JP3546894B2

JP3546894B2 - 検査用プレート

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Publication number: JP3546894B2
Application number: JP24775094A
Authority: JP
Inventors: 直樹倉井; 智昌松田; 雅英川村; 隆黒田; 哲也小野
Original assignee: 株式会社三菱化学ヤトロン; ディックプラスチック株式会社
Priority date: 1994-10-13
Filing date: 1994-10-13
Publication date: 2004-07-28
Anticipated expiration: 2019-07-28
Also published as: JPH08129014A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は、顕微鏡を用いた臨床検査又は研究の際に使用する検査用プレート、抗原が固定されたスライドプレートを有する検査用プレート、抗原が固定されたスライドプレートを有する検査用プレートの製造方法並びにそれらの検査用プレートを使用した検査方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
顕微鏡を用いた蛍光抗体法、酵素抗体法又は病理組織化学は、自己免疫疾患、感染症、病理等の検査で極めて重要な検査法となっている。即ち、自己免疫疾患では抗核抗体、抗ＤＮＡ抗体（クリシディア法）、抗ミトコンドリア抗体等の検査、感染症では梅毒検査（ＦＴＡ−ＡＢＳ）、病理ではガンの組織診断等、多くの検査が行われている。
【０００３】
この検査方法は、間接法と直接法に分類される。間接法は通常スライドプレート上に細胞や組織等の抗原を固定し、被験サンプル中のこの抗原に対する抗体を検出する方法である。例えば、抗核抗体では、Ｈｅｐ２細胞等をスライドプレート上に固定して抗原とする。これに、血清又は血漿等の被験サンプルを反応させ、被験サンプル中の特異抗体を固定細胞中の抗原物質と反応させる。その結合した抗体を蛍光又は酵素で標識された抗イムノグロブリン（標識抗体）と反応させた後、顕微鏡でその染色像を観察する。この方法によると、複数の抗原に対する抗体が検出可能であり、染色パターンによって抗体が対応する抗原が推定できる。直接法は組織、細胞等の被験サンプルをスライドプレート上に固定し、これに蛍光、酵素又はビオチンで標識された抗体を反応させ、その免疫的染色像を顕微鏡で観察する検査方法であり、ガン細胞の検出等に用いられる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】
これまでの顕微鏡を用いた蛍光抗体法又は酵素抗体法の検査では、スライドプレート上に被験サンプルや試薬を分注することとスライドプレートをビーカー等の洗浄漕中で洗浄することの２種類の操作が交互に繰り返されるため、検査工程の自動化が最も困難な分野であった。また、スライドプレート上に抗原を固定する方法に於いても検査と同様の工程が多く、自動化が困難な為に手作業によらざるを得なかった。
【０００５】
抗核抗体の間接蛍光抗体法を例にとり、詳しく説明する。
従来行われている一般的なスライドプレート上に抗原を固定して検査用プレートを製造する手順は、以下の如くである。
【０００６】
▲１▼スライドプレート上にガン細胞Ｈｅｐ２懸濁液を載せ、細胞をガラスに付着させる。
▲２▼スライドプレートを生理食塩水等で洗浄する。
【０００７】
▲３▼アセトンで細胞を固定する。
▲４▼風乾して検査用プレートとする。
次いで、検査用プレートを使用した一般的な検査手順を示す。
【０００８】
▲１▼血清を生理食塩水等で希釈したものを、スライドプレート上に載せ、血清中の特異抗体（抗核抗体）をスライドプレート上の抗原と反応させる。
▲２▼スライドプレートをビーカー中の生理食塩水に漬けて洗浄する。
【０００９】
▲３▼蛍光で標識された抗イムノグロブリンをスライドプレートに載せ、スライドプレート上の抗原と結合した特異抗体と反応させる。
▲４▼スライドプレートをビーカー中の生理食塩水に漬けて洗浄する。
【００１０】
▲５▼グリセリン水溶液をスライドプレートに載せ、カバーグラスを被せて蛍光顕微鏡で観察する。
このように、スライドプレート上への抗原の固定及び抗原を固定したスライドプレートを使用した検査の工程では、スライドプレート上への分注と、スライドプレートのビーカー中での洗浄が繰り返される為、自動化が行い難く、殆どの工程が手作業で行われてきた。その結果、このような顕微鏡を用いる蛍光抗体法及び酵素抗体法はそれ以外の検査の多くが自動化されていく中で最も自動化が遅れた分野となっている。
【００１１】
このような現状で、従来からの古典的方法に改良を試みた例としては、Ｎｕｎｃ社のチェンバースライドがある。このチェンバースライドは、スライドプレート上での細胞の培養を可能にするために開発されたもので、スライドプレートの上に一体に形成された複数個の通孔をシリコンゴムを介して付着させたものであり、この複数個の通孔は取り外すことが可能であるが、一度外した通孔は二度と装着することができない為に自動化機器を利用した効率的な検査に使用することができなかった。
【００１２】
本発明者等は、自動化機器を利用した効率的な検査に使用することができる検査用プレートについて鋭意研究を進めた結果、本発明に到達した。
【００１３】
【課題を解決するための手段】
本発明は、複数個の通孔がそれぞれ独立した区画を形成するように設けられた上方部材と、シール材と、スライドプレートと、下方部材とを有する検査用プレートにおいて、
該上方部材の下面には、該複数個の通孔の周辺に溝が形成されており、
該シール材は、弾性を有する板状体であって該複数個の通孔に対応する位置に該通孔の下部直径と同様の直径の穴を有するとともに該通孔の周辺に形成された該溝内に侵入する突出部を有し、
該スライドプレートは、抗原若しくは被験サンプルを固定する部位以外は撥水処理が施されており、該上方部材に取り付けられた該シール材と該下方部材に対して着脱可能となっており、
該上方部材と該下方部材は、それぞれが着脱可能となるような嵌合部を有していることを特徴とする検査用プレートに関する。
【００１４】
更に、本発明は、上記スライドプレートの抗原若しくは被験サンプルを固定する部位に、予め該抗原若しくは被験サンプルが固定されている検査用プレートに関する。
【００１８】
以下、本発明を図面を参照して詳細に説明する。
図１は本発明に係わる下方部材を有する検査用プレートの一例を示す斜め上方から見た分解斜視図、図２は図１に示した検査用プレートをセットした組立斜視図、図３は図１に示した検査用プレートの平面図、図４は図１に示した検査用プレートの底面図、図５は図３におけるＡ−Ａ線に沿った断面図、図６は図３におけるＢ−Ｂ線に沿った断面図、図７は図３におけるＣ−Ｃ線に沿った断面図、図８は上方部材を上方部材支持部を支点にし開蓋した図５に相当する断面図、図９は上方部材を上方部材支持部を支点にし開蓋した図６に相当する断面図、図１０はスライドプレートと、上方部材を外しスライドプレートを下方部材にセットした状態とを示す平面図、図１１はスライドプレートと、上方部材を外しスライドプレートを下方部材にセットした状態とを示す平面図及び図１２は本発明に係わる下方部材を有する検査用プレートの他の一例を示す斜め上方から見た分解斜視図である。
【００２０】
図１乃至図１１に示す検査用プレートは、上方部材１と、スライドプレート２若しくはスライドプレート３と、下方部材４とを有している。
上方部材１は、通常四角形の形状であり、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ＡＢＳ樹脂、ポリスルホン等の熱可塑性樹脂によって成形することができ、自動洗浄機、自動分注機、ＥＬＩＳＡプロセッサー、マルチピペット等の各種検査機器に対応可能な９６穴マイクロプレートと同様のピッチをもつ複数個の通孔５を有しているのが好ましい。通孔５は、通常９６穴であるが、検査機器等の変更によりその数を増減してもよい。また、かかる通孔は例えば、通孔５から通孔５までのピッチを９．０ｍｍとし、上部直径を７．０ｍｍ、下部直径を６．０ｍｍ、深さを８．０ｍｍとすることが好ましい。
【００２１】
上方部材１の下面には溝６が形成され、シール材７の突出部８がこの溝６内に侵入することにより、上方部材１の下面には通孔５の周辺にシール材７が取り付けられている。シール材７は、流動性、接着性及び適度な弾性等の物性を持つシリコンゴム、エチレンゴム、プロピレンゴム等からなることが好ましく、また硬度を１８乃至５０度とし、肉厚を１．０乃至２．０ｍｍとすることが望ましい。シール材７は独立発泡させてクッション性を高めてもよい。上方部材１の下面にシール材７を取り付けるには、例えばシリコンゴム板を打ち抜くか、或いは射出成形により、上方部材１の通孔５を同様のピッチで直径が５．５ｍｍの穴を９６個有する板状体を形成し、上方部材１の溝６内に硬化性液状シリコンゴムを充填した後に板状体を貼り合わせ、硬化性液状シリコンゴムを効果させてシール材７の突出部８とすることによって上方部材１の下面にシール材７を取り付けてもよいし、或いはシール材７を射出成形する際に上方部材１を金型内にセットしてインサート成型しても良い。
【００２２】
また、上方部材１は、下方部材４に支持されており、好ましくは上方部材１の一端が下方部材４に軸支されるようにその左右に支軸１１を有する構造のものである。尚、かかる上方部材１は図１２に示すように下方部材４に軸支されずに載せられ、下方部材４から取り外すことができる構造のものであってもよい。この場合、上方部材１は支軸１１が形成されない形状となっている。
【００２３】
下方部材４は、内側にスライドプレート２若しくはスライドプレート３を支持する支持部９を有する枠状体であり、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、アクリル樹脂、ポリカーボネート、ＡＢＳ樹脂等の熱可塑性樹脂によって成形することができ、必要に応じてガラス繊維等の強化材を混入してもよい。
【００２４】
下方部材４の一端の左右両側には、支軸受け穴１０が形成され、上方部材１の支軸１１を支軸受け穴１０に嵌合させることによって上方部材１を下方部材４に対して繰り返し開閉させることができる。下方部材４には、支軸受け穴１０と反対側の端部に突部１２が形成されている。上方部材１を下方部材４に閉じ、突部１２を上方部材１に設けられたロック穴１３に嵌合させることにより、上方部材１を下方部材４の支持部９上に置いたスライドプレート２若しくはスライドプレート３に取り付けることができ、上方部材１のシール材７がスライドプレート２若しくはスライドプレート３に圧着されることにより、スライドプレート２若しくはスライドプレート３上で上方部材１の各通孔５が独立区画され、各通孔５に希釈液、洗浄液等を注入しても希釈液、洗浄液等が通孔５から漏れないように密閉される。尚、上方部材１が下方部材４に軸支されない場合、下方部材４は支軸受け穴が形成されない形状のものである。
【００２５】
スライドプレートは、ガラス又はポリエステル、ポリメチルテルペン、エチレン−メタクリル酸共重合体、ポリスチレン、アクリル樹脂、ポリカーボネート、環状オレフィンコーポリマー等の合成樹脂によって形成することができ、抗原又は被験サンプルを固定する部位１４が例えば９６穴マイクロプレートと同様のピッチで設けられた直径４．５ｍｍの区域の場合、１６箇所設けられた１６穴タイプの分割形式のスライドプレート２でもよいし、９６箇所設けられた９６穴タイプの一枚形式のスライドプレート３でもよく、必要に応じて８穴タイプ若しくは２４穴タイプのスライドプレート２でもよい。スライドプレートの抗原又は被験サンプルを固定する部位１４以外は、テフロン等をバインダーとする印刷インキを使用して着色及び撥水処理することが好ましい。これにより、抗原又は被験サンプルを固定する区域を明確に識別することができる上に抗原又は被験サンプルが部位１４をはみ出した際にそれを弾くことができる。
【００２６】
スライドプレート２及びスライドプレート３は下方部材４の支持部９上にセットされる。即ち、スライドプレート２を使用する場合には、その各々を区分、固定させる為に下方部材４の支持部９上で分割リブ１５のピッチ内に１枚乃至６枚セットし、スライドプレート２のａ寸法及びｃ寸法を支持部９におけるｅ寸法及びｇ寸法のそれぞれにほぼ同寸法で対応させるのが好ましい。また、スライドプレート３を使用する場合には、分割リブ１５の先端より内側に１枚セットし、スライドプレート３のｂ寸法及びｄ寸法を支持部９におけるｆ寸法及びｈ寸法のそれぞれにほぼ同寸法で対応させるのが実用上好ましい。スライドプレート２及びスライドプレート３の寸法をこのように定めることにより、２種類のスライドプレート２及びスライドプレート３を確実に支持部９上にセットすることができる。
【００２７】
図１乃至図１１に示す本発明の検査用プレートの例は、下方部材４の一端を軸にして上方部材１を開閉させることにより、下方部材４上に置いてスライドプレート２若しくはスライドプレート３に対して上方部材１を着脱し得るようにしているものである。また、図１２は本発明の検査用プレートの他の例を示すものである。この検査用プレートは、図１乃至１１の検査プレートのような上方部材の支軸及び下方部材の支軸受け穴を設けないもので、下方部材４上にスライドプレート２若しくはスライドプレート３を置き、その上に上方部材１を被せ、下方部材４に形成した凸部１６に上方部材１の垂下部１７の内面に形成した凹部（図示せず）を嵌合させる形式のものである。
【００２９】
本発明に係わる検査用プレートは、間接蛍光抗体法または間接酵素抗体法及び直接蛍光抗体法または直接酵素抗体法等の検査に使用することができる。間接蛍光抗体法または間接酵素抗体法としては、抗核抗体、抗ＤＮＡ抗体（クリシジア法）、抗セントロメア抗体、抗平滑筋抗体、抗ミトコンドリア抗体、抗胃壁細胞抗体、抗好中球抗体等の自己免疫疾患診断及びクラミジア抗体、トキソプラズマ抗体、梅毒抗体（ＦＴＡ−ＡＢＳ）、ＡＴＬＶ抗体、ＥＢウイルス抗体、風疹ウイルス抗体、ヘルペス抗体、サイトメガロウイルス抗体等の感染症診断を挙げることができる。また、直接蛍光抗体法または直接酵素抗体法としては、ヘルペス抗原、クラミジア抗原等の感染症診断及びガンの細胞診断やＩｇＡ腎症検査等の病理学的検査を挙げることができる。
【００３０】
前記検査用プレ−トを使用して抗原を固定したスライドプレートを有する検査用プレート（間接法）の製造法について説明する。
（１）スライドプレ−ト上への抗原の付着
間接法に於ては、スライドプレ−ト上に抗原を固定する。抗原としては、自己免疫疾患診断では、Ｈｅｐ２細胞、クリシジア、染色体、平滑筋、腎組織、胃壁組織、好中球などの自己抗原を持つ細胞や組織が利用可能であり、感染症診断では、バクテリアやウイルスなどの病原体微生物がもちいられる。これらの抗原は適当な培地や緩衝液に懸濁しスライドプレ−ト上に分注してインキュベ−トすることにより、スライドプレ−ト上に付着させ得る。この際、スライドプレ−トが取り付けられた検査用プレートの上方部材の各通孔の上部より、自動分注機などを用いて自動的に抗原懸濁液を分注することができる。
【００３１】
（２）洗浄
抗原がスライドプレ−ト面に付着したら、余分の抗原及び培地や緩衝液を生理食塩水、ＰＢＳ溶液等の洗浄液により洗浄、除去する。この場合にも抗原が付着したスライドプレートをセットしたまま検査用プレートの上方部材の通孔の上部から洗浄機により洗浄することができる。
【００３２】
（３）抗原の固定及び風乾
スライドプレ−ト上へ付着した抗原は、エタノ−ル、アセトン、グルタ−ルアルデヒド、パラホルムアルデヒド、ホルマリン、メタノ−ル、又はこれらを組合せた固定液によって固定される。この場合には、上記（２）で抗原が固定されたスライドプレートを検査用プレートから取り出し、該スレイドプレートのみを固定液に浸して抗原を固定する。抗原が固定されたスライドプレ−トは、風乾される。
【００３３】
（４）抗原が固定されたスライドプレ−トのセット
抗原が固定されたスライドプレ−トを下方部材上に置き、ついで上方部材を被せて検査用プレートとする。このように予め抗原が固定されたスライドプレ−トをセットすることによって、多数の被験サンプルを検査する際にその都度抗原が固定されたスライドプレ−トを作成することなく直ちに検査を行うことができるメリットがある。
【００３４】
上述のような抗原が固定されたスライドプレ−トがセットされた検査用プレートの製造法であれば、上方部材を開閉し若しくは取り外して該スライドプレートを取り出すことなく自動分注機によって抗原懸濁液を分注してスライドプレート上に抗原を付着させ、次いでそのまま洗浄液で洗浄できることになるため、効率よく抗原を固定したスライドプレートを有する検査用プレートを製造することができる。
【００３５】
次に、前記検査用プレートを使用した検査法（間接法）を説明する。
（１）被験サンプルの分注
被験サンプルは通常血清であることが多いが、ヘパリン血漿、ＥＤＴＡ血漿、クエン酸血漿、あるいは腹水、髄液、唾液、尿などあらゆる体液が被験サンプルとなりうる。これらの被験サンプルはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、生理食塩水など通常よく用いられている緩衝液で希釈される。これらの被験サンプルを抗原が固定されたスライドプレートを取り付けた検査用プレートの上方部材の通孔上部から分注する。この時自動分注機を用いることにより、この工程を自動化することができる。被験サンプルを検査用プレートの通孔内に分注すると、被験サンプル中の抗体がスライドプレ−ト上に固定された抗原に結合する。
【００３６】
（２）洗浄１
抗原に結合しなかった余分の抗体（イムノグロブリン）を洗浄操作により除去する。洗浄操作は洗浄液の分注、吸引を繰り返すのであるが、この工程もスライドプレートを検査用プレートから取り出すことなく自動洗浄機の使用により洗浄を自動化することができる。
【００３７】
（３）標識抗体の分注
一回めの洗浄後、標識抗体を分注し、スライドプレ−ト上に固定された抗原に結合した抗体に標識抗体を反応させる。標識抗体としては、蛍光抗体法であれば、抗イムノグロブリン、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＭ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＥなどの抗体を、フルオロセイン、ロ−ダミン、フィコエリスリンなどの蛍光物質で標識したものを挙げることができ、又酵素抗体法であれば、ペルオキシダ−ゼ、アルカリ性フォスファタ−ゼなどの酵素、またはビオチンなどで標識したものを挙げることができる。この場合、検査用プレートの上方部材の通孔上部から自動分注機により標識抗体の分注を自動化することができる。
【００３８】
（４）洗浄２
洗浄１と同様の方法で抗体に結合しなかった標識抗体を洗浄により除去する。
（５）染色基質の分注（酵素抗体法の場合）
酵素抗体法の場合は、染色基質を分注し、標識抗体（酵素）が結合した部位を染色基質により染色する。染色基質としては、標識抗体（酵素）がペルオキシダ−ゼの場合、ジアミノベンチジンなどが用いられる。この染色基質の分注も上記ように自動分注機により自動化することができる。
【００３９】
（６）洗浄３
染色後、洗浄１と同様の方法で余分の染色基質を洗浄により取り除く。
（７）封入剤の分注
以上の操作が終了したスライドプレ−ト上の抗原に封入剤を分注する。これは、染色された抗原などの乾燥を防ぎ、次にスライドプレ−トの上にかぶせるカバ−グラスを密着させる意味がある。この封入剤には、通常１０−１００％のグリセリン水溶液が用いられるが、これに限るわけではない。この工程もスライドプレートを外すことなく自動分注機による自動化が可能である。
【００４０】
以上の（１）乃至（７）の工程に於いて、自動化機器としては、被験サンプルの分注、洗浄、標識抗体の分注、染色基質の分注、封入剤の分注など個々の工程に対応した自動機器を使用することも可能であるし、上方部材の通孔のピッチが９６穴マイクロタイタ−プレ−トと同じであれば、例えば、ベ−リング社のプロセッサ−２、プロセッサ−３、ベックマン社のバイオメック、国際試薬社のエルジアオ−トなどのマイクロプレ−ト用の自動化機器を用いれば、これらのすべての工程を連続して自動化することも可能である。
【００４１】
以上の工程が終了した後、スライドプレ−トを取り出し、スライドプレ−トにカバ−グラスを被せ、顕微鏡にて測定、観察がなされる。
本発明に於いては、上方部材１がスライドプレート上に着脱可能であることにより、顕微鏡にて少数の被験サンプルを測定、観察する際に、８穴タイプ、１６穴タイプ若しくは２４穴タイプのスライドプレートが収納された検査用プレートを使用すると、経済的となる。例えば、１６穴タイプのスライドプレート２が６枚収納された検査用プレートに於いて、２枚のスライドプレート２を使用する必要がある場合には、スライドプレート２から上方部材１を取り外し、４枚のスライドプレート２を取り出し、取り出した４枚のスライドプレート２の代わりにガラスプレートを収納し、スライドプレート２及びガラスプレート上に上方部材１を取り付け、前記の（１）乃至（７）の操作を行った後に２枚のスライドプレート２を取り出して測定、観察をすればよく、先に取り出した４枚のスライドプレート２を後で別の機会で使用することにより、抗原が固定された高価なスライドプレートが無駄になることを防ぐことができる。
【００４２】
次に直接法について説明する。
（１）被験サンプルの付着若しくは固定
直接法では、細胞、組織、喀痰などが被験サンプルとなり、被験サンプルをスライドプレ−ト上に付着させる。これらの被験サンプルは未固定のまま次の工程も行えるし、必要に応じて化学的な固定を行ってもよい。化学的固定には、ホルマリン、パラホルムアルデヒド、グルタ−ルアルデヒド、メタノ−ル、エタノ−ル、アセトン又はこれらの組み合わせなどを利用した固定液が使用可能である。この工程もスライドプレ−トから上方部材をはずすことなく自動分注機による自動化が可能であるが、上方部材をはずした状態で直接スライドプレートに固定することも可能である。
【００４３】
（２）標識抗体若しくは染色液の分注
検査しようとする特異抗原に対する抗体、例えばガンの組織診断の場合にはＣＥＡ、ＡＦＰ、ＰＳＡ、ＣＡ−１９−９などのガン特異抗原や、ケラチン、ビメンチンなどの組織特異抗原に対する抗体、腎臓に於ける免疫複合体の検出では、ＩｇＧ，ＩｇＭ，ＩｇＡなどに対する抗体などを標識したものが用いられる。これらの抗体の標識には蛍光法の場合フルオロセイン、ロ−ダミン、フィコエリスリンなどが使用可能であり、酵素法の場合はペルオキシダ−ゼやアルカリ性フォスファタ−ゼなどが使用可能であり、またビオチンを用いた間接的標識も可能である。また、標識抗体の代わりにパパニコロ染色ヘマトキシリン液１００、パパニコロ染色液ＯＧ−１００、パパニコロ染色液ＥＡ−１００等の染色液を用いた染色法も利用できる。この工程では、標識抗体や染色液などがスライドプレ−ト上の被験サンプル上に分注するのであるが、上方部材をスライドプレ−ト上に取り付けたままでの分注を自動分注機などによる自動化することが可能である。
【００４４】
（３）洗浄１
被験サンプル中の抗原物質に結合しなかった標識抗体や余分の染色液を洗浄操作により取り除く。洗浄は洗浄液の分注と吸引を繰り返すのであるが、自動洗浄機などにより検査用プレートからスライドプレートを取り外すことなく自動化が可能である。
【００４５】
（４）染色基質の分注（酵素標識抗体の場合）
酵素抗体法の場合は、酵素の結合した部位を染色するため、染色基質を分注する。染色基質としては、酵素がペルオキシダ−ゼの場合、ジアミノベンチジンを含有する緩衝液などが用いられる。また、ビオチンによる標識の場合は、ＰＡＰ法やＡＢＣ法などの増幅法も利用可能である。
【００４６】
（５）洗浄２
染色後洗浄し、余分の染色基質を取り除く。
この染色基質の分注、洗浄もスライドプレートを検査用プレートにセットしたままでの自動化機器への対応が可能である。
【００４７】
（６）封入剤の分注
以上の操作が終了した後、スライドプレ−ト上の抗原物質に封入剤が分注される。これは、染色された抗原などの乾燥を防ぎ、次にスライドプレ−ト上にかぶせるカバ−グラスを密着させる意味がある。この工程もスライドプレ−ト上に上方部材を取り付けることにより、自動分注機による自動化が可能となる。
【００４８】
以上の工程が終了した後、上方部材をスライドプレ−トからはずしてカバ−グラスをかけ、顕微鏡により測定がなされる。
本発明に係わる検査用プレートを使用すれば、検査用プレートからスライドプレートを取り外してスライドプレート上に被験サンプルを付着若しくは固定し、次いでスライドプレートを検査用プレートに取り付けて自動化機器を使用して標識抗体若しくは染色液の分注、洗浄、染色基質の分注等を行い、次いでスライドプレートを検査用プレートから取り外して顕微鏡で測定することにより、効率よく測定を行うことができる。
【００４９】
尚、本発明に係る検査用プレートは、予め抗原が固定されたスライドプレートをセットしたものであっても、また、抗原が固定されていないスライドプレートがセットされたものであってもよく、それぞれ用途に応じて使用することができる。
【００５０】
【実施例】
次に実施例により、本発明を説明する。
〔実施例１〕
上方部材の製造
ポリスチレンを使用し、射出成形により、図１乃至図１１に示す上方部材１を成形した。上方部材１には、通孔５から通孔５までのピッチを９．０ｍｍとし、長手側を１２列、短手側を８列として合計９６個の通孔５を形成した。通孔５は、上部直径を７．０ｍｍ、下部直径を上部直径よりも小径である６．０ｍｍ、深さを８．０ｍｍ、容量を約０．３１ｍｌとした。上方部材１の下面にはシール材７を嵌着させる為に幅１．０ｍｍ、深さ１．０ｍｍの溝６を形成した。上方部材１の一端には支軸１１を形成した。
【００５１】
シール材の固定
プレス加工により、肉厚１．０ｍｍ、硬度４０度のシリコーンゴム板（東レ・ダウコーニング・シリコーン社製熱加硫型シリコンゴムＳＨ８４１Ｖ）を上方部材１の下面形状に相当する外形状に打ち抜いた後に、上方部材１と同じピッチで直径５．５ｍｍの穴を９６個形成した。上方部材１の下面に形成した溝６内に硬化性液状シリコーンゴム（東レ・ダウコーニング・シリコーン社製電子部品用コーティング材ＳＥ９１８７ＲＴＶ）を充填し、通孔５と穴を合致させながら上方部材１の下面にシリコーンゴム板を貼り合わせ、２５℃で、１２時間保持して液状シリコーンゴムを硬化させて突出部とすることにより、上方部材１の下面にシール材７を固定した。
【００５２】
下方部材の製造
ガラスフィラーを１５重量％含有したポリカーボネートを使用し、図１乃至図１１に示す下方部材４を成形した。下方部材４には、支持部９上に約１８．０ｍｍの間隔をおいて高さ約５．０ｍｍ、長さ約２．０ｍｍ、肉厚約０．８ｍｍの分割リブ１５を片側に８個づつとして合計１６個形成した。下方部材４の一端には支軸受け穴１０を形成した。
【００５３】
スライドプレートの製造
肉厚１．０ｍｍのガラス板を長手寸法（ａ寸法）が７６．７ｍｍ、短手寸法（ｃ寸法）が１６．８ｍｍとなるように裁断し、抗原若しくは被験サンプルを固定する部位（９６穴マイクロプレートと同様のピッチで設けられ、通孔５の下部直径６．０ｍｍよりも小径である直径４．５ｍｍの区域）１４以外をテフロンをバインダーとする印刷インキで印刷して着色、撥水処理を施すことにより、スライドプレート２を製造した。
【００５４】
また、肉厚１．０ｍｍのガラス板を長手寸法（ｄ寸法）が１１１．３ｍｍ、短手寸法（ｂ寸法）が７２．７ｍｍとなるように裁断し、抗原若しくは被験サンプルを固定する部位（９６穴マイクロプレートと同様のピッチで設けられ、通孔５の下部直径６．０ｍｍよりも小径である直径４．５ｍｍの区域）１４以外をテフロンをバインダーとする印刷インキで印刷して着色、撥水処理を施すことにより、スライドプレート３を製造した。
【００５５】
検査用プレートの作製
上方部材１の支軸１１を下方部材４の支軸受け穴１０に嵌合させた後に、下方部材４の支持部９上にスライドプレート２を６枚セットするか、或いはスライドプレート３を１枚セットすることにより、本発明に係わる検査用プレートを作製した。
〔実施例２〕
空気中に５％の炭酸ガスを含有した炭酸ガスインキュベータ中に於いて３７℃で９０容量部のＭＥＭ−Ｅ培地に１０容量部の牛胎児血清を加えた培地（以下、培地という）でＨｅｐ２細胞を３日間培養した。培養容器に付着したＨｅｐ２細胞を１０ミリモル濃度の燐酸緩衝液に０．１５モル濃度となるように塩化ナトリウムを加えた溶液（以下、ＰＢＳ溶液という）で洗浄した後、０．１２５重量％のトリプシンと０．０１重量％のエチレンジアミンテトラアセテートとを含む緩衝液中に懸濁させ、培地を加えた後、遠心分離を行いＨｅｐ２細胞を集めた。次いで、Ｈｅｐ２細胞を再び培地に懸濁し、遠心分離してＨｅｐ２細胞を集めることにより洗浄を行った。Ｈｅｐ２細胞を再び培地に１０^４個／ｍｌ乃至１０^５個／ｍｌとなるように懸濁し、自動分注機によりスライドプレート３を装着した実施例１の検査用プレートの通孔５内に懸濁液を２００μｌづつ分注した。
【００５６】
空気中に５％の炭酸ガスを含有した炭酸ガスインキュベータ中に於いて検査用プレートを３７℃で１２時間放置し、Ｈｅｐ２細胞をスライドプレート３上に付着させた。
【００５７】
検査用プレートの通孔５内の培地を捨て、検査用プレートからスライドプレート３を取り外し、ＰＢＳ溶液に浸漬して洗浄した後、アセトン中に浸漬してＨｅｐ２細胞をスライドプレート３上に固定した。
【００５８】
Ｈｅｐ２細胞を固定したスライドプレート３を風乾し、検査用プレート内に取り付けることにより、スライドプレート３上に抗原を固定した検査用プレートを作製した。
〔実施例３〕
ヤギ由来抗ヒト・イムノグロブリン抗体をフルオロセインイソチオシアネートで標識して標識抗体を調整し、得られた標識抗体をＰＢＳ溶液で希釈した。
【００５９】
被験サンプルである５０例の血清を自動希釈機を使用してＰＢＳ溶液で２０倍、４０倍、８０倍、１６０倍、３２０倍、６４０倍及び１２８０倍に希釈した。実施例２に記載されたスライドプレート３上に抗原を固定した検査用プレートに於いて上方部材１をスライドプレート３上に取り付けた後に、検査用プレートの通孔５内に自動分注機を使用して前記血清希釈液を１００μｌ分注した後、室温で３０分間放置した。
【００６０】
次いで、自動洗浄機を使用して検査用プレートの通孔５内に３００μｌのＰＢＳ溶液を分注、吸引して洗浄する操作を４回繰り返した。
自動分注機を使用して検査用プレートの通孔５内に前記標識抗体希釈液を１００μｌ分注した後、２５℃で３０分間放置した。
【００６１】
次いで、前記と同様に検査用プレートの通孔５内を洗浄した。
次いで、自動分注機を使用して検査用プレートの通孔５内に８０重量％グリセリン水溶液を１０μｌ分注した後、スライドプレート３を検査用プレートから取り外し、スライドプレート３上にカバーグラスを被せ、蛍光顕微鏡で観察した。
【００６２】
本発明に係わる前記の測定方法に於いて、５０例の血清の内で１５例が陽性と判断されたが、これはＭＢＬ社のフルオローＨＥＰＡＮＡ検査用プレートを使用した従来最も広く使用されている測定方法と同様の結果であった。
【００６３】
また、陽性と判断された血清の内で６例について抗体価（希釈限界倍率）と染色パターンを示すと、表１の通りであり、本発明方法によれば従来法と同等以上の精度で測定し得ることが明かであった。
【００６４】
【表１】

〔実施例４〕
ヤギ由来抗ヒト・イムノグロブリン抗体をペルオキシダーゼで標識して標識抗体を調製し、得られた標識抗体をＰＢＳ溶液で希釈した。
【００６５】
実施例３で使用した５０例の血清を自動希釈機を使用してＰＢＳ溶液で２０倍、４０倍、８０倍、１６０倍、３２０倍、６４０倍及び１２８０倍に希釈した。実施例２に記載されたスライドプレート３上に抗原を固定した検査用プレートに於いて上方部材１をスライドプレート３上に取り付けた後に、検査用プレートの通孔５内に自動分注機を使用して前記血清希釈液を１００μｌ分注した後、室温で３０分間放置した。
【００６６】
次いで、自動洗浄機を使用して検査用プレートの通孔５内に３００μｌのＰＢＳ溶液を分注、吸引して洗浄する操作を４回繰り返した。
次いで、自動分注機を使用して検査用プレートの通孔５内に前記標識抗体希釈液を１００μｌ分注した後、室温で３０分間放置した。
【００６７】
次いで、前記と同様に検査用プレートの通孔５内を洗浄した。
次いで、自動分注機を使用して検査用プレートの通孔５内に１００μｌの染色基質（０．００５重量％の過酸化水素、０．０２重量％のジアミノベンチジンを含有する５０ミリモル濃度のトリス緩衝液、ＰＨ７．６）を分注した後、室温で１０分間放置した。
【００６８】
次いで、前記と同様に検査用プレートの通孔５内を洗浄した。
次いで、自動分注機を使用して検査用プレートの通孔５内に濃度８０重量％のグリセリン水溶液を１０μｌ分注した後、スライドプレート３を検査用プレートから取り外し、スライドプレート３上にカバーグラスを被せ、顕微鏡で観察したところ、実施例３とほぼ同様の結果が得られた。
〔実施例５〕
検査用プレートから取り外したスライドプレート３上に被験サンプルである肺ガン（編平上皮ガン）患者１０例と正常者１０例の新鮮な喀痰を塗布した。
【００６９】
次いで、スライドプレート３を１容量部のエタノールと１容量部のジエチルエーテルとからなる固定液に浸漬してスライドプレート３上に喀痰を固定した。
次いで、スライドプレート３を検査用プレートに取り付け、スライドプレート３上に上方部材１を取り付けた。
【００７０】
次いで、自動洗浄機を使用して検査用プレートの通孔５内に濃度７０容量％のエタノール水溶液を３００μｌ分注して吸引する操作、濃度５０容量％のエタノール水溶液を３００μｌ分注して吸引する操作及び蒸留水を３００μｌ分注して吸引する操作を２回づつ繰り返し、通孔５内を洗浄した。
【００７１】
次いで、自動分注機を使用して検査用プレートの通孔５内にパパニコロ染色ヘマトキシリン液１００（和光純薬社製染色液）を２００μｌ分注し、５分間保持して染色した。
【００７２】
次いで、自動洗浄機を使用して検査用プレートの通孔５内に蒸留水を３００μｌ分注して吸引する操作、濃度７０容量％のエタノール水溶液に１容量％の塩酸を加えた水溶液を３００μｌ分注して吸引する操作、濃度７０容量％のエタノール水溶液に３容量％のアンモニアを加えた水溶液を３００μｌ分注して吸引する操作、濃度７０容量％のエタノール水溶液を３００μｌ分注して吸引する操作及び濃度９０容量％のエタノール水溶液を３００μｌ分注して吸引する操作をそれぞれ２回づつ繰り返し、通孔５内を洗浄した。
【００７３】
次いで、自動分注機を使用して検査用プレートの通孔５内にパパニコロ染色液ＯＧ−１００（和光純薬社製染色液）を２００μｌ分注し、２分間保持して染色した。
【００７４】
次いで、自動洗浄機を使用して検査用プレートの通孔５内に濃度９５容量％のエタノール水溶液を３００μｌ分注して吸引する操作を２回繰り返し、通孔５内を洗浄した。
【００７５】
次いで、自動分注機を使用して検査用プレートの通孔５内にパパニコロ染色液ＥＡ−１００（和光純薬社製染色液）を２００μｌ分注し、３分間保持して染色した。
【００７６】
次いで、自動洗浄機を使用して検査用プレートの通孔５内に濃度９５容量％のエタノール水溶液を３００μｌ分注して吸引する操作を３回繰り返して洗浄した後、通孔５内にキシロールを２００μｌ分注し、５分間放置した。
【００７７】
次いで、自動分注機を使用して検査用プレートの通孔５内に濃度８０容量％のグリセリン水溶液を１０μｌ分注した後、スライドプレート３を検査用プレートから取り外し、スライドプレート３上にカバーグラスを被せ、蛍光顕微鏡で観察したところ、肺ガン患者１０例は全て陽性を示した。
【００７８】
【発明の効果】
本発明に従って、上方部材と下方部材とそれに着脱可能なスライドプレートとを有する検査用プレートを使用すると、これまで自動化が困難であった、顕微鏡を用いた間接蛍光抗体法、間接酵素抗体法、直接蛍光抗体法、直接酵素抗体法、また免疫組織化学等に於いて、顕微鏡で観察する工程よりも以前の工程を極めて効率良く実施することが可能となる。
また、スライドプレート上に上方部材を取り付けた状態で検査用プレートの通孔内のスライドプレート上に抗原を付着させ、次いでスライドプレートを取り外して洗浄、抗原の固定、風乾を行った後に、抗原を固定したスライドプレートを再度検査用プレートに取り付けることにより、スライドプレートに抗原を固定した検査用プレートを極めて効率よく製造することが可能となる。
更に、スライドプレート上に上方部材を取り付けた状態で、抗原が固定されたスライドプレートを有する検査用プレートの通孔内への被験サンプルの分注と洗浄、標識抗体の分注と洗浄、必要に応じて染色基質の分注と洗浄を行った後に、封入剤の分注を行い、次いで検査用プレートから取り外したスライドプレートを顕微鏡で観察する検査方法を提供することができる。
更に、検査用プレートからスライドプレートを取り外してスライドプレート上に被験サンプルを付着若しくは固定し、該スライドプレートを検査用プレートに取り付け、検査用プレートの通孔内への標識抗体若しくは染色液の分注と洗浄及び必要に応じて染色基質の分注と洗浄を行った後に、封入剤の分注を行い、次いでスライドプレートを検査用プレートから取り外して顕微鏡で観察する検査方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明に係わる検査用プレートの一例を示す斜め上方から見た分解斜視図である。
【図２】図１に示した検査用プレートをセットした組立斜視図である。
【図３】図１に示した検査用プレートの平面図である。
【図４】図１に示した検査用プレートの底面図である。
【図５】図３におけるＡ−Ａ線に沿った断面図である。
【図６】図３におけるＢ−Ｂ線に沿った断面図である。
【図７】図３におけるＣ−Ｃ線に沿った断面図である。
【図８】上方部材を開蓋した図５に相当する断面図である。
【図９】上方部材を開蓋した図６に相当する断面図である。
【図１０】スライドプレートと上方部材を外した状態でスライドプレートを下方部材にセットした状態を示す平面図である。
【図１１】スライドプレートと上方部材を外した状態でスライドプレートを下方部材にセットした状態を示す平面図である。
【図１２】本発明に係わる検査用プレートの他の一例を示す斜め上方から見た分解斜視図である。
【符号の説明】
１上方部材
２スライドプレート
３スライドプレート
５通孔

Claims

複数個の通孔がそれぞれ独立した区画を形成するように設けられた上方部材と、シール材と、スライドプレートと、下方部材とを有する検査用プレートにおいて、
該上方部材の下面には、該複数個の通孔の周辺に溝が形成されており、
該シール材は、弾性を有する板状体であって該複数個の通孔に対応する位置に該通孔の下部直径と同様の直径の穴を有するとともに該通孔の周辺に形成された該溝内に侵入する突出部を有し、
該スライドプレートは、抗原若しくは被験サンプルを固定する部位以外は撥水処理が施されており、該上方部材に取り付けられた該シール材と該下方部材に対して着脱可能となっており、
該上方部材と該下方部材は、それぞれが着脱可能となるような嵌合部を有していることを特徴とする検査用プレート。
該シート材は、硬度が１８〜５０度、厚さが１．０〜２．０ｍｍである請求項１に記載の検査用プレート。
該通孔の下部直径が、上部直径よりも小径である請求項２に記載の検査用プレート。
該スライドプレートの該抗原若しくは被験サンプルを固定する部位の直径が、該通孔の下部直径よりも小径である請求項２又は３に記載の検査用プレート。
該上方部材の一端が該下方部材に軸支され、該上方部材を開閉させることによって該上方部材と該下方部材から該スライドプレートを着脱可能とした請求項１〜４のいずれかに記載の検査用プレート。
該スライドプレートの抗原若しくは被験サンプルを固定する部位に、予め該抗原若しくは被験サンプルが固定されている請求項１〜５のいずれかに記載の検査用プレート。