JP3549436B2 - α-Glycosyl hesperidin, its production method and use - Google Patents

Description

【０００４】
ビタミンＰは、生体内で、ビタミンＣの生理活性、例えば、生体結合組織の主成分であるコラーゲンの合成に必要なプロリンやリジンのヒドロキシル化反応に関与し、また、例えば、チトクロームＣのＦｅ＋＋＋を還元してＦｅ＋＋にするなどの酸化還元反応に関与し、更には、白血球増加による免疫増強作用に関与するなどの増強作用が知られており、生体の健康維持、増進に重要な役割をしている。
【０００５】
ヘスペリジンの用途は、単に栄養素としてのビタミンＰ強化剤にとどまらず、その化学構造、生理作用から、単独で、または他のビタミンなどと併用して、例えば、黄色着色剤、酸化防止剤、安定剤、品質改良剤、紫外線吸収剤などとして飲食物などに、また、ウィルス性疾患、細菌性疾患、循環器疾患、悪性腫瘍など感受性疾患の予防剤、治療剤、すなわち抗感受性疾患剤に、更には、黄色着色剤、安定剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、メラニン生成抑制剤などとして美肌剤、色白剤などの化粧品にまで及び、その用途範囲は極めて広い。
【０００６】
しかしながら、ヘスペリジンは水に難溶で、室温では５０Ｌの水にわずか１ｇ程度（約０．００２ｗ／ｖ％）しか溶けず、使用上困難を極めている。これを改善する方法としては、ヘスペリジンにジメチル硫酸を作用させ、ヘスペリジンをメチル誘導体にして、水溶性を増大する方法が知られている。
【０００７】
しかしながら、この方法は、有機化学的手法により行われ、反応に有毒なジメチル硫酸を使用することから、得られる誘導体の精製に相当の困難が伴い、その無毒性、安全性の確保、経済性などの点で満足すべきものではなかった。また、得られるメチル誘導体が苦味を有している欠点もある。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】
従来のヘスペリジン、またはその誘導体の欠点を解消し、水溶性に優れ、実質的に無味、無臭で、毒性の懸念もなく、加えて、生体内で生理活性を充分発揮しうるヘスペリジン誘導体の実現が強く望まれている。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明は、上記欠点を解消するためのものであって、とりわけ、生化学的手法を利用して、新規ヘスペリジン誘導体を目指して鋭意研究した結果に基づくものである。
【００１０】
その結果、ヘスペリジンとα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に、糖転移酵素を作用させることにより、水溶性に優れ、実質的に無味、無臭で、毒性の懸念もなく、生体内で容易に加水分解され、ヘスペリジン本来の生理活性を発揮する新規α−グリコシル ヘスペリジンを生成することを見い出し、その製造方法、並びに飲食物、感受性疾患の予防剤、治療剤、化粧品など、各種組成物への用途を確立して、本発明を完成した。
【００１１】
また、この糖転移反応により生成したα−グリコシル ヘスペリジンを精製するに際しては、その反応溶液と多孔性合成吸着剤とを接触させ、その吸着性の違いを利用することにより、容易に精製できることも見い出し、本発明を完成した。従って、本発明のα−グリコシル ヘスペリジンの製造方法は、従来技術の欠点を一挙に解消し、その工業化の実現を極めて容易にするものである。
【００１２】
以下、本発明を、詳細に説明する。
【００１３】
本発明に用いるヘスペリジンとしては、高度に精製されたヘスペリジンに限る必要はなく、ヘスペリジンと、例えば、シトロニン、ナリンジン、ルチンなどのフラボノイド配糖体との混合物、更には、ヘスペリジンを含有している各種植物由来の抽出物、ジュース、またはその部分精製物などが、適宜使用できる。
【００１４】
植物組織としては、例えば、柑橘類の果実、果皮、未熟果などが、有利に利用できる。
【００１５】
本発明に用いるα−グルコシル糖化合物としては、同時に用いる糖転移酵素によってヘスペリジンからα−グリコシル ヘスペリジンを生成することのできるものであればよく、例えば、アミロース、デキストリン、シクロデキストリン、マルトオリゴ糖などの澱粉部分加水分解物、更には、液化澱粉、糊化澱粉などが、適宜選ばれる。
【００１６】
従って、α−グリコシル ヘスペリジンの生成を容易にするためには、糖転移酵素に好適なα−グルコシル糖化合物が選ばれる。
【００１７】
例えば、糖転移酵素として、α−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２０）を用いる際には、マルトース、マルトトリオース、マルトテトラオースなどのマルトオリゴ糖、またはＤＥ約１０乃至７０の澱粉部分加水分解物などが好適であり、シクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼ（ＥＣ ２．４．１．１９）を用いる際には、シクロデキストリンまたはＤＥ１以下の澱粉糊化物からＤＥ約６０の澱粉部分加水分解物などが好適であり、α−アミラーゼ（ＥＣ３．２．１．１）を用いる際には、ＤＥ１以下の澱粉糊化物からＤＥ約３０のデキストリン、澱粉部分加水分解物などが、好適である。
【００１８】
また、反応時のα−グルコシル糖化合物濃度は、ヘスペリジンに対して約０．５乃至５０倍の範囲が、好適である。
【００１９】
反応時のヘスペリジン含有液は、ヘスペリジンをできるだけ高濃度に含有するものが望ましく、例えば、ヘスペリジンを、懸濁状で、または、高温で溶解させた、もしくはｐＨ７．０を越えるアルカリ側ｐＨで溶解させた溶液状で、ヘスペリジンを高濃度に含有する溶液が適しており、そのヘスペリジンの濃度は約０．００５ｗ／ｖ％以上の高濃度、望ましくは、約０．０１乃至１０．０ｗ／ｖ％含有している溶液を意味する。
【００２０】
本発明に用いる糖転移酵素は、ヘスペリジンと、この酵素に好適な性質のα−グルコシル糖化合物とを、含有する溶液に作用させる時、ヘスペリジンを分解せずにα−グリコシル ヘスペリジンを生成するものであればよい。
【００２１】
例えば、α−グルコシダーゼは、ブタの肝臓、ソバの種子などの動、植物組織由来の酵素、または、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属などに属するカビ、またはサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属などに属する酵母などの微生物を栄養培地で培養し得られる培養物由来の酵素が、シクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼは、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、クレブシーラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）属などに属する細菌培養物由来の酵素が、α−アミラーゼは、バチルス属などに属する細菌、または、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属などに属するカビ培養物由来の酵素などが、適宜選択できる。これらの糖転移酵素は、前記の条件を満足しさえすれば、必ずしも精製して使用する必要はなく、通常は、粗酵素で本発明の目的を達成することができる。
【００２２】
必要ならば、公知の各種方法で精製して使用してもよい。また、市販の糖転移酵素を利用することもできる。使用酵素量と反応時間とは、密接な関係があり、通常は、経済性の点から約５乃至８０時間で反応を終了するように酵素量が選ばれる。また、固定化された糖転移酵素をバッチ式で繰り返し、反応に、または連続式で連続的反応に利用することも、適宜選択できる。
【００２３】
本発明の反応方法は、ヘスペリジンの仕込濃度を高めた状態で、糖転移酵素を作用させるのが望ましい。例えば、ヘスペリジンを懸濁状で反応せしめる場合には、約０．１乃至２．０ｗ／ｖ％の懸濁状ヘスペリジンと適量のα−グルコシル糖化合物とを含有するヘスペリジン高含有液を、ｐＨ約４．５乃至６．５とし、糖転移酵素が作用しうるできるだけ高温、具体的には、約７０乃至９０℃に維持し、これに糖転移酵素を作用させると、ヘスペリジンがα−グリコシル ヘスペリジンに変換するにつれて懸濁状ヘスペリジンが徐々に溶解し、同時に、α−グリコシル ヘスペリジンが容易に高濃度に生成する。
【００２４】
また、例えば、ヘスペリジンをｐＨ７．０を越えるアルカリ側で反応する場合には、ｐＨ約７．５乃至１０．０の水に約０．２乃至５．０ｗ／ｖ％のヘスペリジンを加熱溶解し、これに適量のα−グルコシル糖化合物を溶解して得られるヘスペリジン高含有液を、糖転移酵素の作用しうるできるだけ高ｐＨ、高温、具体的には、ｐＨ約７．５乃至１０．０、温度約５０乃至８０℃に維持し、これに糖転移酵素を作用させるとα−グリコシル ヘスペリジンを容易に、高濃度に生成する。この際、アルカリ性溶液中のヘスペリジンは、分解を起しやすいので、これを防ぐため、できるだけ遮光、嫌気下に維持するのが望ましい。必要ならば、Ｌ−アスコルビン酸、エリソルビン酸などの酸化防止剤を共存させてもよい。
【００２５】
更に、前記条件を組み合せる方法、例えば、約０．５乃至１０．０ｗ／ｖ％のヘスペリジンと適量のα−グルコシル糖化合物とを含有するヘスペリジン高含有液をｐＨ約７．５乃至１０．０、温度約５０乃至８０℃に維持し、これに糖転移酵素を作用させると、α−グリコシル ヘスペリジンを容易に、高濃度に生成する。
【００２６】
また、ヘスペリジンとして、例えば、約０．１乃至１．０規定のカセイソーダ水溶液、カセイカリ水溶液、炭酸ソーダ水溶液、水酸化カルシウム水、アンモニア水などの強アルカリ性水溶液に、約０．５乃至１０．０ｗ／ｖ％の高濃度に溶解させたものを用い、これに塩酸、硫酸などの酸性水溶液を加えて、酵素が作用し得るｐＨ、望ましくはｐＨ７．０を越えるｐＨに調整するとともに、α−グルコシル糖化合物を加え、直ちに、糖転移酵素を作用させることは、α−グリコシル ヘスペリジンを容易に高濃度に生成させることができるので、極めて好都合である。
【００２７】
この際、せっかく高濃度に溶解させたヘスペリジン溶液も、酸性水溶液でｐＨを調整するとヘスペリジンが析出を起し易いので、そのｐＨ調整前に、α−グルコシル糖化合物や少量のα−グリコシル ヘスペリジンなどを共存させて、ヘスペリジンの析出を抑制しつつ糖転移反応を開始することも有利に実施できる。
【００２８】
また、更に必要ならば、反応前のヘスペリジンの溶解度を高め、ヘスペリジンへの糖転移反応を容易にするために、ヘスペリジン高含有液に水と互いに溶解しうる有機溶媒、例えば、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、ｉｓｏ−プロパノール、ｎ−ブタノール、アセトール、アセトンなどの低級アルコール、低級ケトンなどを共存させることも、適宜選択できる。
【００２９】
また、糖転移反応により生成せしめた比較的高分子のα−グリコシル ヘスペリジンは、必要により、そのままで、または、多孔性合成吸着樹脂により精製した後、グルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３）、またはβ−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２）などのアミラーゼによって部分加水分解し、α−グリコシル ヘスペリジンのα−Ｄ−グルコシル基の数を低減させることができる。例えば、グルコアミラーゼを作用させる場合には、α−マルトシル ヘスペリジン以上の高分子物を加水分解し、グルコースを生成するとともにα−グルコシル ヘスペリジンを蓄積生成させることができ、また、β−アミラーゼを作用させる場合には、α−マルトトリオシル ヘスペリジン以上の高分子物を加水分解し、マルトースを生成するとともに、主にα−グルコシル ヘスペリジンとα−マルトシル ヘスペリジンとの混合物を、蓄積生成させることができる。
【００３０】
前述のようにしてα−グリコシル ヘスペリジンを生成せしめた反応溶液は、そのままでα−グリコシル ヘスペリジン製品にすることもできる。通常は、反応溶液を濾過、濃縮してシラップ状の、更には、乾燥、粉末化して粉末状のα−グリコシル ヘスペリジン製品にする。
【００３１】
本製品は、ビタミンＰ強化剤としてばかりでなく、安全性の高い天然型の黄色着色剤、酸化防止剤、安定剤、品質改良剤、予防剤、治療剤、紫外線吸収剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、抗感受性疾患剤、化粧品、プラスチック製品など、各種組成物への用途に、有利に利用できる。
【００３２】
更に、精製されたα−グリコシル ヘスペリジン製品を製造する場合には、多孔性合成吸着剤による吸着性の差を利用してα−グリコシル ヘスペリジンとα−グルコシル糖化合物などの夾雑物とを分離して精製すればよい。
【００３３】
本発明でいう多孔性合成樹脂とは、多孔性で広い吸着表面積を有し、かつ非イオン性のスチレン−ジビニルベンゼン重合体、フェノール−ホルマリン樹脂、アクリレート樹脂、メタアクリレート樹脂などの合成樹脂であり、例えば、市販されているＲｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ社製造の商品名アンバーライトＸＡＤ−１、アンバーライトＸＡＤ−２、アンバーライトＸＡＤ−４、アンバーライトＸＡＤ−７、アンバーライトＸＡＤ−８、アンバーライトＸＡＤ−１１、アンバーライトＸＡＤ−１２、三菱化成工業株式会社製造の商品名ダイヤイオンＨＰ−１０、ダイヤイオンＨＰ−２０、ダイヤイオンＨＰ−３０、ダイヤイオンＨＰ−４０、ダイヤイオンＨＰ−５０、ＩＭＡＣＴＩ社製造の商品名イマクティＳｙｎ−４２、イマクティＳｙｎ−４４、イマクティＳｙｎ−４６などがある。
【００３４】
本発明のα−グリコシル ヘスペリジンを生成せしめた反応液の精製方法は、反応液を、例えば、多孔性合成吸着剤を充填したカラムに通液すると、α−グリコシル ヘスペリジンおよび比較的少量の未反応ヘスペリジンが多孔性合成吸着剤に吸着するのに対し、多量に共存するα−グルコシル糖化合物、水溶性糖類は吸着されることなく、そのまま流出する。
【００３５】
必要ならば、糖転移酵素の反応終了後、多孔性合成吸着剤に接触させるまでの間に、例えば、反応液を加熱して生じる不溶物を濾過して除去したり、ケイ酸アルミン酸マグネシウム、アルミン酸マグネシウムなどで処理して反応液中の蛋白性物質などを吸着除去したり、強酸性イオン交換樹脂（Ｈ型）、中塩基性または弱塩基性イオン交換樹脂（ＯＨ型）などで処理して脱塩するなどの精製方法を組み合せて、利用することも随意である。
【００３６】
前述のようにして、多孔性合成吸着剤カラムに選択的に吸着したα−グリコシル ヘスペリジンと比較的少量の未反応ヘスペリジンとは、希アルカリ、水などで洗浄した後、比較的少量の有機溶媒または有機溶媒と水との混合液、例えば、メタノール水、エタノール水などを通液すれば、まず、α−グリコシル ヘスペリジンが溶出し、通液量を増すか有機溶媒濃度を高めるかすれば未反応ヘスペリジンが溶出してくる。
【００３７】
このα−グリコシル ヘスペリジン高含有溶出液を蒸溜処理して、まず有機溶媒を溜去した後、適当な濃度にまで濃縮すればα−グリコシル ヘスペリジンを主成分とするシラップ状製品が得られる。更に、これを乾燥し粉末化することによって、α−グリコシル ヘスペリジンを主成分とする粉末状製品が得られる。
【００３８】
この有機溶媒によるα−グリコシル ヘスペリジンおよび未反応ヘスペリジンの溶出操作は、同時に、多孔性合成吸着剤の再生操作にもなるので、この多孔性合成吸着剤の繰り返し使用を可能にする。
【００３９】
また、本発明の多孔性合成吸着剤による精製は、α−グルコシル糖化合物、水溶性糖類だけでなく、水溶性の塩類などの夾雑物も同時に除去できる特長を有している。このようにして得られるα−グリコシル ヘスペリジンは、次の特長を有している。
【００４０】
（１）ヘスペリジンと比較してα−グリコシル ヘスペリジンは、水溶性が極めて大きい。また、α−グリコシル ヘスペリジンは、ヘスペリジン含有水溶液からのヘスペリジンの析出を抑制し、該溶液の白濁を防止する。このことから、α−グリコシル ヘスペリジンは、柑橘類果汁に含まれるヘスペリジンの析出を抑制し、白濁を防止することのできる安定剤として有利に利用できる。
（２）ヘスペリジンと比較してα−グリコシル ヘスペリジンは、耐光性、安定性が大きい。
（３）α−グリコシル ヘスペリジンは、体内の酵素によりヘスペリジンとグルコースとに加水分解され、ヘスペリジン本来の生理活性（ビタミンＰ）を示す。また、α−グリコシル ヘスペリジンは、チアミン、リボフラビン、ビタミンＣ、ビタミンＥなど他のビタミンや酸化防止剤の場合とは違って、実質的に無味、無臭であって、変色、褐変、異臭発生の懸念もなく安心して利用でき、α−グリコシル ヘスペリジンを、ビタミンや酸化防止剤の１種または２種以上と併用することも好都合である。また、ビタミンＣとの併用により、それらの持つ生理活性を増強させることができる。
（４）α−グルコシル糖化合物を含有する製品の場合には、α−グリコシル ヘスペリジンの効果を発揮するのみならず、α−グルコシル糖化合物が賦形、増量効や、甘味効果を発揮することができ、また、α−グルコシル糖化合物を除去した精製製品の場合には、ほとんど賦形、増量することなくα−グリコシル ヘスペリジンの効果を発揮することができ、また、実質的に無味、無臭なので自由に調味、調香することができる。
【００４１】
これらの特長から、α−グリコシル ヘスペリジンは安全性の高い天然型のビタミンＰ強化剤としてばかりでなく、黄色着色剤、酸化防止剤、安定剤、品質改良剤、ウィルス性疾患、細菌性疾患、循環器疾患、悪性腫瘍など感受性疾患の予防剤、治療剤、紫外線吸収剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、抗感受性疾患剤、美肌剤、色白剤などの化粧品、更には、プラスチック製品など、各種組成物への用途に有利に利用することができる。
【００４２】
またα−グリコシル ヘスペリジンは、酸味、塩から味、渋味、旨味、苦味などの呈味を有する各種物質ともよく調和し、耐酸性、耐熱性も大きいので、普通一般の飲食物、嗜好物、例えば、調味料、和菓子、洋菓子、氷菓、飲料、スプレッド、ペースト、漬物、ビン缶詰、畜肉加工品、魚肉・水産加工品、乳・卵加工品、野菜加工品、果実加工品、穀類加工品など、広い範囲に利用することができる。また、家畜、家禽、蜜蜂、蚕、魚などの飼育動物のための飼料、餌料などにビタミンＰ強化剤、嗜好性向上などの目的で配合して利用することも、好都合である。
【００４３】
その他、タバコ、トローチ、肝油ドロップ、複合ビタミン剤、口中清涼剤、口中香錠、うがい薬、経管栄養剤、内服薬、注射剤、練歯みがき、口紅、リップクリーム、日焼け止めなど各種固状、ペースト状、液状の嗜好物、感受性疾患の予防剤、治療剤、すなわち、抗感受性疾患剤、美肌剤、色白剤などの化粧品などに配合して利用することも、有利に実施でき、更には、紫外線吸収剤、劣化防止剤などとして、プラスチック製品などに配合して利用することも、有利に実施できる。
【００４４】
また、本発明でいう感受性疾患とは、α−グリコシル ヘスペリジンによって予防され若しくは治療される疾患であり、それが、例えば、ウィルス性疾患、細菌性疾患、外傷性疾患、免疫性疾患、リューマチ、糖尿病、循環器疾患、悪性腫瘍などであってもよい。α−グリコシル ヘスペリジンの感受性疾患予防剤、治療剤は、その目的に応じてその形状を自由に選択できる。例えば、噴霧剤、点眼剤、点鼻剤、うがい剤、注射剤などの液剤、軟膏、はっぷ剤、クリームのようなペースト剤、粉剤、顆粒、カプセル剤、錠剤などの固剤などである。製剤に当たっては、必要に応じて、他の成分、例えば、治療剤、生理活性物質、抗生物質、補助剤、増量剤、安定剤、着色剤、着香剤などの１種また２種以上と併用することも、随意である。
【００４５】
投与量は、含量、投与経路、投与頻度などによって、適宜調節することができる。通常、α−グリコシル ヘスペリジンとして、成人１日当り、約０．００１乃至１０．０グラムの範囲が好適である。
【００４６】
また、化粧品の場合も、大体、前述の予防剤、治療剤に準じて、利用することができる。
【００４７】
α−グリコシル ヘスペリジンを利用する方法としては、それら各種組成物の製品が、完成するまでの工程で、例えば、混和、混捏、溶解、浸漬、浸透、散布、塗布、噴霧、注入など、公知の方法が、適宜選ばれる。
【００４８】
以下、本発明のα−グリコシル ヘスペリジンの一例を実験で説明する。
【００４９】
（実験１）
＜α−グリコシル ヘスペリジンの調製＞
（１）糖転移反応
ヘスペリジン１重量部およびデキストリン（ＤＥ２０）６重量部に水５，００重量部を加えて加熱、溶解し、これにバチルス・ステアロサーモフィルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）由来のシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所販売）をデキストリングラム当り２０単位加え、ｐＨ６．０、７０℃に維持して１８時間反応させ、ヘスペリジンの約７０％をα−グリコシル ヘスペリジンに転換し、その後、加熱失活させ、α−グリコシル ヘスペリジンとともに未反応ヘスペリジンを含有する反応液を得た。
【００５０】
（２）精製
（１）の方法で得た反応液を濾過し、濾液を多孔性合成吸着剤、商品名ダイヤイオンＨＰ−１０（三菱化成工業株式会社販売）を充填したカラムにＳＶ２で通液した。このカラムを水で洗浄した後、５０ｖ／ｖ％エタノールを通液し、この溶出液を濃縮して溶媒を溜去し、粉末化して淡黄色のα−グリコシル ヘスペリジン標品［Ｉ］を原料のヘスペリジン重量に対して約１３０％の収率で得た。
【００５１】
（３）アミラーゼによる加水分解
（２）の方法で得たα−グリコシル ヘスペリジン標品［Ｉ］を水に１ｗ／ｖ％に溶解し、これにグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３、生化学工業株式会社販売）を該標品グラム当り１００単位加え、ｐＨ５．０、５５℃に維持して５時間反応させた。反応液を加熱して酵素を失活させ、濾過し、濾液を多孔性合成吸着剤、商品名ダイヤイオンＨＰ−１０（三菱化成工業株式会社販売）のカラムにＳＶ２で通液した。その結果、溶液中のα−グリコシル ヘスペリジンと未反応ヘスペリジンとが多孔性合成吸着剤に吸着し、グルコース、塩類などは吸着することなく流出した。次いで、カラムを水で通液、洗浄した後、エタノール水溶液濃度を段階的に高めながら通液し、α−グリコシル ヘスペリジン画分を採取し、減圧濃縮し、粉末化して、淡黄色のα−グリコシル ヘスペリジン標品［ＩＩ］を固形物当り原料のヘスペリジン重量に対して約７０％の収率で得た。
【００５２】
また、グルコアミラーゼに代えて、β−アミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．２、生化学工業株式会社販売）を用いて、前述の方法に準じて、α−グリコシル ヘスペリジン標品［Ｉ］を加水分解し、精製、濃縮、粉末化して、淡黄色のα−グリコシル ヘスペリジン標品［ＩＩＩ］を原料のヘスペリジン重量に対して約７０％の収率で得た。
【００５３】
（実験２）
＜α−グリコシル ヘスペリジンの理化学的性質＞
（１）水溶性の向上
実験１（１）の方法で糖転移反応し調製したα−グリコシル ヘスペリジン含反応液と、この方法で用いる酵素を予め加熱失活させて実験１（１）の方法に準じて処理した対照液とを、４℃の冷室に２日間放置したところ、対照液では、ヘスペリジンが析出して白濁したのに対し、α−グリコシル ヘスペリジン含有反応液は透明のままであった。
【００５４】
従って、糖転移反応により生成したα−グリコシル ヘスペリジンは、水溶性が著しく向上している。換言すれば、α−グリコシル ヘスペリジンは、水溶液中に共存する未反応ヘスペリジンの析出を抑制し、該溶液の白濁を防止している。
【００５５】
（２）溶剤に対する溶解性
α−グリコシル ヘスペリジン標品は、水、０．１規定カセイソーダ、０．１規定塩酸に易溶、メタノール、エタノールに微溶、エーテル、ベンゼン、クロロホルムに不溶。
【００５６】
（３） 紫外線吸収スペクトル
α−グリコシル ヘスペリジン標品を０．１規定カセイソーダ溶液に溶解して紫外線吸収スペクトルを調べたところ、標品［Ｉ］、標品［ＩＩ］および標品［ＩＩＩ］のいずれも、ヘスペリジンの場合と同じ２８６ｎｍ付近に吸収極大を有していた。
【００５７】
（４） 赤外線吸収スペクトル
ＫＢｒ錠剤法によって、α−グリコシル ヘスペリジン標品の赤外線吸収スペトルを調べた。α−グリコシル ヘスペリジン標品［Ｉ］の結果を第１図に、標品［ＩＩ］の結果を第２図に示す。
【００５８】
（５）加水分解に対する安定性
（ａ）α−グリコシル ヘスペリジン標品は、ブタの肝臓由来のα−グルコシダーゼ（ＥＣ ３．２．１．２０）により加水分解され、ヘスペリジンとＤ−グルコースとを生成する。
（ｂ）β−グルコシダーゼによっては加水分解されない。
【００５９】
（６）薄層クロマトグラフィー
（ａ）分析方法
プレート；メルク社製
商品名キーゼルゲル６０Ｆ_２５４
展開溶媒；ｎ−ブタノール：酢酸：水＝４：２：１
発色剤 ；１ｗ／ｗ％硫酸第二セリウム１０ｗ／ｗ％硫酸水溶液
（ｂ）分析結果
α−グリコシル ヘスペリジン標品を分析したところ、標品［Ｉ］の場合には、Ｒｆ０．６９のヘスペリジンのスポット以外に、新たに、Ｒｆ０．４８、０．３４、０．２２、０．１６、０．１０、０．０４および原点にスポットが認められ、標品［ＩＩ］の場合には、Ｒｆ０．４８のスポットが認められ、標品［ＩＩＩ］の場合には、Ｒｆ０．４８、０．３４のスポットが認められた。
【００６０】
以上の理化学的性質から、標品［Ｉ］、標品［ＩＩ］および標品［ＩＩＩ］に含まれるＲｆ０．４８を示す物質は、ヘスペリジン１モルにＤ−グルコース残基が１モルα結合したα−グルコシル ヘスペリジン（別名、ヘスペリジンモノグルコサイド）と判断され、標品［Ｉ］および標品［ＩＩＩ］に含まれるＲｆ０．３４を示す物質は、ヘスペリジン１モルにＤ−グルコースが２モルα結合したα−ジグルコシル ヘスペリジン（別名、ヘスペリジンジグルコサイド）と判断され、同様に、標品［Ｉ］に含まれるＲｆ０．２２以下の複数のスポットを示す物質は、ヘスペリジン１モルにＤ−グルコース残基が３モル以上α結合したα−オリゴグルコシル ヘスペリジンであると判断される。
【００６１】
このように、本願発明のα−グリコシル ヘスペリジンは、ヘスペリジンにＤ−グルコース残基が等モル以上α結合した水溶性良好な新規ヘスペリジン糖誘導体であって、生体内に摂取されると、α−グルコシダーゼによって容易に加水分解され、ヘスペリジン本来の生理活性を発揮する。
【００６２】
（実験３）
＜急性毒性＞
７周令のｄｄ系マウスを使用して、実験１（２）の方法で調製したα−グリコシル スペリジン標品［Ｉ］を経口投与して、急性毒性テストをしたところ、体重１ｋｇ当たり、５ｇまで死亡例は見られなかった。従って、本物質の毒性は極めて低い。なお、実験１（３）の方法で調製したα−グリコシル ヘスペリジン標品［ＩＩ］を用いて同様に本テストを行ったところ、前述と同様の結果が得られ、毒性が極めて低いことが、判明した。
【００６３】
以下、本発明の実施例として、α−グリコシル ヘスペリジンの製造例を実施例Ａで、α−グリコシル ヘスペリジンの各種組成物への用途例を実施例Ｂで述べる。
【００６４】
（実施例Ａ−１）
＜α−グリコシル ヘスペリジン＞
ヘスペリジン１重量部を１規定カセイソーダ溶液４重量部で溶解し、これに０．０１規塩酸溶液を加えて中和するとともにデキストリン（ＤＥ１０）４重量部を加え、直ちにバチルス・ステアロサーモフィルス由来のシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼ（株式会社林原生物化学研究所販売）をデキストリングラム当り２０単位加え、ｐＨ６．０、７５℃に維持して、攪拌しつつ２４時間反応させた。反応液を薄層クロマトグラフィーで分析したところ、ヘスペリジンの約７０％が、α−グルコシル ヘスペリジン、α−ジグルコシル ヘスペリジン、α−トリグルコシルヘスペリジン、α−テトラグルコシル ヘスペリジン、α−ペンタグルコシル ヘスペリジンなどのα−グリコシル ヘスペリジンに転換していた。反応液を加熱して酵素を失活させ、濾過し、濾液を、常法に従って、イオン交換樹脂（Ｈ型およびＯＨ型）で脱塩精製し、濃縮して、シラップ状のα−グルコシル糖化合物を含有するα−グリコシル ヘスペリジン製品を、固形物当り原料重量に対して約９０％の収率で得た。
【００６５】
本品は、ビタミンＰ強化剤としてばかりでなく、安全性の高い天然型の黄色着色剤、酸化防止剤、安定剤、品質改良剤、予防剤、治療剤、紫外線吸収剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、抗感受性疾患剤、化粧品、プラスチック製品など、各種組成物への用途に有利に利用できる。
【００６６】
（実施例Ａ−２）
＜α−グルコシル ヘスペリジン＞
実施例Ａ−１の方法に準じて調製したシラップ状のα−グルコシル糖化合物を有するα−グリコシル ヘスペリジン製品１重量部を水４重量部に溶解し、これにグルコアミラーゼ（ＥＣ ３．２．１．３、生化学工業株式会社販売）をα−グリコシル ヘスペリジン製品固形物グラム当り１００単位加え、５０℃、５時間反応させた。反応液を薄層クロマトグラフィーで分析したところ、α−グリコシル ヘスペリジンは、α−グルコシル ヘスペリジンに転換していた。
【００６７】
反応液を加熱して酵素を失活させ、濾過し、濾液を多孔性合成吸着剤、商品名ダイヤイオンＨＰ−１０（三菱化成工業株式会社販売）のカラムにＳＶ２で通液した。その結果、溶液中のα−グルコシル ヘスペリジンと未反応ヘスペリジンとが多孔性合成吸着剤に吸着し、グルコース、塩類などは吸着することなく流出した。次いで、カラムを水で通液、洗浄した後、エタノール水溶液濃度を段階的に高めながら通液し、α−グルコシル ヘスペリジン画分を採取し、減圧濃縮し、粉末化して、粉末状のα−グルコシル ヘスペリジンを固形物当り原料のヘスペリジン重量に対して約６０％の収率で得た。
【００６８】
α−グルコシル ヘスペリジンを酸で加水分解したところ、ヘスペリジン１モルに対し、Ｌ−ラムノース１モル、Ｄ−グルコース２モルを生成し、また、α−グルコシル ヘスペリジンに、ブタの肝臓から抽出し部分精製したα−グルコシダーゼを作用させると、ヘスペリジンとＤ−グルコースとに加水分解されることが判明した。
【００６９】
本α−グルコシル ヘスペリジンは、高度に精製された水溶性の高いビタミンＰ強化剤として、また、黄色着色剤、酸化防止剤、安定剤、品質改良剤、予防剤、治療剤、紫外線吸収剤などとして、飲食物、嗜好物、抗感受性疾患剤、化粧品など、各種組成物への用途に、有利に利用できる。
【００７０】
（実施例Ａ−３）
＜α−グリコシル ヘスペリジン＞
ヘスペリジン１重量部を水５００重量部にｐＨ９．５で加熱溶解し、別にデキストリン（ＤＥ８）１０重量部を水１０重量部に加熱溶解し、次いで、これら溶液を混合し、これにシクロマルトデキストリン グルカノトランスフェラーゼを、デキストリングラム当り３０単位加え、ｐＨ８．２、６５℃に維持して、攪拌しつつ４０時間反応させた。反応液を薄層クロマトグラフィーで分析したところ、ヘスペリジンの約８０％がα−グリコシル ヘスペリジンに転換していた。反応液を加熱して酵素を失活させた後、濾過し、濾液を多孔性合成吸着剤、商品名アンバーライトＸＡＤ−７（Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓ社製造）のカラムにＳＶ１．５で通液した。
【００７１】
その結果、溶液中のα−グリコシル ヘスペリジンと未反応ヘスペリジンとが多孔性合成吸着剤に吸着し、デキストリン、オリゴ糖、塩類などは吸着することなく流出した。このカラムを水で通液、洗浄した後、５０ｖ／ｖ％メタノールを通液して、α−グリコシル ヘスペリジンおよびヘスペリジンを溶出し、これを濃縮し、粉末化して、粉末状α−グリコシル ヘスペリジン製品を原料のヘスペリジン重量に対して約１２０％の収率で得た。
【００７２】
本品は、水溶性の高いビタミンＰ強化剤としてばかりでなく、安全性の高い天然型の黄色着色剤、酸化防止剤、安定剤、品質改良剤、予防剤、治療剤、紫外線吸収剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、抗感受性疾患剤、化粧品、プラスチック製品など、各種組成物への用途に有利に利用できる。
【００７３】
（実施例Ａ−４）
＜α−グリコシル ヘスペリジン＞
（１）α−グルコシダーゼ標品の調製
マルトース４ｗ／ｖ％、リン酸１カリウム０．１ｗ／ｖ％、硝酸アンモニウム０．１ｗ／ｖ％、硫酸マグネシウム０．０５ｗ／ｖ％、塩化カリウム０．０５ｗ／ｖ％、ポリペプトン０．２ｗ／ｖ％、炭酸カルシウム１ｗ／ｖ％（別に、乾熱滅菌して、植菌時には無菌的に添加する。）および水からなる液体培地５００重量部に、ムコール・ジャバニカス（Ｍｕｃｏｒ ｊａｖａｎｉｃｕｓ）ＩＦＯ ４５７０を温度３０℃で、４４時間振盪培養した。培養終了後、菌糸体を採取し、その湿菌糸体４８重量部に対し、０．５Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）に溶解した４Ｍ尿素液５００重量部を加え、３０℃で４０時間静置した後、遠心分離した。この上清を流水中で一夜透析した後、硫安０．９飽和とし、４℃で一夜放置して生成した塩析物を濾取し、０．０１Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ５．３）５０重量部に懸濁溶解した後、遠心分離して上清を採取し、α−グルコシダーゼ標品とした。
【００７４】
（２）α−グリコシル ヘスペリジンの調製
ヘスペリジン５重量部を０．５規定カセイソーダ溶液１００重量部に加熱溶解し、これに０．０１規定塩酸溶液を加えてｐＨ９．５にするとともに、デキストリン（ＤＥ３０）２０重量部を加え、直ちに（１）の方法で調製したα−グルコシダーゼ標品１０重量部を加え、ｐＨ８．５に維持して攪拌しつつ５５℃で４０時間反応させた。反応液を薄層ペーパークロマトグラフィーで分析したところ、ヘスペリジンの約０％がα−グリコシル ヘスペリジンに転換していた。反応液を実施例Ａ−３と同様に精製し、濃縮、粉末化して粉末状α−グリコシル ヘスペリジン製品を原料のヘスペリジン重量に対して約１１０％の収率で得た。
【００７５】
本品は、実施例Ａ−３の場合と同様に、水溶性の高いビタミンＰ強化剤としてばかりでなく、安全性の高い天然型の黄色着色剤、酸化防止剤、安定剤、品質改良剤、予防剤、治療剤、紫外線吸収剤などとして、各種組成物への用途に利用できる。
【００７６】
（実施例Ｂ−１）
＜ハードキャンディー＞
還元麦芽糖水飴（林原商事株式会社販売、登録商標マビット）１，５００重量部を加熱、減圧下で水分約２％以下になるまで濃縮し、これにクエン酸１５重量部および実施例Ａ−３の方法で得た粉末状α−グリコシル ヘスペリジン１重量部および少量のレモン香料を混和し、次いで常法に従って、成形、包装してハードキャンディーを得た。
【００７７】
本品は、ビタミンＰを強化した黄色のレモンキャンディーであって、低う蝕性、低カロリーである。
【００７８】
（実施例Ｂ−２）
＜フキの水煮＞
フキを皮むきし、適当な長さに切断して、薄い食塩水に数時間浸し、これを実施例Ａ−１の方法で得たシラップ状α−グリコシル ヘスペリジンと青色１号とを配合して調製した緑色着色料を含有する液で煮込んで、緑色の鮮かなフキの水煮を得た。
【００７９】
本品は、各種和風料理の材料として色どりを添えるとともに、食物繊維としての生理効果をも発揮する。
【００８０】
（実施例Ｂ−３）
＜求肥＞
モチ種澱粉１重量部に水１．２重量部を混合し、加熱糊化しつつ、これに砂糖１．５重量、結晶性β−マルトース（林原株式会社製造、登録商標サンマルト）０．７重量部、水飴０．３重量部および実施例Ａ−１の方法で得たシラップ状α−グリコシル ヘスペリジン０．２重量部を混和し、以後、常法に従って、成形、包装して求肥を製造した。
【００８１】
本品は、風味、口当りとも良好な求肥で、きびだんご風の和菓子である。
【００８２】
（実施例Ｂ−４）
＜混合甘味料＞
はちみつ１００重量部、異性化糖５０重量部、黒砂糖２重量部および実施例Ａ−４の方法で得た粉末状α−グリコシル ヘスペリジン１重量部を混合して混合甘味料を得た。
【００８３】
本品はビタミンＰを強化した甘味料で健康食品として好適である。
【００８４】
（実施例Ｂ−５）
＜サンドクリーム＞
結晶性α−マルトース（林原株式会社製造、登録商標ファイントース）１，２００重量部、ショートニング１，０００重量部、実施例Ａ−３の方法で得た粉末状α−グリコシル ヘスペリジン１０重量部、レシチン１重量部、レモンオイル１重量部、バニラオイル１重量部を常法により混和してサンドクリームを製造した。
【００８５】
本品は、ビタミンＰ強化、黄色着色したサンドクリームで、口当り、溶け具合、風味とも良好である。
【００８６】
（実施例Ｂ−６）
＜錠剤＞
アスコルビン酸２０重量部に結晶性β−マルトース１３重量部、コーンスターチ４重量部および実施例Ａ−２の方法で得た粉末状α−グルコシル ヘスペリジン３重量部を均一に混合した後、直径１２ｍｍ、２０Ｒ杵を用いて、打錠し錠剤を得た。
【００８７】
本品は、アスコルビン酸とα−グルコシル ヘスペリジンとの複合ビタミン剤でアスコルビン酸の安定性もよく、飲み易い錠剤である。
【００８８】
（実施例Ｂ−７）
＜カプセル剤＞
酢酸カルシウム・一水塩１０重量部、Ｌ−乳酸マグネシウム・三水塩５０重量部、マルトース５７重量部、実施例Ａ−２の方法で得たα−グルコシル ヘスペリジン２０重量部及びエイコサペンタエン酸２０％含有γ−シクロデキストリン包接化合物１２重量部を均一に混合し、顆粒成形機にかけて顆粒とした後、常法に従って、ゼラチンカプセルに封入して、一カプセル１５０ｍｇ入のカプセル剤を製造した。
【００８９】
本品は、血中コレステロール低下剤、免疫賦活剤、美肌剤などとして、感受性疾患の予防剤、治療剤、健康増進用食品などとして有利に利用できる。
【００９０】
（実施例Ｂ−８）
＜軟膏＞
酢酸ナトリウム・三水塩１重量部、ＤＬ−乳酸カルシウム４重量部をグリセリン１０重部と均一に混合し、この混合物を、ワセリン５０重量部、木ロウ１０重量部、ラノリン１０重量部、ゴマ油１４．５重量部、実施例Ａ−４の方法で得たα−グリコシル ヘスペリジン１重量部及びハッカ油０．５重量部の混合物に加え、更に均一に混和して軟膏を製造した。
【００９１】
本品は、日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして、更には外傷、火傷の治癒促進剤などとして、有利に利用できる。
【００９２】
（実施例Ｂ−９）
＜注射剤＞
実施例Ａ−２の方法で得たα−グルコシル ヘスペリジンを水に溶解し、常法に従って、精製濾過してパイロゲンフリーとし、この溶液を２０ｍＬ容アンプルにα−グルコシル ヘスペリジンが５０ｍｇになるように分注し、これを減圧乾燥し、封入して注射剤を製造した。
【００９３】
本注射剤は、単体で、または、他のビタミン、ミネラルなどと混合して筋肉内又は静脈内に投与できる。また、本品は、低温貯蔵の必要もなく、使用に際しての生理食塩水などへの溶解性は極めて良好である。
【００９４】
（実施例Ｂ−１０）
＜注射剤＞
塩化ナトリウム６重量部、塩化カリウム０．３重量部、塩化カルシウム０．２重量部、乳ナトリウム３．１重量部、マルトース４５重量部及び実施例Ａ−２の方法で得たα−グルコシル ヘスペリジン１重量部を水１，０００重量部に溶解し、常法に従って、精製濾過してパイロゲンフリーとし、この溶液を滅菌したプラスチック容器に２５０ｍＬずつ充填して、注射剤を製造した。
【００９５】
本品は、ビタミンＰ補給としてだけでなく、カロリー補給、ミネラル補給のための注射剤で、病中、病後の治療促進、回復促進などに有利に利用できる。
【００９６】
（実施例Ｂ−１１）
＜経管栄養剤＞
結晶性α−マルトース２０重量部、グリシン１．１重量部、グルタミン酸ナトリウム０．１重量部、食塩１．２重量部、クエン酸１重量部、乳酸カルシウム０．４重量部、炭酸マグネシウム０．１重量部、実施例Ａ−３の方法で得たα−グリコシル ヘスペリジン０．１重量部、チアミン０．０１重量部及びリボフラビン０．０１重量部からなる配合物を調製する。この配合物２４ｇずつをラミネートアルミ製小袋に充填し、ヒートシールして経管栄養剤を調製した。
【００９７】
本経管栄養剤は、一袋を約３００乃至５００ｍＬの水に溶解し、経管方法により鼻腔、胃、腸などへの経口的又は非経口的栄養補給液としても有利に利用できる。
【００９８】
（実施例Ｂ−１２）
＜浴用剤＞
ＤＬ−乳酸ナトリウム２１重量部、ピルビン酸ナリトウム８重量部、実施例Ａ−１の方法で得たα−グリコシル ヘスペリジン５重量部及びエタノール４０重量部を、精製水２６重量部及び着色料、香料の適量と混合し、浴用剤を製造した。
【００９９】
本品は、美肌剤、色白剤として好適であり、入浴用の湯に１００乃至１０，０００倍に希釈て利用すればよい。本品は、入浴用の湯の場合と同様に、洗顔用水、化粧水などに希釈して利用することも、有利に実施できる。
【０１００】
（実施例Ｂ−１３）
＜乳液＞
ポリオキシエチレンベヘニルエーテル０．５重量部、テトラオレイン酸ポリオキシエチレンソルビトール１重量部、親油型モノステアリン酸グリセリン１重量部、ピルビン酸０．５重量部、ベヘニルアルコール０．５重量部、アボガド油１重量部、実施例Ａ−３の方法で得たα−グリコシル ヘスペリジン１重量部、ビタミンＥ及び防腐剤の適量を、常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸ナトリウム１重量部、１，３−ブチレングリコール５重量部、カルボキシビニルポニマー０．１重量部及び精製水８５．３重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて攪拌混合し、乳液を製造した。
【０１０１】
本品は、日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして、有利に利用できる。
【０１０２】
（実施例Ｂ−１４）
＜クリーム＞
モノステアリン酸ポリオキシエチレングリコール２重量部、自己乳化型モノステアリン酸グリセリン５重量部、実施例Ａ−２の方法で得たα−グルコシル ヘスペリジン２重量部、流動パラフィン１重量部、トリオクタン酸グリセリル１０重量部及び防腐剤の適量を、常法に従って加熱溶解し、これにＬ−乳酸２重量部、１，３−ブチレングリコール５重量部及び精製水６６重量部を加え、ホモゲナイザーにかけ乳化し、更に香料の適量を加えて攪拌混合しクリームを製造した。
【０１０３】
本品は、日焼け止め、美肌剤、色白剤などとして有利に利用できる。
【０１０４】
【発明の効果】
本文で述べたごとく、本発明の新規物質であるヘスペリジンにＤ−グルコース残基が等モル以上α結合しているα−グリコシル ヘスペリジンは、水溶性に優れ、実質的に無味、無臭で、毒性の懸念もなく、生体内で容易にヘスペリジンとＤ−グルコースとに加水分解され、ヘスペリジン本来の生理活性を発揮する。
【０１０５】
また、このα−グリコシル ヘスペリジンが、ヘスペリジンとα−グルコシル糖化合物とを含有する溶液に、糖転移酵素を作用させる生化学的手法により、容易に生成できることから、経済性に優れ、その工業実施も容易である。
【０１０６】
更に、ヘスペリジンの仕込濃度を高めて反応させることができ、α−グリコシル ヘスペリジンの濃度を、容易に高濃度に生成しうることを見い出し、併せて、この反応液の精製に際して、反応液を多孔性合成吸着剤と接触させてα−グリコシル ヘスペリジンを精製できることも見い出したことにより、α−グリコシル ヘスペリジンの大量製造を、極めて容易にするものである。
【０１０７】
また、このようにして得られるα−グリコシル ヘスペリジンは、水溶性良好、耐光性・安定性良好、充分な生理活性を発揮するなどの特徴を有しており、安全性の高い天然型のビタミンＰ強化剤としてばかりでなく、黄色着色剤、酸化防止剤、安定剤、品質改良剤、予防剤、治療剤、紫外線吸収剤、劣化防止剤などとして、飲食物、嗜好物、飼料、餌料、抗感受性疾患剤、美肌剤、色白剤などの化粧品、更には、プラスチック製品など、各種組成物への用途に有利に利用される。
【０１０８】
従って、本発明によるα−グリコシル ヘスペリジンの工業的製造法と、その用途の確立は、飲食品、化粧品、医薬品、プラスチック産業における工業的意義が極めて大きい。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の一例として、α−グリコシル ヘスペリジン標品［Ｉ］の赤外線吸収スペクトルである。
【図２】本発明の一例として、α−グリコシル ヘスペリジン標品［ＩＩ］の赤外線吸収スペクトルである。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a novel α-glycosyl hesperidin, a method for producing the same, and a use thereof. More specifically, α-glycosyl hesperidin in which a D-glucose residue is α-bonded to hesperidin in equimolar or more, and hesperidin and α A method for producing α-glycosyl hesperidin, comprising reacting a solution containing a glucosyl sugar compound with a glycosyltransferase to produce a novel α-glycosyl hesperidin, and collecting the obtained α-glycosyl hesperidin. Various compositions such as beverages characterized by containing the obtained α-glycosyl hesperidin, foods and drinks such as processed foods, prophylactic agents for susceptible diseases, anti-sensitive diseases agents such as therapeutic agents, cosmetics such as skin-skin agents, fair-skin agents, etc. It relates to the use for things.
[0002]
[Prior art]
Hesperidin has the chemical structure shown in the following chemical formula 1, and has long been known as a vitamin P having physiological actions such as strengthening capillaries, preventing bleeding and regulating blood pressure, and as a yellow pigment, and has been used for foods, pharmaceuticals, and cosmetics. It is used for such purposes.
[0003]
Embedded image

[0004]
Vitamin P participates in vivo in the physiological activity of vitamin C, for example, the hydroxylation reaction of proline and lysine necessary for the synthesis of collagen, which is a main component of biological connective tissue. It is known to be involved in oxidation-reduction reactions such as reduction to Fe ++, and furthermore to enhance immunity by leukocyte increase. It plays an important role in maintaining and promoting the health of living bodies. I have.
[0005]
Hesperidin is used not only as a vitamin P fortifier as a nutrient, but also because of its chemical structure and physiological action, alone or in combination with other vitamins, for example, yellow colorant, antioxidant, stabilizer , As a quality improving agent, an ultraviolet absorber, etc., in foods and drinks, and as a prophylactic or therapeutic agent for susceptible diseases such as viral diseases, bacterial diseases, cardiovascular diseases, malignant tumors, that is, an anti-sensitive disease agent, and It has a very wide range of uses, including yellow colorants, stabilizers, antioxidants, ultraviolet absorbers, melanin production inhibitors, and cosmetics such as skin-care agents and fair-skin agents.
[0006]
However, hesperidin is hardly soluble in water, and only about 1 g (about 0.002 w / v%) is soluble in 50 L of water at room temperature, which is extremely difficult to use. As a method for improving this, a method is known in which dimethyl sulfate is allowed to act on hesperidin to convert hesperidin into a methyl derivative to increase water solubility.
[0007]
However, this method is carried out by an organic chemical method and uses toxic dimethyl sulfate for the reaction, so that the purification of the resulting derivative involves considerable difficulties, and its nontoxicity, safety, economy, etc. Was not satisfactory in that respect. There is also a disadvantage that the resulting methyl derivative has a bitter taste.
[0008]
[Problems to be solved by the invention]
Eliminates the drawbacks of conventional hesperidin or its derivatives, has excellent water solubility, is virtually tasteless, odorless, and has no concerns about toxicity.In addition, it has realized the realization of hesperidin derivatives that can sufficiently exhibit physiological activity in vivo. It is strongly desired.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present invention has been made to solve the above-mentioned drawbacks, and is based on the results of intensive studies aimed at novel hesperidin derivatives using biochemical techniques.
[0010]
As a result, by reacting a glycosyltransferase with a solution containing hesperidin and an α-glucosyl sugar compound, the solution is excellent in water solubility, substantially tasteless, odorless, has no toxicity concerns, and is easily in vivo. It has been found that it is hydrolyzed to produce a novel α-glycosyl hesperidin which exhibits the intrinsic biological activity of hesperidin, its production method, and its use in various compositions such as foods and drinks, preventive agents for susceptible diseases, therapeutic agents, and cosmetics. Was established, and the present invention was completed.
[0011]
It has also been found that, when purifying α-glycosyl hesperidin produced by this transglycosylation reaction, the reaction solution is brought into contact with a porous synthetic adsorbent, and by utilizing the difference in adsorbability, purification can be easily performed. Thus, the present invention has been completed. Therefore, the method for producing α-glycosyl hesperidin according to the present invention eliminates the drawbacks of the prior art at once, and makes it very easy to realize industrialization.
[0012]
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
[0013]
The hesperidin used in the present invention is not limited to highly purified hesperidin, and is a mixture of hesperidin and, for example, flavonoid glycosides such as citronin, naringin, and rutin, and various types containing hesperidin. A plant-derived extract, juice, or a partially purified product thereof can be used as appropriate.
[0014]
As the plant tissue, for example, citrus fruits, pericarp, immature fruits and the like can be advantageously used.
[0015]
As the α-glucosyl sugar compound used in the present invention, any compound capable of producing α-glycosyl hesperidin from hesperidin by simultaneously using a glycosyltransferase may be used, for example, amylose, dextrin, cyclodextrin, starch such as maltooligosaccharide, etc. Partially hydrolysates, furthermore, liquefied starch, gelatinized starch and the like are appropriately selected.
[0016]
Therefore, in order to facilitate the production of α-glycosyl hesperidin, an α-glucosyl sugar compound suitable for a glycosyltransferase is selected.
[0017]
For example, when α-glucosidase (EC 3.2.1.20) is used as a glycosyltransferase, maltooligosaccharides such as maltose, maltotriose, and maltotetraose, or partially hydrolyzed starch having a DE of about 10 to 70 are used. When cyclomaltodextrin glucanotransferase (EC 2.4.1.19) is used, cyclodextrin or a starch hydrolyzate having a DE of about 60 or less can be used. When α-amylase (EC 3.2.1.1) is used, gelatinized starch having a DE of 1 or less, dextrin having a DE of about 30 and partially hydrolyzed starch are preferred.
[0018]
The concentration of the α-glucosyl sugar compound at the time of the reaction is preferably about 0.5 to 50 times that of hesperidin.
[0019]
The liquid containing hesperidin at the time of the reaction is desirably one containing hesperidin as high as possible. For example, hesperidin is dissolved in a suspension or at a high temperature, or dissolved at an alkaline pH exceeding pH 7.0. A solution containing a high concentration of hesperidin in the form of a solution is suitable, and the concentration of hesperidin is high at about 0.005 w / v% or more, preferably about 0.01 to 10.0 w / v%. Means a solution that has
[0020]
The glycosyltransferase used in the present invention is one that produces α-glycosyl hesperidin without decomposing hesperidin when hesperidin and an α-glucosyl sugar compound having properties suitable for this enzyme are allowed to act on a solution containing the same. I just need.
[0021]
For example, α-glucosidase is used in pig liver, buckwheat seeds and other animals, plant tissue-derived enzymes, or fungi belonging to the genus Mucor, Penicillium, or the like, or Saccharomyces. Enzymes derived from cultures obtained by culturing microorganisms such as yeasts belonging to a nutrient medium, cyclomaltodextrin glucanotransferase is an enzyme derived from a bacterial culture belonging to the genus Bacillus, Klebsiella, or the like, As the α-amylase, a bacterium belonging to the genus Bacillus or an enzyme derived from a mold culture belonging to the genus Aspergillus or the like can be appropriately selected. These glycosyltransferases do not necessarily need to be purified and used as long as the above conditions are satisfied. Usually, the purpose of the present invention can be achieved with a crude enzyme.
[0022]
If necessary, it may be used after being purified by various known methods. Alternatively, a commercially available glycosyltransferase can be used. The amount of enzyme used and the reaction time are closely related, and usually the amount of enzyme is selected so that the reaction is completed in about 5 to 80 hours from the viewpoint of economy. In addition, the immobilized glycosyltransferase can be appropriately selected to be repeatedly used in a batch system and used for a reaction or a continuous system for a continuous reaction.
[0023]
In the reaction method of the present invention, it is desirable that the glycosyltransferase is allowed to act in a state where the concentration of hesperidin charged is increased. For example, when hesperidin is allowed to react in suspension, a hesperidin-rich solution containing about 0.1 to 2.0 w / v% of suspended hesperidin and an appropriate amount of an α-glucosyl sugar compound may be reacted at a pH of about When the temperature is maintained at as high as 4.5 to 6.5, at which the glycosyltransferase can act, specifically at about 70 to 90 ° C., and the glycosyltransferase is acted on, the hesperidin is converted to α-glycosyl hesperidin. Suspended hesperidin gradually dissolves as it is converted, while at the same time α-glycosyl hesperidin readily forms at high concentrations.
[0024]
For example, when hesperidin is reacted on the alkali side exceeding pH 7.0, about 0.2 to 5.0 w / v% hesperidin is dissolved by heating in water having a pH of about 7.5 to 10.0, A hesperidin-rich solution obtained by dissolving an appropriate amount of an α-glucosyl sugar compound is added to the solution at a pH as high as possible and at a high temperature at which the glycosyltransferase can act, specifically, at a pH of about 7.5 to 10.0. When maintained at about 50 to 80 ° C. and reacted with glycosyltransferase, α-glycosyl hesperidin is easily produced at a high concentration. At this time, hesperidin in the alkaline solution is liable to be decomposed. Therefore, in order to prevent this, it is desirable to maintain as light and anaerobic as possible. If necessary, an antioxidant such as L-ascorbic acid or erythorbic acid may be co-present.
[0025]
Further, a method of combining the above conditions, for example, a hesperidin-rich solution containing about 0.5 to 10.0% w / v hesperidin and an appropriate amount of an α-glucosyl sugar compound may be prepared at a pH of about 7.5 to 10.0. When the temperature is maintained at about 50 to 80 ° C. and a glycosyltransferase is allowed to act thereon, α-glycosyl hesperidin is easily produced at a high concentration.
[0026]
As hesperidin, for example, about 0.5 to 10.0 w / w of a strongly alkaline aqueous solution such as caustic soda aqueous solution, caustic potash aqueous solution, sodium carbonate aqueous solution, calcium hydroxide aqueous solution, ammonia water, etc. v%, and added with an acidic aqueous solution such as hydrochloric acid or sulfuric acid to adjust the pH to a level at which the enzyme can act, desirably, a pH exceeding pH 7.0. It is very convenient to add the compound and immediately activate the glycosyltransferase, since α-glycosyl hesperidin can be easily produced at a high concentration.
[0027]
At this time, the hesperidin solution, which has been dissolved at a high concentration, also tends to precipitate hesperidin when the pH is adjusted with an acidic aqueous solution.Before the pH adjustment, the α-glucosyl sugar compound or a small amount of α-glycosyl hesperidin, etc. Coexistence can be advantageously implemented to initiate the transglycosylation reaction while suppressing the precipitation of hesperidin.
[0028]
Further, if necessary, in order to increase the solubility of hesperidin before the reaction and facilitate the transglycosylation reaction to hesperidin, an organic solvent which can be mutually dissolved with water in a hesperidin-rich liquid, for example, methanol, ethanol, n Coexistence of lower alcohols such as -propanol, iso-propanol, n-butanol, acetol, acetone and the like, lower ketones and the like can be appropriately selected.
[0029]
The relatively high-molecular-weight α-glycosyl hesperidin produced by the transglycosylation reaction may be used as it is or after being purified by a porous synthetic adsorption resin, and then purified with glucoamylase (EC 3.2.1.3). Or an amylase such as β-amylase (EC 3.2.1.2) to reduce the number of α-D-glucosyl groups of α-glycosyl hesperidin. For example, when glucoamylase is allowed to act, it is possible to hydrolyze high-molecular substances of α-maltosyl hesperidin or more to produce glucose and accumulate and produce α-glucosyl hesperidin, and to act on β-amylase. In this case, it is possible to produce a maltose by hydrolyzing a polymer substance of α-maltotriosyl hesperidin or more, and to accumulate and generate a mixture of mainly α-glucosyl hesperidin and α-maltosyl hesperidin.
[0030]
The reaction solution that has produced α-glycosyl hesperidin as described above can be directly used as an α-glycosyl hesperidin product. Usually, the reaction solution is filtered and concentrated to a syrup-like, and further dried and powdered to a powdered α-glycosyl hesperidin product.
[0031]
This product is used not only as a vitamin P enhancer, but also as a highly safe natural yellow colorant, antioxidant, stabilizer, quality improver, preventive agent, therapeutic agent, UV absorber, etc. The composition can be advantageously used for various compositions such as a taste, a feed, a feed, an antisensitizing agent, a cosmetic, and a plastic product.
[0032]
Furthermore, in the case of producing a purified α-glycosyl hesperidin product, α-glycosyl hesperidin is separated from impurities such as α-glucosyl sugar compound by utilizing the difference in adsorptivity of the porous synthetic adsorbent. It may be purified.
[0033]
The porous synthetic resin referred to in the present invention is a synthetic resin such as a porosity, a large adsorption surface area, and a nonionic styrene-divinylbenzene polymer, a phenol-formalin resin, an acrylate resin, and a methacrylate resin. For example, commercially available Amberlite XAD-1, Amberlite XAD-2, Amberlite XAD-4, Amberlite XAD-7, Amberlite XAD-8, Amberlite XAD-11 manufactured by Rohm & Haas. , Amberlite XAD-12, manufactured by Mitsubishi Kasei Kogyo Co., Ltd., manufactured by Diaion HP-10, Diaion HP-20, Diaion HP-30, Diaion HP-40, Diaion HP-50, manufactured by IMACTI Product name Imakti Syn-42, Imakti Syn-44 , Imakti Syn-46 and the like.
[0034]
The method for purifying a reaction solution that has produced α-glycosyl hesperidin according to the present invention includes the steps of: passing the reaction solution through a column filled with a porous synthetic adsorbent, for example, to obtain α-glycosyl hesperidin and a relatively small amount of unreacted hesperidin. Is adsorbed to the porous synthetic adsorbent, whereas the α-glucosyl sugar compound and the water-soluble saccharide which coexist in a large amount flow out without being adsorbed.
[0035]
If necessary, after the reaction of the glycosyltransferase is completed and before contact with the porous synthetic adsorbent, for example, the reaction solution is heated to remove insolubles generated by filtration, or magnesium aluminate silicate, Treatment with magnesium aluminate, etc. to adsorb and remove proteinaceous substances in the reaction solution, or treatment with strong acidic ion exchange resin (H type), medium basic or weak basic ion exchange resin (OH type), etc. It is optional to combine and utilize purification methods such as desalting.
[0036]
As described above, α-glycosyl hesperidin selectively adsorbed to the porous synthetic adsorbent column and a relatively small amount of unreacted hesperidin are washed with a dilute alkali, water or the like, and then washed with a relatively small amount of an organic solvent or When a mixture of an organic solvent and water, for example, methanol water or ethanol water, is passed, first, α-glycosyl hesperidin is eluted, and unreacted hesperidin is increased by increasing the flow rate or increasing the organic solvent concentration. It elutes.
[0037]
The eluate having a high content of α-glycosyl hesperidin is subjected to a distillation treatment, an organic solvent is first distilled off, and then concentrated to an appropriate concentration to obtain a syrup-like product containing α-glycosyl hesperidin as a main component. Further, by drying and pulverizing the product, a powdery product containing α-glycosyl hesperidin as a main component is obtained.
[0038]
Since the elution operation of α-glycosyl hesperidin and unreacted hesperidin with the organic solvent is also a regeneration operation of the porous synthetic adsorbent, the porous synthetic adsorbent can be repeatedly used.
[0039]
Further, the purification using the porous synthetic adsorbent of the present invention has a feature that not only α-glucosyl sugar compounds and water-soluble saccharides but also impurities such as water-soluble salts can be removed at the same time. The α-glycosyl hesperidin thus obtained has the following features.
[0040]
(1) Compared to hesperidin, α-glycosyl hesperidin has extremely high water solubility. Further, α-glycosyl hesperidin suppresses the precipitation of hesperidin from an aqueous solution containing hesperidin, and prevents the solution from becoming cloudy. For this reason, α-glycosyl hesperidin can be advantageously used as a stabilizer capable of suppressing the precipitation of hesperidin contained in citrus juice and preventing cloudiness.
(2) α-Glycosyl hesperidin has higher light fastness and stability than hesperidin.
(3) α-Glycosyl hesperidin is hydrolyzed to hesperidin and glucose by an enzyme in the body, and exhibits the intrinsic physiological activity (vitamin P) of hesperidin. Unlike other vitamins such as thiamine, riboflavin, vitamin C, and vitamin E and antioxidants, α-glycosyl hesperidin is substantially tasteless and odorless, and may cause discoloration, browning, and off-flavor. It is also convenient to use α-glycosyl hesperidin in combination with one or more vitamins and antioxidants. In addition, the combined use with vitamin C can enhance their biological activity.
(4) In the case of a product containing an α-glucosyl sugar compound, not only the effect of α-glycosyl hesperidin can be exerted, but also the α-glucosyl sugar compound can exert shaping, bulking and sweetening effects. In addition, in the case of a purified product from which the α-glucosyl sugar compound has been removed, the effect of α-glycosyl hesperidin can be exerted with almost no shaping or increase in the volume, and it is substantially tasteless and odorless, so it is free. It can be seasoned and flavored.
[0041]
Because of these features, α-glycosyl hesperidin is not only a highly safe natural vitamin P enhancer, but also a yellow colorant, antioxidant, stabilizer, quality improver, viral disease, bacterial disease, and circulation. Foods, foods, foods, feeds, feeds, anti-sensitivity agents, cosmetics such as skin-whitening agents, skin-whitening agents, etc., as well as plastic products as preventive agents, therapeutic agents, ultraviolet absorbers, etc. for organ diseases and malignant tumors For example, it can be advantageously used for various compositions.
[0042]
In addition, α-glycosyl hesperidin is well-harmonized with various substances having tastes such as sourness, salty taste, astringency, umami, and bitterness, and has high acid resistance and heat resistance. For example, seasonings, Japanese confectionery, western confectionery, frozen confectionery, beverages, spreads, pastes, pickles, canned bottles, processed meat, processed fish and marine products, processed milk and eggs, processed vegetables, processed fruits, processed cereals, etc. Can be used for a wide range. It is also convenient to use it in a feed or feed for breeding animals such as livestock, poultry, bees, silkworms, fish and the like for the purpose of enhancing vitamin P and improving palatability.
[0043]
In addition, various solids and pastes such as tobacco, troches, liver oil drops, multivitamin preparations, mouthwashes, mouthwash tablets, gargles, tube feedings, oral medicines, injections, toothpaste, lipstick, lip balm, sunscreen, etc. It can also be advantageously used in the form of a liquid, a favorite substance, a prophylactic or therapeutic agent for susceptible diseases, that is, an anti-sensitive disease agent, a skin beautifying agent, a cosmetic agent such as a fair skin agent, and the like. It can also be advantageously implemented by blending it with a plastic product or the like as an absorbent or a deterioration inhibitor.
[0044]
The susceptibility disease referred to in the present invention is a disease that is prevented or treated by α-glycosyl hesperidin, and includes, for example, viral disease, bacterial disease, traumatic disease, immune disease, rheumatism, diabetes , Circulatory diseases, malignant tumors and the like. The prophylactic or therapeutic agent for α-glycosyl hesperidin susceptibility disease can be freely selected in form according to the purpose. Examples thereof include liquid preparations such as sprays, eye drops, nasal drops, gargles and injections, pastes such as ointments, plaques and creams, solid preparations such as powders, granules, capsules and tablets. In the preparation, if necessary, it is used in combination with one or more other components such as a therapeutic agent, a physiologically active substance, an antibiotic, an auxiliary agent, a bulking agent, a stabilizer, a coloring agent, a flavoring agent and the like. It is also optional.
[0045]
The dose can be appropriately adjusted depending on the content, administration route, administration frequency and the like. Usually, a range of about 0.001 to 10.0 grams per day of adult is suitable for α-glycosyl hesperidin.
[0046]
In addition, in the case of cosmetics, it can be used according to the above-mentioned prophylactic and therapeutic agents.
[0047]
As a method of using α-glycosyl hesperidin, in the process until the products of the various compositions are completed, for example, known methods such as kneading, kneading, dissolving, dipping, penetrating, spraying, coating, spraying, and pouring are used. Is appropriately selected.
[0048]
Hereinafter, an example of the α-glycosyl hesperidin of the present invention will be described by experiments.
[0049]
(Experiment 1)
<Preparation of α-glycosyl hesperidin>
(1) Glycosyl transfer reaction
5.00 parts by weight of water was added to 1 part by weight of hesperidin and 6 parts by weight of dextrin (DE20), and the mixture was heated and dissolved. The mixture was dissolved in cyclomaltodextrin glucanotransferase derived from Bacillus stearothermophilus. 20 units per dextrin tract was added, and the mixture was allowed to react for 18 hours while maintaining the pH at 6.0 and at 70 ° C., thereby converting about 70% of hesperidin into α-glycosyl hesperidin, followed by heat inactivation. A reaction solution containing unreacted hesperidin together with α-glycosyl hesperidin was obtained.
[0050]
(2) Purification
The reaction solution obtained by the method (1) was filtered, and the filtrate was passed through a column filled with a porous synthetic adsorbent, Diaion HP-10 (trade name, sold by Mitsubishi Chemical Industry Co., Ltd.) at SV2. After washing the column with water, 50 v / v% ethanol was passed through, the eluate was concentrated, the solvent was distilled off, and the mixture was powdered to obtain a pale yellow α-glycosyl hesperidin sample [I] as a raw material. Obtained in a yield of about 130% by weight of hesperidin.
[0051]
(3) Hydrolysis by amylase
The α-glycosyl hesperidin standard [I] obtained by the method (2) was dissolved in water at 1 w / v%, and glucoamylase (EC 3.2.1.3, sold by Seikagaku Corporation) was added thereto. 100 units were added per gram of the sample, and reacted at pH 5.0 and 55 ° C. for 5 hours. The reaction solution was heated to inactivate the enzyme, filtered, and the filtrate was passed through a column of porous synthetic adsorbent, Diaion HP-10 (trade name, sold by Mitsubishi Chemical Industry Co., Ltd.) at SV2. As a result, α-glycosyl hesperidin and unreacted hesperidin in the solution were adsorbed on the porous synthetic adsorbent, and glucose, salts, etc., flowed out without being adsorbed. Then, the column was passed through and washed with water, and then passed while increasing the concentration of the aqueous ethanol solution in a stepwise manner. The α-glycosyl hesperidin fraction was collected, concentrated under reduced pressure, powdered, and pale yellow α-glycosyl. Hesperidin sample [II] was obtained in a yield of about 70% based on the weight of the raw material hesperidin per solid.
[0052]
In addition, instead of glucoamylase, β-amylase (EC 3.2.1.2, manufactured by Seikagaku Corporation) was used to hydrolyze α-glycosyl hesperidin standard [I] according to the method described above. It was decomposed, purified, concentrated, and powdered to obtain a pale yellow α-glycosyl hesperidin standard [III] in a yield of about 70% based on the weight of the raw material hesperidin.
[0053]
(Experiment 2)
<Physicochemical properties of α-glycosyl hesperidin>
(1) Improvement of water solubility
An α-glycosyl hesperidin-containing reaction solution prepared by the transglycosylation reaction according to the method of Experiment 1 (1), and a control solution treated in accordance with the method of Experiment 1 (1) by preliminarily heating and inactivating the enzyme used in this method. Was left in a cold room at 4 ° C. for 2 days. In the control solution, hesperidin precipitated and became cloudy, whereas the α-glycosyl hesperidin-containing reaction solution remained transparent.
[0054]
Therefore, α-glycosyl hesperidin produced by the transglycosylation reaction has remarkably improved water solubility. In other words, α-glycosyl hesperidin suppresses the precipitation of unreacted hesperidin coexisting in the aqueous solution and prevents the solution from becoming cloudy.
[0055]
(2) Solubility in solvents
α-Glycosyl hesperidin standard is easily soluble in water, 0.1N caustic soda, 0.1N hydrochloric acid, slightly soluble in methanol and ethanol, and insoluble in ether, benzene and chloroform.
[0056]
(3) Ultraviolet absorption spectrum
The α-glycosyl hesperidin sample was dissolved in 0.1N caustic soda solution, and the ultraviolet absorption spectrum was examined. As a result, all of the sample [I], sample [II] and sample [III] were the same as those of hesperidin. It had an absorption maximum near the same 286 nm.
[0057]
(4) Infrared absorption spectrum
The infrared absorption spectrum of the α-glycosyl hesperidin sample was examined by the KBr tablet method. FIG. 1 shows the results of the α-glycosyl hesperidin standard [I], and FIG. 2 shows the results of the standard [II].
[0058]
(5) Stability to hydrolysis
(A) α-Glycosyl hesperidin standard is hydrolyzed by α-glucosidase from pig liver (EC 3.2.1.20) to produce hesperidin and D-glucose.
(B) Not hydrolyzed by β-glucosidase.
[0059]
(6) Thin layer chromatography
(A) Analysis method
Plate; Merck
Brand name Kieselgel 60F₂₅₄
Developing solvent: n-butanol: acetic acid: water = 4: 2: 1
Color former: 1 w / w% ceric sulfate 10 w / w% sulfuric acid aqueous solution
(B) Analysis results
When the α-glycosyl hesperidin sample was analyzed, in the case of the sample [I], Rf 0.48, 0.34, 0.22, 0.16, Rf 0.48, 0.34, 0.22, 0.16, Spots were observed at 0.10, 0.04 and the origin. In the case of the sample [II], spots of Rf 0.48 were observed. In the case of the sample [III], Rf 0.48,. 34 spots were observed.
[0060]
Based on the above physicochemical properties, the substance exhibiting Rf 0.48 contained in the sample [I], the sample [II], and the sample [III] has 1 mol of hesperidin and 1 mol α-bond of D-glucose residue. A substance which is determined to be α-glucosyl hesperidin (also known as hesperidin monoglucoside) and has an Rf 0.34 contained in the sample [I] and the sample [III] has 2 moles of D-glucose in 1 mole of hesperidin. Similarly, a substance which is judged to be α-diglucosyl hesperidin (also called hesperidin diglucoside) and shows a plurality of spots having an Rf of 0.22 or less contained in the sample [I] is D-glucose residue in 1 mol of hesperidin. Is determined to be α-oligoglucosyl hesperidin α-bonded in 3 mol or more.
[0061]
As described above, α-glycosyl hesperidin of the present invention is a novel hesperidin sugar derivative having good water solubility in which D-glucose residue is α-bonded to hesperidin in equimolar or more, and when ingested into an organism, α-glucosidase It is easily hydrolyzed by the compound, and exhibits the original physiological activity of hesperidin.
[0062]
(Experiment 3)
<Acute toxicity>
A 7-week-old dd mouse was orally administered with the α-glycosyl speridine preparation [I] prepared by the method of Experiment 1 (2), and subjected to an acute toxicity test. No deaths were found. Therefore, the toxicity of this substance is extremely low. In addition, when this test was similarly performed using the α-glycosyl hesperidin standard [II] prepared by the method of Experiment 1 (3), the same result as described above was obtained, and it was found that the toxicity was extremely low. did.
[0063]
Hereinafter, as examples of the present invention, a production example of α-glycosyl hesperidin will be described in Example A, and application examples of α-glycosyl hesperidin in various compositions will be described in Example B.
[0064]
(Example A-1)
<Α-glycosyl hesperidin>
1 part by weight of hesperidin is dissolved in 4 parts by weight of a 1N sodium hydroxide solution, 0.01 N hydrochloric acid solution is added to neutralize the solution, and 4 parts by weight of dextrin (DE10) is added thereto. Immediately, Bacillus stearothermophilus-derived Cyclomaltodextrin glucanotransferase (manufactured by Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc.) was added in 20 units per dextrin rum, and the mixture was reacted at pH 6.0 and 75 ° C. for 24 hours with stirring. When the reaction mixture was analyzed by thin-layer chromatography, about 70% of hesperidin was found to be α-glucosyl hesperidin, α-diglucosyl hesperidin, α-triglucosyl hesperidin, α-tetraglucosyl hesperidin, α-pentaglucosyl hesperidin, and the like. It had been converted to glycosyl hesperidin. The reaction solution is heated to inactivate the enzyme, filtered, and the filtrate is desalted and purified using an ion-exchange resin (H type and OH type) and concentrated according to a conventional method to obtain a syrup-like α-glucosyl sugar compound. Was obtained in a yield of about 90% based on the weight of the raw material per solid.
[0065]
This product is used not only as a vitamin P enhancer, but also as a highly safe natural yellow colorant, antioxidant, stabilizer, quality improver, preventive agent, therapeutic agent, ultraviolet absorber, etc. It can be advantageously used for various compositions, such as foods, feeds, feeds, anti-sensitivity agents, cosmetics, and plastic products.
[0066]
(Example A-2)
<Α-glucosyl hesperidin>
1 part by weight of an α-glycosyl hesperidin product having a syrup-like α-glucosyl sugar compound prepared according to the method of Example A-1 is dissolved in 4 parts by weight of water, and glucoamylase (EC 3.2.1) is added thereto. .3, sold by Seikagaku Corporation) was added at 100 units per gram of solid α-glycosyl hesperidin product, and reacted at 50 ° C for 5 hours. When the reaction solution was analyzed by thin-layer chromatography, α-glycosyl hesperidin was converted to α-glucosyl hesperidin.
[0067]
The reaction solution was heated to inactivate the enzyme, filtered, and the filtrate was passed through a column of porous synthetic adsorbent, Diaion HP-10 (trade name, sold by Mitsubishi Chemical Industry Co., Ltd.) at SV2. As a result, α-glucosyl hesperidin and unreacted hesperidin in the solution were adsorbed on the porous synthetic adsorbent, and glucose, salts, etc., flowed out without being adsorbed. Next, the column was passed through and washed with water, and then passed while increasing the concentration of the aqueous ethanol solution in a stepwise manner. The α-glucosyl hesperidin fraction was collected, concentrated under reduced pressure, powdered, and powdered α-glucosyl. Hesperidin was obtained in a yield of about 60% based on the weight of the raw material hesperidin per solid.
[0068]
When α-glucosyl hesperidin was hydrolyzed with an acid, 1 mol of L-rhamnose and 2 mol of D-glucose were produced for 1 mol of hesperidin, and α-glucosyl hesperidin was extracted from pig liver and partially purified. It was found that when α-glucosidase was acted on, it was hydrolyzed to hesperidin and D-glucose.
[0069]
The α-glucosyl hesperidin is a highly purified water-soluble vitamin P enhancer, and also as a yellow colorant, antioxidant, stabilizer, quality improver, preventive agent, therapeutic agent, ultraviolet absorber, etc. It can be advantageously used for various compositions, such as foods and drinks, favorite foods, anti-sensitivity agents, cosmetics, and the like.
[0070]
(Example A-3)
<Α-glycosyl hesperidin>
1 part by weight of hesperidin is heated and dissolved in 500 parts by weight of water at pH 9.5, and 10 parts by weight of dextrin (DE8) is separately heated and dissolved in 10 parts by weight of water. Then, these solutions are mixed and mixed with cyclomaltodextrin gluca. No transferase was added in 30 units per dextrin ram, and the mixture was reacted at 40 ° C. for 40 hours with stirring at pH 8.2 and 65 ° C. When the reaction solution was analyzed by thin-layer chromatography, about 80% of hesperidin was converted to α-glycosyl hesperidin. The reaction solution was heated to inactivate the enzyme, and then filtered. The filtrate was passed through a column of a porous synthetic adsorbent, trade name Amberlite XAD-7 (manufactured by Rohm & Haas) at SV 1.5.
[0071]
As a result, α-glycosyl hesperidin and unreacted hesperidin in the solution were adsorbed on the porous synthetic adsorbent, and dextrins, oligosaccharides, salts and the like flowed out without being adsorbed. After the column was washed with water and washed with water, 50 v / v% methanol was passed through to elute α-glycosyl hesperidin and hesperidin, which were concentrated and powdered to obtain a powdered α-glycosyl hesperidin product. It was obtained in a yield of about 120% based on the weight of the raw material hesperidin.
[0072]
This product is not only a highly water-soluble vitamin P enhancer, but also a highly safe natural yellow colorant, antioxidant, stabilizer, quality improver, preventive agent, therapeutic agent, ultraviolet absorber, etc. It can be advantageously used for various compositions, such as foods and drinks, foods, feeds, feeds, anti-sensitivity agents, cosmetics, and plastic products.
[0073]
(Example A-4)
<Α-glycosyl hesperidin>
(1) Preparation of α-glucosidase preparation
Maltose 4 w / v%, potassium monophosphate 0.1 w / v%, ammonium nitrate 0.1 w / v%, magnesium sulfate 0.05 w / v%, potassium chloride 0.05 w / v%, polypeptone 0.2 w / v% , Calcium carbonate 1 w / v% (separately sterilized by dry heat and added aseptically at the time of inoculation) and 500 parts by weight of a liquid medium consisting of water and Mucor javanicus IFO 4570 at a temperature of 30 ° C. For 44 hours with shaking. After completion of the culture, the mycelium was collected, and to 48 parts by weight of the wet mycelium, 500 parts by weight of a 4 M urea solution dissolved in 0.5 M acetate buffer (pH 5.3) was added, and the mixture was allowed to stand at 30 ° C. for 40 hours. And then centrifuged. The supernatant was dialyzed overnight in running water, adjusted to 0.9 saturation with ammonium sulfate, allowed to stand at 4 ° C. overnight, and the formed salt precipitate was collected by filtration, and 50 parts by weight of a 0.01 M acetate buffer (pH 5.3) was added. , And centrifuged to collect the supernatant, which was used as an α-glucosidase standard.
[0074]
(2) Preparation of α-glycosyl hesperidin
5 parts by weight of hesperidin was dissolved by heating in 100 parts by weight of 0.5N sodium hydroxide solution, and a pH of 9.5 was added by adding a 0.01N hydrochloric acid solution, and 20 parts by weight of dextrin (DE30) was added. ) Was added, and the mixture was reacted at 55 ° C for 40 hours with stirring while maintaining the pH at 8.5. When the reaction solution was analyzed by thin-layer paper chromatography, about 0% of hesperidin was converted to α-glycosyl hesperidin. The reaction solution was purified, concentrated and powdered in the same manner as in Example A-3 to obtain a powdery α-glycosyl hesperidin product in a yield of about 110% based on the weight of the raw material hesperidin.
[0075]
This product is not only a highly water-soluble vitamin P enhancer, but also a highly safe natural yellow colorant, an antioxidant, a stabilizer, a quality improving agent, as in Example A-3. It can be used for various compositions as a prophylactic agent, a therapeutic agent, an ultraviolet absorber and the like.
[0076]
(Example B-1)
<Hard candy>
1,500 parts by weight of reduced maltose syrup (manufactured by Hayashibara Shoji Co., Ltd., registered trademark: Mavit) are heated and concentrated under reduced pressure until the water content becomes about 2% or less, and then 15 parts by weight of citric acid and the mixture of Example A-3 1 part by weight of the powdery α-glycosyl hesperidin obtained by the method and a small amount of lemon flavor were mixed, and then molded and packaged according to a conventional method to obtain a hard candy.
[0077]
This product is a yellow lemon candy enriched with vitamin P, and has low caries and low calories.
[0078]
(Example B-2)
<Boiled butterbur water>
Peel the butterflies, cut into appropriate lengths, soak in thin saline for several hours, mix this with syrup-like α-glycosyl hesperidin obtained by the method of Example A-1 and Blue No. 1 The mixture was boiled with the prepared liquid containing a green colorant to obtain boiled green butterbur.
[0079]
This product not only adds color to various Japanese-style dishes, but also has a physiological effect as a dietary fiber.
[0080]
(Example B-3)
<Fertilization>
1.2 parts by weight of water was mixed with 1 part by weight of waxy seed starch, and while heating and gelatinizing, 1.5 parts by weight of sugar and 0.7 parts by weight of crystalline β-maltose (manufactured by Hayashibara Co., Ltd., San Marto) Then, 0.3 parts by weight of syrup and 0.2 parts by weight of syrup-like α-glycosyl hesperidin obtained by the method of Example A-1 were mixed, and then molded and packaged according to a conventional method to produce a fertilizer.
[0081]
This product is a kibibi-dango-style Japanese confection with good flavor and mouthfeel.
[0082]
(Example B-4)
<Mixed sweetener>
100 parts by weight of honey, 50 parts by weight of isomerized sugar, 2 parts by weight of brown sugar, and 1 part by weight of powdery α-glycosyl hesperidin obtained by the method of Example A-4 were mixed to obtain a mixed sweetener.
[0083]
This product is a sweetener enriched with vitamin P and is suitable as a health food.
[0084]
(Example B-5)
<Sand cream>
1,200 parts by weight of crystalline α-maltose (manufactured by Hayashibara Co., Ltd., registered trade name: Finetoose), 1,000 parts by weight of shortening, 10 parts by weight of powdery α-glycosyl hesperidin obtained by the method of Example A-3, lecithin One part by weight, 1 part by weight of lemon oil and 1 part by weight of vanilla oil were mixed by a conventional method to produce a sand cream.
[0085]
This product is a vitamin P-enriched, yellow-colored sand cream with good mouthfeel, melting, and flavor.
[0086]
(Example B-6)
<Tablets>
13 parts by weight of crystalline β-maltose, 4 parts by weight of corn starch and 3 parts by weight of powdery α-glucosyl hesperidin obtained by the method of Example A-2 were uniformly mixed with 20 parts by weight of ascorbic acid, and then a mixture having a diameter of 12 mm and 20R was obtained. Tablets were obtained using a pestle to obtain tablets.
[0087]
This product is a multivitamin preparation of ascorbic acid and α-glucosyl hesperidin, and has good stability of ascorbic acid and is easy to drink.
[0088]
(Example B-7)
<Capsule>
10 parts by weight of calcium acetate / monohydrate, 50 parts by weight of L-magnesium lactate / trihydrate, 57 parts by weight of maltose, 20 parts by weight of α-glucosyl hesperidin obtained by the method of Example A-2 and 20% of eicosapentaenoic acid After 12 parts by weight of the contained γ-cyclodextrin clathrate compound was uniformly mixed and granulated by a granulator, the mixture was encapsulated in a gelatin capsule according to a conventional method to produce a capsule containing 150 mg per capsule.
[0089]
The product can be advantageously used as a blood cholesterol lowering agent, an immunostimulant, a skin beautifying agent, a preventive agent for susceptibility diseases, a therapeutic agent, a food for promoting health, and the like.
[0090]
(Example B-8)
<Ointment>
1 part by weight of sodium acetate / trihydrate and 4 parts by weight of DL-calcium lactate are uniformly mixed with 10 parts by weight of glycerin, and this mixture is mixed with 50 parts by weight of vaseline, 10 parts by weight of wood wax, 10 parts by weight of lanolin, and 14 parts of sesame oil. An ointment was prepared by adding 0.5 parts by weight, 1 part by weight of α-glycosyl hesperidin obtained by the method of Example A-4, and 0.5 part by weight of peppermint oil, and further uniformly mixing.
[0091]
The product can be advantageously used as a sunscreen, a skin-beautifying agent, a skin-whitening agent, etc., and also as a healing promoter for wounds and burns.
[0092]
(Example B-9)
<Injection>
The α-glucosyl hesperidin obtained by the method of Example A-2 was dissolved in water, purified and filtered according to a conventional method to be pyrogen-free, and the solution was divided into 20 mL ampoules so that α-glucosyl hesperidin became 50 mg. It was poured, dried under reduced pressure, and sealed to produce an injection.
[0093]
The injection can be administered alone or mixed with other vitamins, minerals, etc., intramuscularly or intravenously. Further, the product does not need to be stored at low temperature, and has extremely good solubility in physiological saline and the like when used.
[0094]
(Example B-10)
<Injection>
6 parts by weight of sodium chloride, 0.3 parts by weight of potassium chloride, 0.2 parts by weight of calcium chloride, 3.1 parts by weight of sodium lactate, 45 parts by weight of maltose and α-glucosyl hesperidin 1 obtained by the method of Example A-2 A part by weight was dissolved in 1,000 parts by weight of water and purified and filtered to be pyrogen-free according to a conventional method, and this solution was filled into a sterilized plastic container by 250 mL to prepare an injection.
[0095]
This product is an injection not only for supplementing vitamin P but also for supplementing calories and minerals, and can be advantageously used for promoting treatment during and after illness and promoting recovery.
[0096]
(Example B-11)
<Tube nutrition>
20 parts by weight of crystalline α-maltose, 1.1 parts by weight of glycine, 0.1 parts by weight of sodium glutamate, 1.2 parts by weight of sodium chloride, 1 part by weight of citric acid, 0.4 parts by weight of calcium lactate, 0.1 parts of magnesium carbonate A formulation comprising 0.1 part by weight of α-glycosyl hesperidin obtained by the method of Example A-3, 0.01 part by weight of thiamine and 0.01 part by weight of riboflavin is prepared. Each 24 g of the blend was filled in a laminated aluminum pouch and heat sealed to prepare a tube nutritional supplement.
[0097]
The present tube-feeding nutrient can be advantageously used as an oral or parenteral nutritional supplement for the nasal cavity, stomach, intestine, etc. by dissolving one bag in about 300 to 500 mL of water by a tube-feeding method.
[0098]
(Example B-12)
<Bath agent>
21 parts by weight of DL-sodium lactate, 8 parts by weight of sodium pyruvate, 5 parts by weight of α-glycosyl hesperidin and 40 parts by weight of ethanol obtained by the method of Example A-1, 26 parts by weight of purified water, and It was mixed with an appropriate amount to produce a bath agent.
[0099]
The product is suitable as a skin-beautifying agent and a skin-whitening agent, and may be used after being diluted 100 to 10,000 times in hot water for bathing. As in the case of hot water for bathing, the product can be advantageously used by diluting it in face wash water, lotion and the like.
[0100]
(Example B-13)
<Emulsion>
0.5 parts by weight of polyoxyethylene behenyl ether, 1 part by weight of polyoxyethylene sorbitol tetraoleate, 1 part by weight of lipophilic glyceryl monostearate, 0.5 part by weight of pyruvate, 0.5 part by weight of behenyl alcohol, avocado oil 1 part by weight, 1 part by weight of α-glycosyl hesperidin obtained by the method of Example A-3, an appropriate amount of vitamin E and a preservative are dissolved by heating according to a conventional method, and 1 part by weight of sodium L-lactate, 1, 5 parts by weight of 3-butylene glycol, 0.1 parts by weight of carboxyvinyl ponymer and 85.3 parts by weight of purified water were added, and the mixture was emulsified with a homogenizer, and an appropriate amount of a flavor was further added, followed by stirring and mixing to prepare an emulsion.
[0101]
The product can be advantageously used as a sunscreen, a skin beautifying agent, a fairing agent and the like.
[0102]
(Example B-14)
<Cream>
2 parts by weight of polyoxyethylene glycol monostearate, 5 parts by weight of self-emulsifying glyceryl monostearate, 2 parts by weight of α-glucosyl hesperidin obtained by the method of Example A-2, 1 part by weight of liquid paraffin, glyceryl trioctanoate 10 In a conventional manner, 2 parts by weight of L-lactic acid, 5 parts by weight of 1,3-butylene glycol and 66 parts by weight of purified water are added, and the mixture is emulsified with a homogenizer and emulsified. Was added and stirred and mixed to produce a cream.
[0103]
The product can be advantageously used as a sunscreen, a skin beautifying agent, a fairing agent and the like.
[0104]
【The invention's effect】
As described in the text, α-glycosyl hesperidin, in which D-glucose residues are α-bonded in equimolar or more to hesperidin, which is a novel substance of the present invention, is excellent in water solubility, substantially tasteless, odorless, and toxic. Without concern, it is easily hydrolyzed in vivo into hesperidin and D-glucose, and exhibits the natural physiological activity of hesperidin.
[0105]
Further, since this α-glycosyl hesperidin can be easily produced by a biochemical method of allowing a glycosyltransferase to act on a solution containing hesperidin and an α-glucosyl sugar compound, it is excellent in economical efficiency and industrially used. Easy.
[0106]
Furthermore, it was found that the reaction can be carried out by increasing the concentration of hesperidin used, and that the concentration of α-glycosyl hesperidin can be easily increased to a high concentration. It has also been found that α-glycosyl hesperidin can be purified by contact with a synthetic adsorbent, thereby greatly facilitating the mass production of α-glycosyl hesperidin.
[0107]
The α-glycosyl hesperidin thus obtained has characteristics such as good water solubility, good light fastness and stability, and sufficient bioactivity, and is a highly safe natural vitamin P. Not only as an enhancer, but also as a yellow colorant, antioxidant, stabilizer, quality improving agent, preventive agent, therapeutic agent, ultraviolet absorber, anti-deterioration agent, etc., food and drink, favorite food, feed, feed, anti-sensitivity It is advantageously used for cosmetics such as disease agents, skin beautifiers, fair skin agents, and various compositions such as plastic products.
[0108]
Therefore, establishment of the industrial production method of α-glycosyl hesperidin and the use thereof according to the present invention has great industrial significance in the food and beverage, cosmetics, pharmaceutical and plastic industries.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is an infrared absorption spectrum of α-glycosyl hesperidin sample [I] as an example of the present invention.
FIG. 2 is an infrared absorption spectrum of α-glycosyl hesperidin sample [II] as an example of the present invention.

Claims (3)

In cosmetics containing hesperidin as a vitamin P enhancer, yellow colorant, antioxidant, stabilizer, ultraviolet absorber, skin beautifier, or fair skin agent, hesperidin has excellent water solubility, and hesperidin and D- A cosmetic product characterized by using α-glycosyl hesperidin, which is hydrolyzed to glucose and has D-glucose residues α-bonded to hesperidin in an equimolar amount or more. The cosmetic according to claim 1, wherein the cosmetic is lipstick, lip balm, sunscreen, toothpaste, bath agent or emulsion. The cosmetic according to claim 1 or 2, further comprising vitamin E.

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