JP3680324B2 - Mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, gene and amino acid production method thereof - Google Patents
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】
本発明は、変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、それをコードする遺伝子及びアミノ酸の製造法に関し、詳しくは、アスパラギン酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有する遺伝子とその利用に関する。
【0002】
【従来の技術】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、大部分の細菌や全ての植物に見いだされる酵素である。本酵素の役割は、アスパラギン酸やグルタミン酸の生合成および、クエン酸サイクルに回転維持のためにC4ジカルボン酸を供給することにある。しかし、微生物を用いたアミノ酸の発酵生産において本酵素が及ぼす影響を示した報告は少なく、その重要性は明らかではない(Atushi, Yokota and Isamu, Shiio, Agric. Biol. Chem., 52, 455-463 (1988)、Josef, Cremer et al., Appl. Environ. Microbiol., 57, 1746-1752 (1991)、Petra, G. Peters-Weintisch, FEMS Microbiol. Letters, 112, 269-274 (1993))。
【0003】
ところで、アミノ酸はタンパクの成分として細胞に普遍的に存在する化合物であるが、経済的なエネルギー代謝及び物質代謝のために、その生産は厳密に制御されている。この制御は、主としてフィードバック制御、すなわち代謝経路の下流における産物が上流の反応を触媒する酵素の活性を阻害することによる制御であり、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼも、活性発現に様々な調節を受けている。
【0004】
例えば、エシェリヒア(Escherichia)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属細菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼでは、アスパラギン酸によって活性が阻害される。
【0005】
従来、アミノ酸醗酵においては効率的な生産のために種々の技術が開発され、フィードバック制御に非感受性になった変異株を使用したロイシン、イソロイシン、トリプトファン、フェニルアラニン等の醗酵生産が行われている。しかしながら、アスパラギン酸による阻害に非感受性になったホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ変異酵素や、これをアスパラギン酸族やグルタミン酸族のアミノ酸の醗酵生産に利用するという試みは知られていない。
【0006】
一方、大腸菌(エシェリヒア・コリ:Escherichia coli)のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子である ppc 遺伝子はすでにクローニングされ、塩基配列も決定されている(Fujita,N.,Miwa,T.,Ishijima,S.,Izui,K. and Katsuki H. J.Biochem.95,909-916(1984))が、同酵素においてもアスパラギン酸による阻害が解除された変異体の報告はない。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、上記観点からなされたものであり、アスパラギン酸によるフィードバック阻害が実質的に解除されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ及びその遺伝子及びその利用法を提供することを課題とする。
【0008】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、大腸菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの特定の部位のアミノ酸を他のアミノ酸に置換することによって、アスパラギン酸による阻害が実質的に解除されることを見いだし、そのような変異酵素をコードする遺伝子を取得することに成功し、本発明を完成させるに至った。
【0009】
すなわち本願発明は、エシェリヒア属に属する微生物由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおいて、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアスパラギン酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有することを特徴とする変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ、及びこの変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするDNA配列である。
【0010】
本発明はさらに、このDNA断片を保持するエシェリヒア属又はコリネホルム細菌に属する微生物、及びこれらの微生物を好適な培地で培養し、この培地からL−リジン、L−スレオニン、L−メチオニン、L−イソロイシン、L−グルタミン酸、L−アルギニン及びL−プロリンから選ばれるアミノ酸を分離することを特徴とするアミノ酸の製造方法を提供する。
【0011】
尚、本明細書において、変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするDNA配列あるいはこれにプロモーターを含むDNA配列を、単に「本発明のDNA配列」、「変異遺伝子」あるいはホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子ということがある。
【0012】
以下、本発明について詳細に説明する。
【0013】
<1>変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
本発明の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ(以下、単に「変異型酵素」ともいう)は、エシェリヒア属に属する微生物のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼにおいて、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアスパラギン酸によるフィードバック阻害を解除する変異を有するものである。
【0014】
このような変異としては、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの酵素活性を失わないまま、上記フィードバック阻害を実質的に解除するものであればどのようなものでもよいが、例えば、その変異を有する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをエシェリヒア属に属する微生物の細胞内に存在させたときに、下記性質を有する化合物に対する耐性を細胞に付与する変異が挙げられる;
野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを産生するエシェリヒア属に属する微生物に対して生育阻害作用を示し、
前記生育阻害作用はL−グルタミン酸またはL−アスパラギン酸の存在によって回復され、かつ、
野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を阻害する。
【0015】
さらに具体的には、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのN−末端から
▲1▼625番目のグルタミン酸をリジンに置換させる変異、
▲2▼222番目のアルギニンをヒスチジンに、223番目のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異、
▲3▼288番目のセリンをフェニルアラニンに、289番目のグルタミン酸をリジンに、551番目のメチオニンをイソロイシンに、804番目のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異、
▲4▼867番目のアラニンをスレオニンに置換させる変異、
が挙げられる。
【0016】
尚、エシェリヒア属に属する微生物のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとして、大腸菌のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子から推定されるアミノ酸配列(Fujita,N.,Miwa,T.,Ishijima,S.,Izui,K. and Katsuki H. J.Biochem.95,909-916(1984))を、配列表配列番号1に示す。
【0017】
上記変異型酵素は、下記の本発明のDNA配列によってコードされ、このDNA配列を大腸菌等で発現させることにより生産される。
【0018】
<2>本発明のDNA配列及びそれを保持する微生物
一方、本発明のDNA配列は、上記変異型酵素をコードするDNA配列であり、エシェリヒア属に属する微生物のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするDNA断片において、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアスパラギン酸によるフィードバック阻害を解除する変異をコーディング領域内に有する。
【0019】
具体的には、上記▲1▼〜▲4▼の変異を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするDNA配列、例えば、配列表配列番号1の塩基配列において、
i) 塩基番号2111〜2113のGAAが、AAAまたはAAGに変換する変異、
ii) 塩基番号902〜904のCGCがCATまたはCACに、及び905〜907のGAAがAAAまたはAAGに各々変換する変異、
iii)塩基番号1100〜1102のTCTがTTTまたはTTCに、1103〜1105のGAAがAAAまたはAAGに、1889〜1891のATGがATT、ATCまたはATAに、及び2648〜2650のGAAがAAAまたはAAGに各々変換する変異
iv) 2837〜2839のGCGがACT、ACC、ACA、ACGのいずれかに変換する変異
のいずれかを有するDNA配列が挙げられる。
【0020】
このような変異型遺伝子は、野生型酵素遺伝子あるいは他の変異を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子と宿主に適合するベクターDNAとを連結して得られる組換えDNAを変異処理し、この組換えDNAによる形質転換体からスクリーニングすることにより得られる。あるいは、野生型酵素を生産する微生物を変異処理し、変異型酵素を生産する変異株を創成した後、該変異株から変異型遺伝子をスクリーニングしてもよい。組換えDNAの変異処理には、ヒドロキシルアミン等が使用される。また、微生物自体を変異処理する場合は、通常人工突然変異に用いられている薬剤あるは方法を用いればよい。
【0021】
上記野生型酵素遺伝子あるいは他の変異を有するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子は、エシェリヒア属に属する微生物のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードする遺伝子であれば、いかなるものでもよく、塩基配列が決定されておりクローン化されていることが好ましい。クローン化されていない場合には、PCR法等を用いて該遺伝子を含むDNA断片を増幅単離した後、適当なベクターを用いてクローン化することができる。
【0022】
上記のような遺伝子として、例えば、すでにクローニングされ塩基配列も決定されている、大腸菌の遺伝子(Fujita,N.,Miwa,T.,Ishijima,S.,Izui,K. and Katsuki, H. J.Biochem.95,909-916(1984))が挙げられる。この遺伝子のコーディング領域の配列は、配列表の配列番号1に示したとおりである(塩基番号239〜2890)。
【0023】
変異遺伝子を有する宿主のスクリーニングは、アスパラギン酸のアナログ化合物を用いて行うことができる。アナログ化合物としては、次の性質を有していることが好ましい。すなわち、野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを生産するエシェリヒア属に属する微生物に対して生育阻害作用を示し、前記生育阻害作用はL−グルタミン酸又はL−アスパラギン酸の存在によって回復され、かつ、野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性を阻害する。
【0024】
上記のようなアナログ化合物を、野生型酵素を生産するエシェリヒア属に属する微生物、例えばエシェリヒア・コリHB101の生育の阻害を指標として選択し、そのアナログ化合物に耐性な変異株をスクリーニングすれば、アスパラギン酸によるフィードバック阻害が解除されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを生産する宿主が得られる可能性が高い。
【0025】
ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの阻害剤の一般的な構造として、C4ジカルボン酸構造をとることが必須であると提唱されている。このような観点から、本発明者は種々の化合物をスクリーニングした。エシェリヒア・コリHB101をLB培地で前培養し、DL-2-アミノ-4-ホスホノ酪酸、ブロモコハク酸メソ-2,3-ジブロモコハク酸、2,2-ジフルオロコハク酸、3-ブロモピルビン酸、α-ケト酪酸、α-ケトアジピン酸、DL-スレオ-β-ヒドロキシアスパラギン酸、L-アスパラギン酸-β-メチルエステル、α-メチル-DL-アスパラギン酸、2,3-ジアミノコハク酸又はアスパラギン酸-β-ヒドラジドを含むM9培地(チアミン 20μg/ml、Leu、Pro各3μg/ml含む)で本培養し、経時的に660nmで吸光度を測定することにより、生育を調べた。
【0026】
さらに、それらの化合物が生育阻止濃度で存在するときに、核酸(ウリジン、アデノシン各10mg/dl)、グルタミン酸、あるいはアスパラギン酸族のアミノ酸(Asp 0.025%、Met、Thr、Lys各0.1%)の添加により阻害が回復するか否かを調べた。
【0027】
その結果、3種の化合物、3−ブロモピルビン酸(3BP)(化1)、アスパラギン酸−β−ヒドラジド(AHY)(化2)、DL−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸(βHA)(化3)を選択した。
【0028】
【化1】
【0029】
【化2】
【0030】
【化3】
【0031】
これらのアナログ化合物による大腸菌の生育阻害を図1〜3に示す。さらに、上記阻害回復物質を単独で、あるいは2種類もしくは3種類の混合物として加えたときの、大腸菌の生育回復を図4〜6に示す。また、対照として、阻害物質非存在下で阻害回復物質を添加したときの生育を図7に示す。尚、図4〜7中、添加物1、2、3は、各々核酸、グルタミン酸、あるいはアスパラギン酸族のアミノ酸を示す。
【0032】
さらに、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼに対するアナログ化合物による活性阻害を調べた。Yoshinaga, T., Izui, K. and Katsuki, H., J. Biochem., 68, 747-750 (1970)に記載の方法に準じて、酵素活性を測定した。
【0033】
LB培地で培養したエシェリヒア・コリHB101を破砕し、懸濁液を遠心分離して上清を粗酵素液とした。酵素活性の測定は、2mMホスホエノールピルビン酸カリウム、0.1mM NADH、0.1M トリス−酢酸(pH8.5)、1.5Uマレートデヒドロゲナーゼ、及び粗酵素を含む測定系中に、活性に影響する事が知られているアセチルコエンザイムAを0.1mMの濃度で存在させて、340nmの吸光度の減少を測定することにより行った。結果を図8に示す。
【0034】
以上の結果から、上記の3種のアナログ化合物は、大腸菌の生育を阻害し、核酸単独ではこの阻害を回復できないが、グルタミン酸あるいはアスパラギン酸族アミノ酸の添加により阻害を回復できることが明らかである。したがって、これらのアナログ化合物はホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの選択的な阻害剤であると推定された。本発明において、後記実施例に示したように、これら3種の化合物を用いて変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを生産する大腸菌を選択することに成功している。
【0035】
上記化合物を用いて目的とする変異型酵素遺伝子を有する形質転換体をスクリーニングし、組換えDNAを回収すれば、その変異型酵素遺伝子が得られる。また、微生物自体を変異処理した場合には、上記化合物を用いて目的とする変異型酵素遺伝子を有する変異株をスクリーニングし、該株より目的とする変異型酵素遺伝子を含むDNA断片を単離し、適当なベクターに連結すれば、その変異型酵素遺伝子が得られる。
【0036】
このようにして変異が導入されたホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするDNA断片を、適当な宿主−ベクター系を用いて発現させることによって、変異型酵素を生産させることができる。また、本発明のDNA断片を、宿主染色体DNA内に組み込むことにより形質転換しても、目的の変異型酵素を産生できる。
【0037】
宿主としては、エシェリヒア属に属する微生物、例えば、大腸菌、コリネホルム細菌等が挙げられる。コリネホルム細菌は、コリネバクテリウム属細菌、従来ブレビバクテリウム属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌として統合されたブレビバクテリウム属細菌、及びコリネバクテリウム属細菌と非常に近縁なブレビバクテリウム属細菌を含む。尚、アミノ酸製造に好適な宿主については、後述する。
【0038】
一方、ベクターDNAとしては、プラスミドベクターが好ましく、宿主の細胞内で自立複製可能なものが好ましい。宿主が大腸菌の場合には、例えば pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG399、RSF1010等が挙げられる。他にもファージDNAのベクターも利用できる。
【0039】
また、宿主がコリネホルム細菌の場合に使用できるベクター及びそれを保持する宿主を以下に例示する。尚、かっこ内に国際寄託機関の寄託番号を示した。
【0040】
【0041】
これらのベクターは、寄託微生物から次のようにして得られる。対数増殖期に集められた細胞をリゾチーム及びSDSを用いて溶菌し、30000×gで遠心分離して溶解物から得た上澄液にポリエチレングリコールを添加し、セシウムクロライド−エチジウムブロマイド平衡密度勾配遠心分離により分別精製する。
【0042】
本発明のDNA配列を上記ベクターに挿入して得られる組換えベクターで大腸菌を形質転換するには、例えば細胞を塩化カルシウムで処理してDNAの透過性を高める方法(Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1977))等、通常大腸菌の形質転換に用いられる方法を用いることができる。
【0043】
また、コリネホルム細菌の形質転換法としては、上記の細胞を塩化カルシウムで処理する方法、または細胞がDNAを取込可能な特定の成長時期に取り込む方法(Duncan, C. H. et al.によるバチルス・ズブチリスに関する報告)がある。さらに、プラチミドDNAを容易に取り込むDNA受容体のプロトプラストまたはスフェロプラストを成形することによって細菌細胞内に取り込むことが可能である。これらは、バチルス・ズブチリス、アクチノマイセス及び酵母について知られている(Chang, S. et al. Molec. Gen. Genet., 168, 111, (1979)、Bibb et al., Nature, 274, 398, (1978)、Hinnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978))。 その他、特開平2−207791号公報にコリネホルム細菌の形質転換法が開示されている。
【0044】
本発明のDNA配列を上記宿主内で発現させるには、lac、trp、PL等の微生物内で効率よく働くプロモーターを用いてもよく、本発明のDNA配列がホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子のプロモーターを含んでいる場合は、これをそのまま用いてもよい。また、コリネホルム細菌を宿主とする場合は、公知のブレビバクテリウム属細菌由来のtrpプロモーター(特開昭62−244382号公報)等を使用することもできる。
【0045】
また、上記のように、本発明のDNA配列を自立複製可能なベクターDNAに挿入したものを宿主に導入し、プラスミドとして宿主に保持させてもよいが、本発明のDNA配列を、トランスポゾン(Berg,D.E. and Berg,C.M.,Bio/Technol.,1,417(1983))、Muファージ(特開平2−109985)または相同性組換え(Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab.(1972))を用いた方法で微生物の染色体に組み込んでもよい。また、コリネホルム細菌の染色体に本発明のDNAを組み込むには、特開平5−7491号公報に開示される温度感受性プラスミドが利用できる。
【0046】
上記のようにして本発明のDNA配列で形質転換された微生物を培養し、このDNA配列を発現させると、変異型酵素が得られる。このようにして得られた変異型酵素が、アスパラギン酸によるフィードバック阻害が解除されているかどうかは、酵素反応系にアスパラギン酸を添加して活性を測定することにより、明かとなる。
【0047】
また、本発明のDNA配列は、アスパラギン酸によるフィードバック阻害が解除された変異酵素をコードしているので、このDNA配列を有する微生物を、以下に示すように、アスパラギン酸族やグルタミン酸族のアミノ酸の効率的な醗酵生産に利用することができる。
【0048】
後記実施例で得られた変異型酵素遺伝子を保持するエシェリヒア・コリAJ 12907、AJ 12908、AJ 12909、AJ 12910は、平成5年8月3日に工業技術院生命工学工業技術研究所(郵便番号305 日本国茨城県つくば市東一丁目1番3号)に、各々順にFERM P−13774、FERM P−13775、FERM P−13776、FERM P−13777として寄託されており、平成6年7月11日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号 FERM BP-4734、FERM BP-4735、FERM BP-4736、FERM BP-4737として寄託されている。
【0049】
<3>アミノ酸の製造方法
本発明のDNA配列を保持する微生物を好適な培地で培養し、生じたアミノ酸を分離することにより、アミノ酸を製造することができる。このようなアミノ酸として、L−リジン、L−スレオニン、L−メチオニン、L−イソロイシン、L−グルタミン酸、L−アルギニン、L−プロリンが挙げられる。
【0050】
以下に、本発明のDNA配列を導入し各アミノ酸の製造に使用するのに好適な宿主及び培養法を例示する。
【0051】
(1)本発明のアミノ酸の製造方法に好適な宿主
(i)L−リジン製造に好適な宿主
本発明によるL−リジン製造に用いる宿主として、エシェリヒア属細菌、好ましくはL−リジン生産性の大腸菌が挙げられる。具体的には、リジンアナログに耐性を有する変異株が例示できる。このリジンアナログは、エシェリヒア属の微生物の増殖を阻害するようなものであるが、その抑制はL−リジンが培地中に共存すれば、全体的または部分的に解除されるようなものである。例えば、オキサリジン、リジンハイドロキサメート、S−(2−アミノエチル)−システイン(以下、「AEC」と略記する)、γ−メチルリジン、α−クロロカプロラクタム等がある。これらのリジンアナログに耐性を有する変異株は、通常の人工変異操作をエシェリヒア属の微生物に施すことにより得られる。L−リジン製造に用いる菌株として、具体的には、エシェリヒア・コリ AJ11442(FERM P−5084として寄託されている。特開昭56−18596号公報第471頁左下欄参照)が挙げられる。
【0052】
一方、コリネホルム細菌の種々の人工変異株が、L−リジン生産菌として用いられており、これらを本発明に使用することができる。このような人工変異株としては次のようなものがある。AEC耐性変異株、その成長にL−ホモセリンのようなアミノ酸を必要とする変異株(特公昭48−28078号,特公昭56−6499号),AECに耐性を示し、更にL−ロイシン、L−ホモセリン,L−プロリン,L−セリン,L−アルギニン,L−アラニン,L−バリン等のアミノ酸を要求する変異株(米国特許第3708395号及び第3825472号),DL−α−アミノ−ε−カプロラクタム,α−アミノ−ラウリルラクタム,キノイド,N−ラウロイルロイシンに耐性を示すL−リジン生産変異株,オキザロ酢酸脱炭酸酵素(デカルボキシラ−ゼ)または呼吸系酵素の阻害剤に耐性を示すL−リジン生産変異株(特開昭50−53588号,特開昭50−31093号,特開昭52−102498号,特開昭53−86089号,特開昭55−9783号,特開昭55−9759号,特開昭56−32995号,特開昭56−39778号,特公昭53−43591号,特公昭53−1833号),イノシトールまたは酢酸を要求するL−リジン生産変異株(特開昭55−9784号,特開昭56−8692号),フルオロピルビン酸または34℃以上の温度に対して感性を示すL−リジン生産変異株(特開昭55−9783号,特開昭53−86090号)、エチレングリコールに耐性を示し、L−リジンを生産するブレビバクテリウムまたはコリネバクテリウムの変異株(米国特許出願第333455号参照)。
【0053】
リジン製造に用いる具体的なコリネホルム細菌としては、次のものが挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12031 (FERM BP-277) 特開昭60-62994号公報第525頁左下欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム ATCC39134 特開昭60-62994号公報第473頁右下欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 3463 (FERM P-1987) 特公昭51-34477号公報参照
また、以下に示すコリネホルム細菌の野生株も同様に本発明に使用することができる。
【0054】
【0055】
(ii)L−スレオニン製造に好適な宿主
エシェリヒア・コリ B-3996 (RIA 1867) 特表平3-501682号公報参照
エシェリヒア・コリ AJ 12349 (FERM P-9574) 特開平2-458号公報第887頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12351 (FERM P-9576) 特開平2-458号公報第887頁右下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12352 (FERM P-9577) 特開平2-458号公報第888頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11332 (FERM P-4898) 特開平2-458号公報第889頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12350 (FERM P-9575) 特開平2-458号公報第889頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12353 (FERM P-9578) 特開平2-458号公報第889頁右上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12358 (FERM P-9764) 特開平2-458号公報第890頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 12359 (FERM P-9765) 特開平2-458号公報第890頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11334 (FERM P-4900) 特公平1-29559号公報第201頁6欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11333 (FERM P-4899) 特公平1-29559号公報第201頁6欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11335 (FERM P-4901) 特公平1-29559号公報第202頁7欄参照
【0056】
コリネホルム細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 11188 (FERM P-4190) 特開昭60-87788号公報第473頁右上欄参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 11682 (FERM BP-118) 特公平2-31956号公報第230頁8欄参照
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 11683 (FERM BP-119) 特公平2-31956号公報第231頁10欄参照
【0057】
(iii)L−メチオニン製造に好適な宿主
L−メチオニン製造には、以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ AJ 11457 (FERM P-5175) 特開昭56-35992号公報第552頁右上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11458 (FERM P-5176) 特開昭56-35992号公報第552頁右上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11459 (FERM P-5177) 特開昭56-35992号公報第552頁右上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11539 (FERM P-5479) 特開昭56-144092号公報第435頁左下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11540 (FERM P-5480) 特開昭56-144092号公報第435頁左下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11541 (FERM P-5481) 特開昭56-144092号公報第435頁左下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11542 (FERM P-5482) 特開昭56-144092号公報第435頁左下欄参照
【0058】
(iv)L−アスパラギン酸製造に好適な宿主
L−アスパラギン酸製造には以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 3859 (FERM P-2799) 特開昭51-61689号公報第524頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 3860 (FERM P-2800) 特開昭51-61689号公報第524頁 左上欄参照
コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム AJ 3877 (FERM P-2803) 特開昭51-61689号公報第524頁左上欄参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 3876 (FERM P-2802) 特開昭51-61689号公報第524頁左上欄参照
【0059】
(v)L−イソロイシン製造に好適な宿主
エシェリヒア属細菌としては、エシェリヒア・コリ KX141 (VKPM-B4781)(特開平4-330275号公報45段落参照)が、コリネホルム細菌としては、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12404 (FERM P-10141)(特開平2-42988号公報第603頁左下欄参照)、ブレビバクテリウム・フラバム AJ 12405 (FERM P-10142)(特開平2-42988号公報第524頁左下欄参照)が挙げられる。
【0060】
(vi)L−グルタミン酸製造に好適な宿主
エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ AJ 12628 (FERM P-12380) '93年フランス特許公開No. 2 680 178号参照
エシェリヒア・コリ AJ 12624 (FERM P-12379) '93年フランス特許公開No. 2 680 178号参照
【0061】
コリネホルム細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12745 (FERM BP-2922) 特開平3-49690号公報第561頁右下欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12746 (FERM BP-2923) 特開平3-49690号公報第562頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12747 (FERM BP-2924) 特開平3-49690号公報第562頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 12748 (FERM BP-2925) 特開平3-49690号公報第562頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 14067 特開平5-3793号公報第3頁表1参照
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 21492 特開平5-3793号公報第3頁表1参照
【0062】
(vii)L−アルギニン製造に好適な宿主
エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ AJ 11593 (FERM P-5616) 特開昭57-5693号公報第468頁左上欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11594 (FERM P-5617) 特開昭57-5693号公報第468頁右上欄参照
【0063】
コリネホルム細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 12144 (FERM P-7642) 特公平5-27388号公報第174頁4欄参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 12145 (FERM P-7643) 特公平5-27388号公報第174頁4欄参照
ブレビバクテリウム・フラバム ATCC 21493 特開平5-3793号公報第3頁表1参照
コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC 21659 特開平5-3793号公報第3頁表1参照
【0064】
(viii)L−プロリン製造に好適な宿主
エシェリヒア属細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
エシェリヒア・コリ AJ 11543 (FERM P-5483) 特開昭56-144093号公報第435頁左下欄参照
エシェリヒア・コリ AJ 11544 (FERM P-5484) 特開昭56-144093号公報第435頁左下欄参照
【0065】
コリネホルム細菌としては、以下の菌株が挙げられる。
ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 11225 (FERM P-4370) 特開昭60-87788号公報第473頁左上欄参照
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 11512 (FERM P-5332) 特公昭62-36679号公報第185頁2欄 参照
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 11513 (FERM P-5333) 特公昭62-36679号公報第185頁2欄 参照
ブレビバクテリウム・フラバム AJ 11514 (FERM P-5334) 特公昭62-36679号公報第185頁2欄 参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 11522 (FERM P-5342) 特公昭62-36679号公報第185頁2欄 参照
コリネバクテリウム・グルタミクム AJ 11523 (FERM P-5343) 特公昭62-36679号公報第185頁2欄 参照
【0066】
(2)培養法
上記宿主を培養する方法は、従来のアミノ酸生産菌の培養方法と特に変わらない。すなわち、培地としては炭素源、窒素源、無機イオン、さらに必要に応じてアミノ酸、ビタミン等の有機微量栄養素を含有する通常のものである。
【0067】
炭素源としては、グルコース、シュクロース、ラクトース等及びこれらを含有する澱粉加水分解液、ホエイ、糖蜜等が用いられる。窒素源としては、アンモニアガス、アンモニア水、アンモニウム塩その他が使用できる。尚、アミノ酸等の栄養要求性変異株を宿主に使用する場合は、その株が要求するアミノ酸等の栄養素を培地に適宜加える必要がある。以下に、アミノ酸製造に用いる培地として、リジン製造用の培地の一例を表1に示す。尚、炭酸カルシウムは別個に殺菌後、他成分に添加する。
【0068】
【表1】
【0069】
培養は、好気的条件下で培地のpH及び温度を適宜調節しつつ、実質的にアミノ酸の生成蓄積が停止するまで行われる。こうして培養液中に蓄積されたアミノ酸を採取するには、通常の方法を適用できる。
【0070】
【実施例】
以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的に説明する。
【0071】
【実施例1】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子の取得
すでにクローニングされ、塩基配列も決定されているホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子をベクタープラスミドpBR322のSalI部位に挿入して得られたプラスミドpS2を用いて、変異型遺伝子の作製を行った。pS2は、薬剤耐性マーカー遺伝子として、アンピシリン耐性遺伝子を有する(Sabe, H. et al., Gene, 31, 279-283, 1984)。
【0072】
pS2DNAを、ヒドロキシルアミン処理溶液(20μg/ml pS2DNA、0.05M リン酸ナトリウム(pH6.0)、1mM EDTA、0.4Mヒドロキシルアミン)で、75℃、2時間処理した。ヒドロキシルアミン処理は、pHの影響を受けるので、水酸化ナトリウムでpHを6.0に調整した1Mヒドロキシルアミン・HCl、1mM EDTA溶液80μlと、0.1M リン酸ナトリウム(pH6.0)、1mM EDTA溶液100μlと、2μgのpS2DNAを含むTE(10mM Tris-HCl、1mM EDTA)緩衝液とを混合し、最終的に水で200μlとした。
【0073】
上記条件は、処理後のpS2でエシェリヒア・コリHB101を形質転換したときに、アンピシリン含有培地での形質転換体の生存率が処理前の0.2%となる条件である。
【0074】
ヒドロキシルアミン処理したpS2でエシェリヒア・コリHB101を形質転換し、アンピシリンを含む平板培地に塗布し、約10000コロニーの形質転換体を得た。これらを液体培地に懸濁し、アスパラギン酸のアナログ化合物である3−ブロモピルビン酸(3BP)、アスパラギン酸−β−ヒドラジド(AHY)、DL−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸(βHA)のいずれかを最小阻止濃度付近の濃度で含む平板培地に、培地1枚あたり103〜105個となるように塗布し、生育するコロニーを選択した。
【0075】
こうして得られたアナログ化合物耐性株100株から、The Journal of Biochemistry, Vol.67, No.4, 1970に記載の方法に準じて、各々の生産するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを粗精製し、アナログ化合物による活性阻害を調べた。酵素活性の測定は、前記と同様にして行った。
【0076】
さらに、アナログ化合物により活性を阻害されない変異型酵素を生産する菌株からプラスミドを単離し、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ欠損変異株であるエシェリヒア・コリPCR1(Sabe, H. et al., Gene, 31, 279-283, 1984)に導入し、変異型酵素を産生することを確認した。
【0077】
こうして、変異型酵素遺伝子を有する5株の形質転換体を得た。これらの遺伝子の塩基配列を決定した結果、2株については同一の変異を有しており、4種類の変異型遺伝子が得られた。これらを保持する形質転換体は、AJ 12907、AJ 12908、AJ 12909、AJ 12910と命名され、平成5年8月3日に工業技術院生命工学工業技術研究所(郵便番号305 日本国茨城県つくば市東一丁目1番3号)に、各々順にFERM P−13774、FERM P−13775、FERM P−13776、FERM P−13777として寄託されており、平成6年7月11日に、この原寄託からブダペスト条約に基づく国際寄託へ移管され、受託番号 FERM BP-4734、FERM BP-4735、FERM BP-4736、FERM BP-4737として寄託されている。また、これらの保持するプラスミドは、各々順にpBP5、pHA19、pBP122、pR6と名付けた。各々のプラスミドに含まれるホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が有する変異を、表2に示す。表中の数字は、配列番号1におけるヌクレオチド番号またはアミノ酸番号を表す。
【0078】
【表2】
【0079】
尚、AJ 12907、AJ 12909は、500μg/mlの3BPを含む培地で、AJ 12908は、1000μg/mlのβHAを含む培地で、AJ 12910は、500μg/mlのAHYを含む培地で選択されたものである。
【0080】
【実施例2】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ
上記4株の形質転換体の産生するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼについて、アスパラギン酸に対する感受性を調べた。これらの菌株は、宿主由来のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を欠損しているので、産生するホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、プラスミド由来のものである。
【0081】
アスパラギン酸に対する感受性は、既知の方法(Yoshinaga,T.,Izui,K and Katsuki,H. J.Biochem.,68,747-750(1970))に従って調べた。すなわち、活性測定系中に、活性に影響することが知られているアセチルコエンザイムAを0.1mMあるいは1mMの濃度で存在させて、各形質転換体及びpS2を保持する大腸菌が産生する酵素の活性を測定したところ、アスパラギン酸に対する感受性は、図9、11のように測定された。
【0082】
この結果から、アスパラギン酸が高濃度になると、野生型の酵素は活性を失うのに対し、本発明の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、活性を実質的に保持し続けていることが明らかである。
【0083】
【実施例3】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを導入したエシェリヒア・コリによるL−スレオニンの発酵生産
エシェリヒア・コリのスレオニン生産菌としてはB−3996株(特表平3-501682号公報)が現在知られている内で最も高い生産能力を持っている。そこで変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼの評価を行うにあたり、B−3996を宿主として用いることにした。このB−3996株は、Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding に、登録番号 RIA 1867 のもとに寄託されている。また評価する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとしてはpBP5を選び、実験に供した。
【0084】
エシェリヒア・コリB−3996に変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つプラスミドpBP5を、Hanahan(J. Mol. Biol., Vol.106, p577,(1983))の方法により導入し、形質転換体を分離した。対照として、野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を発現するプラスミドであるpS2でエシェリヒア・コリB−3996を同様に形質転換した。
【0085】
エシェリヒア・コリB−3996及びその形質転換体を、それぞれ表3の組成の培地20mlを注入した500ml坂口フラスコに接種して37℃にて40時間培養し、L−スレオニンの生産量を調べたところ、表4に示す結果を得た。尚、前記培地は、グルコースとMgSO4・7H2O、及びそれ以外の成分とに2分し、KOHでpH7.0 に調整した後に、115℃で10分間オートクレーブし、これらを混合した後に別殺菌したCaCO3を30g/l添加した。
【0086】
【表3】
【0087】
【表4】
【0088】
この結果から明らかなように、本発明のDNA配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリB−3996は、野生型酵素を発現するプラスミドを保持するエシェリヒア・コリB−3996よりもスレオニン生産能が向上した。
【0089】
【実施例4】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを導入したエシェリヒア・コリによるL−グルタミン酸の発酵生産
エシェリヒア・コリ グルタミン酸生産菌としては、特開平4−11461号公報に示されるエシェリヒア・コリAJ 12628が、現在知られている内で最も高い生産能力を持っている。そこで変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを評価するにあたり、AJ 12628を宿主として用いることにした。AJ 12628株は、通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に登録番号FERM BP−3853のもとに寄託されている。また評価する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼとしてはpBP5を選び、実験に供した。
【0090】
エシェリヒア・コリ AJ 12628に変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つプラスミドpBP5を、Hanahan(J. Mol. Biol., Vol.106, p577,(1983))の方法により導入し、形質転換体を分離した。同様に、pS2によるエシェリヒア・コリ AJ 12628の形質転換体を分離した。
【0091】
エシェリヒア・コリ AJ 12628に変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを持つプラスミドpBP5を、Hanahan(J. Mol. Biol., Vol.106, p577,(1983))の方法により導入し、形質転換体を分離した。同様に、pS2によるエシェリヒア・コリ AJ 12628の形質転換体を分離した。
【0092】
し、これらを混合した後に別殺菌したCaCO3を30g/l添加した。
【0093】
【表5】
【0094】
【表6】
【0095】
この結果から明らかなように、本発明のDNA配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持するエシェリヒア・コリAJ 12628は、野生型酵素を発現するプラスミドを保持するエシェリヒア・コリAJ 12628よりもグルタミン酸生産能が向上した。
【0096】
【実施例5】
変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼを導入したコリネホルム細菌によるリジンの生産
変異型遺伝子をコリネホルム細菌に導入して発現させるために、ブレビバクテリウム属細菌由来のプロモーターの取得を行い、変異型遺伝子に連結し、発現型プラスミドを作製した。さらに、これをブレビバクテリウム属細菌に導入し、L−リジンの製造を行った。
【0097】
<1>ブレビバクテリウム属細菌由来アスパルトキナーゼ(AK)遺伝子の取得ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバクテリウム・グルタミカム)野生株ATCC13869株より常法に従い、染色体DNAを調製した。染色体DNAよりPCR(polymerase chain reaction;White,T.J. et al. ;Trends Genet., 5,185(1989)参照)によりAK遺伝子を増幅した。増幅に用いたDNAプライマーはコリネバクテリウム・グルタミカムにおいて既知となっている配列(Molecular Microbiology(1991)5(5),1197-1204, Mol.Gen.Genet.(1990)224,317-324参照)を基にしてAK遺伝子をコードする約1643bpの領域を増幅すべく、23merのオリゴヌクレオチド(配列番号2)及び21merのオリゴヌクレオチド(配列番号3)を合成した。
【0098】
DNAの合成は、Applied Biosystems社製DNA合成機 model 380Bを使用し、ホスホアミダイト法(Tetrahedron Letters(1981),22,1859参照)を用いて、常法に従って合成した。PCR反応は、宝酒造(株)製DNAサーマルサイクラー PJ2000型を用い、TaqDNAポリメラーゼを用い、供給者により指定された方法に従って遺伝子増幅を行なった。
【0099】
増幅した1643kbの遺伝子断片をアガロースゲル電気泳動により確認した後、ゲルより切り出した該断片を常法により精製し、制限酵素NruI(宝酒造(株)製)及びEcoRI(宝酒造(株)製)にて切断した。遺伝子断片のクローン化用ベクターにはpHSG399(Takeshita, S. et al.;Gene(1987),61,63-74参照)を用いた。pHSG399を制限酵素SmaI(宝酒造(株)製)及び制限酵素EcoRIにて切断し、増幅したAK遺伝子断片と接続した。
【0100】
DNAの接続はDNAライゲーションキット(宝酒造(株)製)を用い、指定された方法にて行なった。この様にしてpHSG399にブレビバクテリウム染色体より増幅されたAK遺伝子断片の接続されたプラスミドを作製した。野生株であるATCC13869由来のAK遺伝子を有するプラスミドをp399AKYと命名した。
【0101】
<2>ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムのAK遺伝子の塩基配列の決定
AKプラスミドp399AKYを調製し、AK遺伝子の塩基配列の決定を行なった。塩基配列の決定はサンガーらの方法(F.Sanger et al :Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 74,5463(1977)などがある)によった。結果を配列表配列番号4に記す。同DNA断片は2つのオープン・リーディング・フレームをもち、これらはおのおの、AKのαサブユニットとβサブユニットに対応する。各々のオープン・リーディング・フレームに対応するアミノ酸配列を、配列番号4及び配列番号5に示す。
【0102】
<3>ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ発現型プラスミドの作製
野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を保持するプラスミドであるpS2、及び取得した変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を保持するプラスミドであるpBP5より、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子を含む約4.4kbのSalI断片を抽出し、大腸菌に汎用されているプラスミドベクターpHSG399のSalIサイトに導入した。作製したプラスミドを、野生型をpHS2、変異型をpHBP5と各々命名した。
【0103】
pHS2およびpHBP5をブレビバクテリウム中で発現するプラスミドとすべく、ブレビバクテリウム中で機能するプロモーター、及びプラスミドの複製起点の導入を行った。プロモーターとしては、クローン化したAK遺伝子のプロモーター領域と推定される、塩基配列の1番目のNruIサイトから207番目のApaLIサイトまでを含む遺伝子断片をp399AKYより抽出し、pHS2およびpHBP5の構造遺伝子の約60bp手前にあるAvaIサイトに転写方向が順方向となるよう挿入した。
【0104】
更に、ベクター上にあるサイトにブレビバクテリウム中でプラスミドの自律増殖を可能にする遺伝子断片、すなわちプラスミドの複製起点を導入した。プラスミドの複製起点を含む遺伝子断片は、ブレビバクテリウム用ベクターpHC4(特開平5−7491号公報段落番号10参照、同プラスミドを保持するエシェリヒア・コリAJ 12036は工業技術院微生命工学工業技術研究所に寄託されており、寄託番号FERM P12215が付されている)より抽出し、両末端の制限酵素部位をリンカーの導入によりPstIサイトに改変した。
【0105】
この断片を、ブレビバクテリウムのプロモーターを付加したプラスミドの、ベクター部分であるPstIサイトに導入した。構築した発現型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプラスミドを、pS2に由来する野生型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプラスミドをpHS2B、pBP5に由来する変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼプラスミドをpHBP5Bと各々命名した。
【0106】
<4>ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ発現型プラスミドを用いたL−リジンの生産
作成したpHS2B、pHBP5Bを各々ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムL−リジン生産菌であるAJ 3463(特公平51-34477号公報参照)に導入した。遺伝子の導入は、電気パルスを用いた形質転換法を用いた(特開平2−207791号公報参照)。宿主及び形質転換体を表7の組成のリジン生産培地にて72時間、31.5℃にて振蘯培養を行った。前記培地は、表に記載の成分のうちCaCO3以外を1lの水に添加し、KOHを用いてpH8.0に調整後、115℃、15分間オートクレーブした後、乾熱滅菌したCaCO3をさらに添加して調製した。培養後の培地中のL−リジンの蓄積量を表8に示す。
【0107】
【表7】
【0108】
【表8】
【0109】
この結果に示されるように、本発明のDNA配列を有する変異型酵素発現プラスミドを保持するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 3463は、野生型酵素を発現するプラスミドを保持するブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム AJ 3463よりもリジン生産能が向上した。
【0110】
【発明の効果】
本発明のDNA配列は、変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードし、このDNA配列を保持する微生物は、前記酵素を産生する。
【0111】
本発明の変異型ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼは、アスパラギン酸による活性阻害を実質的に受けないので、アスパラギン酸により生合成の調節を受けるアミノ酸の醗酵生産等に利用することができる。
【0112】
【配列表】
【0113】
【0114】
【0115】
【0116】
【0117】
【図面の簡単な説明】
【図1】 3−ブロモピルビン酸による生育阻害を示す図。
【図2】 アスパラギン酸−β−ヒドラジドによる生育阻害を示す図。
【図3】 DL−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸による生育阻害を示す図。
【図4】 3−ブロモピルビン酸に対する阻害回復物質の効果を示す図。
【図5】 アスパラギン酸−β−ヒドラジドに対する阻害回復物質の効果を示す図。
【図6】 DL−スレオ−β−ヒドロキシアスパラギン酸に対する阻害回復物質の効果を示す図。
【図7】 生育に与える生育回復因子の影響。
【図8】 生育阻害物質のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ活性に対する阻害を示す図。
【図9】 本発明のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアスパラギン酸による阻害を示す図。
【図10】 本発明のホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのアスパラギン酸による阻害を示す図。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, a gene encoding the same, and a method for producing an amino acid. More specifically, the present invention relates to a gene having a mutation that cancels feedback inhibition by aspartic acid and use thereof.
[0002]
[Prior art]
Phosphoenolpyruvate carboxylase is an enzyme found in most bacteria and all plants. The role of this enzyme is to supply C4 dicarboxylic acid for biosynthesis of aspartic acid and glutamic acid and for maintaining rotation in the citric acid cycle. However, there are few reports showing the effect of this enzyme on the fermentative production of amino acids using microorganisms, and its importance is not clear (Atushi, Yokota and Isamu, Shiio, Agric. Biol. Chem., 52, 455- 463 (1988), Josef, Cremer et al., Appl. Environ. Microbiol., 57, 1746-1752 (1991), Petra, G. Peters-Weintisch, FEMS Microbiol. Letters, 112, 269-274 (1993)) .
[0003]
By the way, amino acids are compounds that are universally present in cells as protein components, but their production is strictly controlled for economic energy metabolism and substance metabolism. This control is mainly feedback control, i.e., control by inhibiting the activity of an enzyme that catalyzes an upstream reaction by a product downstream of the metabolic pathway, and phosphoenolpyruvate carboxylase is also subject to various regulation of activity expression. Yes.
[0004]
For example, the activity of phosphoenolpyruvate carboxylase of the genus Escherichia and Corynebacterium is inhibited by aspartic acid.
[0005]
Conventionally, various techniques have been developed for efficient production in amino acid fermentation, and fermentation production of leucine, isoleucine, tryptophan, phenylalanine and the like using mutants that have become insensitive to feedback control has been performed. However, there is no known phosphoenolpyruvate carboxylase mutant enzyme that has become insensitive to inhibition by aspartic acid, or an attempt to use it for fermentation production of amino acids of the aspartic acid group or glutamic acid group.
[0006]
On the other hand, the ppc gene, which encodes the phosphoenolpyruvate carboxylase of Escherichia coli, has already been cloned and the nucleotide sequence has been determined (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K. and Katsuki HJ Biochem. 95, 909-916 (1984)), but there is no report of a mutant in which inhibition by aspartic acid is released even in this enzyme.
[0007]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made from the above viewpoint, and an object of the present invention is to provide a phosphoenolpyruvate carboxylase, a gene thereof, and a method for using the same, in which feedback inhibition by aspartic acid is substantially eliminated.
[0008]
[Means for Solving the Problems]
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has succeeded in substantially inhibiting inhibition by aspartic acid by substituting an amino acid at a specific site of E. coli phosphoenolpyruvate carboxylase with another amino acid. It was found that the gene was released, and succeeded in obtaining a gene encoding such a mutant enzyme, thereby completing the present invention.
[0009]
That is, the present invention is a phosphoenolpyruvate carboxylase derived from a microorganism belonging to the genus Escherichia, wherein the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase has a mutation that cancels feedback inhibition of aspartate of phosphoenolpyruvate carboxylase, and This is a DNA sequence encoding this mutant phosphoenolpyruvate carboxylase.
[0010]
The present invention further comprises a microorganism belonging to the genus Escherichia or coryneform which retains this DNA fragment, and these microorganisms are cultured in a suitable medium, from which L-lysine, L-threonine, L-methionine, L-isoleucine are cultured. A method for producing an amino acid, comprising separating an amino acid selected from L-glutamic acid, L-arginine and L-proline.
[0011]
In the present specification, a DNA sequence encoding a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase or a DNA sequence including a promoter is simply referred to as “the DNA sequence of the present invention”, “mutant gene” or phosphoenolpyruvate carboxylase gene. Sometimes.
[0012]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0013]
<1> Mutant phosphoenolpyruvate carboxylase
The mutant phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention (hereinafter also simply referred to as “mutant enzyme”) cancels feedback inhibition of phosphoenolpyruvate carboxylase by aspartate in phosphoenolpyruvate carboxylase of microorganisms belonging to the genus Escherichia. It has a mutation to do.
[0014]
As such a mutation, any mutation can be used as long as it substantially cancels the feedback inhibition without losing the enzyme activity of phosphoenolpyruvate carboxylase. When enolpyruvate carboxylase is present in a cell of a microorganism belonging to the genus Escherichia, a mutation that confers resistance to a compound having the following properties on the cell;
Shows growth inhibitory action against microorganisms belonging to the genus Escherichia that produce wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase,
The growth inhibitory action is restored by the presence of L-glutamic acid or L-aspartic acid, and
Inhibits wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase activity.
[0015]
More specifically, from the N-terminus of phosphoenolpyruvate carboxylase.
(1) A mutation that replaces the 625th glutamic acid with lysine,
(2) Mutation that replaces the 222nd arginine with histidine and the 223rd glutamic acid with lysine,
(3) Mutations that replace 288th serine with phenylalanine, 289th glutamic acid with lysine, 551st methionine with isoleucine, and 804th glutamic acid with lysine,
(4) Mutation that replaces 867th alanine with threonine,
Is mentioned.
[0016]
As the phosphoenolpyruvate carboxylase of microorganisms belonging to the genus Escherichia, the amino acid sequence deduced from the phosphoenolpyruvate carboxylase gene of Escherichia coli (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K. and Katsuki HJBiochem. 95, 909-916 (1984)) is shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
[0017]
The mutant enzyme is encoded by the following DNA sequence of the present invention, and is produced by expressing this DNA sequence in Escherichia coli or the like.
[0018]
<2> DNA sequence of the present invention and microorganisms holding the same
On the other hand, the DNA sequence of the present invention is a DNA sequence encoding the above-mentioned mutant enzyme, and feedback inhibition of phosphoenolpyruvate carboxylase by aspartate in a DNA fragment encoding phosphoenolpyruvate carboxylase of a microorganism belonging to the genus Escherichia. It has a mutation in the coding region that cancels.
[0019]
Specifically, in the DNA sequence encoding the phosphoenolpyruvate carboxylase having the mutations (1) to (4) above, for example, the base sequence of SEQ ID NO: 1 in the sequence listing,
i) a mutation in which GAA of base numbers 2111 to 2113 is converted to AAA or AAG;
ii) a mutation that converts CGCs of base numbers 902 to 904 to CAT or CAC, and GAA of 905 to 907 to AAA or AAG, respectively.
iii) TCT of base numbers 1100 to 1102 is TTT or TTC, GAA of 1103 to 1105 is AAA or AAG, ATG of 1889 to 1891 is ATT, ATC or ATA, and GAA of 2648 to 2650 is AAA or AAG Mutation to convert each
iv) Mutations in which 2837-2839 GCG is converted to ACT, ACC, ACA, or ACG
Or a DNA sequence having any of the following.
[0020]
Such a mutant gene is obtained by mutating a recombinant DNA obtained by linking a phosphoenolpyruvate carboxylase gene having a wild-type enzyme gene or other mutation and a vector DNA suitable for the host, It is obtained by screening from the transformant according to 1. Alternatively, a microorganism that produces a wild-type enzyme may be mutated to create a mutant strain that produces the mutant enzyme, and then a mutant gene may be screened from the mutant strain. Hydroxylamine or the like is used for the mutation treatment of the recombinant DNA. In addition, when the microorganism itself is mutated, a drug or method usually used for artificial mutation may be used.
[0021]
The phosphoenolpyruvate carboxylase gene having the above wild-type enzyme gene or other mutation may be any gene that encodes phosphoenolpyruvate carboxylase of a microorganism belonging to the genus Escherichia, and its base sequence has been determined. Preferably it has been cloned. If not cloned, a DNA fragment containing the gene can be amplified and isolated using PCR or the like and then cloned using an appropriate vector.
[0022]
As the above gene, for example, an E. coli gene (Fujita, N., Miwa, T., Ishijima, S., Izui, K. and Katsuki, HJ Biochem. 95, 909- 916 (1984)). The sequence of the coding region of this gene is as shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing (base numbers 239 to 2890).
[0023]
Screening of a host having a mutated gene can be performed using an aspartic acid analog compound. The analog compound preferably has the following properties. That is, it exhibits a growth inhibitory action against microorganisms belonging to the genus Escherichia that produce wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase, which is restored by the presence of L-glutamic acid or L-aspartic acid, Inhibits enol pyruvate carboxylase activity.
[0024]
Aspartic acid can be obtained by selecting an analog compound as described above as an indicator of inhibition of growth of a microorganism belonging to the genus Escherichia that produces a wild-type enzyme, for example, Escherichia coli HB101, and screening for a mutant strain resistant to the analog compound. It is highly possible to obtain a host that produces phosphoenolpyruvate carboxylase in which feedback inhibition by is released.
[0025]
As a general structure of inhibitors of phosphoenolpyruvate carboxylase, it has been proposed that it is essential to adopt a C4 dicarboxylic acid structure. From such a viewpoint, the present inventor screened various compounds. Escherichia coli HB101 is pre-cultured in LB medium, DL-2-amino-4-phosphonobutyric acid, meso-2,3-dibromosuccinic acid bromosuccinate, 2,2-difluorosuccinic acid, 3-bromopyruvic acid, α -Ketobutyric acid, α-ketoadipic acid, DL-threo-β-hydroxyaspartic acid, L-aspartic acid-β-methyl ester, α-methyl-DL-aspartic acid, 2,3-diaminosuccinic acid or aspartic acid-β -Main culture in M9 medium containing hydrazide (
[0026]
Furthermore, when these compounds are present at growth inhibitory concentrations, addition of nucleic acids (uridine,
[0027]
As a result, three compounds, 3-bromopyruvic acid (3BP) (Chemical formula 1), aspartic acid-β-hydrazide (AHY) (Chemical formula 2), DL-threo-β-hydroxyaspartic acid (βHA) (Chemical formula 3) ) Was selected.
[0028]
[Chemical 1]
[0029]
[Chemical formula 2]
[0030]
[Chemical 3]
[0031]
The growth inhibition of E. coli by these analog compounds is shown in FIGS. Furthermore, the growth recovery of Escherichia coli when the inhibitory recovery substance is added alone or as a mixture of two or three types is shown in FIGS. As a control, FIG. 7 shows the growth when an inhibitory recovery substance was added in the absence of the inhibitory substance. In FIGS. 4 to 7,
[0032]
Furthermore, activity inhibition by analog compounds against phosphoenolpyruvate carboxylase was examined. The enzyme activity was measured according to the method described in Yoshinaga, T., Izui, K. and Katsuki, H., J. Biochem., 68, 747-750 (1970).
[0033]
Escherichia coli HB101 cultured in LB medium was crushed, the suspension was centrifuged, and the supernatant was used as a crude enzyme solution. Measurement of enzyme activity affects activity in a measurement system containing 2 mM potassium phosphoenolpyruvate, 0.1 mM NADH, 0.1 M tris-acetic acid (pH 8.5), 1.5 U malate dehydrogenase, and crude enzyme. This was done by measuring the decrease in absorbance at 340 nm in the presence of acetyl coenzyme A, known to be present, at a concentration of 0.1 mM. The results are shown in FIG.
[0034]
From the above results, it is clear that the above three analog compounds inhibit the growth of Escherichia coli and cannot recover this inhibition by nucleic acid alone, but can recover the inhibition by addition of glutamic acid or aspartic acid group amino acids. Therefore, these analog compounds were presumed to be selective inhibitors of phosphoenolpyruvate carboxylase. In the present invention, as shown in the examples described later, these three compounds were used to successfully select E. coli that produces mutant phosphoenolpyruvate carboxylase.
[0035]
By screening a transformant having the target mutant enzyme gene using the above compound and recovering the recombinant DNA, the mutant enzyme gene can be obtained. When the microorganism itself is mutated, the above compound is used to screen for a mutant strain having the target mutant enzyme gene, and a DNA fragment containing the target mutant enzyme gene is isolated from the strain, When ligated to an appropriate vector, the mutant enzyme gene can be obtained.
[0036]
A mutant enzyme can be produced by expressing a DNA fragment encoding a phosphoenolpyruvate carboxylase having a mutation introduced in this manner, using an appropriate host-vector system. Moreover, even if it transforms by incorporating the DNA fragment of this invention in host chromosomal DNA, the target mutant enzyme can be produced.
[0037]
Examples of the host include microorganisms belonging to the genus Escherichia, such as Escherichia coli and coryneform bacteria. Coryneform bacteria have been classified as Corynebacterium, traditionally Brevibacterium, but are now integrated as Corynebacterium, and Brevi, which is closely related to Corynebacterium. Contains bacteria belonging to the genus Bacteria. A host suitable for amino acid production will be described later.
[0038]
On the other hand, as the vector DNA, a plasmid vector is preferable, and a vector capable of autonomous replication in a host cell is preferable. When the host is Escherichia coli, examples thereof include pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG399, RSF1010 and the like. In addition, phage DNA vectors can also be used.
[0039]
Moreover, the vector which can be used when a host is coryneform bacteria, and the host holding it are illustrated below. The deposit number of the international depository is shown in parentheses.
[0040]
[0041]
These vectors are obtained from the deposited microorganism as follows. Cells collected in the logarithmic growth phase are lysed using lysozyme and SDS, centrifuged at 30000 × g, polyethylene glycol is added to the supernatant obtained from the lysate, and cesium chloride-ethidium bromide equilibrium density gradient centrifugation. Separate and purify by separation.
[0042]
In order to transform Escherichia coli with a recombinant vector obtained by inserting the DNA sequence of the present invention into the above vector, for example, a method in which cells are treated with calcium chloride to increase DNA permeability (Mandel, M. and Higa, A., J. Mol. Biol., 53, 159 (1977)), and the like can be used.
[0043]
Coryneform bacteria can also be transformed by treating the cells with calcium chloride or by incorporating the cells at a specific growth stage in which the cells can take up DNA (related to Bacillus subtilis by Duncan, CH et al.). Report). Furthermore, it can be incorporated into bacterial cells by shaping protoplasts or spheroplasts of DNA receptors that readily incorporate platimide DNA. These are known for Bacillus subtilis, Actinomyces and yeast (Chang, S. et al. Molec. Gen. Genet., 168, 111, (1979), Bibb et al., Nature, 274, 398. (1978), Hinnnen, A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)). In addition, JP-A-2-207791 discloses a method for transforming coryneform bacteria.
[0044]
In order to express the DNA sequence of the present invention in the above-mentioned host, a promoter that works efficiently in microorganisms such as lac, trp, and PL may be used, and the DNA sequence of the present invention can be used as a promoter of the phosphoenolpyruvate carboxylase gene. If included, this may be used as it is. In addition, when a coryneform bacterium is used as a host, a known trp promoter derived from a bacterium belonging to the genus Brevibacterium (Japanese Patent Laid-Open No. 62-244382) or the like can also be used.
[0045]
In addition, as described above, the DNA sequence of the present invention inserted into a vector DNA capable of autonomous replication may be introduced into the host and retained as a plasmid in the host, but the DNA sequence of the present invention may be transposon (Berg DE and Berg, CM, Bio / Technol., 1,417 (1983)), Mu phage (Japanese Patent Laid-Open No. 2-109985) or homologous recombination (Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Lab. (1972)). It may be integrated into the chromosome of the microorganism by a method. In order to incorporate the DNA of the present invention into the chromosome of coryneform bacteria, a temperature sensitive plasmid disclosed in JP-A-5-7491 can be used.
[0046]
When a microorganism transformed with the DNA sequence of the present invention is cultured as described above and this DNA sequence is expressed, a mutant enzyme is obtained. Whether the mutant enzyme thus obtained has been released from feedback inhibition by aspartic acid can be clarified by measuring the activity by adding aspartic acid to the enzyme reaction system.
[0047]
In addition, since the DNA sequence of the present invention encodes a mutant enzyme in which feedback inhibition by aspartic acid has been released, a microorganism having this DNA sequence can be used as an amino acid of aspartic acid group or glutamic acid group as shown below. It can be used for efficient fermentation production.
[0048]
Escherichia coli AJ 12907, AJ 12908, AJ 12909, and AJ 12910, which retain the mutant enzyme gene obtained in the examples described later, were founded on August 3, 1993 at the Institute of Biotechnology, Institute of Industrial Science and Technology (zip code). 305, Ibaraki Prefecture Tsukuba City East 1-3-3, respectively) are deposited in order as FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P-13777, FERM P-13777, respectively, July 11, 1994 In addition, this original deposit was transferred to an international deposit based on the Budapest Treaty and deposited as deposit numbers FERM BP-4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736, and FERM BP-4737.
[0049]
<3> Amino acid production method
An amino acid can be produced by culturing a microorganism retaining the DNA sequence of the present invention in a suitable medium and separating the resulting amino acid. Examples of such amino acids include L-lysine, L-threonine, L-methionine, L-isoleucine, L-glutamic acid, L-arginine, and L-proline.
[0050]
Examples of suitable hosts and culture methods for introducing the DNA sequence of the present invention and using them for the production of each amino acid are shown below.
[0051]
(1) A suitable host for the method for producing an amino acid of the present invention
(i) Suitable host for L-lysine production
Examples of a host used for producing L-lysine according to the present invention include Escherichia bacteria, preferably L-lysine-producing Escherichia coli. Specifically, mutants having resistance to lysine analogs can be exemplified. This lysine analog is such that it inhibits the growth of Escherichia microorganisms, but its suppression is such that it is released in whole or in part if L-lysine coexists in the medium. Examples include oxalysine, lysine hydroxamate, S- (2-aminoethyl) -cysteine (hereinafter abbreviated as “AEC”), γ-methyllysine, α-chlorocaprolactam, and the like. Mutant strains resistant to these lysine analogs can be obtained by subjecting Escherichia microorganisms to normal artificial mutation procedures. Specific examples of the strain used for the production of L-lysine include Escherichia coli AJ11442 (deposited as FERM P-5084; see JP-A-56-18596, page 471, lower left column).
[0052]
On the other hand, various artificial mutants of coryneform bacteria are used as L-lysine-producing bacteria, and these can be used in the present invention. Examples of such artificial mutants are as follows. AEC resistant mutants, mutants that require amino acids such as L-homoserine for their growth (Japanese Patent Publication No. 48-28078, Japanese Patent Publication No. 56-6499), AEC resistant, L-leucine, L- Mutants requiring amino acids such as homoserine, L-proline, L-serine, L-arginine, L-alanine, L-valine (US Pat. Nos. 3,708,395 and 3,825,472), DL-α-amino-ε-caprolactam , Α-amino-lauryl lactam, quinoid, L-lysine production mutants resistant to N-lauroylleucine, oxaloacetate decarboxylase (decarboxylase) or L-lysine production resistant to respiratory enzyme inhibitors Mutants (JP 50-53588, JP 50-31093, JP 52-102498, JP 53-8608) No. 55-9783, No. 55-9759, No. 56-32995, No. 56-39778, No. 53-43591, No. 53-1833), Inositol Or L-lysine production mutants requiring acetic acid (JP 55-9784, JP 56-8692), L-lysine production mutants having sensitivity to fluoropyruvic acid or a temperature of 34 ° C. or higher (JP-A-55-9783, JP-A-53-86090), a Brevibacterium or Corynebacterium mutant that exhibits resistance to ethylene glycol and produces L-lysine (see US Patent Application No. 333455) .
[0053]
Specific coryneform bacteria used for lysine production include the following.
Brevibacterium lactofermentum AJ 12031 (FERM BP-277) Refer to JP-A-60-62994, page 525, lower left column
Brevibacterium lactofermentum ATCC39134 Refer to JP-A-60-62994, page 473, lower right column
Brevibacterium lactofermentum AJ 3463 (FERM P-1987) Japanese Patent Publication No. 51-34477
Further, the following wild strains of coryneform bacteria can also be used in the present invention.
[0054]
[0055]
(ii) Suitable host for L-threonine production
Escherichia coli B-3996 (RIA 1867) Refer to Japanese Patent Publication No. 3-501682
Escherichia coli AJ 12349 (FERM P-9574) JP-A-2-458, page 887, upper left column
Escherichia coli AJ 12351 (FERM P-9576) JP-A-2-458, page 887, lower right column
Escherichia coli AJ 12352 (FERM P-9577) Refer to JP-A-2-458, page 888, upper left column.
Escherichia coli AJ 11332 (FERM P-4898) Refer to JP-A-2-458, page 889, upper left column.
Escherichia coli AJ 12350 (FERM P-9575) Refer to JP-A-2-458, page 889, upper left column.
Escherichia coli AJ 12353 (FERM P-9578) JP-A-2-458, page 889, upper right column
Escherichia coli AJ 12358 (FERM P-9764) Refer to JP-A-2-458, page 890, upper left column
Escherichia coli AJ 12359 (FERM P-9765) Japanese Laid-Open Patent Publication No. 2-458, page 890, upper left column
Escherichia coli AJ 11334 (FERM P-4900) Japanese Patent Publication No. 1-29559, page 201, column 6
Escherichia coli AJ 11333 (FERM P-4899) See Japanese Patent Publication No. 1-29559, page 201, column 6
Escherichia coli AJ 11335 (FERM P-4901) Japanese Patent Publication No. 1-29559, page 202,
[0056]
Examples of coryneform bacteria include the following strains:
Brevibacterium lactofermentum AJ 11188 (FERM P-4190) Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-87788, page 473, upper right column
Corynebacterium glutamicum AJ 11682 (FERM BP-118) Japanese Patent Publication No. 2-31956, page 230, column 8
Brevibacterium flavum AJ 11683 (FERM BP-119) See Japanese Patent Publication No. 2-31956, p.231,
[0057]
(iii) Suitable host for L-methionine production
The following strains are mentioned for L-methionine production.
Escherichia coli AJ 11457 (FERM P-5175) Japanese Patent Laid-Open No. 56-35992, page 552, upper right column
Escherichia coli AJ 11458 (FERM P-5176) Japanese Patent Laid-Open No. 56-35992, page 552, upper right column
Escherichia coli AJ 11459 (FERM P-5177) Japanese Patent Laid-Open No. 56-35992, page 552, upper right column
Escherichia coli AJ 11539 (FERM P-5479) Japanese Laid-Open Patent Publication No. 56-144092, page 435, lower left column
Escherichia coli AJ 11540 (FERM P-5480) Japanese Patent Laid-Open Publication No. 56-144092, page 435, lower left column
Escherichia coli AJ 11541 (FERM P-5481) Japanese Laid-Open Patent Publication No. 56-144092, page 435, lower left column
Escherichia coli AJ 11542 (FERM P-5482) Japanese Patent Laid-Open No. 56-144092, page 435, lower left column
[0058]
(iv) A suitable host for the production of L-aspartic acid
The following strains can be mentioned for the production of L-aspartic acid.
Brevibacterium flavum AJ 3859 (FERM P-2799) JP 51-61689, page 524, upper left column
Brevibacterium lactofermentum AJ 3860 (FERM P-2800) JP 51-61689, page 524, upper left column
Corynebacterium acetoacidophilum AJ 3877 (FERM P-2803) See JP-A-51-61689, page 524, upper left column
Corynebacterium glutamicum AJ 3876 (FERM P-2802) JP 51-61689, page 524, upper left column
[0059]
(v) Suitable host for L-isoleucine production
Examples of Escherichia bacteria include Escherichia coli KX141 (VKPM-B4781) (see JP-A-4-330275, paragraph 45), and examples of coryneform bacteria include Brevibacterium lactofermentum AJ 12404 (FERM P-10141) ( JP-A-2-42988, page 603, lower left column) and Brevibacterium flavum AJ 12405 (FERM P-10142) (see JP-A-2-42988, page 524, lower left column).
[0060]
(vi) A suitable host for the production of L-glutamic acid
Examples of the Escherichia bacterium include the following strains.
Escherichia coli AJ 12628 (FERM P-12380) '93 See French Patent Publication No. 2 680 178
Escherichia coli AJ 12624 (FERM P-12379) See '93 French Patent Publication No. 2 680 178
[0061]
Examples of coryneform bacteria include the following strains:
Brevibacterium lactofermentum AJ 12745 (FERM BP-2922) Refer to JP-A-3-49690, page 561, lower right column
Brevibacterium lactofermentum AJ 12746 (FERM BP-2923) See JP-A-3-49690, page 562, upper left column
Brevibacterium lactofermentum AJ 12747 (FERM BP-2924) Refer to JP-A-3-49690, page 562, upper left column
Brevibacterium lactofermentum AJ 12748 (FERM BP-2925) Refer to JP-A-3-49690, page 562, upper left column
Brevibacterium flavum ATCC 14067 See Table 1 on
Corynebacterium glutamicum ATCC 21492 See Table 1 on
[0062]
(vii) A suitable host for L-arginine production
Examples of the Escherichia bacterium include the following strains.
Escherichia coli AJ 11593 (FERM P-5616) Japanese Patent Laid-Open No. 57-5693, page 468, upper left column
Escherichia coli AJ 11594 (FERM P-5617) Japanese Patent Laid-Open No. 57-5693, page 468, upper right column
[0063]
Examples of coryneform bacteria include the following strains:
Brevibacterium flavum AJ 12144 (FERM P-7642) Japanese Patent Publication No. 5-27388, page 174,
Corynebacterium glutamicum AJ 12145 (FERM P-7643) Japanese Patent Publication No. 5-27388, page 174,
Brevibacterium flavum ATCC 21493 See Table 1 on
Corynebacterium glutamicum ATCC 21659 See Table 1 on
[0064]
(viii) A suitable host for producing L-proline
Examples of the Escherichia bacterium include the following strains.
Escherichia coli AJ 11543 (FERM P-5483) Japanese Patent Laid-Open Publication No. 56-144093, page 435, lower left column
Escherichia coli AJ 11544 (FERM P-5484) Japanese Patent Laid-Open No. 56-144093, page 435, lower left column
[0065]
Examples of coryneform bacteria include the following strains:
Brevibacterium lactofermentum AJ 11225 (FERM P-4370) See JP-A-60-87788, page 473, upper left column
Brevibacterium flavum AJ 11512 (FERM P-5332) Japanese Patent Publication No. 62-36679, page 185,
Brevibacterium flavum AJ 11513 (FERM P-5333) Japanese Patent Publication No. 62-36679, page 185,
Brevibacterium flavum AJ 11514 (FERM P-5334) Japanese Patent Publication No. 62-36679, page 185,
Corynebacterium glutamicum AJ 11522 (FERM P-5342) Japanese Patent Publication No. 62-36679, page 185,
Corynebacterium glutamicum AJ 11523 (FERM P-5343) Japanese Patent Publication No. 62-36679, page 185,
[0066]
(2) Culture method
The method for culturing the host is not particularly different from the conventional method for culturing amino acid-producing bacteria. That is, the medium is a normal medium containing a carbon source, a nitrogen source, inorganic ions, and, if necessary, organic micronutrients such as amino acids and vitamins.
[0067]
As the carbon source, glucose, sucrose, lactose and the like, starch hydrolyzate containing them, whey, molasses and the like are used. As the nitrogen source, ammonia gas, aqueous ammonia, ammonium salt and the like can be used. When an auxotrophic mutant such as an amino acid is used as a host, it is necessary to appropriately add nutrients such as an amino acid required by the strain to the medium. Table 1 shows an example of a medium for producing lysine as a medium used for amino acid production. In addition, calcium carbonate is added to other components after sterilizing separately.
[0068]
[Table 1]
[0069]
Culturing is performed until the production and accumulation of amino acids is substantially stopped while appropriately adjusting the pH and temperature of the medium under aerobic conditions. In order to collect amino acids accumulated in the culture medium in this way, ordinary methods can be applied.
[0070]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0071]
[Example 1]
Acquisition of mutant phosphoenolpyruvate carboxylase gene
Using the plasmid pS2 obtained by inserting the phosphoenolpyruvate carboxylase gene, which has already been cloned and whose nucleotide sequence has been determined, into the SalI site of the vector plasmid pBR322, a mutant gene was prepared. pS2 has an ampicillin resistance gene as a drug resistance marker gene (Sabe, H. et al., Gene, 31, 279-283, 1984).
[0072]
pS2DNA was treated with hydroxylamine treatment solution (20 μg / ml pS2DNA, 0.05 M sodium phosphate (pH 6.0), 1 mM EDTA, 0.4 M hydroxylamine) at 75 ° C. for 2 hours. Since hydroxylamine treatment is affected by pH, 80 μl of 1 M hydroxylamine / HCl, 1 mM EDTA solution adjusted to pH 6.0 with sodium hydroxide, 0.1 M sodium phosphate (pH 6.0), 1
[0073]
The above conditions are such that when Escherichia coli HB101 is transformed with pS2 after the treatment, the viability of the transformant in the ampicillin-containing medium is 0.2% before the treatment.
[0074]
Escherichia coli HB101 was transformed with pS2 treated with hydroxylamine and applied to a plate medium containing ampicillin to obtain transformants of about 10,000 colonies. These are suspended in a liquid medium, and any one of 3-bromopyruvic acid (3BP), aspartic acid-β-hydrazide (AHY), DL-threo-β-hydroxyaspartic acid (βHA), which is an analog compound of aspartic acid, is added. 10 per plate of medium containing a plate around the minimum inhibitory concentration. Three -10 Five The colonies were applied so as to be individual, and colonies to grow were selected.
[0075]
According to the method described in The Journal of Biochemistry, Vol.67, No.4, 1970, the phosphoenolpyruvate carboxylase produced by each was roughly purified from 100 analog compound resistant strains thus obtained, The inhibition of the activity was investigated. The enzyme activity was measured as described above.
[0076]
Furthermore, a plasmid was isolated from a strain that produced a mutant enzyme whose activity was not inhibited by the analog compound, and Escherichia coli PCR1 (Sabe, H. et al., Gene, 31, 279), which is a phosphoenolpyruvate carboxylase-deficient mutant. -283, 1984) and confirmed that a mutant enzyme was produced.
[0077]
In this way, 5 strains of transformant genes were obtained. As a result of determining the base sequences of these genes, the two strains had the same mutation, and four mutant genes were obtained. The transformants retaining these were designated as AJ 12907, AJ 12908, AJ 12909, and AJ 12910. On August 3, 1993, the Institute of Biotechnology, Tsukuba, Japan 1-3, Shitohigashi) are deposited in order as FERM P-13774, FERM P-13775, FERM P-13777, FERM P-13777, respectively. It has been transferred to the international deposit under the Budapest Treaty and has been deposited under the accession numbers FERM BP-4734, FERM BP-4735, FERM BP-4736 and FERM BP-4737. Moreover, these retained plasmids were named pBP5, pHA19, pBP122, and pR6, respectively. Table 2 shows the mutations possessed by the phosphoenolpyruvate carboxylase gene contained in each plasmid. The numbers in the table represent nucleotide numbers or amino acid numbers in SEQ ID NO: 1.
[0078]
[Table 2]
[0079]
AJ 12907 and AJ 12909 are mediums containing 500 μg / ml 3BP, AJ 12908 is a medium containing 1000 μg / ml βHA, and AJ 12910 is selected from a medium containing 500 μg / ml AHY. It is.
[0080]
[Example 2]
Mutant phosphoenolpyruvate carboxylase
The phosphoenolpyruvate carboxylase produced by the four transformants was examined for its sensitivity to aspartate. Since these strains are deficient in the host-derived phosphoenolpyruvate carboxylase gene, the produced phosphoenolpyruvate carboxylase is derived from a plasmid.
[0081]
Sensitivity to aspartic acid was examined according to a known method (Yoshinaga, T., Izui, K and Katsuki, HJ Biochem., 68, 747-750 (1970)). That is, the activity of an enzyme produced by Escherichia coli that holds each transformant and pS2 in the presence of acetyl coenzyme A, which is known to affect the activity, at a concentration of 0.1 mM or 1 mM in the activity measurement system. As a result, the sensitivity to aspartic acid was measured as shown in FIGS.
[0082]
From this result, it is clear that when the aspartic acid concentration is high, the wild-type enzyme loses its activity, whereas the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention substantially keeps its activity. is there.
[0083]
[Example 3]
Fermentative production of L-threonine by Escherichia coli introduced with a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase
As a threonine-producing bacterium of Escherichia coli, B-3996 strain (Japanese Patent Publication No. 3-501682) is currently known and has the highest production capacity. Therefore, in evaluating mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, B-3996 was used as a host. This B-3996 strain has been deposited with the Research Institute for Genetics and Industrial Microorganism Breeding under the registration number RIA 1867. In addition, pBP5 was selected as the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase to be evaluated and used for the experiment.
[0084]
Plasmid pBP5 having a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli B-3996 was introduced by the method of Hanahan (J. Mol. Biol., Vol. 106, p577, (1983)), and the transformant was isolated. did. As a control, Escherichia coli B-3996 was similarly transformed with pS2, which is a plasmid expressing the wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase gene.
[0085]
Escherichia coli B-3996 and its transformant were inoculated into a 500 ml Sakaguchi flask into which 20 ml of the medium having the composition shown in Table 3 had been injected, and cultured at 37 ° C. for 40 hours, and the amount of L-threonine produced was examined. The results shown in Table 4 were obtained. The medium is glucose and MgSO. Four ・ 7H 2 OCO and other components for 2 minutes, adjusted to pH 7.0 with KOH, autoclaved at 115 ° C. for 10 minutes, mixed, and then sterilized CaCO Three Was added at 30 g / l.
[0086]
[Table 3]
[0087]
[Table 4]
[0088]
As is apparent from the results, Escherichia coli B-3996 holding the mutant enzyme expression plasmid having the DNA sequence of the present invention is more threonine than Escherichia coli B-3996 holding the plasmid expressing the wild type enzyme. Productivity improved.
[0089]
[Example 4]
Fermentative production of L-glutamic acid by Escherichia coli introduced with a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase
As an Escherichia coli glutamic acid-producing bacterium, Escherichia coli AJ12628 disclosed in JP-A-4-11461 has the highest production capacity among currently known. Therefore, in evaluating mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, it was decided to use AJ12628 as a host. The AJ 12628 strain has been deposited with the registration number FERM BP-3853 at the Institute of Biotechnology, Ministry of International Trade and Industry. In addition, pBP5 was selected as the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase to be evaluated and used for the experiment.
[0090]
Plasmid pBP5 having a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli AJ 12628 was introduced by the method of Hanahan (J. Mol. Biol., Vol. 106, p577, (1983)), and the transformant was isolated. . Similarly, a transformant of Escherichia coli AJ 12628 by pS2 was isolated.
[0091]
Plasmid pBP5 having a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase in Escherichia coli AJ 12628 was introduced by the method of Hanahan (J. Mol. Biol., Vol. 106, p577, (1983)), and the transformant was isolated. . Similarly, a transformant of Escherichia coli AJ 12628 by pS2 was isolated.
[0092]
And sterilized CaCO after mixing them Three Was added at 30 g / l.
[0093]
[Table 5]
[0094]
[Table 6]
[0095]
As is clear from this result, Escherichia coli AJ 12628 holding the mutant enzyme expression plasmid having the DNA sequence of the present invention has a higher glutamate producing ability than Escherichia coli AJ 12628 holding the plasmid expressing the wild type enzyme. Improved.
[0096]
[Example 5]
Production of lysine by coryneform bacteria introduced with mutant phosphoenolpyruvate carboxylase.
In order to introduce and express a mutant gene in coryneform bacteria, a promoter derived from the genus Brevibacterium was obtained and linked to the mutant gene to prepare an expression plasmid. Further, this was introduced into a bacterium belonging to the genus Brevibacterium to produce L-lysine.
[0097]
<1> Acquisition of Brevibacterium genus Aspartokinase (AK) gene Chromosomal DNA was prepared from Brevibacterium lactofermentum (Corynebacterium glutamicum) wild strain ATCC13869 according to a conventional method. The AK gene was amplified from the chromosomal DNA by PCR (polymerase chain reaction; White, TJ et al .; see Trends Genet., 5,185 (1989)). DNA primers used for amplification are based on sequences known in Corynebacterium glutamicum (see Molecular Microbiology (1991) 5 (5), 1197-1204, Mol. Gen. Genet. (1990) 224, 317-324). In order to amplify an approximately 1643 bp region encoding the AK gene, a 23-mer oligonucleotide (SEQ ID NO: 2) and a 21-mer oligonucleotide (SEQ ID NO: 3) were synthesized.
[0098]
DNA was synthesized according to a conventional method using a DNA synthesizer model 380B manufactured by Applied Biosystems and using the phosphoramidite method (see Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859). For PCR reaction, DNA thermal cycler PJ2000 type manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd. was used, and Taq DNA polymerase was used for gene amplification according to the method specified by the supplier.
[0099]
After confirming the amplified 1643 kb gene fragment by agarose gel electrophoresis, the fragment cut out from the gel was purified by a conventional method, and restriction enzymes NruI (Takara Shuzo Co., Ltd.) and EcoRI (Takara Shuzo Co., Ltd.) were used. Disconnected. PHSG399 (see Takeshita, S. et al .; Gene (1987), 61, 63-74) was used as a gene fragment cloning vector. pHSG399 was cleaved with restriction enzyme SmaI (Takara Shuzo Co., Ltd.) and restriction enzyme EcoRI and connected to the amplified AK gene fragment.
[0100]
DNA was connected by a designated method using a DNA ligation kit (Takara Shuzo Co., Ltd.). In this manner, a plasmid in which the AK gene fragment amplified from the Brevibacterium chromosome was connected to pHSG399 was prepared. A plasmid having the AK gene derived from the wild-type ATCC 13869 was named p399AKY.
[0101]
<2> Determination of nucleotide sequence of AK gene of Brevibacterium lactofermentum
AK plasmid p399AKY was prepared and the nucleotide sequence of the AK gene was determined. The nucleotide sequence was determined by the method of Sanger et al. (F. Sanger et al: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977), etc.). The results are shown in SEQ ID NO: 4 in the sequence listing. The DNA fragment has two open reading frames, which correspond to the α and β subunits of AK, respectively. The amino acid sequences corresponding to each open reading frame are shown in SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5.
[0102]
<3> Preparation of phosphoenolpyruvate carboxylase expression type plasmid
From the plasmid pS2 carrying the wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase gene and the obtained mutant phosphoenolpyruvate carboxylase gene pBP5 from the plasmid pBP5, about 4.4 kb of SalI containing the phosphoenolpyruvate carboxylase gene is obtained. The fragment was extracted and introduced into the SalI site of plasmid vector pHSG399, which is widely used in E. coli. The prepared plasmid was named pHS2 for the wild type and pHBP5 for the mutant type.
[0103]
In order to make pHS2 and pHBP5 into plasmids that are expressed in Brevibacterium, a promoter that functions in Brevibacterium and an origin of replication of the plasmid were introduced. As the promoter, a gene fragment including the first NruI site to the 207th ApaLI site of the base sequence, which is presumed to be the promoter region of the cloned AK gene, is extracted from p399AKY, and about the structural genes of pHS2 and pHBP5. It was inserted into the
[0104]
Furthermore, a gene fragment that enables autonomous growth of the plasmid in Brevibacterium, that is, a plasmid replication origin, was introduced into a site on the vector. The gene fragment containing the origin of replication of the plasmid is the Brevibacterium vector pHC4 (see paragraph No. 10 of JP-A-5-7491, Escherichia coli AJ 12036 carrying the plasmid is the Institute of Microbiological Engineering, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology) The restriction enzyme sites at both ends were modified to PstI sites by introducing linkers.
[0105]
This fragment was introduced into a PstI site, which is a vector portion, of a plasmid to which a Brevibacterium promoter was added. The constructed expression type phosphoenolpyruvate carboxylase plasmid was named pHS2B, the wild-type phosphoenolpyruvate carboxylase plasmid derived from pS2, and the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase plasmid derived from pBP5 was named pHBP5B.
[0106]
<4> Production of L-lysine using phosphoenolpyruvate carboxylase expression type plasmid
The prepared pHS2B and pHBP5B were each introduced into AJ 3463 (see Japanese Patent Publication No. 51-34477), which is a Brevibacterium lactofermentum L-lysine producing bacterium. The gene was introduced by a transformation method using an electric pulse (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-207791). The host and transformant were subjected to shaking culture at 31.5 ° C. for 72 hours in a lysine production medium having the composition shown in Table 7. The medium is CaCO among the components listed in the table. Three Was added to 1 liter of water, adjusted to pH 8.0 with KOH, autoclaved at 115 ° C for 15 minutes, and then dry-heat sterilized CaCO Three Was further added. Table 8 shows the amount of L-lysine accumulated in the culture medium.
[0107]
[Table 7]
[0108]
[Table 8]
[0109]
As shown in this result, Brevibacterium lactofermentum AJ 3463 holding the mutant enzyme expression plasmid having the DNA sequence of the present invention is Brevibacterium lactoferfer holding the plasmid expressing the wild type enzyme. The lysine production ability was improved over Mentum AJ 3463.
[0110]
【The invention's effect】
The DNA sequence of the present invention encodes a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase, and a microorganism that retains this DNA sequence produces the enzyme.
[0111]
Since the mutant phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention is not substantially inhibited in activity by aspartic acid, it can be used for fermentation production of amino acids whose biosynthesis is regulated by aspartic acid.
[0112]
[Sequence Listing]
[0113]
[0114]
[0115]
[0116]
[0117]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a graph showing growth inhibition by 3-bromopyruvic acid.
FIG. 2 is a graph showing growth inhibition by aspartic acid-β-hydrazide.
FIG. 3 is a diagram showing growth inhibition by DL-threo-β-hydroxyaspartic acid.
FIG. 4 is a graph showing the effect of an inhibitory recovery substance on 3-bromopyruvic acid.
FIG. 5 is a graph showing the effect of an inhibitory recovery substance on aspartic acid-β-hydrazide.
FIG. 6 is a graph showing the effect of an inhibitory recovery substance on DL-threo-β-hydroxyaspartic acid.
FIG. 7 shows the effect of growth recovery factors on growth.
FIG. 8 is a graph showing inhibition of a growth inhibitory substance on phosphoenolpyruvate carboxylase activity.
FIG. 9 shows inhibition of phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention by aspartic acid.
FIG. 10 shows inhibition of phosphoenolpyruvate carboxylase of the present invention by aspartic acid.
Claims (2)
(i)ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのN−末端から625番目のグルタミン酸をリジンに置換させる変異、
(ii)ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのN−末端から222番目のアルギニンをヒスチジンに、223番目のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異、
(iii)ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのN−末端から288番目のセリンをフェニルアラニンに、289番目のグルタミン酸をリジンに、551番目のメチオニンをイソロイシンに、804番目のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異、
(iv)ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのN−末端から867番目のアラニンをスレオニンに置換させる変異。 A phosphoenolpyruvate carboxylase derived from a microorganism belonging to the genus Escherichia , which has at least one mutation selected from the following mutations and encodes a mutant phosphoenolpyruvate carboxylase in which feedback inhibition by aspartic acid is released A microorganism belonging to the genus Escherichia or coryneform bacterium transformed with the DNA fragment to be incorporated into the chromosomal DNA, cultured in a suitable medium, from which L-lysine, L-threonine, L-methionine, L-isoleucine, A method for producing an amino acid, comprising separating an amino acid selected from L-glutamic acid, L-arginine and L-proline;
(I) a mutation that substitutes lysine for the 625-th glutamic acid from the N-terminus of phosphoenolpyruvate carboxylase;
(Ii) a mutation that replaces the 222nd arginine from the N-terminal of phosphoenolpyruvate carboxylase with histidine and the 223rd glutamic acid with lysine,
(Iii) a mutation for substituting the 288th serine from the N-terminus of phosphoenolpyruvate carboxylase with phenylalanine, the 289th glutamic acid with lysine, the 551st methionine with isoleucine, and the 804th glutamic acid with lysine;
(Iv) A mutation that substitutes threonine for the 867th alanine from the N-terminal of phosphoenolpyruvate carboxylase.
(i)ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのN−末端から625番目のグルタミン酸をリジンに置換させる変異、(I) a mutation that substitutes lysine for the 625-th glutamic acid from the N-terminal of phosphoenolpyruvate carboxylase;
(ii)ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのN−末端から222番目のアルギニンをヒスチジンに、223番目のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異、(Ii) a mutation for substituting the 222nd arginine from the N-terminus of phosphoenolpyruvate carboxylase with histidine and the 223rd glutamic acid with lysine,
(iii)ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのN−末端から288番目のセリンをフェニルアラニンに、289番目のグルタミン酸をリジンに、551番目のメチオニンをイソロイシンに、804番目のグルタミン酸をリジンに各々置換させる変異、(Iii) a mutation for substituting the 288th serine from the N-terminal of phosphoenolpyruvate carboxylase with phenylalanine, the 289th glutamic acid with lysine, the 551st methionine with isoleucine, and the 804th glutamic acid with lysine;
(iv)ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼのN−末端から867番目のアラニンをスレオニンに置換させる変異。(Iv) A mutation that substitutes threonine for the 867th alanine from the N-terminus of phosphoenolpyruvate carboxylase.
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