JP3582632B2

JP3582632B2 - 核酸抽出用容器

Info

Publication number: JP3582632B2
Application number: JP35753097A
Authority: JP
Inventors: 茂駒井; 克哉大門; 裕宝田
Original assignee: Toyobo Co Ltd
Current assignee: Toyobo Co Ltd
Priority date: 1997-12-25
Filing date: 1997-12-25
Publication date: 2004-10-27
Anticipated expiration: 2017-12-25
Also published as: JPH11187862A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、核酸を含有する種々の試料、特に生体試料から核酸を抽出する際に用いられる容器に関する。
【０００２】
【従来の技術】
近年数多くの分野において、生体試料などからの核酸の抽出が盛んに行われている。例えば遺伝子工学やＤＮＡプローブの作製においては、目的とする蛋白質を生産する細胞からＤＮＡやＲＮＡを抽出する操作が行われている。また、ＤＮＡプローブを用いてウイルスＤＮＡもしくはウイルスＲＮＡを検出する臨床診断においては、生体試料から検出されるべきＤＮＡもしくはウイルスＲＮＡを抽出する操作が行われている。
【０００３】
このように核酸を抽出する操作は、種々の分野において非常に重要なものである。従来から核酸抽出方法としては、プロテアーゼＫ法、フェノール／クロロホルム抽出など多くの方法が知られている（例えば、遺伝子医学Ｖｏｌ．１，Ｎｏ．１，ｐ１１２〜１１９，１９９７）。
【０００４】
また、特開平９−１９２９２号公報には、磁性担体を用いる核酸抽出方法も提案されている。これは磁性担体はマグネットを近づけると粒子全体が磁化されてマグネットに引き寄せられ、マグネットを離すと直ちに磁性を失って、元に戻る性質がある。この磁性担体の表面に核酸を吸着できるようにすれば、マグネットの利用により、磁性担体を洗浄するとき、容器内壁に磁性担体を集めて不要な液の除去を効率的に行なうことができる。磁性担体を用いる固体と液体の分離方法は、核酸抽出に限らず免疫診断におけるタンパク質の分析や検査などでも、従来より用いられてきた遠心分離に替わる方法として開発され、数多く実用化されてきたものである。
【０００５】
これらの抽出操作に用いられる容器には、例えば特公平４−３１９４５号公報に記載されるような、プラスチックで形成されたフタ付きのマイクロチューブと呼ばれているものがある。この容器では、試薬の注入、排出時にフタは開放された状態にあり、一方、一定温度で一定時間、反応槽内の液を加温するような反応過程、あるいは遠心分離を行う過程においては、フタは閉じた状態で使用される。
【０００６】
また、特開平８−４３４００号公報においては、特異的結合反応を応用した分析方法に用いられる反応容器が提案されている。これは容器底部に傾斜を持たせて特異結合反応を促進させることを工夫している特徴を有し、核酸抽出においても適用できると考えられるが、反応過程においては容器はフタのされない状態で使用される構造になっている。
【０００７】
また、診断用容器（特開平４−３２０９６２号公報）、免疫測定用反応容器（特開平４−３６３６６１号公報）や化学分析装置などに用いられる反応容器（特公昭６３−２０１７２号公報）など数多くの容器が提案されている。しかしながら、これらのほとんどは容器内部への液を注入するとき、あるいは容器内の液を排出する過程で容器のフタを開放した状態で使用する構造になっている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
核酸抽出操作は、通常、赤血球溶血、白血球濃縮、細胞膜分解および核酸精製よりなる。上述した抽出法に共通する操作をブロック図にまとめると、図１に示すように、液の注入操作、液反応のための混合操作、Ｂ／Ｆ分離（固相分離）、不要成分液の除去もしくは核酸の回収よりなる。
【０００９】
ところで、臨床診断においては、核酸を抽出する場合、対象検体を同時に複数個処理することがある。一つの検体に１個の抽出用容器を使用するので、多数の抽出容器がクリーンベンチ内での操作あるいは核酸抽出の自動化装置において使われるのが一般的である。
【００１０】
したがって、複数個の抽出容器が限られたスペースに並べられ、同時に抽出操作が行われる場合、例えば試料や試薬の注入、排出などの操作においては、前記したようなフタが開放された容器を使用すると、例えば血液のような生物試料中に含まれる危険なウイルスの飛散による感染や、容器間にまたがって発生するキャリーオーバーのためのコンタミネーションといった臨床診断でもっとも注意しなければならない問題が発生する恐れがある。
【００１１】
さらに、従来の容器では、液の注入、排出にピペット操作でチップ先端を容器内部に挿入するため、容器内部へ外部から反応を阻害する因子が混入する危険性のある構造となっている。
【００１２】
本発明は、従来の核酸抽出操作に多く用いられている開放系の抽出容器に生じている上記のような問題を解決するためになされたものであって、キャリーオーバーによるコンタミネーションを防止する新たな核酸抽出用容器を提供することを目的とする。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記の目的を達成するため、鋭意検討の結果、核酸抽出に用いる容器構造を密閉系とすることにより、キャリーオーバーによるコンタミネーションを防止することが可能であることを見出し、本発明に到達した。
【００１４】
すなわち、本発明は、生物試料および試薬を混合して反応せしめる反応槽部分、不要成分液を蓄えるドレインカップ部分、および核酸を回収するチューブとを同一支持板に固定して構成されることを特徴とする核酸抽出用容器である。
【００１５】
【発明の実施の形態】
本発明は、生物試料や試薬を混合させて反応させる反応槽部分、不要成分液を蓄えるドレインカップ部分、および核酸を回収するチューブを同一支持板に固定して構成されることを特徴とするものである。上記核酸を回収するチューブは、支持板に着脱自在に装着できる構造を有していることが、操作上、好ましい。
【００１６】
本発明において、生体試料とは、血液、血清、バフィーコート、尿、糞便、能脊髄液、精液、唾液、組織、細胞、培養物のような核酸を含有する試料をいう。
【００１７】
本発明において用いられる試薬とは、核酸を抽出するための試薬であり、カオトロピック物質、ＥＤＴＡ，トリス塩酸などを含有する緩衝液が挙げられる。カオトロピック物質としては、グアニジン塩、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カリウム、（イソ）チオシアン酸ナトリウム、尿素などが例示される。それらは組み合わせて使用してもよい。その濃度は約１〜１０モル／ｌ程度が好ましい。グアニジンチオシアン酸塩、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、トリス／塩酸緩衝液が特に好ましい。
【００１８】
また、本発明における反応槽部分は、上記生体試料から上記試薬を用いて核酸の抽出を行なう部分であり、ドレインカップ部分は、該抽出を行なった際の不要成分を含む液を回収する部分であり、核酸を回収するチューブは、目的とする核酸を含む抽出液を回収する部分をいう。さらに、支持板は、該反応槽部分、該ドレインカップ部分および該核酸を回収するチューブを保持させるための板状のものをいう。
【００１９】
また、好ましくは、反応槽部分の液を排出するための排出パイプ、該排出パイプと連結された回転部材、反応槽上部に挿入して液を排出し得るように該回転部材に排出通路が形成され、該回転部材により液の排出流路が制御されるような構造を有する。
【００２０】
より好ましくは、該回転部材に貫通するパイプを一体に形成し、該回転部材の貫通パイプ上部から加えられる圧力によって反応槽内の液を排出せしめる構造を有する。
【００２１】
さらに好ましくは、上記回転部材を外部に設けられた駆動手段により回転制御し、反応槽内部の液をドレインカップ部分もしくは回収チューブへ選択的に排出することのできる構造をもたせたことを有する。
【００２２】
上記の反応槽、回転部材の手段によれば、核酸抽出過程で行われる液の注入・排出という操作において、前記回転部材の貫通パイプを通じて液を注入する際、注入ノズルもしくは注入チップ先端を反応槽内部に挿入することなく実施することができ、かつ貫通パイプから加えられる圧力によって、排出パイプと回転部材の通路で形成される排出流路に沿って反応槽内部の液がドレインカップ部分もしくは回収チューブへ排出することが可能となる。
【００２３】
ここで、核酸抽出用容器を構成している上記の反応槽部分、ドレインカップ部分、核酸を回収するチューブの材質としては、従来より用いられている、例えばガラス、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニルあるいは表面にシリコンコーティングが施された一般的な樹脂が例示される。なかでも、核酸吸着のない点から、ポリプロピレンが特に好ましい。また、形状としては、反応槽部分は円錐形、ドレインカップ部分は円筒形、核酸を回収するチューブは通常用いられているマイクロチューブが好ましい。
【００２４】
以下、本発明の容器を図面を用いて説明する。
【００２５】
図２は、本発明の核酸抽出用容器の一実施態様を示す線図的断面図である。核酸抽出用容器は、生体試料や試薬を混合させて反応させる反応槽部分１と、不要成分液を蓄えるドレインカップ部分２と、核酸を回収するチューブ３、核酸を回収するチューブ３へ核酸を排出する流路を形成するフタ８と、反応槽部分１の上部に挿入して形成する回転部材６、回転部材６の回転時の上下ガタを抑えるキャップ９と抽出用容器全体の組立を行って固定する役目をする支持板４とから構成される。また、７はドレインカップ・フタ、１０は貫通パイプを示す。
【００２６】
図３は本発明の容器の一実施態様の詳細な組立分解を示す。図中、１〜１０は上述したとおりである。また、１１、１２は腕、１６は穴である。図４は本発明の核酸抽出用容器の支持板を示す図である。図中、１３は穴、１４、１５は切り欠きである。これらを用いて、さらに詳しく構造を説明する。
【００２７】
核酸抽出用容器は，図４の支持板４をベースとして組み立てられる。まず、支持板４の片側にはＵ字形の切り欠き１４が設けられ、このＵ字形切り欠き部分にドレインカップ部分２を挿入勘合し、反応槽部分１に一体で形成されている腕１１と、ドレインカップ部分に設けられた穴１６とが挿入結合されるようにして、ドレインカップ部分２は支持板４に固定される。また、ドレインカップ部分２の上部開放部には、空気抜きのための小穴を持つフタ７が挿入されてはめ込まれる。
【００２８】
一方、反応槽の設けられた腕１１の反対側に同じく腕１２を形成し、この腕１２に核酸回収チューブ３への排出流路を形成するフタ８が挿入勘合されて固定される。核酸回収チューブ３は、支持板４のＵ字形切り欠き１５部分に挿入されて固定される。
【００２９】
次に、反応槽部分１の開放された上部には、排出パイプ５と連結された回転部材６が挿入勘合される。この回転部材６には、貫通パイプ１０が一体で形成されていて、反応槽部分１への液注入通路あるいは外部から圧力を加える通路として用いられる。さらに、回転部材６の回転時の上下ガタをなくすため、内側にネジが設けられたキャップ９が反応槽部分１とネジ締めによって固定される。
【００３０】
図５は回転部材６を示し、図５（ａ）は上面図、図５（ｂ）は側面図である。排出パイプ５は回転部材の通路１７に挿入接続することで連結され、排出流路を形成する。また、回転部材に設けられた貫通パイプ１０の内径は反応槽部分の内側へいくほど小さくなるテーパー構造としている。
【００３１】
上記のように、生物試料および試薬を混合して反応せしめる反応槽部分、不要成分液を蓄えるドレインカップ部分、および核酸を回収するチューブとを同一支持板に固定された構成により、本発明の核酸抽出用容器は成るものである。なお、上記回収チューブ３は、核酸抽出が完了した時点で取り外される必要があるので、着脱自在の構造になっている。
【００３２】
次に、上述した核酸抽出用容器の使用方法の一例について説明する。ここで核酸抽出方法としては、すでに特開平９−１９２９２号公報で示されている磁性担体を用いる方法に基づくものである。すなわち超常磁性金属酸化物を含む磁性シリカ粒子と核酸を含有する生物試料および核酸抽出用溶液を本発明の容器に注入して、混合する。核酸が結合した磁性シリカ粒子を磁界を用いて液体から分離し（Ｂ／Ｆ分離）、最終的に核酸が結合した磁性シリカ粒子から核酸を溶離させる工程からなっている。
【００３３】
図６は、上記した核酸抽出法を行う場合における、本発明の核酸抽出用容器使用の模式図を示すものである。これに基づいてさらに詳しく説明する。まず図６（ａ）は液の注入工程を示す。すなわち、貫通パイプ１０の入り口にシリンジあるいはピペッターなどの分注手段（図示しない）と接続された分注ノズルあるいはフィルターチップ先端１８が位置決めされ、液が注入される。この場合、分注ノズル先端あるいはフィルタチップ先端が反応槽内部まで挿入されないため、外部から反応系を阻害する因子を反応槽内部に混入する危険はない。
【００３４】
この工程では、具体的には、例えば磁性シリカ粒子のような核酸結合用磁性担体、例えば血液などの核酸を含有する生物試料および核酸抽出用溶液の注入が行われる。
【００３５】
次に、図６（ｂ）は混合工程を示す。この工程では、反応槽内部に磁性シリカ粒子、核酸を含有する生物試料及び核酸抽出用溶液を、外部にある永久磁石、特にここではリング形状した磁石１９の上下運動によって反応槽内部の磁性担体を攪拌させて液全体の混合を実現させている。永久磁石の強さあるいは攪拌する時間の調整により液全体の混合は十分に行われる。
【００３６】
図６（ｃ）は、核酸が結合した磁性担体を磁界を用いて液体から分離する（Ｂ／Ｆ分離）工程を示す。この工程は永久磁石を用いて行われ得る。具体的には生物試料、核酸抽出用溶液、磁性担体からなる液体を含む反応槽部分の底部に永久磁石を近づけ、磁性担体だけを反応槽底部に集めて、核酸抽出用溶液などの不要成分液と分離することである。
【００３７】
図６（ｄ）は、不要成分液を排出する工程を示す。加圧ポンプ（図示しない）に連結された加圧ノズル先端２２が回転部材の貫通パイプ入り口に位置決めされる。この状態で加圧ポンプより圧力を加えると、反応槽内部にある液体は排出パイプと回転部材とで形成された排出流路に沿って押し出され、ドレインカップ部分へ排出される。同時にドレインカップ上部の小穴には排気ノズル２３が設置され、反応槽からのガスを導いて廃棄ボトルなど（図示しない）一箇所に集められ処理される。この様にすることで、他の容器にコンタミネーションする危険が防止できる。具体的に、磁性担体は反応槽底部に磁石で集められた状態のまま、不要となった核酸抽出用溶液などの溶液のみが排出流路を通してドレインカップ部分へ移動することになる。
【００３８】
次に、磁性担体をエタノールで数回洗浄する工程となる。これは上述した注入、混合、Ｂ／Ｆ分離、排出の各工程を全く同様に実行することで行い得る。
【００３９】
また、磁性担体を乾燥する工程では、不要成分液を排出させた後、反応槽内部へ熱風を通すか、あるいは反応槽部分を外部から加温することで容易に乾燥させ得る。
【００４０】
そして、最後に核酸を磁性担体から溶離し、回収する工程は上述した洗浄、乾燥処理を行った後、滅菌水などの低イオン濃度の溶液を磁性担体に添加することにより、磁性担体に結合した核酸を低イオン濃度の溶液から回収し得る。この回収工程の模式図を図６（ｅ）に示す。
【００４１】
核酸を回収する工程においては、回転部材を外部駆動手段によって１８０度回転させると排出パイプと回転部材の通路から形成される排出流路は、ドレインカップ部分から回収チューブ側へ接続される。
【００４２】
したがって、本核酸抽出用容器は、回転部材を回転制御することにより反応槽内部の液をドレインカップ部分あるいは回収チューブへと選択的に排出することのできる構造となっている。
【００４３】
【発明の効果】
生物試料および試薬を混合して反応せしめる反応槽部分、不要成分液を蓄えるドレインカップ部分、および核酸を回収するチューブとを同一支持板に固定して構成されることを特徴とする、本発明の核酸抽出用容器を用いることにより、従来の開放系で使用されるマイクロチューブ等と比べて、格段にコンタミネーションの防止が実現されるばかりでなく、外部から抽出反応を阻害する危険因子の混入をはるかに少なくできる。したがって、遺伝子診断などに使われる核酸を高い信頼度をもって抽出することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】一般的な、核酸抽出プロセスの共通工程を示す図である。
【図２】本発明の核酸抽出用容器を示す図である。
【図３】本発明の核酸抽出用容器の組立分解図を示す図である。
【図４】本発明の核酸抽出用容器の支持板を示す図である。
【図５】本発明の核酸抽出用容器の回転部材を示す図である（（ａ）上面図、（ｂ）側面図）。
【図６】本発明の核酸抽出用容器を用いた核酸抽出方法の模式図を示す図である（（ａ）注入工程、（ｂ）混合工程、（ｃ）Ｂ／Ｆ分離工程、（ｄ）不要成分液排出工程、（ｅ）核酸回収工程）。
【符号の説明】
１反応槽部分
２ドレインカップ部分
３回収チューブ
４支持板
５排出パイプ
６回転部材
７ドレインカップ・フタ
８回収流路を形成するフタ
９キャップ
１０貫通パイプ
１１、１２腕
１３穴
１４、１５切り欠き
１６穴
１７通路
１８分注ノズルあるいはフィルタチップ
１９リング磁石
２０磁石
２１磁性担体
２２加圧ノズル
２３排気ノズル

Claims

生物試料および試薬を混合して反応せしめる反応槽部分、不要成分液を蓄えるドレインカップ部分、および核酸を回収するチューブとを同一支持板に固定して構成される核酸抽出用の容器であって、さらに、（１）反応槽部分の液を排出するための排出パイプおよび該排出パイプとを回転部材に貫通させて一体形成したものを該反応槽上部に挿入し、該回転部材の貫通パイプ上部から加えられる圧力によって反応槽内の液を排出せしめる構造、（２）回転部材を外部に設けられた駆動手段により回転制御し、反応槽内部の液をドレインカップ部分もしくは回収チューブへ選択的に排出することのできる構造、の両方を有する核酸抽出用容器。
核酸を回収するチューブが支持板に着脱自在に装着できる構造を有している請求項１記載の核酸抽出用容器。
容器とは独立にかつ外部に駆動手段が設けられてなる請求項１または２に記載の核酸抽出用容器。