脈を剥離して、末梢側を糸で結紮し、糸から２〜３cmのところを血管鉗子でクランプした。結紮部分の中枢側を眼下剪刀で血管径の１／４〜１／３切り、そこから試料であるホローファイバーを１０cm、中枢側に向かって挿入した。挿入位置から１cmほどのところで、血管外に出ているホローファイバーの端部を縫いつけ、ホローファイバーが流されるのを防止した。切開部分を縫合し、抗生物質を投与して、以後試料を取り出すまで２週間にわたって飼育した。
２週間後、ヘパリン加ペントバルビタールで麻酔下、正中切開を施し、腹部大動脈より適当なチューブを用いて脱血してウサギを犠死させた後、ホローファイバーを挿入した部分の血管を切断した。血管を切開してホローファイバーと血管内部を写真に撮るとともに、目視で観察し５段階評価を行った。結果は表１に示した。
【００３６】
フィルムＡをクエン酸加牛血漿に浸漬し、３７℃の振盪恒温槽で２週間にわたって溶出を行った。クエン酸加牛血漿は一日おきに交換した。以下、溶出後のフィルムをフィルムＡ’と呼ぶ。フィルムＡと同様の方法でフィルムＡ’での血漿相対凝固時間、抗菌性について評価を行った。結果は表１に示した。
【００３７】
【表１】
【００３８】
表１におけるin vivo 抗血栓性の５段階評価とは次の通りである。
ａ：血小板凝集、血栓生成、フィブリン生成いずれも観察されない
ｂ：フィブリン生成または血小板凝集は見られるが血栓生成は観察されない
ｃ：フィブリン生成または血小板凝集が見られ血栓生成がわずかに観察される
ｄ：フィブリン生成または血小板凝集が見られ血栓生成がかなり観察される
ｅ：フィブリン生成または血小板凝集が見られ大量の血栓生成が観察される
【００３９】
〈実施例２〉
ヘパリンナトリウム塩１０．００ｇをイオン交換水に溶解させ、全量で１００mlとした。塩化トリ（ｎ−ブチル）ラウリルホスホニウム（以下ＴＢＬＰ・Ｃｌと略記する）１６．７６ｇをイオン交換水に溶解させ、全量で１６８mlとした。双方の溶液を氷冷下で混合し、そのまま４℃で１５時間静置して懸濁液を得た。この懸濁液を３３００rpm で遠心沈降させて回収し、さらに蒸留水を加え懸濁させた後遠心分離によって沈殿を洗浄する操作を３回繰り返し、その後沈殿を乾燥させてＴＢＬＰ・Ｃｌとヘパリンの複合体（以下ＴＢＬＰ−Ｈｅｐと略記する）を得た。このＴＢＬＰ−Ｈｅｐはベンゼン、ＤＭＦ、ＴＨＦ、クロロホルム等の有機溶媒に可溶であった。
【００４０】
脂溶化ヘパリンをＴＢＣＰ−ＨｅｐからＴＢＬＰ−Ｈｅｐに変えた以外は実施例１と同様の方法で、ＴＢＬＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ＰＵブレンド材料Ｂ、および材料Ｂから成るフィルムＢを得た。この材料ＢおよびフィルムＢを用いて、実施例１と同様の方法で血漿相対凝固時間、補体価、抗菌性、in vivo 抗血栓性を評価した。また、実施例１と同様の方法でフィルムＢの溶出試験を実施し、得られた溶出フィルムＢ’の血漿相対凝固時間、抗菌性についても評価した。結果は表１に示した。
【００４１】
〈比較例１〉
実施例１で得たＴＢＣＰ−Ｈｅｐ１００mg、およびＡｇＺｅｏ２０mgにベンゼンを加えて全量で１００ｇとし、ＴＢＣＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ベンゼン懸濁液を得た。１２cm×１２cmのＰＵフィルム上にこの懸濁液３．００ｇを均一に載せ、４０℃で８時間窒素気流下で乾燥後、４０℃で減圧乾燥を１５時間行い、厚さ約６０μｍのフィルムを得た（以下このＴＢＣＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ＰＵコーティングフィルムをフィルムＣと略記する）。
【００４２】
このＴＢＣＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ベンゼン懸濁液でコーティングを行って補体価とin vivo 抗血栓性を、フィルムＣを用いて血漿相対凝固時間と抗菌性を実施例１と同様の方法で評価した。また、実施例１と同様の方法でフィルムＣの溶出試験を実施し、得られた溶出フィルムＣ’の血漿相対凝固時間および抗菌性についても評価した。結果は表１に示した。
【００４３】
〈比較例２〉
実施例２で得たＴＢＬＰ−Ｈｅｐ１００mg、およびＡｇＺｅｏ２０mgにベンゼンを加えて全量で１００ｇとし、ＴＢＬＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ベンゼン懸濁液を得た。１２cm×１２cmのＰＵフィルム上にこの懸濁液３．００ｇを均一に載せ、４０℃で８時間窒素気流下で乾燥後、４０℃で減圧乾燥を１５時間行い、厚さ約６０μｍのフィルムを得た（以下このＴＢＬＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ＰＵコーティングフィルムをフィルムＤと略記する）。
【００４４】
このＴＢＬＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ベンゼン懸濁液でコーティングを行って補体価とin vivo 抗血栓性を、フィルムＤを用いて血漿相対凝固時間と抗菌性を実施例１と同様の方法で評価した。また、実施例１と同様の方法でフィルムＤの溶出試験を実施し、得られた溶出フィルムＤ’の血漿相対凝固時間および抗菌性についても評価した。結果は表１に示した。
【００４５】
〈比較例３〉
ＰＵをＴＨＦに溶解して５％溶液とした。このＰＵ溶液１０００ｇに対し、実施例１で得たＴＢＣＰ−Ｈｅｐ５．００ｇを加えて、均一溶液とした。このＴＢＣＰ−Ｈｅｐ／ＰＵブレンド溶液２０ｇを水平に保った１２cm×１２cmのガラス板上に均一に載せ、４０℃で８時間窒素気流下で乾燥後、４０℃で減圧乾燥を１５時間行い、厚さ約６０μｍのフィルムを得た（以下このＴＢＣＰ−Ｈｅｐ／ＰＵブレンド材料を材料Ｅ、材料Ｅから得たフィルムをフィルムＥと略記する）。フィルムＥには、ＴＢＣＰ−Ｈｅｐが１０phr 添加されていることになる。
【００４６】
この材料ＥおよびフィルムＥを用いて、実施例１と同様の方法で血漿相対凝固時間、補体価、抗菌性、in vivo 抗血栓性を評価した。また、実施例１と同様の方法で実施例１と同様の方法でフィルムＥの溶出試験を実施し、得られた溶出フィルムＥ’の血漿相対凝固時間および抗菌性についても評価した。結果は表１に示した。
【００４７】
〈比較例４〉
ＰＵをＴＨＦに溶解して５％溶液とした。このＰＵ溶液１０００ｇに対し、ＡｇＺｅｏ１．００ｇを加えて、一様な懸濁液とした。このＡｇＺｅｏ／ＰＵブレンド懸濁液２０ｇを水平に保った１２cm×１２cmのガラス板上に均一に載せ、４０℃で８時間窒素気流下で乾燥後、４０℃で減圧乾燥を１５時間行い、厚さ約６０μｍのフィルムを得た（以下このＡｇＺｅｏ／ＰＵブレンド材料を材料Ｆ、材料Ｆから得たフィルムをフィルムＦと略記する）。フィルムＦには、ＡｇＺｅｏが２phr 添加されていることになる。
【００４８】
この材料ＦおよびフィルムＦを用いて、実施例１と同様の方法で血漿相対凝固時間、抗菌性、in vivo 抗血栓性を評価した。また、実施例１と同様の方法でフィルムＧの溶出試験を実施し、得られた溶出フィルムＦ’の血漿相対凝固時間および抗菌性についても評価した。結果は表１に示した。
【００４９】
〈比較例５〉
脂溶化ヘパリンを導入していないＰＵフィルム（フィルムＧ）を用いて血漿相対凝固時間、抗菌性を評価した。また、実施例１と同様の方法でフィルムＧの溶出試験を実施し、得られた溶出フィルムＧ’の血漿相対凝固時間、抗菌性についても評価した。結果は表１に示した。
【００５０】
表１に示した結果からわかるように、本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は優れた抗血栓性、抗菌性を示しており、溶出後も性能が維持されている。有機高分子材料を含有せずに、フィルム表面に脂溶化ムコ多糖と無機系抗菌剤をコーティングした比較例１、２では、溶出前の性能は比較的良好であるものの、血漿溶出による性能の低下が大きいことがわかる。有機高分子材料を含有しない状態では脂溶化ムコ多糖、無機系抗菌剤は血漿による溶出で剥離しやすく、性能の低下を招いていると考えられる。
無機系抗菌剤を添加していない比較例３の材料は、抗血栓性は比較的良好であるが、抗菌性は劣っており、特に溶出後の抗菌性低下が大きい。脂溶化ムコ多糖が含まれていない比較例４では抗血栓性が著しく劣るのに加えて、抗菌性も本発明の抗菌性付与抗血栓性材料には及ばない。抗血栓性が脂溶化されたヘパリンによって発揮されていることを示すとともに、第４級ホスホニウムと無機系抗菌剤の相乗効果によって抗菌性が向上していることも示唆している。
【００５１】
【発明の効果】
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は、基材となるポリマーに簡便に抗血栓性、抗菌性を付与することができ、その性能は材料調製直後のみならず、長期間の溶出操作後も維持される。したがって、本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は医療用材料の抗血栓化、抗菌化を行う材料として優れた適性を有している。
【発明の属する技術分野】
本発明は、ムコ多糖類と第４級ホスホニウムのイオン性複合体、無機系抗菌剤および有機高分子材料を必須成分として少なくとも含有して成る抗菌性付与抗血栓性材料に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】
加工性、弾性、可撓性に優れた人工材料は、近年医療用材料として広く利用されるようになってきているが、人工腎臓、人工肺、補助循環装置、人工血管等の人工臓器や、注射器、血液バッグ、心臓カテーテル等のディスポーザブル製品として今後ますます利用が拡大することが予想される。これらの医用材料としては充分な機械的強度や耐久性に加えて、生体に対する安全性、特に血液と接触した場合に血液が凝固しないこと、すなわち抗血栓性が要求される。
【０００３】
従来医療用材料に抗血栓性を付与する手法としては、（１）材料表面にヘパリン等のムコ多糖類やウロキナーゼ等の線溶活性因子を固定させたもの、（２）材料表面を修飾して陰電荷や親水性などを付与したもの、（３）材料表面を不活性化したものの３通りに大別できる。このうち（１）の方法（以下、表面ヘパリン法と略記する）はさらに（Ａ）ポリマーと脂溶化したヘパリンのブレンド法、（Ｂ）脂溶化したヘパリンでの材料表面被覆法、（Ｃ）材料中のカチオン性基にヘパリンをイオン結合させる方法、（Ｄ）材料とヘパリンを共有結合させる方法に細分類される。
【０００４】
上記の方法のうち（２）、（３）の方法は長期的に体液と接触した場合には材料表面にタンパクが吸着して生体膜類似表面を形成し、安定した抗血栓性を得ることが可能である。しかし材料を生体内（血液接触部位）に導入した初期段階では、生体内において種々の凝固因子等が活性化された状態にあるため、ヘパリン投与などの抗凝血療法を施すことなしに充分な抗血栓性を得るのは困難である。
【０００５】
これに対して（１）は導入初期段階には表面上のヘパリンやウロキナーゼによって抗血栓性または生成した血栓の溶解性能が発揮されるが、長期間の使用によって一般的に性能が低下する傾向にある。すなわち（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）では通常生理条件下での長期の使用によってヘパリン類が脱離し易く、生体内に固定して用いる医療用材料としては充分な性能が得られにくい。（Ｄ）で得られる材料ではヘパリンが共有結合されているため脱離しにくいという利点を有するが、従来の結合方法では往々にしてヘパリン構成成分であるＤ−グルコサミンやＤ−グルクロン酸のコンフォメーションに変化を与えてしまい、抗凝血効果を低下させてしまうという欠点がある。
【０００６】
また（Ｃ）、（Ｄ）の方法では、ヘパリンの固定化に利用できる官能基を含む材料を選択するか、あるいは新たに導入する必要がある。このため、材料の選択の幅が狭められたり、官能基の導入によって材料の機械的強度が低下したりする可能性がある。また操作の煩雑化によって医療用材料を得る工程数が増加するという問題もある。
【０００７】
このように材料の抗血栓化の容易さ、適用できる材料の選択の幅の広さから考えると、（Ａ）ポリマーと脂溶化したヘパリンのブレンド法もしくは（Ｂ）脂溶化したヘパリンでの材料表面被覆法が最も優れた方法であると言える。しかしながらこの方法の致命的欠点は既述の通り、生理条件下での長期の使用によってヘパリン類が脱離し易いという点である。逆に言えばこの欠点を克服することによって簡便性、汎用性に富む優れた抗血栓化を提供することが可能になる。
【０００８】
この問題を解決する手段として、特開平２−２７０８２３に開示されている方法がある。この方法は天然ムコ多糖類と天然脂質もしくは合成脂質との複合体を形成させることを特徴としており、ヘパリンと生体内リン脂質の複合体で材料表面を被覆する技術が好ましい例として挙げられている。
【０００９】
しかしながら、この方法はヘパリン溶出に伴って同時に溶出されるカチオン性物質（脂溶化剤）が天然脂質もしくは合成脂質であるため、生体に悪影響を及ぼしにくい点においてのみ有用であると言える。すなわちこの方法により、長期間使用時のヘパリンの溶出による抗凝血性の低下が解決されたとは言い難い。
【００１０】
また高栄養輸液カテーテル（以下ＩＶＨと略記する）など、長期間体内に留置する必要のある医用デバイスでは、生体−材料界面からの感染が問題であった。血液と材料の接触によって生成した血栓に菌が繁殖し、これが体内に入り込んで感染を引き起こす。したがって、このような医用デバイスに使用される材料には抗血栓性と抗菌性を同時に持つことが必要である。抗菌性付与抗血栓性素材が強く望まれていたにもかかわらず、この分野に応用可能な素材はほとんど報告されていないのが現状である。
【００１１】
一方、抗菌性材料に関しては種々の技術が報告されている。抗菌剤としてアンモニウム塩を含有する抗菌性材料については、例えば特公平４−２５３０１、特公平３−６４１４３、ビグアニドを含有する抗菌性材料に関しては例えば、特公平５−８０２２５、特公平２−６１２６１、特公平３−１０３４１、アクリジン化合物を含有する抗菌性材料については、例えば特公平３−７６３４３などによって開示されている。また特開平７−８２５１１、特開平７−５３３１６、特開平４−２６６９１２、特開平５−３１０８２０などではホスホニウム塩を含有する抗菌性材料について開示されている。さらに特公平６−５５８９２ではプロテイン銀を抗菌有効成分として含有する抗菌性材料が開示されている。
【００１２】
これらの技術では抗菌性は１種の抗菌性物質によって発揮されているため、数多くの菌種に対して十分な抗菌性を発揮するのは困難である。特にアンモニウム、ホスホニウムを有効成分とする有機系の抗菌剤では、グラム陰性菌に対する効果が不十分であることが多い。またこれらの素材は抗血栓性に対する配慮がなされていないため、長期留置用医用デバイス等に応用可能な抗菌性付与抗血栓性素材として利用するのは困難である。
【００１３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記従来技術の欠点を解決し、簡便性、汎用性に加え長期間の抗血栓性を発揮することが可能であると同時に、広い抗菌スペクトルを持ち、優れた抗菌性を発揮する抗菌性付与抗血栓性材料を提供することを目的としている。
【００１４】
【課題を解決するための手段】
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は、少なくとも１種のムコ多糖類と第４級ホスホニウムのイオン性複合体、無機系抗菌剤および有機高分子材料を少なくとも含有することを特徴とする。
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は、ムコ多糖類としてヘパリンもしくはヘパリン金属塩が少なくとも含有されていることを特徴とする。
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は、第４級ホスホニウムが前記化１の構造であることを特徴とする。
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は、有機高分子材料がポリハロゲン化ビニル、ポリハロゲン化ビニリデン、ポリウレタン、ポリウレタンウレア、ポリエステルもしくはポリアミドのうちのいずれかであることを特徴とする。
【００１５】
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料の必須成分である第４級ホスホニウムは前記化１の構造を有することを特徴としているが、この第４級ホスホニウムは１種類だけ使用しても、何種類かを同時に併用してもよい。第４級ホスホニウムのリン原子に結合する４つの炭化水素鎖のうち、一つは炭素数１〜２５、好ましくは３〜２０、さらに好ましくは６〜２０のアルキル基である。他の３つの炭化水素鎖は、炭素数１〜１２、好ましくは１〜８のアルキル基、または炭素数６〜１２、好ましくは６〜１０のアリール基、または炭素数７〜２０、好ましくは７〜１２のアラルキル基である。
【００１６】
第４級ホスホニウムとしては具体的に、例えばトリブチルラウリルホスホニウム、トリブチルミリスチルホスホニウム、トリブチルセチルホスホニウム、トリブチルステアリルホスホニウム、トリフェニルラウリルホスホニウム、トリフェニルミリスチルホスホニウム、トリフェニルセチルホスホニウム、トリフェニルステアリルホスホニウム、ベンジルジメチルラウリルホスホニウム、ベンジルジメチルミリスチルホスホニウム、ベンジルジメチルセチルホスホニウム、ベンジルジメチルステアリルホスホニウムなどが例示されるが、化１によって示される構造の化合物であれば、これらに限定されない。
【００１７】
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料はムコ多糖類の使用を必須としているが、このムコ多糖類としては例えばヘパリン、コンドロイチン硫酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸等が挙げられるが、中でもヘパリンもしくはヘパリン金属塩が特に抗血栓能に優れており、また実施例も多く報告されており好ましい。
【００１８】
ムコ多糖類と第４級ホスホニウムとのイオン性複合体（以下脂溶化ムコ多糖と略記する）を得る方法は特に限定されないが、例えばムコ多糖類の水溶液もしくは水分散液と、第４級ホスホニウム塩の水溶液もしくは水分散液を混合し、得られた沈澱を回収、凍結乾燥する方法などが挙げられる。この際に使用する水に替えて、弱酸性緩衝液を使用することも可能である。
緩衝液に使用される溶質としては、例えば２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸、３−（Ｎ−モルホリノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］エタンスルホン酸が好ましく、特に好ましくは２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（以下ＭＥＳと略記する）、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）（以下ＰＩＰＥＳと略記する）、３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（以下ＭＯＰＳと略記する）である。
【００１９】
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は脂溶化ムコ多糖のほか、無機系抗菌剤が必須成分として含有されて成る。無機系抗菌剤としては、例えば銀、銅、亜鉛等の金属を有効成分とする抗菌剤や抗菌性ガラス等が使用できる。銀を有効成分とする抗菌剤として具体的には、例えば銀ゼオライト、銀−リン酸ジルコニウム複合体、銀セラミックスなどを利用することが可能である。またプロテイン銀やスルファジアジン銀など、金属の有機化合物錯体も本発明において無機系抗菌剤として使用することが可能である。これらの無機系抗菌剤のうち、本発明においては銀系抗菌剤もしくは抗菌性ガラスが好ましく用いられ、中でも銀ゼオライトがさらに好ましく用いられる。
【００２０】
本発明においては添加された無機系抗菌剤と脂溶化剤として機能する第４級ホスホニウムとの相乗効果によって、優れた抗菌性、広い抗菌スペクトルを材料に導入することが可能である。
【００２１】
本発明においては、脂溶化ムコ多糖、無機系抗菌剤および有機高分子材料を必須成分として少なくとも含有することを特徴とする。脂溶化ムコ多糖と無機系抗菌剤が有機高分子材料に導入されることにより高分子材料表面が不活性化すると同時に、一部は高分子材料から徐放することよって抗血栓性、抗菌性が発揮されるものと考えられる。本発明の抗血栓性および抗菌活性をもつ医用材料では重合体と脂溶化ムコ多糖および無機系抗菌剤の親和性により、生体成分との接触によっても脂溶化ムコ多糖、無機系抗菌剤の徐放が制御され、長期間の溶出後も非常に優れた抗血栓性と抗菌性を維持することが可能である。
【００２２】
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料に使用される有機高分子材料は、具体的には例えばポリハロゲン化ビニル、ポリハロゲン化ビニリデン、ポリウレタン、ポリウレタンウレア、ポリエステル、ポリアミド、ポリプロピレン、ポリエチレン等の従来より使用されている材質、また将来使用されるであろう材質が広く利用できるが、中でもポリハロゲン化ビニル、ポリハロゲン化ビニリデン、ポリウレタン、ポリウレタンウレア、ポリエステル、ポリアミドが好ましく、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリウレタン、ポリウレタンウレアがさらに好ましい。
【００２３】
通常、ポリ塩化ビニルやポリ塩化ビニリデンには可塑剤として芳香族カルボン酸エステル、または脂肪族カルボン酸エステルが添加されている。特にポリ塩化ビニルにおいてはジオクチルフタレート（以下ＤＯＰと略記する）の使用が一般的であるが、このような添加剤の共存は本発明によって制限されない。むしろ、医用材料として要求される加工性、弾性、可撓性等の機械的特性を考慮した場合には、可塑剤を添加するのが好ましい。さらに我々の研究によると、可塑剤を添加した場合にはより一層抗血栓性、抗菌性が発揮されやすくなる傾向が確認された。詳細な機構は明かではないが、可塑剤の共存によって重合体内での脂溶化ムコ多糖のモービリティーが向上し、より活性を発揮しやすいコンフォメーションを取りながら材料−生体成分界面に滲出するためであろうと考えられる。添加量は特に制限されないが重合体に対して５〜１００phr であり、好ましくは１０〜８０phr である。
【００２４】
本発明において、脂溶化ムコ多糖および無機系抗菌剤を有機高分子材料に導入する場合の添加量は、基材１００重量部に対して脂溶化ムコ多糖を好ましくは０．１重量部〜１００重量部、さらに好ましくは１重量部〜５０重量部程度の量で添加するのが推奨される（以下、基材１００重量部に対して添加剤１重量部を加えた場合、添加剤添加量は１phr であると表現する）。また無機系抗菌剤の添加量は基材に対し好ましくは０．１〜５０phr 、さらに好ましくは１〜３０phr 程度の量で添加するのが推奨され、脂溶化ムコ多糖と無機抗菌剤の添加量比は４０：１〜１：４が好ましく、２０：１〜１：１がさらに好ましい。
【００２５】
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料はさらに、基材となる他の構造体に導入することも可能である。構造体の素材としては特に限定されるものではなく、例えばポリエーテルウレタン、ポリウレタン、ポリウレタンウレア、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリエステル、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリカーボネート等従来より使用されている材質、また将来使用されるであろう材質が広く利用できる。また既存および新規の材質からなる血液透析膜、血漿分離膜、吸着剤等の血液処理剤に抗血栓性を付与する目的で導入することも可能である。
【００２６】
基材への導入方法も特に限定されないが、通常のブレンド法、コーティング法が適用可能であり、コーティング方法についても、塗布法、スプレー法、ディップ法等、特に制限なく適用できる。これらの方法のうち、生理活性物質であるムコ多糖類に熱履歴を与えることのない方法を選ぶことが好ましい。
【００２７】
詳細な機構は明らかではないが、本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は生体成分との接触初期段階ではもちろん、接触が長期にわたった後も良好な抗血栓性が維持できる。また第４級ホスホニウムと無機系抗菌剤の相乗効果によって抗血栓性と同時に優れた抗菌性をも導入することができる。
【００２８】
このような利点を活かして、本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は各種の医療用器具あるいは機器類に使用される素材の抗血栓化に広く適用できる。具体的には、血液透析膜や血漿分離膜およびこれらのコーティング剤、血液中老廃物の吸着用コーティング剤に適用できる。また人工肺用の膜素材（血液と酸素の隔壁）や人工心肺におけるシート肺のシート材料、大動脈バルーン、血液バッグ、カテーテル、カニューレ、シャント、血液回路等広範な分野に用いられ得る。本発明の抗菌性付与抗血栓性材料が抗菌性を同時に有する特長を利用し、従来生体−材料界面からの感染が問題であったＩＶＨなどに適用することも特に好ましい。
【００２９】
以下、実施例を用いて本発明を説明するが、本発明は特にこれらに限定されるものではない。
【００３０】
〈実施例１〉
ヘパリンナトリウム塩１０．００ｇをイオン交換水に溶解させ、全量で１００mlとした。塩化トリ（ｎ−ブチル）セチルホスホニウム（以下ＴＢＣＰ・Ｃｌと略記する）１９．０７ｇをイオン交換水に溶解させ、全量で１９１mlとした。双方の溶液を氷冷下で混合し、そのまま４℃で１５時間静置して懸濁液を得た。この懸濁液を３３００rpm で遠心沈降させて回収し、さらに蒸留水を加え懸濁させた後遠心分離によって沈殿を洗浄する操作を３回繰り返し、その後沈殿を乾燥させてＴＢＣＰ・Ｃｌとヘパリンの複合体（以下ＴＢＣＰ−Ｈｅｐと略記する）を得た。このＴＢＣＰ−Ｈｅｐはベンゼン、ＤＭＦ、ＴＨＦ、クロロホルム等の有機溶媒に可溶であった。
【００３１】
市販ポリウレタン（Pellethane（商品名）、以下ＰＵと略記する）をＴＨＦに溶解して５％溶液とした。このＰＵ溶液１０００ｇに対し、上記で得たＴＢＣＰ−Ｈｅｐ５．００ｇ、および市販抗菌剤である銀ゼオライト（品川燃料株式会社製、ゼオミック（商品名）、以下ＡｇＺｅｏと略記する）１．００ｇを加えて、一様な懸濁液とした。このＴＢＣＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ＰＵブレンド懸濁液２０ｇを水平に保った１２cm×１２cmのガラス板上に均一に載せ、４０℃で８時間窒素気流下で乾燥後、４０℃で減圧乾燥を１５時間行い、厚さ約６０μｍのフィルムを得た（以下このＴＢＣＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ＰＵブレンド材料を材料Ａ、材料Ａから得たフィルムをフィルムＡと略記する）。フィルムＡには、ＴＢＣＰ−Ｈｅｐが１０phr 、ＡｇＺｅｏが２phr 添加されていることになる。
【００３２】
上記で得たフィルムＡ上での血漿相対凝固時間について以下の方法で評価を行った。
フィルムＡを直径約３cmの円形に切り抜き、直径１０cmの時計皿の中央にはりつけた。このフィルム上にウサギ（日本白色種）のクエン酸加血漿２００μｌを取り、０．０２５mol ／ｌの塩化カルシウム水溶液２００μｌを加え、時計皿を３７℃の恒温槽に浮かせながら液が混和するように穏やかに振盪した。塩化カルシウム水溶液を添加した時点から血漿が凝固（血漿が動かなくなる時点）までの経過時間を測定し、同様の操作をガラス上で行った場合の血漿凝固に要した時間で割り、相対凝固時間として表した。ただし、ガラス板上での凝固時間の１２倍を超えても血漿が凝固しない場合には評価を中断し、相対凝固時間は＞１２と表した。結果は後記表１に示した。
【００３３】
材料Ａ懸濁液をＴＨＦで希釈して２％とし、この溶液に４０〜６０メッシュのガラスビーズを３０分浸漬した後ガラスフィルターで濾過し、窒素気流下４０℃で８時間、４０℃で減圧乾燥を１５時間行ってガラスビーズ表面に材料Ａをコートした。ヒト血清のＰＢＳ(-) ２倍希釈液１mlにこのコーティングビーズ１００mgを浸漬し、穏やかに振盪しながら３７℃で３０分間インキュベートした。この液をサンプルとしてＭａｙｅｒ法（Mayer,M.M.，”Complement and Compliment fixation”Experiment Immunochemistry 2nd Ed.，p133〜240 ，C.C.ThomasPublisher ，1961）により溶血補体価（ＣＨ５０）を測定した。結果はビーズを加えない上記希釈血清１mlにおける補体価を１００％とし、百分率によって表１に示した。
【００３４】
フィルムＡの抗菌性を以下の方法で評価した。なお、一連の操作は全て無菌的に行った。
ブロース液（滅菌生理食塩水で５０倍希釈）により、約１×１０7 個／mlの濃度とした緑膿菌液（以下この菌液を菌原液と呼ぶ）を調製した。この菌原液の濃度は、次のように測定した。菌原液を１０4 倍に希釈した後１００μｌを普通寒天板にまき、２４時間後に形成された緑膿菌のコロニー数を計測した。このコロニー数をＮ個とすると、菌原液の濃度Ｃは
Ｃ＝１０4 ×Ｎ／０．１＝１０5 ×Ｎ［個／ml］
と示される。
この菌原液１００μｌをブロース液（滅菌生理食塩液で４０倍希釈）で希釈して全量で４０mlに調製した（以下この液を浸漬原液と呼ぶ）。浸漬原液に、あらかじめ５cm×５cmに裁断してＥＯＧ滅菌したフィルムＡ上を浸漬し、３７℃で２４時間培養した。培養後、浸漬原液を滅菌生理食塩水で１０倍系列で１０4 倍まで希釈した（以下１０n 倍希釈液と略記する）。それぞれの希釈液１００μｌを普通寒天培地上にまき、２４時間後普通寒天板上に形成された緑膿菌のコロニー数が３０ないし３００個のプレートについて計測した。計測して得られたコロニー数をＮn 個とすると、２５cm2 フィルムＡとの接触後の菌数Ｎa は次の式で与えられる。
Ｎa ＝４０×１０n ×Ｎn ／０．１
フィルムＡと接触する前の菌原液の濃度は前記Ｃの通りであり、使用した原液量は１００μｌであるから、フィルムＡ接触前の菌数Ｎb は次式で示される。
Ｎb ＝１０5 ×Ｎ
浸漬原液４０ml中での２５cm2 の大きさのフィルムとの接触によるＮb →Ｎa の個数変化を表１に示した。接触によって菌数が減少するということはフィルムの抗菌性が発揮されていることを示す。
【００３５】
材料ＡのＴＨＦ４％懸濁液を調製し、これに既存の人工肺用ポリプロピレン製多孔質ホローファイバーを浸漬して引き揚げ、４０℃で１２時間乾燥することによってホローファイバーへのコーティングを行った。このホローファイバーを使用しin vivo で抗血栓性を評価した。実験方法は次の通りである。
ペントバルビタール麻酔下でウサギ（日本白色種、♂、２．５〜３．０kg）の大腿静脈を剥離して、末梢側を糸で結紮し、糸から２〜３cmのところを血管鉗子でクランプした。結紮部分の中枢側を眼下剪刀で血管径の１／４〜１／３切り、そこから試料であるホローファイバーを１０cm、中枢側に向かって挿入した。挿入位置から１cmほどのところで、血管外に出ているホローファイバーの端部を縫いつけ、ホローファイバーが流されるのを防止した。切開部分を縫合し、抗生物質を投与して、以後試料を取り出すまで２週間にわたって飼育した。
２週間後、ヘパリン加ペントバルビタールで麻酔下、正中切開を施し、腹部大動脈より適当なチューブを用いて脱血してウサギを犠死させた後、ホローファイバーを挿入した部分の血管を切断した。血管を切開してホローファイバーと血管内部を写真に撮るとともに、目視で観察し５段階評価を行った。結果は表１に示した。
【００３６】
フィルムＡをクエン酸加牛血漿に浸漬し、３７℃の振盪恒温槽で２週間にわたって溶出を行った。クエン酸加牛血漿は一日おきに交換した。以下、溶出後のフィルムをフィルムＡ’と呼ぶ。フィルムＡと同様の方法でフィルムＡ’での血漿相対凝固時間、抗菌性について評価を行った。結果は表１に示した。
【００３７】
【表１】
表１におけるin vivo 抗血栓性の５段階評価とは次の通りである。
ａ：血小板凝集、血栓生成、フィブリン生成いずれも観察されない
ｂ：フィブリン生成または血小板凝集は見られるが血栓生成は観察されない
ｃ：フィブリン生成または血小板凝集が見られ血栓生成がわずかに観察される
ｄ：フィブリン生成または血小板凝集が見られ血栓生成がかなり観察される
ｅ：フィブリン生成または血小板凝集が見られ大量の血栓生成が観察される
【００３９】
〈実施例２〉
ヘパリンナトリウム塩１０．００ｇをイオン交換水に溶解させ、全量で１００mlとした。塩化トリ（ｎ−ブチル）ラウリルホスホニウム（以下ＴＢＬＰ・Ｃｌと略記する）１６．７６ｇをイオン交換水に溶解させ、全量で１６８mlとした。双方の溶液を氷冷下で混合し、そのまま４℃で１５時間静置して懸濁液を得た。この懸濁液を３３００rpm で遠心沈降させて回収し、さらに蒸留水を加え懸濁させた後遠心分離によって沈殿を洗浄する操作を３回繰り返し、その後沈殿を乾燥させてＴＢＬＰ・Ｃｌとヘパリンの複合体（以下ＴＢＬＰ−Ｈｅｐと略記する）を得た。このＴＢＬＰ−Ｈｅｐはベンゼン、ＤＭＦ、ＴＨＦ、クロロホルム等の有機溶媒に可溶であった。
【００４０】
脂溶化ヘパリンをＴＢＣＰ−ＨｅｐからＴＢＬＰ−Ｈｅｐに変えた以外は実施例１と同様の方法で、ＴＢＬＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ＰＵブレンド材料Ｂ、および材料Ｂから成るフィルムＢを得た。この材料ＢおよびフィルムＢを用いて、実施例１と同様の方法で血漿相対凝固時間、補体価、抗菌性、in vivo 抗血栓性を評価した。また、実施例１と同様の方法でフィルムＢの溶出試験を実施し、得られた溶出フィルムＢ’の血漿相対凝固時間、抗菌性についても評価した。結果は表１に示した。
【００４１】
〈比較例１〉
実施例１で得たＴＢＣＰ−Ｈｅｐ１００mg、およびＡｇＺｅｏ２０mgにベンゼンを加えて全量で１００ｇとし、ＴＢＣＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ベンゼン懸濁液を得た。１２cm×１２cmのＰＵフィルム上にこの懸濁液３．００ｇを均一に載せ、４０℃で８時間窒素気流下で乾燥後、４０℃で減圧乾燥を１５時間行い、厚さ約６０μｍのフィルムを得た（以下このＴＢＣＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ＰＵコーティングフィルムをフィルムＣと略記する）。
【００４２】
このＴＢＣＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ベンゼン懸濁液でコーティングを行って補体価とin vivo 抗血栓性を、フィルムＣを用いて血漿相対凝固時間と抗菌性を実施例１と同様の方法で評価した。また、実施例１と同様の方法でフィルムＣの溶出試験を実施し、得られた溶出フィルムＣ’の血漿相対凝固時間および抗菌性についても評価した。結果は表１に示した。
【００４３】
〈比較例２〉
実施例２で得たＴＢＬＰ−Ｈｅｐ１００mg、およびＡｇＺｅｏ２０mgにベンゼンを加えて全量で１００ｇとし、ＴＢＬＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ベンゼン懸濁液を得た。１２cm×１２cmのＰＵフィルム上にこの懸濁液３．００ｇを均一に載せ、４０℃で８時間窒素気流下で乾燥後、４０℃で減圧乾燥を１５時間行い、厚さ約６０μｍのフィルムを得た（以下このＴＢＬＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ＰＵコーティングフィルムをフィルムＤと略記する）。
【００４４】
このＴＢＬＰ−Ｈｅｐ，ＡｇＺｅｏ／ベンゼン懸濁液でコーティングを行って補体価とin vivo 抗血栓性を、フィルムＤを用いて血漿相対凝固時間と抗菌性を実施例１と同様の方法で評価した。また、実施例１と同様の方法でフィルムＤの溶出試験を実施し、得られた溶出フィルムＤ’の血漿相対凝固時間および抗菌性についても評価した。結果は表１に示した。
【００４５】
〈比較例３〉
ＰＵをＴＨＦに溶解して５％溶液とした。このＰＵ溶液１０００ｇに対し、実施例１で得たＴＢＣＰ−Ｈｅｐ５．００ｇを加えて、均一溶液とした。このＴＢＣＰ−Ｈｅｐ／ＰＵブレンド溶液２０ｇを水平に保った１２cm×１２cmのガラス板上に均一に載せ、４０℃で８時間窒素気流下で乾燥後、４０℃で減圧乾燥を１５時間行い、厚さ約６０μｍのフィルムを得た（以下このＴＢＣＰ−Ｈｅｐ／ＰＵブレンド材料を材料Ｅ、材料Ｅから得たフィルムをフィルムＥと略記する）。フィルムＥには、ＴＢＣＰ−Ｈｅｐが１０phr 添加されていることになる。
【００４６】
この材料ＥおよびフィルムＥを用いて、実施例１と同様の方法で血漿相対凝固時間、補体価、抗菌性、in vivo 抗血栓性を評価した。また、実施例１と同様の方法で実施例１と同様の方法でフィルムＥの溶出試験を実施し、得られた溶出フィルムＥ’の血漿相対凝固時間および抗菌性についても評価した。結果は表１に示した。
【００４７】
〈比較例４〉
ＰＵをＴＨＦに溶解して５％溶液とした。このＰＵ溶液１０００ｇに対し、ＡｇＺｅｏ１．００ｇを加えて、一様な懸濁液とした。このＡｇＺｅｏ／ＰＵブレンド懸濁液２０ｇを水平に保った１２cm×１２cmのガラス板上に均一に載せ、４０℃で８時間窒素気流下で乾燥後、４０℃で減圧乾燥を１５時間行い、厚さ約６０μｍのフィルムを得た（以下このＡｇＺｅｏ／ＰＵブレンド材料を材料Ｆ、材料Ｆから得たフィルムをフィルムＦと略記する）。フィルムＦには、ＡｇＺｅｏが２phr 添加されていることになる。
【００４８】
この材料ＦおよびフィルムＦを用いて、実施例１と同様の方法で血漿相対凝固時間、抗菌性、in vivo 抗血栓性を評価した。また、実施例１と同様の方法でフィルムＧの溶出試験を実施し、得られた溶出フィルムＦ’の血漿相対凝固時間および抗菌性についても評価した。結果は表１に示した。
【００４９】
〈比較例５〉
脂溶化ヘパリンを導入していないＰＵフィルム（フィルムＧ）を用いて血漿相対凝固時間、抗菌性を評価した。また、実施例１と同様の方法でフィルムＧの溶出試験を実施し、得られた溶出フィルムＧ’の血漿相対凝固時間、抗菌性についても評価した。結果は表１に示した。
【００５０】
表１に示した結果からわかるように、本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は優れた抗血栓性、抗菌性を示しており、溶出後も性能が維持されている。有機高分子材料を含有せずに、フィルム表面に脂溶化ムコ多糖と無機系抗菌剤をコーティングした比較例１、２では、溶出前の性能は比較的良好であるものの、血漿溶出による性能の低下が大きいことがわかる。有機高分子材料を含有しない状態では脂溶化ムコ多糖、無機系抗菌剤は血漿による溶出で剥離しやすく、性能の低下を招いていると考えられる。
無機系抗菌剤を添加していない比較例３の材料は、抗血栓性は比較的良好であるが、抗菌性は劣っており、特に溶出後の抗菌性低下が大きい。脂溶化ムコ多糖が含まれていない比較例４では抗血栓性が著しく劣るのに加えて、抗菌性も本発明の抗菌性付与抗血栓性材料には及ばない。抗血栓性が脂溶化されたヘパリンによって発揮されていることを示すとともに、第４級ホスホニウムと無機系抗菌剤の相乗効果によって抗菌性が向上していることも示唆している。
【００５１】
【発明の効果】
本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は、基材となるポリマーに簡便に抗血栓性、抗菌性を付与することができ、その性能は材料調製直後のみならず、長期間の溶出操作後も維持される。したがって、本発明の抗菌性付与抗血栓性材料は医療用材料の抗血栓化、抗菌化を行う材料として優れた適性を有している。
Claims (5)
- 下記（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を少なくとも含有することを特徴とする抗菌性付与抗血栓性材料。
（ａ）少なくとも１種のムコ多糖類と第４級ホスホニウムのイオン性複合体から成る脂溶化ムコ多糖
（ｂ）無機系抗菌剤
（ｃ）有機高分子材料 - ムコ多糖類としてヘパリンもしくはヘパリン金属塩が少なくとも含有されている請求項１記載の抗菌性付与抗血栓性材料。
- 第４級ホスホニウムが下記化１の構造である請求項１または２記載の抗菌性付与抗血栓性材料。
- 有機高分子材料がポリハロゲン化ビニル、ポリハロゲン化ビニリデン、ポリウレタン、ポリウレタンウレア、ポリエステルもしくはポリアミドのうちのいずれかである請求項１〜３のいずれかに記載の抗菌性付与抗血栓性材料。
- 有機高分子材料１００重量部に対して脂溶化ムコ多糖を０．１〜５０重量部および無機系抗菌剤を０．１〜５０重量部含有されている請求項１〜４記載のいずれかに抗菌性付与抗血栓性材料。
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