JP3542664B2

JP3542664B2 - Immunoassay for plasminogen activator inhibitor-1

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Publication number: JP3542664B2
Application number: JP18278895A
Authority: JP
Inventors: 万紀曽我部; 孝明宗林; 英毅神野; 文雄古崎
Original assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Current assignee: Mitsubishi Chemical Corp
Priority date: 1995-07-19
Filing date: 1995-07-19
Publication date: 2004-07-14
Anticipated expiration: 2015-07-19
Also published as: JPH0933524A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１（以下、「ＰＡＩ−１」と略記することがある）測定用のラテックス試薬、及びそれを用いたＰＡＩ−１総量の測定法に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】
血液線溶系は、血中のプラスミノーゲンがプラスミノーゲンアクチベーターにより活性化されプラスミンとなることで開始し、血栓のフィブリンを溶解する。組織や尿のプラスミノーゲンアクチベーターに対するインヒビターとして、実際に血液線溶系を制御しているとみられているのが、ＰＡＩ−１である。
【０００３】
ＰＡＩ−１は、分子量が約５万、３７９アミノ酸残基からなる一本鎖の糖蛋白であり、血中の組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）のインヒビターであることが知られている（ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＨｅｍｏｓｔａｓｉｓａｎｄＴｈｒｏｍｂｏｓｉｓ，Ｃｏｌｌｅｒ，Ｂ．Ｓ．，ｅｄ．ＷＢＳａｕｎｄｅａｒｓＰｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，（１９８９）８７−１１５）。血中ＰＡＩ−１は、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体、活性型ＰＡＩ−１、潜在型ＰＡＩ−１など様々な形態で存在する。ＰＡＩ−１は血管内皮細胞より放出されると速やかにｔＰＡと結合してその活性を阻害し、血中の線溶活性を規定する重要な因子である。
【０００４】
血中ＰＡＩ−１濃度が高い場合、フィブリンによって形成された血栓が溶けにくい状態であると考えられる（Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ，８，１０４−１１２（１９９４））。例えば急性心筋梗塞症、深部動脈血栓症、糸球体腎炎、アテローマ性動脈硬化症、敗血症、ＤＩＣ（ＤｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄＩｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒＣｏａｇｕｌａｔｉｏｎ：播種性血管内凝固症候群）等の疾患では、ＰＡＩ−１の放出量が著しく増加し、血栓が極めて溶けにくくなり、虚血性臓器障害の原因となっている。このような場合、血中に放出されたＰＡＩ−１の総量は血管内皮障害を反映し、ＰＡＩ−１の総濃度の測定はこうした疾患の診断、重篤さの診断、予後の判断、治療に有効であると考えられ、迅速な測定が望まれている。
【０００５】
ところで従来、血中ＰＡＩ−１を測定するものとして、ＰＡＩ活性、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体量、ＰＡＩ−１総抗原量などが知られている。これらに対し、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体、ＰＡＩ−１総抗原量は酵素免疫測定法で、ＰＡＩ活性はｔＰＡの作用により生じるプラスミンの活性を呈色性基質により測定する方法で、従来測定が行われてきた。しかし、これらはいずれも操作が煩雑で、２時間以上のインキュベーションが必要であるなど、反応、測定に要する時間が長いという問題を有していた。
【０００６】
さらに、ＰＡＩ活性を測定する方法では、活性型ＰＡＩ−１の生体内代謝時間は、半減期が６〜７分と短かく（ＣｉｒｃｕｌａｔｉｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ，６７，１２８１−１２８６（１９９０））、特に活性型ＰＡＩ−１はインビトロでも不安定であり、３７℃での半減期は２〜４時間（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３９，４９７−５０３（１９８６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６，３，１５４５４−１５４６１（１９８８））と短く、冷凍保存や凍結融解に対する安定性も低いため、測定中あるいは測定前に失活してしまうという問題があった。
【０００７】
また、ＰＡＩ−１総抗原量を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定している例では、２０時間以上もの長時間を必要としており（Ｂｌｏｏｄ，７７，１９４９−１９５７（１９９１））、血液凝固疾患における血管内皮障害の指標とすることは困難であった。
【０００８】
したがって、血液凝固疾患の病態を正確に把握するためには、分析時間の短いＰＡＩ−１の測定法の開発が望まれていた。
【０００９】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記問題点を解決すべく検討を重ねてきた結果、迅速、簡便な免疫測定法であるラテックス凝集法を応用したＰＡＩ−１測定用試薬及びＰＡＩ−１測定法を開発し、本発明を完成するに至った。
【００１０】
すなわち本発明は、ラテックス粒子上にプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１に結合する抗体が固定化されたプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１測定用ラテックス試薬である。
【００１１】
また本願発明は、上記ラテックス試薬を用いたラテックス凝集により、試料中のプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１の存在または量を測定する免疫測定法を提供する。このプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１の量は、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１の総抗原量として測定することが好ましい。
【００１２】
さらに本願発明は、上記の方法によりプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター−１の総抗原量を測定することを特徴とする血液凝固疾患の検知法を提供する。
【００１３】
尚、「ＰＡＩ−１総抗原量」とは、ＰＡＩ活性の有無に関わらず、フリー（遊離）のＰＡＩ−１、ｔＰＡ（組織プラスミノーゲンアクチベーター）を始めとするプラスミノーゲンアクチベーターとＰＡＩ−１との複合体など、様々な形態のＰＡＩ−１の抗原としての総量を意味する。
【００１４】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態を説明する。
＜１＞ＰＡＩ−１測定用ラテックス試薬
本発明のラテックス試薬は、ＰＡＩ−１の測定、特にＰＡＩ−１総抗原量を測定するための免疫試薬であり、ラテックス粒子上にＰＡＩ−１に結合する抗体が固定化されたものである。
【００１５】
本発明のラテックス試薬に用いるラテックス粒子としては、ラテックス凝集を利用した免疫測定に通常用いられるラテックス粒子を使用することができ、ポリスチレンラテックス、スチレンとジビニルベンゼンの共重合体、アクリル酸とスチレンの共重合体、スチレンとマレイン酸の共重合体、スチレンとメタクリル酸の共重合体、スチレンとアクリル酸とアルキルアクリレートなどの共重合体、酢酸ビニルとアクリル酸の共重合体等が挙げられる。ラテックス粒子の粒径としては０．１〜１．０μｍ程度が好ましい。
【００１６】
上記ラテックス粒子の粒子上にＰＡＩ−１に結合する抗体（抗ＰＡＩ−１抗体）を固定化することによって、本発明のラテックス試薬が得られる。抗ＰＡＩ−１抗体は、ラット、モルモット、ウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、馬、牛などの哺乳動物をＰＡＩ−１で免疫することにより得られる。免疫後、これらの動物から採血し、血清を分離して得られる抗ＰＡＩ−１抗血清も本発明に使用することができるが、ラテックス粒子への固定化の効率等の観点からは、免疫グロブリン分画として精製した抗ＰＡＩ−１抗体を用いることが好ましい。抗ＰＡＩ−１の精製は、例えばＮｉｓｏｎｏｆｆらの方法（Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，ＥｉｓｅｎＨ．Ｎ．（ｅｄ）．ＹｅａｒＢｏｏｋＭｅｄｉｃａｌＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ，（１９６４）１０，１３４−１４１）により行うことができる。また、ＰＡＩ−１で免役したマウスの脾細胞をミエローマ細胞と融合して得られるハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体も本発明に適用することができるが、モノクローナル抗体を用いる場合は、認識するエピトープが異なる２種類以上のモノクローナル抗体が必要である。
【００１７】
免疫に用いるＰＡＩ−１は、例えば、ＷＩ３８ＶＡ１３２ＲＡ株（ＡＴＣＣＣＣＬ７５．１）、ＨＴ１０８０株（ＡＴＣＣＣＣＬ１２１）、ＣａＳＫｉ株（ＡＴＣＣＣＲＬ１５５０）等のヒト由来ＰＡＩ−１産生細胞株の培養上清から精製することにより得られる。このような細胞株を、無血清ＤＭＥＭ培地等の適当な培地で培養すれば、培養液中にＰＡＩ−１が分泌される。その際、培地にデキサメタゾンを２×１０^−６Ｍ程度添加しておくと、ＰＡＩ−１が効率よく産生される。
【００１８】
またＰＡＩ−１は、遺伝子組換え技術により作製されたＰＡＩ−１を発現する大腸菌を培養することによっても得られる。
培養上清からのＰＡＩ−１の粗精製は、後記実施例では、抗ＰＡＩ−１マウスモノクローナル抗体固定セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）を用いたアフィニティクロマトグラフィーにより行ったが、モノクローナル抗体の代わりにコンカナバリンＡ固定セファロースによって粗精製することもできる。かくして得られる粗精製物をゲル濾過クロマトグラフィーにより分画することによって、精製ＰＡＩ−１が得られる。各フラクション中のＰＡＩ−１の相対量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット法で確認できる。
【００１９】
上記のようにして得られた抗ＰＡＩ−１抗体は、ＰＡＩ−１との反応性をイムノブロッティング等により調べることによって評価することができる。例えば、ＰＡＩ−１をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけ、泳動後のゲルをニトロセルロース膜等に転写し、抗ＰＡＩ−１抗体、抗ＰＡＩ−１抗体の調製に用いた免疫動物のイムノグロブリンに対する他の動物の抗体をアルカリフォスファターゼ等で標識した二次抗体、及び酵素反応により発色する基質色素と順次インキュベートして発色させることにより、ＰＡＩ−１と抗ＰＡＩ−１抗体との反応性を調べることができる。その際、活性型ＰＡＩ−１、潜在型ＰＡＩ−１、ｔＰＡとＰＡＩ−１との複合体等、種々の形態のＰＡＩ−１、及び他の血漿タンパクも同じゲルで泳動し、抗ＰＡＩ−１抗体がＰＡＩ−１の形態に関わらず結合し、他の血漿タンパクには結合しないことを確認しておくことが好ましい。
【００２０】
抗ＰＡＩ−１抗体をラテックス粒子上に固定化する方法としては特に制限はなく、例えば、ラテックス粒子と抗体を混合することによりおこる物理的な吸着を用いる物理吸着法、カルボジイミドなどのカップリング剤により、ラテックス粒子表面のカルボキシル基やアミノ基と抗体分子を化学的に結合させる化学結合法が用いられる。また、抗体分子をスペーサー分子を介してラテックス粒子に結合させてもよい。さらに、アルブミンなどの他のタンパク質に化学結合法を用いて抗体を結合させた後に、そのタンパク質をラテックス粒子に物理的あるいは化学的に固定化してもよい。
【００２１】
ラテックス粒子に固定化する抗ＰＡＩ−１抗体としては、ＩｇＧそのものでもよいが、ＩｇＧをペプシン、パパインなどの消化酵素、あるいはジチオスレイトール、メルカプトエタノールなどの還元剤を用いてＦ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’などにフラグメント化したものが用いられる。ＩｇＭなどの他のクラスの抗体も同様の処理をして使用することができる。
【００２２】
＜２＞ラテックス試薬を用いたＰＡＩ−１の免疫測定法
本発明の免疫測定法は、上記のラテックス試薬を用いたラテックス凝集により、試料中のＰＡＩ−１の存在または量を測定する方法である。すなわち、ラテックス試薬をＰＡＩ−１を含有する試料溶液に添加すると、抗ＰＡＩ−１抗体を介してラテックス粒子が結合し、凝集する。このラテックス粒子の凝集を測定することによって、ＰＡＩ−１の存在または量を測定することができる。ラテックスの凝集は、スライドラテックス凝集法によって検知することもできるが、可視光から近赤外域の光（４００〜２４００ｎｍ、好ましくは６００〜１０００ｎｍ）の吸収の増加を、分光光度計を用いて経時的に測光することにより、正確に測定することができる。このような測定を行う装置として、三菱化学株式会社のＬＰＩＡ−２００ラテックス凝集全自動測定器、ロシュ・ダイアグノスティック・システムズ社のＣＯＢＡＳＦＡＲＡ装置およびＣＯＢＡＳＭＩＲＡ装置、および日立製作所の日立７０４分析装置等が挙げられる。
【００２３】
試料とラテックス試薬との反応は、生理的食塩水、緩衝液等の液体中で行われる。ラテックス試薬と試料中のタンパクとの非特異的結合を抑制するために、界面活性剤等の吸着抑制剤を反応液に添加してもよい。
【００２４】
ＰＡＩ−１の絶対量を測定するためには、量が既知のＰＡＩ−１標準品を用いて検量線を作成しておけばよい。検量線は、例えば、ラテックス粒子の凝集量に対してＰＡＩ−１標準品の濃度またはＰＡＩ活性をプロットすることにより得られる。試料を適宜段階的に希釈し、この希釈液にラテックス粒子を加え、ラテックス凝集を測定し、得られた測定値と検量線から、試料中のＰＡＩ−１量（濃度）を知ることができる。
【００２５】
＜３＞本発明の免疫測定法の利用
本発明のラテックス試薬を用いたＰＡＩ−１の測定法によれば、血漿中のＰＡＩ−１総濃度を、ｔＰＡ等との複合体の形成の有無、活性型、潜在型の如何に関わらず、短時間、簡便、かつ再現性よく測定することができる。また、本発明の免疫測定法に用いる検体は、保存安定性に優れている。
【００２６】
内皮細胞刺激により、ＰＡＩ−１と共にｔＰＡの放出が亢進している場合、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体形成のため、血漿中ＰＡＩ活性は低下し、その値は血管内皮のＰＡＩ−１放出量を反映しない。一方、本発明により測定されるＰＡＩ−１総濃度は、ＰＡＩ−１放出量を通して血管内皮の状態を常に反映する指標として有益であると考えられる。
【００２７】
また、血漿検体中のＰＡＩ−１総濃度はＰＡＩ活性を測定するよりも安定であり、臨床検体として扱いやすい。本発明により測定されるＰＡＩ−１総抗原量は、ＰＡＩ活性との相関性が高く、ＰＡＩ活性をよく反映する。
【００２８】
以上のことから、本発明の免疫測定法によりＰＡＩ−１総抗原量を測定することは、血液凝固疾患の診断に利用できることが期待される。
【００２９】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。
【００３０】
【実施例１】抗ＰＡＩ−１抗体結合ラテックス試薬
＜１＞ＰＡＩ−１の調製
ヒト由来ＰＡＩ−１産生細胞株ＷＩ３８ＶＡ１３２ＲＡ（ＡＴＣＣＣＣＬ７５．１）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）添加ＤＭＥＭ培地（日水製）で、ローラーボトル中で増殖させ、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）で細胞を洗浄した後、デキサメタゾン２×１０^−６Ｍを含む無血清ＤＭＥＭ培地中で１０日間培養した。その後、培養上清を回収し、抗ＰＡＩ−１マウスモノクローナル抗体固定セファロース４Ｂアフィニティカラムに通してＰＡＩ−１を吸着させた後、３ＭＭｇＣｌ_２で溶出し、粗精製ＰＡＩ−１を得た。抗ＰＡＩ−１マウスモノクローナル抗体固定セファロース４Ｂは、マウスモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ（米国カリフォルニア、ラジョラのスクリップスクリニックアンドリサーチファウンデーション（ＳｃｒｉｐｐｓＣｌｉｎｉｃａｎｄＲｅｓｅａｒｃｈＦｏｕｎｄａｔｉｏｎ）のＤ．Ｊ．ロスクトフ（Ｄ．Ｊ．Ｌｏｓｋｕｔｏｆｆ）博士より恵与された。Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，８３，１７４７−１７５２（１９８９）参照）から抗ＰＡＩ−１モノクローナル抗体を調製し、これをＣＮＢｒ−セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）に結合することにより作製した。
【００３１】
上記で得られた溶出物を３ＭＭｇＣｌ_２で平衡化したセファクリルＳ−２００（ファルマシア社製）カラムを用いたゲル濾過クロマトグラフィーにより分画し、精製ＰＡＩ−１を得た。この精製ＰＡＩ−１を、１０％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に付し、泳動後ゲルを銀染色した結果、分子量約５万のほぼ単一のバンドが認められた。
【００３２】
＜２＞抗ＰＡＩ−１ウサギポリクローナル抗体の調製
上記で得られたＰＡＩ−１を、限外濾過膜（アミコン社、ＹＭ−１０）を用いて４００μｇ／ｍｌに濃縮した。これとフロイントの完全アジュバントとの混合物でニュージーランド白色ウサギを免疫し、８〜１０週間後に追加免疫を行った。初回免疫より１０〜１４週間後に採血し、抗ＰＡＩ−１抗血清を得た。
【００３３】
上記抗ＰＡＩ−１血清を、Ｎｉｓｏｎｏｆｆらの方法（Ｎｉｓｏｎｏｆｆ，Ａ．ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｅｄｉｃａｌＲｅｓｅａｒｃｈ，ＥｉｓｅｎＨ．Ｎ．（ｅｄ）．ＹｅａｒＢｏｏｋＭｅｄｉｃａｌＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｃｈｉｃａｇｏ，（１９６４）１０，１３４−１４１）により精製し、抗ＰＡＩ−１ポリクローナル抗体を得た。すなわち、抗血清から硫酸アンモニウム塩析により、粗γ−グロブリン分画を得、ペプシン消化によりＦ（ａｂ’）_２を得た。
【００３４】
＜３＞抗ＰＡＩ−１抗体の評価
（１）精製ＰＡＩ−１の活性化
精製ＰＡＩ−１の活性化は、Ｈｅｋｍａｎらの方法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６０，１１５８１−１１５８７（１９８５））、すなわち、精製ＰＡＩ−１を２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）に対して透析後ＳＤＳを添加し、０．１％ＳＤＳ存在下で３７℃で３０分インキュベートすることにより行った。活性化させたＰＡＩ−１は、４℃で２０時間、３０００倍容の２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７．６）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０に対して十分に透析した。
【００３５】
（２）抗ＰＡＩ−１抗体と活性化ＰＡＩ−１、ｔＰＡ、及びｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体との反応
得られた活性化ＰＡＩ−１と一本鎖ｔＰＡ（Ｂｉｏｐｏｏｌ社製）とを３７℃で３０分間混合することにより、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体を作製し、１／４容のＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（０．２５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、４．４％ＳＤＳ、４０％グリセロール、０．０５％ブロモフェノールブルー）を加えてｔＰＡの結合反応を停止させた。
【００３６】
活性化ＰＡＩ−１、ｔＰＡ、及びｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体は、Ｌａｅｍｍｌｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ，２２７，６８０−６８５（１９７０））にしたがったＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。アクリルアミド濃度は、スタッキングゲルは４％、ランニングゲルは９％とした。泳動後、ゲルは銀染色、あるいはウェスタンブロッティング解析を行った。ウェスタンブロッティングは、ゲルをニトロセルロース膜に転写し、抗ＰＡＩ−１抗体、アルカリフォスファターゼ標識した抗ウサギＩｇヤギ抗体、及び基質色素と順次インキュベートして発色させることにより行った。
【００３７】
ゲルを銀染色した結果、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体はおよそ１２０ｋｄの大きさを示した。また、過剰のｔＰＡを加えると、ＰＡＩ−１の分解物が認められた。イムノブロッティングの結果、抗ＰＡＩ−１抗体は、ＰＡＩ−１、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体、及びこれらの分解物を認識し、ｔＰＡとのクロス反応は認められなかった。また、正常ヒト血漿などのその他のタンパクに対して上記と同様にしてイムノブロッティングを行った結果、これらのタンパクとのクロス反応は認められなかった。こうして、抗ＰＡＩ−１抗体の特異性が確認された。
【００３８】
＜４＞抗ＰＡＩ−１抗体結合ラテックス試薬の調製
抗ＰＡＩ−１抗体を、硫酸アンモニウムを用いた塩析によりγ−グロブリン分画として粗精製した後、ペプシン消化して抗ＰＡＩ−１Ｆ（ａｂ’）_２を得た。このＰＡＩ−１Ｆ（ａｂ’）_２を、平均粒径０．５３μｍのポリスチレンラテックス（セラダイン社製）表面に常法により固定し、ラテックス試薬とした。試薬中のラテックス濃度は０．１〜０．５％であり、ＰＡＩ−１Ｆ（ａｂ’）_２の濃度は０．０２５〜０．２５μｇ／μｌであった。
【００３９】
【実施例２】血漿ＰＡＩ−１の測定
＜１＞ＰＡＩ−１標準品を用いたＰＡＩ−１測定用検量線の作成
Ｂｒａｄｆｏｒｄの方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７２，２４８−２５４（１９７６））を用いて精製ＰＡＩ−１のタンパク質量を定量し、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）添加トリス緩衝液で１５、３０、９０、２７０ｎｇ／ｍｌに希釈し、ＰＡＩ−１測定用標準品とした。
【００４０】
上記ＰＡＩ−１標準品溶液５μｌ、ＢＳＡ含有トリス−塩酸緩衝液２７０μｌ、実施例１で得られたラテックス試薬４０μｌを混合し、反応キュベットに自動分注後、近赤外（９５０ｎｍ）の吸収の増加を１０分間測定することにより、免疫反応を観察した。測定は、ラテックス凝集全自動測定器（三菱化学（株）製：ＬＰＩＡ−２００システム）を用いて行った。測定は、２０分以内に完了した。その結果、ＰＡＩ−１量とラテックス凝集率は、直線性を示した。
【００４１】
＜２＞ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体に対するラテックス試薬の反応性
活性型ＰＡＩ−１に対するｔＰＡ量を増加させて、上記と同様にしてこれらを反応させ、ＰＡＩ−１総濃度、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体濃度、及びＰＡＩ活性を測定した。ＰＡＩ−１総濃度はＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｐｏｏｌ社製、ＴｉｎｔＥｌｉｓｅ）を用いて、ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体濃度はサンドウィッチＥＩＡキット（帝人（株）社製、ｔＰＡＩ−Ｃｔｅｓｔ）を用いて、ＰＡＩ活性は合成基質法による測定キット（Ｂｉｏｐｏｏｌ社製、Ｓｐｅｃｔｒｏｌｙｓｅ／ｆｉｂｌｉｎ）を用いて、それぞれ測定した。結果を図１に示す。図中、●はＰＡＩ−１総濃度（ｎｇ／ｍｌ）、□はｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体濃度（ｎｇ／ｍｌ）、○はＰＡＩ活性（Ｕ／ｍｌ）をそれぞれ表す。図に示されるように、ｔＰＡ量が増加するにつれてｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体濃度は増加し、ＰＡＩ−１に対するｔＰＡのモル濃度比が１：１以上になると飽和した。ＰＡＩ活性は、ｔＰＡの増加に伴い低下したが、ＰＡＩ−１総濃度は変化しなかった。
【００４２】
また、種々の形態のＰＡＩ−１、すなわち、活性型、潜在型（ｌａｔｅｎｔ：活性型ＰＡＩ−１血漿を凍結融解を２回繰り返すことにより得た）、及び一本鎖ｔＰＡ（ｏｃｔＰＡ）、組換えｔＰＡ（三菱化学（株）製）またはヒト重鎖ウロキナーゼ（ＵＫ）（Ａｍｅｒｉｃａｎｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ社製）との複合体について同様の測定を行ったところ、すべての形態においてほぼ１００％の試薬反応性を示した（表１）。
【００４３】
【表１】

【００４４】
また、本発明のラテックス試薬は、ＰＡＩ活性が低下した潜在型ＰＡＩ−１血漿に対する反応性も変化は無かった。
【００４５】
＜３＞ＰＡＩ−１の抗原としての保存安定性
４℃で５日間、及び凍結融解を３回繰り返した健常人血漿試料中のＰＡＩ活性は経時的に活性が低下したが、ラテックス試薬に対する反応性は変化せず、安定であった。
【００４６】
＜４＞本発明の方法と他のＰＡＩ−１測定法との相関
健常人及び各種血液凝固疾患患者の血液を０．１％クエン酸ナトリウムに加え、２０００×ｇで１５分遠心して血小板に乏しい血漿を得た。全ての試料は、−４０℃で保存した。
【００４７】
正常人及び患者の血漿中のＰＡＩ活性と、本発明の方法により測定したＰＡＩ−１総濃度との相関を図２に示す。これらの相関係数（ｒ）は、０．７９であった。また、ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｐｏｏｌ社製、ＴｉｎｔＥｌｉｓｅ）により測定したＰＡＩ−１総濃度と本発明の方法による測定値との相関係数は０．９４と高かったが、サンドウィッチＥＩＡキット（帝人（株）社製、ｔＰＡＩ−Ｃｔｅｓｔ）で測定したｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体とＰＡＩ−１との相関係数は０．３４であった。
【００４８】
＜５＞ＰＡＩ−１総濃度の希釈直線性の評価
急性心筋梗塞患者のクエン酸添加血漿３検体について、ＢＳＡ含有トリス緩衝液で２倍づつ連続希釈した試料用いて、直線性を調べた。これらの試料５μｌ、ＢＳＡ含有トリス−塩酸緩衝液２７０μｌ、実施例１で得られたラテックス試薬４０μｌを混合し、反応キュベットに自動分注後、上記と同様にしてラテックス粒子の凝集を測定した。ＰＡＩ−１標準品の検量線から、検体中のＰＡＩ−１総濃度を算出した。結果を図３に示す。いずれの検体においても良好な希釈直線性を示した。
【００４９】
反応系に加えたＰＡＩ−１標準品の回収率は、８０〜１１０％であった。測定領域全域にわたって、同時再現性の検討結果は、標準品及び健常人血漿試料についての変動係数は２−５％（ｎ＝１０）であった。
【００５０】
これとは別に測定した日本人の健常人（ｎ＝６７）のＰＡＩ−１総濃度は、２２．３７±１５．１８ｎｇ／ｍｌ、９５パーセンタイルは５０ｎｇ／ｍｌ以下であった。
【００５１】
【発明の効果】
本発明のラテックス試薬を用いたＰＡＩ−１の測定法によれば、短時間で再現性よくＰＡＩ−１総濃度を測定することができる。また、本発明の方法に用いる検体は、保存安定性に優れている。本発明のＰＡＩ−１総濃度の測定法は、血液凝固疾患における血管内皮障害の指標となると期待される。
【図面の簡単な説明】
【図１】ｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体のラテックス試薬に対する反応性を示す図。図中、●はＰＡＩ−１総濃度（ｎｇ／ｍｌ）、□はｔＰＡ・ＰＡＩ−１複合体濃度（ｎｇ／ｍｌ）、○はＰＡＩ活性（Ｕ／ｍｌ）をそれぞれ表す。
【図２】ＰＡＩ活性と本発明の方法により測定したＰＡＩ−１総濃度との相関を示す図。
【図３】血液凝固疾患患者のクエン酸添加血漿中のＰＡＩ−１総濃度の希釈直線性を示す図。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a latex reagent for measuring plasminogen activator inhibitor-1 (hereinafter sometimes abbreviated as “PAI-1”) and a method for measuring the total amount of PAI-1 using the same.
[0002]
Problems to be solved by the prior art and the invention
The blood fibrinolysis system starts when plasminogen in blood is activated by plasminogen activator to become plasmin, and dissolves fibrin in the thrombus. PAI-1 is believed to actually control the blood fibrinolytic system as an inhibitor of plasminogen activator in tissues and urine.
[0003]
PAI-1 is a single-chain glycoprotein having a molecular weight of about 50,000 and 379 amino acid residues, and is known to be an inhibitor of tissue plasminogen activator (tPA) in blood (Progress). in Hemostasis and Thrombosis, Coller, BS, ed. WB Saunders Philadelphia, (1989) 87-115). Blood PAI-1 exists in various forms such as tPA / PAI-1 complex, active PAI-1 and latent PAI-1. When released from vascular endothelial cells, PAI-1 rapidly binds to tPA and inhibits its activity, and is an important factor that regulates fibrinolytic activity in blood.
[0004]
When the blood PAI-1 concentration is high, it is considered that the thrombus formed by fibrin is in a state in which it is difficult to dissolve (Fibrinlysis, 8, 104-112 (1994)). For example, in diseases such as acute myocardial infarction, deep arterial thrombosis, glomerulonephritis, atherosclerosis, sepsis, and DIC (Dissimilated Intravascular Coagulation), the amount of PAI-1 released is significantly increased. However, the thrombus becomes extremely difficult to dissolve, causing ischemic organ damage. In such cases, the total amount of PAI-1 released into the blood reflects vascular endothelial damage, and the measurement of the total concentration of PAI-1 is useful for the diagnosis, seriousness diagnosis, prognosis and treatment of such diseases. It is considered to be effective, and rapid measurement is desired.
[0005]
Conventionally, PAI activity, the amount of tPA / PAI-1 complex, the amount of PAI-1 total antigen, and the like have been known for measuring blood PAI-1. On the other hand, the total amount of tPA / PAI-1 complex and PAI-1 antigen is measured by an enzyme immunoassay, and the PAI activity is measured by a method of measuring the activity of plasmin generated by the action of tPA using a chromogenic substrate. Has been done. However, all of these methods have a problem that the operation is complicated and the time required for the reaction and the measurement is long, such as the necessity of incubation for 2 hours or more.
[0006]
Furthermore, in the method for measuring PAI activity, the half-life of the in vivo metabolism time of active PAI-1 is as short as 6 to 7 minutes (Circulation Research, 67, 1281-1286 (1990)). -1 is also unstable in vitro and has a half-life at 37 ° C. of 2 to 4 hours (Biochem. J., 239, 497-503 (1986), J. Biol. Chem., 26, 3, 15454-15461). (1988)), and the stability to frozen storage and freeze-thaw is low, so that there is a problem that it is deactivated during or before the measurement.
[0007]
Further, in the case where the total amount of PAI-1 antigen is measured by an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), a long time of 20 hours or more is required (Blood, 77, 1949-1957 (1991)). It was difficult to use it as an indicator of vascular endothelial damage in mice.
[0008]
Therefore, in order to accurately grasp the pathology of a blood coagulation disease, it has been desired to develop a method for measuring PAI-1 having a short analysis time.
[0009]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have been studying to solve the above problems, and as a result, have developed a PAI-1 measuring reagent and a PAI-1 measuring method to which a latex agglutination method which is a quick and simple immunoassay method is applied. Thus, the present invention has been completed.
[0010]
That is, the present invention is a latex reagent for measuring plasminogen activator inhibitor-1 in which an antibody that binds to plasminogen activator inhibitor-1 is immobilized on latex particles.
[0011]
The present invention also provides an immunoassay for measuring the presence or amount of plasminogen activator inhibitor-1 in a sample by latex agglutination using the above latex reagent. The amount of the plasminogen activator inhibitor-1 is preferably measured as the total antigen amount of the plasminogen activator inhibitor-1.
[0012]
Further, the present invention provides a method for detecting a blood coagulation disease, which comprises measuring the total antigen amount of plasminogen activator inhibitor-1 by the above method.
[0013]
The “total amount of PAI-1 antigen” refers to plasminogen activator and PAI including free (free) PAI-1 and tPA (tissue plasminogen activator) regardless of the presence or absence of PAI activity. Means the total amount of various forms of PAI-1 as an antigen, such as a complex with PAI-1.
[0014]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
Hereinafter, embodiments of the present invention will be described.
<1> Latex Reagent for PAI-1 Measurement The latex reagent of the present invention is an immunoreagent for measuring PAI-1, particularly for measuring the total amount of PAI-1 antigen, and binds to PAI-1 on latex particles. The antibody is immobilized.
[0015]
As the latex particles used in the latex reagent of the present invention, latex particles usually used for immunoassay utilizing latex agglutination can be used, such as polystyrene latex, a copolymer of styrene and divinylbenzene, and a copolymer of acrylic acid and styrene. Examples thereof include a polymer, a copolymer of styrene and maleic acid, a copolymer of styrene and methacrylic acid, a copolymer of styrene, acrylic acid and alkyl acrylate, and a copolymer of vinyl acetate and acrylic acid. The particle size of the latex particles is preferably about 0.1 to 1.0 μm.
[0016]
The latex reagent of the present invention can be obtained by immobilizing an antibody that binds to PAI-1 (anti-PAI-1 antibody) on the latex particles. The anti-PAI-1 antibody can be obtained by immunizing mammals such as rats, guinea pigs, rabbits, mice, goats, sheep, horses, cows and the like with PAI-1. Anti-PAI-1 antiserum obtained by collecting blood from these animals after immunization and separating serum can also be used in the present invention. However, from the viewpoint of the efficiency of immobilization to latex particles, etc., It is preferable to use a purified anti-PAI-1 antibody as a fraction. Purification of anti-PAI-1 is carried out, for example, by the method of Nisonoff et al. (Nisonoff, A. Methods in Medical Research, Eisen HN (ed). Year Book Medical Publishers, Chicago, (1064-1), 1064-1). be able to. Furthermore, a monoclonal antibody produced by a hybridoma obtained by fusing spleen cells of a mouse immunized with PAI-1 with myeloma cells can also be applied to the present invention. However, when a monoclonal antibody is used, the epitope recognized is different. Two or more monoclonal antibodies are required.
[0017]
PAI-1 used for immunization is purified from a culture supernatant of a human-derived PAI-1 producing cell line such as WI38 VA1322RA (ATCC CCL75.1), HT1080 (ATCC CCL121), and CaSKi (ATCC CRL1550). It can be obtained by: When such a cell line is cultured in an appropriate medium such as a serum-free DMEM medium, PAI-1 is secreted into the culture solution. At that time, if about 2 × 10 ⁻⁶ M of dexamethasone is added to the medium, PAI-1 is efficiently produced.
[0018]
PAI-1 can also be obtained by culturing Escherichia coli expressing PAI-1 produced by a gene recombination technique.
The crude purification of PAI-1 from the culture supernatant was performed by affinity chromatography using Sepharose 4B (manufactured by Pharmacia) immobilized with anti-PAI-1 mouse monoclonal antibody in Examples described later, but instead of concanavalin, the monoclonal antibody was used. Crude purification can also be performed using A-fixed Sepharose. By fractionating the crude product thus obtained by gel filtration chromatography, purified PAI-1 is obtained. The relative amount of PAI-1 in each fraction can be confirmed by SDS-PAGE and Western blot.
[0019]
The anti-PAI-1 antibody obtained as described above can be evaluated by examining the reactivity with PAI-1 by immunoblotting or the like. For example, PAI-1 is subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and the gel after electrophoresis is transferred to a nitrocellulose membrane or the like, and used for the preparation of anti-PAI-1 antibody and anti-PAI-1 antibody. The antibody of another animal against the immunoglobulin of the animal is sequentially incubated with a secondary antibody labeled with alkaline phosphatase or the like, and a substrate dye that develops a color by an enzymatic reaction to develop a color, thereby allowing PAI-1 and anti-PAI-1 antibody to react with each other. The reactivity can be checked. At this time, various forms of PAI-1 such as active PAI-1, latent PAI-1, a complex of tPA and PAI-1, and other plasma proteins also migrate on the same gel, and anti-PAI-1 It is preferable to confirm that the antibody binds regardless of the form of PAI-1 and does not bind to other plasma proteins.
[0020]
The method for immobilizing the anti-PAI-1 antibody on the latex particles is not particularly limited. For example, a physical adsorption method using physical adsorption caused by mixing latex particles and an antibody, a coupling agent such as carbodiimide, or the like. A chemical bonding method is used in which a carboxyl group or amino group on the surface of the latex particles is chemically bonded to the antibody molecule. Further, the antibody molecule may be bound to the latex particles via a spacer molecule. Furthermore, after binding the antibody to another protein such as albumin using a chemical bonding method, the protein may be physically or chemically immobilized on latex particles.
[0021]
As the anti-PAI-1 antibody immobilized on the latex particles, IgG itself may be used, but IgG may be F (ab ') ₂ by using a digestive enzyme such as pepsin or papain, or a reducing agent such as dithiothreitol or mercaptoethanol. , Fab, Fab ′ and the like are used. Other classes of antibodies, such as IgM, can be used with similar treatment.
[0022]
<2> Immunoassay for PAI-1 using latex reagent The immunoassay of the present invention is a method for measuring the presence or amount of PAI-1 in a sample by latex agglutination using the above latex reagent. . That is, when the latex reagent is added to the sample solution containing PAI-1, latex particles are bound via the anti-PAI-1 antibody and aggregate. By measuring the aggregation of the latex particles, the presence or amount of PAI-1 can be measured. Latex agglutination can be detected by a slide latex agglutination method, but the increase in absorption of visible to near-infrared light (400 to 2400 nm, preferably 600 to 1000 nm) is measured over time using a spectrophotometer. By performing photometry, accurate measurement can be performed. Examples of an apparatus for performing such a measurement include an LPIA-200 latex agglutination automatic measuring apparatus of Mitsubishi Chemical Corporation, a COBAS FARA apparatus and a COBAS MIRA apparatus of Roche Diagnostic Systems, and a Hitachi 704 analyzer of Hitachi, Ltd. Is mentioned.
[0023]
The reaction between the sample and the latex reagent is performed in a liquid such as physiological saline or a buffer. In order to suppress non-specific binding between the latex reagent and the protein in the sample, an adsorption inhibitor such as a surfactant may be added to the reaction solution.
[0024]
In order to measure the absolute amount of PAI-1, a calibration curve may be prepared using a PAI-1 standard having a known amount. The calibration curve is obtained by, for example, plotting the concentration of the PAI-1 standard or the PAI activity against the amount of aggregation of latex particles. The sample is appropriately diluted stepwise, latex particles are added to the diluted solution, latex agglutination is measured, and the amount (concentration) of PAI-1 in the sample can be known from the measured value and the calibration curve.
[0025]
<3> Utilization of the immunoassay of the present invention According to the method of measuring PAI-1 using the latex reagent of the present invention, the total concentration of PAI-1 in plasma can be determined by determining whether a complex with tPA or the like is formed, Regardless of the active form or the latent form, the measurement can be performed in a short time, simply, and with good reproducibility. In addition, the sample used for the immunoassay of the present invention has excellent storage stability.
[0026]
When the release of tPA together with PAI-1 is enhanced by endothelial cell stimulation, the plasma PAI activity decreases due to the formation of the tPA · PAI-1 complex, and the value decreases the amount of PAI-1 released from the vascular endothelium. Does not reflect. On the other hand, the total PAI-1 concentration measured by the present invention is considered to be useful as an index that constantly reflects the state of vascular endothelium through the amount of PAI-1 released.
[0027]
Further, the total concentration of PAI-1 in the plasma sample is more stable than the measurement of PAI activity, and is easy to handle as a clinical sample. The total amount of PAI-1 antigen measured according to the present invention has a high correlation with PAI activity and well reflects PAI activity.
[0028]
From the above, it is expected that measuring the total amount of PAI-1 antigen by the immunoassay of the present invention can be used for diagnosis of blood coagulation diseases.
[0029]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.
[0030]
Example 1 Preparation of anti-PAI-1 antibody-bound latex reagent <1> Preparation of PAI-1 Human-derived PAI-1 producing cell line WI38 VA13 2RA (ATCC CCL75.1) was added to DMEM supplemented with 10% fetal calf serum (FCS). After growing in a roller bottle with a medium (manufactured by Nissui), washing the cells with PBS (phosphate buffered saline), the cells were cultured in a serum-free DMEM medium containing 2 × 10 ⁻⁶ M of dexamethasone for 10 days. . Thereafter, the culture supernatant was collected and passed through a Sepharose 4B affinity column immobilized with an anti-PAI-1 mouse monoclonal antibody to adsorb PAI-1, and then eluted with 3M MgCl ₂ to obtain crude purified PAI-1. Anti-PAI-1 mouse monoclonal antibody-immobilized Sepharose 4B is a hybridoma that produces mouse monoclonal antibodies (DJ Rostokh of Scripps Clinic and Research Foundation, La Jolla, California, USA). Locutoff) Dr. J. Clin. Invest., 83, 1747-1752 (1989)), prepared an anti-PAI-1 monoclonal antibody, and conjugated it to CNBr-Sepharose 4B (Pharmacia). It produced by doing.
[0031]
The eluate obtained above was fractionated by gel filtration chromatography using a Sephacryl S-200 (manufactured by Pharmacia) column equilibrated with 3 M MgCl ₂ to obtain purified PAI-1. This purified PAI-1 was subjected to 10% SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and after the electrophoresis, the gel was stained with silver. As a result, an almost single band having a molecular weight of about 50,000 was observed.
[0032]
<2> Preparation of anti-PAI-1 rabbit polyclonal antibody PAI-1 obtained above was concentrated to 400 μg / ml using an ultrafiltration membrane (Amicon, YM-10). New Zealand white rabbits were immunized with a mixture of this and complete Freund's adjuvant, and boosted 8 to 10 weeks later. Blood was collected 10 to 14 weeks after the initial immunization to obtain an anti-PAI-1 antiserum.
[0033]
The anti-PAI-1 serum was purified by the method of Nisonoff et al. (Nisonoff, A. Methods in Medical Research, Eisen HN (ed). Year Book Medical Publishers, Chicago, (1964) 10, 134-1). An anti-PAI-1 polyclonal antibody was obtained. That is, a crude γ-globulin fraction was obtained from the antiserum by ammonium sulfate salting out, and F (ab ′) ₂ was obtained by digestion with pepsin.
[0034]
<3> Evaluation of Anti-PAI-1 Antibody (1) Activation of Purified PAI-1 Activation of purified PAI-1 was performed by the method of Hekman et al. (J. Biol. Chem., 260, 11581-11587 (1985)). That is, the purified PAI-1 was dialyzed against 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), followed by addition of SDS and incubation at 37 ° C. for 30 minutes in the presence of 0.1% SDS. The activated PAI-1 was thoroughly dialyzed against 3000 volumes of 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 0.05% Tween 20 at 4 ° C. for 20 hours.
[0035]
(2) Reaction of Anti-PAI-1 Antibody with Activated PAI-1, tPA, and tPA · PAI-1 Complex The obtained activated PAI-1 and single-chain tPA (manufactured by Biopool) at 37 ° C. For 30 minutes to produce a tPA · PAI-1 complex, and a 1/4 volume SDS-PAGE sample buffer (0.25 M Tris-HCl (pH 6.8), 4.4% SDS, 40% Glycerol, 0.05% bromophenol blue) was added to stop the binding reaction of tPA.
[0036]
Activated PAI-1, tPA, and tPA.PAI-1 complex were analyzed by SDS-PAGE according to the method of Laemmli (Nature, 227, 680-685 (1970)). The acrylamide concentration was 4% for the stacking gel and 9% for the running gel. After electrophoresis, the gel was subjected to silver staining or Western blotting analysis. Western blotting was performed by transferring the gel to a nitrocellulose membrane and sequentially incubating with an anti-PAI-1 antibody, an alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit Ig goat antibody, and a substrate dye to develop color.
[0037]
As a result of silver staining of the gel, the tPA / PAI-1 complex showed a size of about 120 kd. When excess tPA was added, a decomposition product of PAI-1 was observed. As a result of the immunoblotting, the anti-PAI-1 antibody recognized PAI-1, a tPA · PAI-1 complex, and a degradation product thereof, and no cross-reaction with tPA was recognized. When other proteins such as normal human plasma were subjected to immunoblotting in the same manner as described above, no cross-reaction with these proteins was observed. Thus, the specificity of the anti-PAI-1 antibody was confirmed.
[0038]
<4> Preparation of anti-PAI-1 antibody-bound latex reagent The anti-PAI-1 antibody was roughly purified as a γ-globulin fraction by salting out using ammonium sulfate, and then digested with pepsin to obtain anti-PAI-1 F (ab ′). ₂ ) was obtained. This PAI-1F (ab ') ₂ was immobilized on a polystyrene latex (Ceradyne) surface having an average particle size of 0.53 [mu] m by a conventional method to obtain a latex reagent. The latex concentration in the reagent was 0.1-0.5%, and the concentration of PAI-1 F (ab ') ₂ was 0.025-0.25 μg / μl.
[0039]
Example 2 Measurement of Plasma PAI-1 <1> Preparation of Calibration Curve for PAI-1 Measurement Using PAI-1 Standard Sample The method of Bradford (Anal. Biochem., 72, 248-254 (1976)) was used. The purified PAI-1 was used to quantitate the protein amount, and diluted with BSA (bovine serum albumin) -added Tris buffer to 15, 30, 90, and 270 ng / ml to obtain a standard for PAI-1 measurement.
[0040]
5 μl of the above-mentioned PAI-1 standard solution, 270 μl of BSA-containing Tris-HCl buffer, and 40 μl of the latex reagent obtained in Example 1 were mixed, and after automatic dispensing into a reaction cuvette, the absorption in the near infrared (950 nm) was increased. The immune reaction was observed by measuring for 10 minutes. The measurement was performed using a latex agglutination fully automatic measuring device (LPIA-200 system, manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation). The measurement was completed within 20 minutes. As a result, the PAI-1 amount and the latex agglutination ratio showed linearity.
[0041]
<2> Reactivity of latex reagent with respect to tPA · PAI-1 complex The amount of tPA with respect to active PAI-1 was increased, and these were reacted in the same manner as described above to obtain a total PAI-1 concentration and tPA · PAI-1. Complex concentration and PAI activity were measured. The PAI-1 total concentration was determined using an ELISA kit (Biopool, TintElise), and the tPA • PAI-1 complex concentration was determined using a sandwich EIA kit (Teijin KK, tPAI-C test). Was measured using a measurement kit (Biopoly, Spectrum / fibrin) by the synthetic substrate method. The results are shown in FIG. In the figure, ● represents the total concentration of PAI-1 (ng / ml), □ represents the concentration of tPA / PAI-1 complex (ng / ml), and ○ represents the PAI activity (U / ml). As shown in the figure, the tPA / PAI-1 complex concentration increased as the amount of tPA increased, and became saturated when the molar ratio of tPA to PAI-1 became 1: 1 or more. PAI activity decreased with increasing tPA, but total PAI-1 concentration did not change.
[0042]
In addition, various forms of PAI-1, namely, active and latent forms (latent: obtained by repeating freeze-thaw of active PAI-1 plasma twice), and single-chain tPA (octPA), recombinant A similar measurement was performed on a complex with tPA (manufactured by Mitsubishi Chemical Corporation) or human heavy chain urokinase (UK) (manufactured by American diagnostics). As a result, almost 100% reagent reactivity was exhibited in all the forms. (Table 1).
[0043]
[Table 1]

[0044]
The reactivity of the latex reagent of the present invention for latent PAI-1 plasma with reduced PAI activity was not changed.
[0045]
<3> Storage stability of PAI-1 as an antigen The PAI activity in a healthy human plasma sample obtained by repeating freezing and thawing three times at 4 ° C. for 5 days, and the activity decreased with time, but the reactivity with latex reagent Was unchanged and stable.
[0046]
<4> Correlation between the method of the present invention and other PAI-1 measurement methods Blood of healthy persons and patients with various blood coagulation diseases is added to 0.1% sodium citrate, and centrifuged at 2000 × g for 15 minutes to be poor in platelets. Plasma was obtained. All samples were stored at -40C.
[0047]
FIG. 2 shows the correlation between PAI activity in plasma of normal persons and patients and the total PAI-1 concentration measured by the method of the present invention. These correlation coefficients (r) were 0.79. Further, the correlation coefficient between the total PAI-1 concentration measured by an ELISA kit (Biopool, TintElise) and the value measured by the method of the present invention was as high as 0.94, but the sandwich EIA kit (Teijin Co., Ltd.) The correlation coefficient between the tPA-PAI-1 complex and PAI-1 measured by tPAI-C test was 0.34.
[0048]
<5> Evaluation of Dilution Linearity of PAI-1 Total Concentration The linearity of three samples of citrated plasma of acute myocardial infarction patients was serially diluted with a BSA-containing Tris buffer by a factor of two to examine the linearity. 5 μl of these samples, 270 μl of BSA-containing Tris-HCl buffer, and 40 μl of the latex reagent obtained in Example 1 were mixed, and after automatically dispensing into a reaction cuvette, aggregation of latex particles was measured in the same manner as described above. From the calibration curve of the PAI-1 standard, the total concentration of PAI-1 in the sample was calculated. The results are shown in FIG. All the samples showed good dilution linearity.
[0049]
The recovery of the PAI-1 standard added to the reaction system was 80 to 110%. As a result of the examination of the simultaneous reproducibility over the entire measurement region, the coefficient of variation of the standard sample and the healthy human plasma sample was 2 to 5% (n = 10).
[0050]
Separately, the total PAI-1 concentration in Japanese healthy subjects (n = 67) was 22.37 ± 15.18 ng / ml, and the 95th percentile was 50 ng / ml or less.
[0051]
【The invention's effect】
According to the method for measuring PAI-1 using the latex reagent of the present invention, the total PAI-1 concentration can be measured in a short time and with good reproducibility. Further, the specimen used in the method of the present invention has excellent storage stability. The method for measuring the total PAI-1 concentration of the present invention is expected to be an indicator of vascular endothelial damage in blood coagulation diseases.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a diagram showing the reactivity of a tPA / PAI-1 complex with a latex reagent. In the figure, ● represents the total concentration of PAI-1 (ng / ml), □ represents the concentration of tPA / PAI-1 complex (ng / ml), and ○ represents the PAI activity (U / ml).
FIG. 2 is a diagram showing a correlation between PAI activity and total PAI-1 concentration measured by the method of the present invention.
FIG. 3 is a graph showing the dilution linearity of the total concentration of PAI-1 in citrated plasma of a blood coagulation disease patient.

Claims

Immunoassay by latex aggregation of plasminogen activator inhibitor-1 in which polyclonal antibodies that bind to any of the active, latent, and complex forms of plasminogen activator inhibitor-1 are immobilized on latex particles. Reagent for use in the method.

An immunoassay for measuring the total amount of plasminogen activator inhibitor-1 antigen in a sample by latex agglutination using the reagent according to claim 1.

A method for detecting a disease caused by a vascular endothelial disorder, comprising measuring the total antigen amount of plasminogen activator inhibitor-1 by the method according to claim 2.