JP3582891B2 - Primer and DNA sequencing method using the same - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明はＤＮＡ塩基配列などの解析法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
従来、大きなＤＮＡ（例えば１０６ 塩基長）の塩基配列決定のために、まず ＤＮＡを酵素を用いて切断し、プラスミドなどのベクター中にクローニング手法を用いて目的断片を挿入し、これを大腸菌に注入し寒天培地で培養し、得られたコロニーを分別することにより断片化した目的ＤＮＡを分取していた。次いで分取したＤＮＡ断片を含むプラスミドを用いてＤＮＡ塩基配列決定をコロニーごとに行っていた。通常１回の塩基配列操作で決定できるＤＮＡ塩基長は３００〜 ５００塩基であり、１Ｍ（１０６ ）塩基の決定には２０００以上のプラスミドを解析する必要があった。また、コロニーを取ってきても同じＤＮＡ断片を含むコロニーを取る可能性もあり、６〜１０倍のコロニーを取る必要があった。
【０００３】
また、長いＤＮＡの解析法としてプライマウォーキング（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８，１７８７−１７９１， １９９２）が知られている。この方法はＤＮＡを端から４００塩基位ずつ決定していく方法である。すなわち、決定したＤＮＡ鎖の末端近傍の配列を持つオリゴマをプライマとして用いて配列決定を順次行う。この方法も１Ｍ塩基のＤＮＡを解析しようとすると２５００回の配列解析を行う必要があり、解析には数年を必要とした。
【０００４】
クローニングやウォーキングの煩雑性を解決するために、数種類のＤＮＡ制限酵素断片を混合物の状態で直接配列決定する方法も試みられている（ＤＮＡ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １， ２３１−２３７， １９９４）。これは、
（１）各ＤＮＡ制限酵素断片を認識するために既知配列オリゴマをＤＮＡ制限酵素
断片の末端にライゲーション反応で導入する工程、
（２）制限酵素切断部に導入した既知配列オリゴマとそれに続く１ないし３塩基の未知配列を認識できるプライマのセットを用いてシーケンシング反応を行う工
程
からなる。このプライマのセットは例えば、未知配列部分が３塩基なら６４通りの全ての配列の種類からなり、混合ＤＮＡ断片が１０程度であればクローニング等で各断片の分離を行うことなく配列決定できる。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】
このように大きなＤＮＡの塩基配列決定は従来非常に手間と時間のかかるプロセスからなっていた。更に制限酵素による切断断片のサイズや種類によってはクローニング操作でベクター中に挿入しにくいものも存在し、全塩基配列決定が困難となる場合もあり、新しい手法の開発が望まれていた。また、ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １， ２３１−２３７， １９９４ 記載のプライマセットを用い、混合ＤＮＡ断片から直接配列決定する方法が有望であるが、ライゲーションを用いて既知配列オリゴマを制限酵素切断部に導入する工程の効率が通常２ないし１０％と低いため、十分な感度が得られずに配列決定が難しいケースが多く、特別な高感度ＤＮＡ検出装置が必要であった。
【０００６】
【課題を解決するための手段】
ＤＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， １， ２３１−２３７， １９９４ 記載の方法ではプライマの結合しうる既知配列を導入するためにライゲーション反応を用いている。本発明ではライゲーションを行わずに既知配列を導入するために図１のようにターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ４を用いて試料ＤＮＡ１の制限酵素切断部２の ３′末端に単一塩基からなるポリヌクレオチド５、例えば、ポリＡを付加する工程を設けている。
【０００７】
導入した単一塩基に相補的なプライマ６を用いてポリメラーゼ反応を行うわけであるが、プライマの結合位置がＤＮＡ断片の制限酵素切断部に対し一義的に決定される必要がある。このため、プライマ６には単一塩基部分７に続く制限酵素切断部に相補的な配列８を連結させたものを利用する。
【０００８】
特に単一塩基部分７がＡあるいはＴでは相補鎖との結合がＧ，Ｃに比べ強固ではないため、たとえ試料ＤＮＡに導入した単一塩基ポリヌクレオチド５に対してプライマの７の位置がずれてハイブリダイズして制限酵素切断部２に対してプライマ６の末端部８が正確にハイブリダイズしなかったとしても、解離と再ハイブリダイゼーションがおきるので、いずれ試料ＤＮＡ１の制限酵素切断部２を基点として一義的にプライマ結合位置が決まるので都合が良い。
【０００９】
さらに本発明での特徴は、図２のように任意の単一塩基からなるポリヌクレオチド７と、このポリヌクレオチド７の３′末端に制限酵素切断部２に相補的な配列８と、それに続く任意の塩基の組合せの部位９を有する構造のＤＮＡポリメラーゼ反応用プライマ６を用いることで、複数の制限酵素切断ＤＮＡ断片が複数種共存するケースでも各ＤＮＡ断片の配列を各制限酵素切断部位から正確に決定できる点にある。
【００１０】
すなわち、プライマ６の任意の塩基組合せ部９と試料ＤＮＡ１の制限酵素切断部２に続く塩基部３とが完全に相補な場合のみ相補鎖合成１０が起きるが、１１のようにプライマの末端部分９が相補でないと末端部分が試料ＤＮＡから解離した形となり相補鎖合成は起きない。
【００１１】
本発明でのプライマ構造をまとめると図３のようになる。
【００１２】
本発明ではいかにして制限酵素切断部を正確に認識できるかが重要なポイントになる。プライマの制限酵素認識部８が短いと正確な認識が困難になるので利用できる制限酵素切断部８の塩基長が長いほど良い。４塩基認識制限酵素は平均 ２５６塩基に１か所の出現頻度があるので、１回のＤＮＡ配列決定で４００塩基程度しか配列決定ができないオートシーケンサを用いる上では都合が良いが、通常の５′末端突出型の制限酵素では利用できる３′末端部位の制限酵素切断部は最大でも１塩基しか残っていない。例えば、代表的な４塩基制限酵素Ｓａｕ３ＡＩでは利用できる塩基は残っていない。５′末端突出型の６塩基認識酵素でも切断後に利用できる塩基は少なく、例えば、Ｈｉｎｄ ＩＩＩでは利用できる塩基は１塩基しか残らない。
【００１３】
この点を本発明は、任意の単一塩基からなるポリヌクレオチドの３′末端に続く部分を３′突出端を形成する制限酵素切断部に相補的な配列とすることで解決している。例えば、３′末端突出型の４塩基認識酵素Ｎｌａ ＩＩＩ では切断後に３′末端が４塩基突出するので４塩基すべてが利用できる。また、同じく４塩基認識酵素Ｈｈａ Ｉ では切断後に３′末端が３塩基突出するので３塩基が利用できる。さらに、制限酵素切断部２に相補的な配列８とそれに続く任意の２塩基の組合せの部位９を用いることで既知配列部分が５ないし６塩基となるため、制限酵素切断部に対する正確なプライマのハイブリサイゼーションと配列決定ができる。
【００１４】
また、本発明では、制限酵素切断部の３′末端にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて単一塩基を重合導入する。このため、５′末端突出型の制限酵素切断部はターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼによる重合速度が遅くなる。ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて単一塩基を重合導入する点からも、３′突出端を形成する制限酵素で試料を切断するのが最も優れている。
【００１５】
しかし、３′突出端を形成する制限酵素の種類は少ない。この点から本発明では任意の単一塩基からなるポリヌクレオチドの３′末端に続く部分が平滑末端を形成する制限酵素切断部に相補的な配列を利用することで解決している。平滑末端を形成する制限酵素切断部でも反応速度は落ちるもののターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて単一塩基を重合導入することが可能であるので、プライマの制限酵素切断部に相補的な配列が十分長く得ることができれば利用することができる。
【００１６】
たとえば、４塩基認識の制限酵素では制限酵素切断部２に相補的なプライマ配列部分８には２塩基利用することができる。また、６塩基認識酵素では３塩基の利用が可能で、単一塩基からなるオリゴマ７に続く平滑末端型制限酵素認識部８を連結したプライマないし、制限酵素認識部に１塩基以上の任意配列部分９を付加したプライマを用いて試料ＤＮＡの特定の制限酵素切断部から配列決定する上で支障はない。
【００１７】
さらに、制限酵素による切断部位が５′末端突出型になる場合は、図４のようにあらかじめＤＮＡポリメラーゼを用いて制限酵素切断部のギャップ１２を１３のように埋め、平滑末端とすることで制限酵素切断部に結合するプライマ部位８の塩基長を確保することができる。一度平滑末端にしてしまえばターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ４を用いて１５のように単一塩基を重合導入することが可能であるので、反応操作は複雑になるものの広く一般的に使用されている５′突出端を形成するような制限酵素切断部１２の利用が可能になる。
【００１８】
【作用】
本発明に利用できるプライマの単一塩基部は６塩基長ないし２０塩基長が望ましい。制限酵素認識部が４塩基でその３′末端に任意の塩基長を連結する場合はこれだけで５塩基以上となる。このため単一塩基部がＡまたはＴでも単一塩基部７の塩基長はあまり長くする必要はない。このようなケースではプライマの総塩基長が１８塩基長停度で良く、単一塩基長は６ないし１５塩基で良い。制限酵素認識部とこれに続く任意の塩基部が短い場合はプライマのＴｍを上げるため長めの単一塩基部が必要になるが、ＡやＴでは２０塩基以上にしても効果の向上はあまり望めない。単一塩基部はＡ，Ｔ，ＣないしＧのいずれでも良いが、Ａ，Ｔの方が試料ＤＮＡに導入した単一塩基ポリヌクレオチド５（あるいは１５）に対してプライマの７の位置がずれてハイブリダイズして制限酵素切断部２あるいは １２に対してプライマ６が正確にハイブリダイズしなかったとしても、解離と再ハイブリダイゼーションが生じて、いずれ試料ＤＮＡ１の制限酵素切断部２あるいは１２を基点として一義的にプライマ結合位置が決まるので都合が良い。
【００１９】
単一塩基部がＧあるいはＣではＴｍが高いため、いったんずれてハイブリダイズしたプライマは、再度、解離して正確な位置にハイブリダイズしなおすことができないのであまり長くすることはできない。
【００２０】
単一塩基部がＧあるいはＣでは経験的に全プライマ長の半分以上にすることは避けるべきである。酵素切断部に相補的なプライマ配列は特異的なハイブリダイゼーションを維持するため単一塩基部位７とは異なる塩基で２塩基以上が必要になる。このような設計基準に基づき調製されたプライマはターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて試料ＤＮＡの制限酵素切断部の３′末端に単一塩基を重合導入した部位に正確にハイブリダイズすることができ、プライマの３′末端は試料ＤＮＡの制限酵素認識部の５′末端側に正確に一致する。このため、本発明のプライマを用いて試料ＤＮＡの特定の制限酵素末端から配列決定を行うことができる。
【００２１】
制限酵素切断部に相補的な配列に続く任意の塩基の組合せ部は１塩基以上なるべく長い方が複数の制限酵素切断部を混合状態のままで配列決定する上で有利であるが、プライマセットとしていろいろな種類の任意配列をそろえる必要があるので、図３に示すように２ないし４塩基が実用上好ましい。もちろん制限酵素切断部の一方が固定されたり、両端が異なる酵素の切断物である場合などは、任意配列部がなくても有効に配列決定することができる。任意配列部９が２塩基で １６種，３塩基で６４種，４塩基で２５６種となる。
【００２２】
本プライマの利用法としては一定長の配列を決定した部分から特定の制限酵素切断部を選択し、選択した制限酵素切断部から再度本プライマを用いて配列決定するプライマウォーキングに応用することができる。この場合は配列の分かった部分から制限酵素切断部とそれに続く任意配列部分を選択できるので、すべての任意配列のプライマをそろえる必要はなく、任意部位が４塩基でも１００種程度そろえておけば実用上問題ない。２塩基ないし３塩基の任意配列を持つプライマでもきわめて有効である。このような設計基準に基づき調製されたプライマは、任意配列部分の効果により複数の制限酵素切断部を混合状態のままで配列決定することができる。また、前述のプライマウォーキングに特に有効である。
【００２３】
【実施例】
（実施例１）
５′突出端型制限酵素を用いた本発明の一実施例を、試料としてλファージ ＤＮＡ（４８Ｋｂ）のＨｉｎｄ ＩＩＩ分解物を用いた例で説明する。λファージＤＮＡ４１ を制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩで切断した後ポリメラーゼ反応を行い３′のギャップを埋め、平滑末端構造を持つ２本鎖ＤＮＡ断片混合物を得る。
【００２４】
制限酵素切断条件はλファージＤＮＡ ０．５ｐｍｏｌ を１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２，５０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）からなる反応液中で５ｕのＨｉｎｄ ＩＩＩを３７℃３０分間として反応させた。反応体積は２０μｌである。反応終了後３Ｍ ＮａＣｌ ５μｌとエタノール６３μｌ加え、−２０℃３０分間放置後、遠心して制限酵素切断ＤＮＡを回収した。
【００２５】
平滑末端構造を得るため、ＤＮＡ伸長基質として０．２μＭ のｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧＴＰ，ｄＴＴＰ混合液）とポリメラーゼとして０．５ｕ Ｔ７−ＤＮＡポリメラーゼを用い、２０ｍＭのＭｇＣｌ２ ，５０ｍＭのＮａＣｌ，４０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中で３７℃２分間反応させた。反応液は ２０μｌで行った。反応終了は３ＭのＮａＣｌを５μｌとエタノール６３μｌ加え、−２０℃３０分間放置後、遠心して制限酵素切断ＤＮＡを回収した。
【００２６】
次にターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて制限酵素切断部の３′末端に単一塩基としてポリＡを導入する。反応は、制限酵素切断 ＤＮＡ断片混合物を１ｍＭのｄＡＴＰ，１ｍＭのＣｏＣｌ２ ，０．５ｍＭのＭｇＣｌ２，０．５ｍＭの２−メルカプトエタノールを含む１００ｍＭ のカコジル酸緩衝液（ｐＨ７．２）中で１２．５ｕのターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いて３７℃３０分間行った。反応液量は２０．５μｌ である。反応終了後３ＭのＮａＣｌを１０μｌとエタノール７６μｌを加え、−２０℃３０分間放置後、遠心してポリＡを導入したＤＮＡ断片混合物を回収し、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液１００μｌに溶解した。
【００２７】
このようにして調製したＤＮＡ断片混合物から表１の配列番号１に記載のスルホローダミン１０１蛍光体標識プライマを用いて試料混合物のまま配列決定を試みた。
【００２８】
【表１】
配列決定反応はＴａｑサイクルシーケンシング反応を用いた。反応条件を図５に示す。シーケンシング反応物の分析には日立ＳＱ−３０００型オートＤＮＡシーケンサをスルホローダミン１０１蛍光体用にＨｅ−Ｎｅレーザ（波長５９４ ｎｍ）励起として用いた。その結果、図６の７１のような一連の末端を持つ配列番号１記載の構造のプライマを用いることで、λファージＤＮＡのＨｉｎｄ ＩＩＩ切断部分より６１ないし６５の部位の配列決定をすることができた。各部位の配列決定塩基長は平均４３７塩基である。
【００３０】
（実施例２）
本実施例では本発明の３′突出端型の４塩基認識制限酵素を用いた例について述べる。また、本実施例では、実用性を考慮し、制限酵素分解物の一部を固相担体を用いて抽出し、固相担体上でシーケンシング反応を行っている。
【００３１】
まず実施例１に従いλファージＤＮＡのＨｉｎｄ ＩＩＩ分解物を得る。さらにこの手法と同様に平滑末端とした後、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを用いてポリＡを導入する。このＤＮＡ断片混合物の２．０ｋ 塩基長の特定の断片を分取するため配列番号２と３のプライマを用いＰＣＲを行い目的断片のみを増幅する。
【００３２】
【表２】
【表３】
ＰＣＲには後で２本鎖ＤＮＡの分取が容易なように配列番号２にビオチンを導入したプライマとビオチンの入っていない配列番号３のプライマの組合せ、及び、ビオチン入りの配列番号３のプライマとビオチン無しの配列番号２のプライマの２種の組合せを用いた。反応条件はＥｘ Ｔａｑ（宝酒造株式会社）を用い下記のプロトコールで行った。
【００３５】
上記手法により調製した約０．１ａｍｏｌ のＤＮＡ断片混合物に１０ｐｍｏｌのプライマに１０×緩衝液（酵素付属の１０×Ｅｘ Ｔａｑ緩衝液）を終濃度で１／１０になるように加え、更に０．２ｍＭ になるようにｄＮＴＰを加え２５μｌにした。９５℃２分間変性させ、５７℃に冷却した後、Ｅｘ Ｔａｑ １ｕを添加し、９５℃３０秒，５７℃３０秒，７２℃５分間を１工程として本工程を３０回繰り返した。増幅した約２．１ｋ 塩基長のフラグメント電気泳動的に分離して試料とした。電気泳動分離は０．８％ のアガロースゲルを用いた。泳動緩衝液は１ｍＭ ＥＤＴＡを含む４０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ８．３ ）で行った泳動長は約１０ｃｍ、泳動電圧は１００ｖである。泳動分離後、常法に従いエチジウムブロマイド染色を行い２．１ｋ 塩基長の分離バンドを注意深く切り出し、分離ＤＮＡを５ｍＭ ＥＤＴＡを含む２００ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸緩衝液（ｐＨ８．３ ）に抽出した。
【００３６】
本方法により一方の５′末端にビオチンが結合した約１ｐｍｏｌの２．１ｋ 塩基長のＤＮＡ断片を得ることができた。０．８％ アガロース電気泳動を用いて合成したＤＮＡ断片長を測定したところ、塩基長は約２．１ｋ 塩基であることが確認できた。
【００３７】
このようにして得た２．０ｋ塩基長のＤＮＡ断片を４塩基認識制限酵素Ｎｌａ ＩＩＩを用いて部分分解する。部分分解は０．５ｐｍｏｌの２．１ｋ塩基長のＤＮＡ断片と ０．１ｕのＮｌａ ＩＩＩを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２，５０ｍＭのＮａＣｌ，１ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）からなる反応液中で３７℃３０分間行った。この条件で不完全消化されたいろいろな長さのＤＮＡ断片が得られる。反応後、終濃度で５ｍＭになるようにＥＤＴＡを加え反応を停止した。２０μｇのストレプトアビジン固定磁気ビーズ（ＤＡＹＮＡＢＥＡＤＳ；ダイナル社）を用いてＮｌａ ＩＩＩ 切断ＤＮＡを回収した。ビオチンの入っていない分解断片は洗浄により除去され、いずれか片方の５′末端を固定化したＤＮＡ断片試料を得ることができる。たとえば、ビオチン化プライマに配列番号２の物を用いれば、＋鎖、配列番号３を用いれば−鎖の５′末端が固定される。
【００３８】
この操作で固定化末端が２．１ｋ 塩基長のＤＮＡ断片の片方のオリジナルな ５′末端で、他方がＮｌａ ＩＩＩ 切断部からなるいろいろな断片長のＤＮＡ断片が固定された磁気ビーズ担体を得ることができる。このいろいろなＮｌａ ＩＩＩ 切断部から末端選択性のあるプライマを用いてシーケンシングを行うことで長いＤＮＡを効率良く配列決定することができる。また、本手法によりＤＮＡ断片の種類を約半分にすることができ、同一末端配列の出現頻度を落とすことができるので、末端に選択性のある本発明プライマのセットでシーケンシングがしやすくなる。
【００３９】
実際の配列決定反応はＴａｑサイクルシーケンシング反応を用い図１に準拠して行った。ただし試料ＤＮＡとしては、磁気ビーズに固定した上記方法で調製した磁気ビーズに固定したＤＮＡ断片、プライマとしてはＮｌａ ＩＩＩ 切断部に選択性のある配列番号４に記載の末端Ｎ１Ｎ２がＡ，Ｃ，Ｇ、およびＴの全ての組合せのプライマ（計１６種）をセットそしてあらかじめ合成し、これを用いて配列決定反応を行った。
【００４０】
【表４】
図７に配列決定に利用できたプライマの末端配列を７１に、これらプライマを用いて配列決定できた部分を７２の矢印で示した。この方式で２０２８塩基長のＤＮＡをたった一度のシーケンシング反応と一度の電気泳動で決定することができることがわかる。同一の試料ＤＮＡを通常のショットガン法で解析したところ、完全に配列決定するのに２６クローンから計５２回のシーケンシング反応を行う必要があった。よって本発明を用いれば、クローニングの手間が省けるうえ、配列決定の重複を減らすことができるため長いＤＮＡの配列決定に有効であることが確認された。
【００４２】
（実施例３）
本方法をウォーキング法に応用した例を示す。実施例２の方法でλファージ ＤＮＡのＨｉｎｄ ＩＩＩ分解物の２．１ｋ 塩基長の特定の断片をＰＣＲで増幅しその片方の末端にビオチンを導入した。増幅した２．１ｋ塩基長断片をＮｌａ ＩＩＩで部分分解し２０μｇのストレプトアビジン固定磁気ビーズ（ＤＡＹＮＡＢＥＡＤＳ；ダイナル社）に結合させた。まず、固定化したＤＮＡ断片末端のポリＡ部分と制限酵素Ｈｉｎｄ ＩＩＩ 、それに続く２塩基に相補的な配列番号４のプライマを用いて配列決定を行う。実際の配列決定反応は実施例２と同様にＴａｑサイクルシーケンシング反応を用い図１に準拠して行った。
【００４３】
その結果、プライマに続く部分の１５塩基目から３７０塩基までの配列を決定することができた。決定した配列範囲でＮｌａ ＩＩＩ 認識部は１１４番目と２９６番目の位置にあることがわかる。そこで配列決定した部分の最も３′末端よりの切断部とそれに続く２塩基に相補的なプライマ配列としては、配列番号４のＮ１Ｎ２がＴＡの物を得ることができる。このプライマを用いて２回目の配列決定を行う。その結果、２回目の配列決定として４１４塩基、最初のプライマ位置から数えて７８４塩基までの配列が決定できた。同様に３回目の配列決定を２回目で得た配列からＮｌａ ＩＩＩ 認識部を選ぶと、配列番号４のＮ１Ｎ２はＧＴが適当であることがわかり、これを利用してシーケンシングを行った。このようにして配列決定，Ｎｌａ ＩＩＩ認識部の選択，Ｎｌａ ＩＩＩ切断部とこれに続く２塩基に相補的なプライマの選択を４回順次繰り返すことにより最終的に２．１ｋ 塩基長のうち最初の１４塩基とを除く１６８２塩基までの部分の配列を決定することができた。最初の１４塩基は蛍光標識プライマの電気泳動分離ピークのバックグランドが上昇するため配列決定ができなかったが、反対側のＤＮＡ鎖を配列決定するか、２．１ｋ 塩基断片の隣のＤＮＡ断片から配列決定することができる。
【００４４】
本実施例によればプライマウォーキング法を用いたＤＮＡ配列決定において、配列決定した部分に相補的なプライマをその都度合成する必要がなく、制限酵素切断部に続く末端配列２塩基に選択的なプライマ１６種あるいは３塩基に特異的な６４種のセットとしてあらかじめ用意しておいたなかから選択して配列決定できるので、迅速にかつローコストで配列決定することができる。
【００４５】
【発明の効果】
本発明によれば長いＤＮＡを制限酵素切断した切断末端近傍の配列を利用することで各断片の配列を決定することができるので、クローニングの回数を減らすことができる。各ＤＮＡ断片を同時に解析することにより短時間に長いＤＮＡの解析をすることができる。また、相補的なプライマを毎回合成することなくプライマウォーキングで配列決定ができる。
【００４６】
たとえば１Ｍ塩基のＤＮＡを約５００個の平均鎖長２Ｋｂの断片にわけて並行解析すると、末端配列サーチ，分画に２〜３日，配列決定をゲルキャピラリーアレーとプライマウォーキングを用いて行うと３〜４日で行えるので約１週間で解析でき、従来より百倍近い速さで解析することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の説明図。
【図２】本発明の説明図。
【図３】本発明のプライマ構造の説明図。
【図４】本発明の説明図。
【図５】本発明に用いたシーケンシングプロトコールの説明図。
【図６】結果の一例の説明図。
【図７】結果の一例の説明図。
【符号の説明】
１…試料ＤＮＡ、２…制限酵素切断部、３…塩基配列部分、４…ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ、５…単一塩基ポリヌクレオチド、６…プライマ、７…プライマの単一塩基部分、８…制限酵素切断部に相補的な配列部分、９…プライマの制限酵素認識部に続く任意の塩基配列部分、１０…相補鎖合成部分、１１…プライマの任意配列部分が試料ＤＮＡと相補的関係にない状態。[0001]
[Industrial applications]
The present invention relates to a method for analyzing a DNA base sequence and the like.
[0002]
[Prior art]
Conventionally, in order large DNA sequencing (for example 106 bases in length), DNA was cleaved with enzymes first inserted fragment of interest using cloning techniques into a vector such as a plasmid, which in E. coli The cells were injected, cultured on an agar medium, and the resulting colonies were sorted to separate the fragmented target DNA. Subsequently, DNA sequencing was performed for each colony using the plasmid containing the fractionated DNA fragment. Usually, the DNA base length that can be determined by one base sequence operation is 300 to 500 bases, and the determination of 1M (10 6 ) bases required analysis of 2000 or more plasmids. In addition, even if a colony is picked up, there is a possibility that a colony containing the same DNA fragment is picked up, and it is necessary to pick up a 6- to 10-fold colony.
[0003]
As a method for analyzing long DNA, primer walking (Science 258 , 1787-1791, 1992) is known. This method is a method in which DNA is determined 400 bases at a time from the end. That is, sequence determination is sequentially performed using an oligomer having a sequence near the end of the determined DNA chain as a primer. This method also requires 2500 times of sequence analysis to analyze 1M base DNA, and the analysis required several years.
[0004]
In order to solve the complexity of cloning and walking, a method of directly sequencing several kinds of DNA restriction enzyme fragments in a mixture state has also been attempted (DNA
Research, 1 , 231-237, 1994). this is,
(1) a step of introducing a known sequence oligomer into the end of the DNA restriction enzyme fragment by ligation reaction in order to recognize each DNA restriction enzyme fragment,
(2) A step of performing a sequencing reaction using a set of a known sequence oligomer introduced into the restriction enzyme cleavage site and a primer that can recognize an unknown sequence of 1 to 3 bases. This set of primers is composed of, for example, all 64 sequence types if the unknown sequence portion is 3 bases, and if the mixed DNA fragment is about 10, the sequence can be determined without separation of each fragment by cloning or the like.
[0005]
[Problems to be solved by the invention]
Conventionally, nucleotide sequencing of such large DNAs has been a very laborious and time-consuming process. Furthermore, there are some fragments that are difficult to insert into a vector by cloning operation depending on the size and type of a fragment digested with a restriction enzyme, and it may be difficult to determine the entire nucleotide sequence. Therefore, development of a new method has been desired. A promising method is to use a primer set described in DNA Research, 1 , 231-237, 1994 to directly sequence from a mixed DNA fragment. However, a step of introducing a known sequence oligomer into a restriction enzyme cleavage site by ligation Since the efficiency of DNA is usually as low as 2 to 10%, it is often difficult to determine the sequence without obtaining sufficient sensitivity, and a special high-sensitivity DNA detector was required.
[0006]
[Means for Solving the Problems]
In the method described in DNA Research, 1 , 231-237, 1994, a ligation reaction is used to introduce a known sequence to which a primer can bind. In the present invention, in order to introduce a known sequence without performing ligation, a
[0007]
The polymerase reaction is carried out using the
[0008]
In particular, when the
[0009]
Further, a feature of the present invention is that, as shown in FIG. 2, a
[0010]
That is, the
[0011]
FIG. 3 summarizes the primer structure in the present invention.
[0012]
In the present invention, an important point is how to accurately recognize the restriction enzyme cleavage site. If the restriction
[0013]
The present invention solves this point by making the portion following the 3 'end of a polynucleotide consisting of an arbitrary single base a sequence complementary to a restriction enzyme cleavage portion forming a 3' protruding end. For example, in the case of Nla III, a 3'-protruding
[0014]
In the present invention, a single base is polymerized and introduced into the 3 'end of the restriction enzyme cleavage site using terminal deoxynucleotidyl transferase. For this reason, the rate of polymerization of the terminal deoxynucleotidyl transferase at the 5'-terminal protruding restriction enzyme cleavage site is reduced. From the viewpoint of polymerizing and introducing a single base using terminal deoxynucleotidyl transferase, it is most excellent to cut the sample with a restriction enzyme that forms a 3 'protruding end.
[0015]
However, there are few types of restriction enzymes that form the 3 'protruding end. In view of this, the present invention solves the problem by using a sequence complementary to a restriction enzyme cleavage site where the portion following the 3 'end of a polynucleotide consisting of an arbitrary single base forms a blunt end. Although the reaction rate is slow even at the restriction enzyme cleavage site that forms blunt ends, it is possible to polymerize and introduce a single base using terminal deoxynucleotidyl transferase, so that a sequence complementary to the restriction enzyme cleavage site of the primer is sufficient. If you can get long, you can use it.
[0016]
For example, for a restriction enzyme that recognizes four bases, two bases can be used for the
[0017]
Further, when the cleavage site by the restriction enzyme becomes a 5'-end protruding type, the
[0018]
[Action]
The single base portion of the primer that can be used in the present invention preferably has a length of 6 to 20 bases. When the restriction enzyme recognition part is 4 bases and ligates an arbitrary base length to its 3 'end, this alone results in 5 bases or more. Therefore, even if the single base is A or T, the base length of the
[0019]
Since the single base portion of G or C has a high Tm, a primer that has shifted and hybridized once cannot be dissociated again and re-hybridized to an accurate position, and therefore cannot be made too long.
[0020]
If the single base is G or C, it should be empirically avoided to make the length more than half of the total primer length. The primer sequence complementary to the enzyme cleavage site requires two or more bases different from the
[0021]
As long as the combination of any bases following the sequence complementary to the restriction enzyme cleavage site is as long as one base or more as long as possible, it is advantageous for sequencing a plurality of restriction enzyme cleavage sites in a mixed state. Since various types of arbitrary sequences need to be prepared, two to four bases are practically preferable as shown in FIG. Of course, when one of the restriction enzyme cleavage portions is fixed or the both ends are cut products of different enzymes, the sequence can be effectively determined without an arbitrary sequence portion. The
[0022]
This primer can be used for primer walking, in which a specific restriction enzyme cleavage site is selected from a portion where a sequence of a certain length has been determined, and sequencing is performed again using the primer from the selected restriction enzyme cleavage site. . In this case, it is possible to select the restriction enzyme cleavage part and the arbitrary sequence part following it from the known part of the sequence, so it is not necessary to prepare all the primers of any sequence. No problem. Primers having an arbitrary sequence of 2 to 3 bases are also very effective. Primers prepared on the basis of such design criteria can be sequenced in a mixed state of a plurality of restriction enzyme cut portions by the effect of an arbitrary sequence portion. It is particularly effective for the above-described primer walking.
[0023]
【Example】
(Example 1)
One example of the present invention using a 5 'protruding end type restriction enzyme will be described with reference to an example using a Hind III digest of λ phage DNA (48 Kb) as a sample. After cutting the λ phage DNA 41 with the restriction enzyme Hind III, a polymerase reaction is performed to fill in the 3 ′ gap to obtain a double-stranded DNA fragment mixture having a blunt-end structure.
[0024]
Restriction enzyme cleavage conditions were as follows: 0.5 pmol of λ phage DNA was mixed with 5 u of Hind III in a reaction solution consisting of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM MgCl 2 , 50 mM NaCl, 1 mM dithiothreitol (DTT). Was reacted at 37 ° C. for 30 minutes. Reaction volume is 20 μl. After completion of the reaction, 5 μl of 3M NaCl and 63 μl of ethanol were added, left at −20 ° C. for 30 minutes, and centrifuged to collect restriction enzyme-cleaved DNA.
[0025]
In order to obtain a blunt-end structure, 0.2 μM dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP mixture) as a DNA extension substrate and 0.5 uT7-DNA polymerase as a polymerase were used, 20 mM MgCl 2 , 50 mM NaCl, 40 mM In Tris-HCl (pH 7.5) buffer at 37 ° C for 2 minutes. The reaction was performed in a volume of 20 μl. To terminate the reaction, 5 μl of 3M NaCl and 63 μl of ethanol were added, left at −20 ° C. for 30 minutes, and centrifuged to collect restriction enzyme-cleaved DNA.
[0026]
Next, poly A is introduced as a single base at the 3 'end of the restriction enzyme cleavage site using terminal deoxynucleotidyl transferase. The reaction was carried out using a restriction enzyme-digested DNA fragment mixture in 100 mM cacodylate buffer (pH 7.2) containing 1 mM dATP, 1 mM CoCl 2 , 0.5 mM MgCl 2 , and 0.5 mM 2-mercaptoethanol. This was performed at 37 ° C. for 30 minutes using 0.5 u of terminal deoxynucleotidyl transferase. The reaction volume is 20.5 μl. After completion of the reaction, 10 μl of 3M NaCl and 76 μl of ethanol were added, and the mixture was allowed to stand at −20 ° C. for 30 minutes, and then centrifuged to collect a DNA fragment mixture into which poly A had been introduced. The mixture was added to 100 μl of 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) buffer. Dissolved.
[0027]
From the DNA fragment mixture thus prepared, sequencing was attempted using the sulforhodamine 101 fluorophore-labeled primer shown in SEQ ID NO: 1 of Table 1 as a sample mixture.
[0028]
[Table 1]
The sequencing reaction used a Taq cycle sequencing reaction. The reaction conditions are shown in FIG. For analysis of the sequencing reaction, a Hitachi SQ-3000 type auto-DNA sequencer was used for the sulforhodamine 101 phosphor as a He-Ne laser (wavelength 594 nm) excitation. As a result, by using a primer having a structure shown in SEQ ID NO: 1 having a series of ends such as 71 in FIG. 6, it is possible to determine the sequence of 61 to 65 sites from the Hind III digested portion of the λ phage DNA. Was. The average length of the sequencing base at each site is 437 bases.
[0030]
(Example 2)
In this example, an example using the 3 'protruding end type 4-base recognition restriction enzyme of the present invention will be described. Further, in this example, in consideration of practicality, a part of the restriction enzyme decomposition product is extracted using a solid phase carrier, and a sequencing reaction is performed on the solid phase carrier.
[0031]
First, a HindIII digest of λ phage DNA is obtained according to Example 1. Furthermore, after blunt-ending as in this method, polyA is introduced using terminal deoxynucleotidyl transferase. PCR is performed using the primers of SEQ ID NOs: 2 and 3 to fractionate a specific 2.0-kb base fragment of this DNA fragment mixture, and only the target fragment is amplified.
[0032]
[Table 2]
[Table 3]
For the PCR, a combination of a primer obtained by introducing biotin into SEQ ID NO: 2 and a primer of SEQ ID NO: 3 containing no biotin and a primer of SEQ ID NO: 3 containing biotin so that the double-stranded DNA can be easily separated later. And two primers of SEQ ID NO: 2 without biotin. The reaction was carried out using Ex Taq (Takara Shuzo Co., Ltd.) according to the following protocol.
[0035]
A 10 × buffer (10 × Ex Taq buffer attached to the enzyme) was added to a 10 pmol primer to the DNA fragment mixture of about 0.1 amol prepared by the above method so that the final concentration was 1/10, and 0.2 mM was further added. DNTP was added to make the volume 25 μl. After denaturation at 95 ° C. for 2 minutes and cooling to 57 ° C., Ex Taq 1u was added, and this step was repeated 30 times with 95 ° C. for 30 seconds, 57 ° C. for 30 seconds and 72 ° C. for 5 minutes as one step. The amplified fragment of about 2.1 k base length was electrophoretically separated and used as a sample. For electrophoretic separation, a 0.8% agarose gel was used. The electrophoresis buffer was a 40 mM Tris-acetate buffer (pH 8.3) containing 1 mM EDTA, and the electrophoresis length was about 10 cm, and the electrophoresis voltage was 100 V. After the electrophoretic separation, ethidium bromide staining was carried out according to a conventional method, and a 2.1 k-base-length separated band was carefully cut out. The separated DNA was extracted into a 200 mM Tris-acetate buffer (pH 8.3) containing 5 mM EDTA.
[0036]
According to this method, about 1 pmol of a DNA fragment having a base length of 2.1 k and having biotin bound to one 5 'end was obtained. When the length of the synthesized DNA fragment was measured using 0.8% agarose electrophoresis, it was confirmed that the base length was about 2.1 k bases.
[0037]
The thus-obtained DNA fragment having a length of 2.0 k bases is partially digested with a 4-base recognition restriction enzyme Nla III. Partial degradation was performed using 10 mM Tris-HCl (pH 7.5) containing 0.5 pmol of a 2.1 k base length DNA fragment and 0.1 u of Nla III, 10 mM MgCl 2 , 50 mM NaCl, and 1 mM dithiothreitol ( (DTT) at 37 ° C. for 30 minutes. Under these conditions, incompletely digested DNA fragments of various lengths are obtained. After the reaction, EDTA was added to a final concentration of 5 mM to stop the reaction. Nla III-digested DNA was recovered using 20 μg of streptavidin-fixed magnetic beads (DAYNABEADS; Dynal). The degraded fragment containing no biotin is removed by washing, and a DNA fragment sample having one of the 5 'ends immobilized can be obtained. For example, when the sequence of SEQ ID NO: 2 is used as the biotinylated primer, the 5'-end of the + strand is fixed when SEQ ID NO: 3 is used.
[0038]
By this operation, a magnetic bead carrier having immobilized ends on one side of an original 5 'end of a DNA fragment having a base length of 2.1 k and immobilized DNA fragments of various fragment lengths comprising Nla III cut portions on the other side is obtained. Can be. Long DNAs can be efficiently sequenced by performing sequencing from these various Nla III cleavage sites using primers having terminal selectivity. In addition, since the type of DNA fragment can be reduced to about half by this method and the frequency of occurrence of the same terminal sequence can be reduced, sequencing can be easily performed with the set of the primer of the present invention having terminal selectivity.
[0039]
The actual sequencing reaction was performed according to FIG. 1 using a Taq cycle sequencing reaction. However, as the sample DNA, the DNA fragment fixed on the magnetic beads prepared by the above method fixed on the magnetic beads, and as the primer, the terminal N 1 N 2 described in SEQ ID NO: 4 having selectivity for the Nla III cut portion is A, Primers of all combinations of C, G, and T (a total of 16 types) were set and synthesized in advance, and used for sequencing reactions.
[0040]
[Table 4]
In FIG. 7, the terminal sequence of the primer which can be used for sequencing is indicated by 71, and the portion which can be sequenced using these primers is indicated by
[0042]
(Example 3)
An example in which the present method is applied to a walking method will be described. According to the method of Example 2, a specific fragment of 2.1 k base length of HindIII digest of λ phage DNA was amplified by PCR, and biotin was introduced into one end of the fragment. The amplified 2.1 kbase fragment was partially digested with Nla III and bound to 20 μg of streptavidin-fixed magnetic beads (DAYNABEADS; Dynal). First, sequencing is performed using the poly A portion at the end of the immobilized DNA fragment, the restriction enzyme Hind III, and the subsequent primer of SEQ ID NO: 4 complementary to two bases. The actual sequencing reaction was performed according to FIG. 1 using the Taq cycle sequencing reaction as in Example 2.
[0043]
As a result, the sequence from the 15th base to the 370 base in the portion following the primer could be determined. It can be seen that the Nla III recognition unit is located at the 114th and 296th positions in the determined sequence range. Therefore, as the primer sequence complementary to the cut portion from the 3 'end of the sequenced portion and the subsequent 2 bases, N 1 N 2 of SEQ ID NO: 4 can be obtained as TA. A second sequencing is performed using this primer. As a result, a sequence of 414 bases and 784 bases counted from the first primer position could be determined in the second sequencing. Similarly, when the Nla III recognition site was selected from the sequence obtained in the second sequencing in the third sequencing, GT was found to be appropriate for N 1 N 2 in SEQ ID NO: 4, and sequencing was performed using this. Was. In this way, sequencing, selection of the Nla III recognition site, selection of the Nla III cleavage site and subsequent selection of a primer complementary to the two bases are sequentially repeated four times, and finally the first of the 2.1 k base length is finally obtained. The sequence up to 1682 bases excluding 14 bases could be determined. The first 14 bases could not be sequenced because the background of the electrophoretic separation peak of the fluorescent-labeled primer increased, but the opposite DNA strand was sequenced or the DNA fragment adjacent to the 2.1 k base fragment was Can be sequenced.
[0044]
According to the present embodiment, in the DNA sequencing using the primer walking method, it is not necessary to synthesize a primer complementary to the sequenced portion each time, and the primer selective to the two nucleotides of the terminal sequence following the restriction enzyme cleavage site can be used. Since the sequence can be selected and prepared from a set of 64 types specific to 16 or 3 bases in advance, the sequence can be determined quickly and at low cost.
[0045]
【The invention's effect】
According to the present invention, the sequence of each fragment can be determined by using a sequence near the cleavage end obtained by cutting a long DNA with a restriction enzyme, so that the number of times of cloning can be reduced. By analyzing each DNA fragment at the same time, a long DNA can be analyzed in a short time. Also, sequencing can be performed by primer walking without synthesizing a complementary primer every time.
[0046]
For example, when 1M base DNA is analyzed in parallel by dividing into about 500 fragments having an average chain length of 2 Kb, 2 to 3 days for terminal sequence search and fractionation, 3 times when sequencing is performed using gel capillary array and primer walking. Since the analysis can be performed in about 4 days, the analysis can be performed in about one week, and the analysis can be performed at a speed nearly one hundred times faster than in the past.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an explanatory diagram of the present invention.
FIG. 2 is an explanatory diagram of the present invention.
FIG. 3 is an explanatory view of a primer structure of the present invention.
FIG. 4 is an explanatory diagram of the present invention.
FIG. 5 is an explanatory diagram of a sequencing protocol used in the present invention.
FIG. 6 is an explanatory diagram of an example of a result.
FIG. 7 is an explanatory diagram of an example of a result.
[Explanation of symbols]
DESCRIPTION OF
Claims (7)
前記単一塩基部の３’末端に制限酵素切断部の配列に相補的な配列をもつ制限酵素認識部とを有し、前記制限酵素認識部の配列が、平滑末端を形成する前記制限酵素切断部の配列に相補的な配列であることを特徴とするプライマ。A single base consisting of a plurality of single bases;
A restriction enzyme recognition portion having a sequence complementary to the sequence of the restriction enzyme cleavage portion at the 3 ′ end of the single base portion , wherein the sequence of the restriction enzyme recognition portion forms a blunt end; A primer, which is a sequence complementary to a partial sequence .
（２）ターミナルデオキシヌクレオチジルトランストランスフェラーゼを用いて前記ＤＮＡ断片の３’末端に単一種の塩基の複数からなるポリヌクレオチドを導入する工程と、
（３）請求項１から請求項３の何れかに記載のプライマを用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行なう工程とを有することを特徴とするＤＮＡ塩基配列決定法。(1) a step of cutting a sample DNA with a specific restriction enzyme to obtain a DNA fragment;
(2) introducing a polynucleotide comprising a plurality of single bases into the 3 ′ end of the DNA fragment using terminal deoxynucleotidyl transferase;
(3) DNA sequencing, characterized in that a step of performing a DNA polymerase error peptidase reaction using primers according to claims 1 to claim 3.
（２）前記複数のＤＮＡ断片から特定のＤＮＡ断片をＰＣＲ増幅して分取する工程と、
（３）工程（２）で分取した前記特定のＤＮＡ断片の一方の５’末端にビオチンを結合する工程と、
（４）一方の５’末端にビオチンを結合した前記特定のＤＮＡ断片を、前記第１の制限酵素とは異なる第２の制限酵素で部分分解して不完全消化された異なる長さのＤＮＡ断片を得る工程と、
（５）ストレプトアビジンを固定した磁気ビーズを用いて、工程（４）で得たＤＮＡ断片から、一端が前記磁気ビーズ固定され、他端が前記第２の制限酵素による切断部であるＤＮ
Ａ断片を回収する工程と、
（６）ターミナルデオキシヌクレオチジルトランストランスフェラーゼを用いて工程（５）で回収したＤＮＡ断片の３’末端に単一種の塩基の複数からなるポリヌクレオチドを導入する工程と、
（７）請求項１から請求項３の何れかに記載のプライマを用いてＤＮＡポリメラーゼ反応を行なう工程とを有することを特徴とするＤＮＡ塩基配列決定法。(1) cutting a sample DNA with a first restriction enzyme to obtain a plurality of DNA fragments;
(2) PCR-amplifying and fractionating a specific DNA fragment from the plurality of DNA fragments;
(3) binding biotin to one 5 ′ end of the specific DNA fragment fractionated in step (2);
(4) DNA fragments of different lengths which are partially digested with the second restriction enzyme different from the first restriction enzyme to incompletely digest the specific DNA fragment having biotin bound to one 5 ′ end Obtaining a
(5) Using the magnetic beads to which streptavidin is fixed, from the DNA fragment obtained in step (4), one end of which is fixed to the magnetic beads and the other end is a DN cut by the second restriction enzyme.
Recovering the A fragment;
(6) a step of introducing a polynucleotide consisting of a plurality of single bases into the 3 ′ end of the DNA fragment recovered in step (5) using terminal deoxynucleotidyltransferase;
And (7) a step of performing a DNA polymerase reaction using the primer according to any one of claims 1 to 3.
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