JP3541677B2

JP3541677B2 - Measurement method and reagent for direct bilirubin

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Publication number: JP3541677B2
Application number: JP14328298A
Authority: JP
Inventors: 良小島; 吉清笹川; 泰典岡崎; 健長澤
Original assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Current assignee: Nitto Boseki Co Ltd
Priority date: 1997-06-06
Filing date: 1998-05-25
Publication date: 2004-07-14
Anticipated expiration: 2018-05-25
Also published as: JPH1172497A

Description

【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、試料中に含まれる直接型ビリルビンの測定方法及びそれに用いる測定用試薬に関する。
【０００２】
【従来の技術】
ビリルビンは老化赤血球由来のヘモグロビンの代謝産物で胆汁色素の主成分である。血液中には、側鎖のプロピオン酸基が肝臓で酵素的に主にグルクロン酸とエステル結合し水溶性が増加した画分（抱合型）と、プロピオン酸基が遊離の状態のままであり水溶性が低い画分（遊離型）が主に存在する。前者はジアゾ試薬と容易に反応するために直接型ビリルビンと称され、後者はアルコールなどの反応促進剤の存在下において初めてジアゾ試薬と反応するため、間接型ビリルビンとして捉らえられている。間接型ビリルビンは、反応促進剤の存在下全てのビリルビンをジアゾ発色して求められる総ビリルビンから直接型ビリルビンを差し引いて求めることができる。
これらの抱合型（直接型）および遊離型（間接型）の各ビリルビン濃度を分別定量することにより各種肝疾患、溶血性疾患などによる黄だんの鑑別および診断を行うことができるため、ビリルビンの測定は臨床検査における重要な項目となっている。
【０００３】
直接型ビリルビンの定量法としては、以下に示すように、ジアゾ試薬による方法、ビリルビンオキシダーゼによる方法、高速液体クロマトグラフィーによる方法、化学的酸化剤による方法などが報告されている。
【０００４】
Ａ）ジアゾ試薬による直接型ビリルビンの測定方法
ジアゾ試薬による方法は、ビリルビンがジアゾ試薬と反応してアゾビリルビンを生成し、その結果、ビリルビン本来の可視部極大吸収波長より長波長域にアゾビリルビンの極大吸収が発生するため、この波長における吸光度変化によりビリルビンを定量するものである。これらは、間接型ビリルビンの反応促進剤の種類、反応停止条件、アゾビリルビンの検出条件の違いにより種々のものが報告されている（Ｍａｌｌｏｙ，Ｈ．Ｔ．，Ｅｖｅｌｙｎ，Ｋ．Ａ．；Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１１９，４８１（１９３７）；Ｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｂｉｌｉｒｕｂｉｎｗｉｔｈｔｈｅｐｈｏｔｏｅｌｅｃｔｒｉｃｃｏｌｏｒｉｍｅｔｅｒ；Ｊｅｎｄｒａｓｓｉｋ，Ｌ．，Ｇｒｏｆ，Ｐ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｚ．，２９７．８１（１９３８）：ＶｅｒｅｉｎｆａｃｈｔｅＰｈｏｔｏｍｅｔｒｉｓｃｈｅＭｅｔｈｏｄｅｎｚｕｒＢｅｓｔｉｍｍｕｎｇｄｅｓＢｌｕｔｂｉｌｉｒｕｂｉｎｓ；Ｍｉｃｈａｅｌｅｓｓｏｎ，Ｍ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１２（Ｓｕｐｐ．５６），１〜８（１９３７）；Ｂｉｌｉｒｕｂｉｎｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｉｎｓｅｒｕｍａｎｄｕｒｉｎｅ）。
【０００５】
Ｂ）ビリルビンオキシダーゼによる直接型ビリルビンの測定方法
ビリルビンオキシダーゼによる方法は、ビリルビンを含む検体にビリルビンオキシダーゼを作用させて、ビリルビンをビリベルジンに酸化させ、この際、ビリルビンの極大吸収波長域の吸光度が消失するので、この吸光度の減少量により定量するものである。この測定法では、間接ビリルビンの反応抑制の方法に種々の工夫がなされており、下記のごとく多数の方法が報告されている。
【０００６】
Ｂ１）ｐＨ３．５〜４．５でビリルビンオキシダーゼを作用させることを特徴とする直接型ビリルビンの測定方法（特開昭５９−１２５８９９）。
Ｂ２）陰イオン界面活性剤を含有するｐＨ５〜６の酸性緩衝液中で、ビリルビンオキシダーゼを作用させることを特徴とする直接型ビリルビンの測定方法（ＳｈｏｇｏＯｔｓｕｊｉ：Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１，３３〜３８（１９８８）および特開昭６０−１５２９５５）。
Ｂ３）ｐＨ９〜１０の緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作用させ生じた吸光度の変化を測定することを特徴とする抱合型ビリルビンの定量方法（特開昭６２−５８９９９）。
Ｂ４）ｐＨ２．０〜３．３のフェロシアン化カリウムおよび／またはフェリシアン化カリウムを含む緩衝液中でビリルビンオキシダーゼを作用させ、生じた吸光度変化を測定することを特徴とする直接型ビリルビンの定量方法（特開昭６４−５４９９）。
Ｂ５）ビリルビンオキシダーゼとともに、フッ素化合物または還元剤を共存させることを特徴とする直接型ビリルビンの定量方法（特開平５−２７６９９２）。
Ｂ６）ビリルビンオキシダーゼとともに、テトラピロール環化合物を共存させることを特徴とする直接型ビリルビンの定量方法（特開平７−２３１７９５）。
【０００７】
Ｃ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による直接型ビリルビンの測定方法
ＨＰＬＣによる直接型ビリルビンの測定法は、逆相カラムに有機溶剤の濃度勾配をかけビリルビンの画分を親水性／疎水性の序列により分画するものである。ＨＰＬＣによると血清中のビリルビンは主にα、β、γ、δの４画分に分離され、それぞれ、α画分は遊離型ビリルビン、β画分は１分子中に２つある側鎖のプロピオン酸基の１つのみがグルクロン酸とエステル結合をしているビリルビン（ビリルビンモノグルクロナイド）、γ画分はプロピオン酸基が２つともグルクロン酸とエステル結合をしているビリルビン（ビリルビンジグルクロナイド）、δ画分はアルブミンとビリルビンが共有結合をしているものと同定されている。また、δ画分はγ画分とアルブミンが非酵素的に反応した結果、生成したものと推定されている（山本俊夫：日内会誌７８（１１），３６〜４１（１９８９））。なお、ＨＰＬＣでのα画分は上記Ａ）のジアゾ試薬による方法では間接型ビリルビンに相当し、一方、βとγおよびδ画分は直接型ビリルビンに相当するとされる（ＪｏｈｎＪ．Ｌａｕｆｆ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２８（４）６２９〜６３７（１９８２））。ＨＰＬＣ法は、煩雑な検体前処理工程を極力省略した形で改良が進められており、種々の報告がなされている（ＮａｋａｍｕｒａＨ．：Ｂｕｎｓｅｋｉｋａｇａｋｕ，３６，３５２〜３５５（１９８７）；ＹｕｋｉｈｉｋｏＡｄａｃｈｉ：ＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｉａＪａｐｏｎｉｃａ，２３（３），２６８〜２７２（１９８８）；加藤裕子：近畿大医誌第１４巻１号９７〜１１２（１９８９）．）。
【０００８】
Ｄ）化学的酸化剤による直接型ビリルビンの測定方法
化学的酸化剤によるものは、ビリルビンオキシダーゼの代わりに、低分子量の酸化剤を作用させて、ビリルビンをビリベルジンに酸化し、この際のビリルビンに基づく吸光度減少量により定量するものである。これらも、間接型ビリルビンの反応抑制の方法に種々の工夫がなされており、下記のごとく報告されている。
Ｄ１）銅イオンおよびチオ尿素もしくはその誘導体を被検液に作用させることを特徴とする直接型ビリルビンの定量方法（特開昭６３−１１８６６２）。
Ｄ２）バナジン酸イオンまたは３価のマンガンイオンを酸化剤として作用させ、試料の光学的変化を測定することを特徴とするビリルビンの定量方法（特開平５−１８９７８）。この方法で直接型ビリルビンを測定するためには、間接型ビリルビンの反応抑制剤として、ヒドラジン類、ヒドロキシルアミン類、オキシム類、脂肪族多価アミン類、フェノール類、水溶性高分子およびＨＬＢが１５以上の非イオン型界面活性剤からなる群より選ばれた１種以上の化合物を使用する。
Ｄ３）亜硝酸を酸化剤として作用させ、試料の光学的変化を測定することを特徴とするビリルビンの定量方法（ＷＯ９６−１７２５１）。この方法で直接型ビリルビンを測定するためには、間接型ビリルビンの反応抑制剤として、ＨＬＢが１２〜１５のポリオキシエチレン（ｎ−アルキルあるいはｉｓｏ−アルキル）エーテル、チオ尿素、ヒドラジン、ポリビニルピロリドン等を使用する。
【０００９】
上記Ａ）〜Ｄ）の各測定法にはそれぞれ一長一短があり、現在のところ、必ずしも、満足のいく測定方法は存在しない。以下に各測定法の問題点を列記する。
【００１０】
ジアゾ試薬による方法Ａ）は、反応促進剤が共存しない場合での反応をジアゾ直接反応と定義し、直接型ビリルビンの名称の由来ともなっている。しかしながら、このジアゾ直接反応は間接型ビリルビンの一部に対しても起こり得ることが多数報告がなされている（例えば、Ｋｉｌｌｅｎｂｅｒｇ，Ｐ．Ｇ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，７８，１０１１〜１０１５（１９８０）；Ｂｌａｎｋａｅｒｔ，Ｎ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，９６，１９８〜２１２（１９８０）；真鍋幸男：分析化学，３０，７３６〜７４０（１９８１）；Ｃｈａｎ，Ｋ．Ｍ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，３１，１５６０〜１５６３（１９８５）；高坂彰：検査と技術１４９７１〜９７５（１９８６）；足立幸彦：生物試料分析９３３〜４２（１９８６））。従ってジアゾ直接反応により定義されたビリルビン測定値は、正確には“直接型ビリルビン”を測定しているとは言い切れない。
【００１１】
ビリルビンオキシダーゼによる方法Ｂ）は、ジアゾ直接反応により定義されたビリルビン測定値と近似し得るように測定系を開発した結果、間接型ビリルビンの一部に対しても酸化反応が認められ、一般的には“直接型ビリルビン”を測定しているとは言い切れない。その中で、ビリルビンオキシダーゼにフッ素化合物を共存させる方法（特開平５−２７６９９２）やテトラピロール環化合物を共存させる方法（特開平７−２３１７９５）は、間接型ビリルビンに対する反応を回避し得るものである。しかし、フッ素化合物を使用するため環境汚染に問題を有し、またテトラピロール環化合物を試薬中に存在させるため安定性に欠け、溶液状態で長時間使用することに問題を有する。
【００１２】
高速液体クロマトグラフィーによる方法Ｃ）は、高い分析性能を有するが１検体の処理に約１時間を要するので、多数の検体を処理するには不向きである。また高価で特殊な装置を必要とし汎用性に欠ける。
【００１３】
化学的酸化剤による方法Ｄ）は、ビリルビンオキシダーゼによるものと同様にジアゾ直接反応により定義された直接型ビリルビン測定値と近似し得るように測定系を開発した結果、間接型ビリルビンの一部に対しても酸化反応が認められ、やはり正確には“直接型ビリルビン”を測定しているとは言い切れない。
【００１４】
以上述べてきたように、間接型ビリルビンに対する反応を完全に回避し、安定かつ安全な直接型ビリルビンの測定方法は現在のところ必ずしも存在せず、この開発が待ち望まれている。
【００１５】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は上記した現状に鑑みなされたもので、間接型ビリルビンの干渉を完全に回避し、廃液による環境汚染等の危険性のない直接型ビリルビンの測定方法および測定用試薬の提供をその目的とする。
【００１６】
【課題を解決するための手段】
本発明者らはビリルビンオキシダーゼの至適ｐＨ域において、間接型ビリルビンや直接型ビリルビンの反応性を鋭意検討した結果、ビリルビンにビリルビンオキシダーゼを作用させる際に、チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）、または１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオンを共存させた場合、間接型ビリルビンの酸化が完全に抑制されると共に、直接型ビリルビンの酸化が定量的に進行し直接型ビリルビンを正確に測定できることを見いだし本発明を完成するに至った。
【００１７】
すなわち、本発明は、試料にビリルビンオキシダーゼを作用させ、該試料の光学的変化により試料中の直接型ビリルビンを測定する方法において、チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）及び１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオンから選ばれる間接型ビリルビン反応抑制剤の１種以上を共存させてビリルビンオキシダーゼを作用させることを特徴とする直接型ビリルビンの測定方法である。
更に本発明は、必須構成成分として、ｉ）ビリルビンオキシダーゼとii）チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸及び１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオンから選ばれる間接型ビリルビン反応抑制剤の１種以上とを含むことを特徴とする直接型ビリルビン測定用試薬である。
【００１８】
【発明の実施の形態】
本発明では、試料は、直接型ビリルビンまたは間接型ビリルビンを含むものであれば特に限定しない。通常、試料は、血しょう、血清、尿等の生態体液試料、またはこれらのモデルサンプルである。
【００１９】
本発明の方法においては、間接型ビリルビン反応抑制剤として用いるチオシアン酸イオンとしては、特に限定されないが、チオシアン酸アルカリ金属、チオシアン酸アルカリ土類金属、チオシアン酸アンモニウム等が挙げられるが、チオシアン酸ナトリウム、チオシアン酸カリウム等が好ましい。
【００２０】
ヒドラジド類としては、アセチルヒドラジド、フタルヒドラジド、イソフタロイルジヒドラジド、テレフタリックジヒドラジド、ベンゼンスルフォニルヒドラジド等を例示できる。
【００２１】
還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤＨ）または還元型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（ＮＡＤＰＨ）は、直接、反応試薬中に共存させてもよく、あるいはアルコールデヒドロゲナーゼ、グルコール−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等の酵素反応により酸化型ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドから誘導したものを用いても本発明の目的を達することができる。
【００２２】
カリウムイオンとしては、塩化カリウム、臭化カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、酒石酸カリウム、乳酸カリウム、フタル酸カリウム、硫酸カリウム等が限定されずに使用しうる。
【００２３】
本発明においては、試料中のビリルビンにビリルビンオキシダーゼを作用させる際、その酵素反応液中に共存させる間接型ビリルビン反応抑制剤は、低濃度に過ぎると間接型ビリルビンの反応抑制効果が充分に得にくく、また高濃度に過ぎるとビリルビンオキシダーゼの阻害性が昂進し直接型ビリルビンの酸化反応が妨害されやすい。従って、間接型ビリルビン反応抑制剤として、チオシアン酸イオン又はヒドラジド類を用いる場合には酵素反応液中において、０．１ｍＭ〜１００ｍＭの濃度が好ましく、０．２ｍＭ〜５０ｍＭの濃度がさらに好ましい。
ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを用いる場合には、０．１ｍＭ〜１０ｍＭ、好ましくは０．２ｍＭ〜５ｍＭの濃度範囲である。
【００２４】
カリウムイオンを用いる場合には、酵素反応液中で、カリウムイオン濃度は、１００ｍＭ〜８００ｍＭが好ましく、１１０ｍＭ〜６００ｍＭがさらに好ましく、１２０〜４００ｍＭが特に好ましい。カリウムイオン濃度が１００ｍＭを超えないと、間接型ビリルビンの反応抑制効果が弱くなる。カリウムイオン濃度が８００ｍＭを越えるビリルビンオキシダーゼの阻害性が昂進し直接型ビリルビンの酸化反応が妨害されやすい。
【００２５】
本発明の方法においては、間接型ビリルビン反応抑制剤は、２種以上を用いてもよい。例えば、チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨから選ばれる２種以上の反応抑制剤を併用することができる。また、チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、ＮＡＤＨ及びＮＡＤＰＨから選ばれる１種または２種以上の反応抑制剤とカリウムイオンとを併用することもできる。
【００２６】
本発明の方法において、ビリルビンオキシダーゼは、特に限定されないが、Ｍｙｒｏｔｈｅｃｉｕｍｖｅｒｒｕｃａｒｉａ由来のビリルビンオキシダーゼ（天野製薬（株）から入手可能）あるいはＴｒａｃｈｙｄｅｒｍａｔｓｕｎｏｄａｅ由来のビリルビンオキシダーゼ（宝酒造（株）から入手可能）あるいはＰｌｅｕｒｏｔｕｓ属由来のビリルビンオキシダーゼ（株式会社盛進から入手可能）等が挙げられ、その必要量は最終反応液中において、それぞれ０．００１〜１０Ｕ／ｍｌの濃度にて使用するのが好ましい。より好ましくは０．０１〜１Ｕ／ｍｌ、特に好ましくは０．０２〜０．５Ｕ／ｍｌの濃度範囲である。
【００２７】
ビリルビンオキシダーゼを作用させる際、ｐＨ範囲は、酵素活性が至適状態で発現しうる範囲であれば限定されないが、ｐＨ４．５〜６．５が好ましく、ｐＨ５．０〜６．０が特に好ましい。使用する緩衝液はこのｐＨ範囲において緩衝能を有するものであれば特に限定されないが、フタル酸水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、リンゴ酸／水酸化ナトリウム緩衝液等を含むものが挙げられる。特に緩衝液の成分として、フタル酸水素カリウム等のカリウム塩を含む場合、カリウムイオンが、間接型ビリルビン反応抑制効果を有する点から好ましい。
【００２８】
本発明では、試料中の直接型ビリルビンを、例えば、ビリルビンオキシダーゼおよび間接型ビリルビン反応抑制剤の１種以上を含む直接型ビリルビン測定用試薬を用いて測定することができる。
【００２９】
直接型ビリルビン測定用試薬としては、例えば、チオシアン酸イオン又はヒドラジド類を含む液を第１試薬液とし、また、ビリルビンオキシダーゼを含む液を第２試薬液とし、これら２つの試薬から構成されるキットとすることが好ましい。第１試薬液には、さらにカリウムイオンを含むことが好ましい。
【００３０】
あるいは、例えば、ｐＨ４．５〜６．５の緩衝液、好ましくはｐＨ５．０〜６．０の緩衝液を第１試薬液とし、また、ビリルビンオキシダーゼとＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨまたはカリウムイオンとを含む液を第２試薬液とし、これら２つの試薬から構成されるキットとすることがＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨまたはビリルビンオキシダーゼの安定性から好ましい。ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨを用いる場合、ＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨの溶液状態での安定性から、第２試薬液のｐＨは、９以上が好ましく、９〜１１．０がさらに好ましい。さらにカリウムイオンを含むことが好ましい。
間接型ビリルビンオキシダーゼの反応抑制剤としてカリウムイオンを単独で用いる場合、ビリルビンオキシダーゼを含む第２試薬液のｐＨは、７〜１１がビリルビンオキシダーゼの安定性から好ましい。
緩衝液の組成としては、前記したように、フタル酸水素カリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、クエン酸ナトリウム／水酸化ナトリウム緩衝液、リンゴ酸／水酸化ナトリウム緩衝液等を含むものを例示できる。
第１試薬液には、さらにカリウムイオンを含むことが好ましい。
【００３１】
本発明の方法は、例えば、上記したキットにより、以下のように実施できる。試料と上記の第１試薬液とを混合し、この混合液中のビリルビンに基づく波長域（４３０〜４６０ｎｍ）の特定の波長、好ましくは波長４５０ｎｍにおける吸光度を測定する（吸光度１）。ついで、得られる液にビリルビンオキシダーゼを含む第２試薬液を添加して２５〜４０℃で、３〜１５分間、ビリルビンの酸化反応を行った後、再度溶液中のビリルビンに基づく特定の波長における吸光度を測定する（吸光度２）。得られた吸光度１および吸光度２の値に液量補正等を処した後、酸化反応前後での吸光度変化量を求める。この値と、予め濃度既知の標準液を用いて上記と同様の操作により得られた吸光度変化量に基づいて作成した検量線から、試料中の直接型ビリルビン濃度を求めることができる。このようなキットによる直接型ビリルビンの測定方法は、日立７０７０型自動分析装置等の汎用型の自動分析装置に適用可能である。なお、試料は、０．００５〜２ｍｌが好ましい。
【００３２】
直接型ビリルビン測定用試薬に含まれるチオシアン酸イオン、ヒドラジド類、カリウムイオンは水溶液中でとくに不安定ではなく、またＮＡＤＨまたはＮＡＤＰＨおよびビリルビンオキシダーゼは、ｐＨ９以上では水溶液中でとくに不安定ではないので、この試薬は、水溶液の状態で液状試薬として使用することも可能である。また、直接型ビリルビン測定用試薬には、他の試薬類、例えば防腐剤、キレート化剤、界面活性剤等の通常の試薬やキットに使用し得るものであれば公知の方法に準じて適宜選択して使用することができる。
【００３３】
【実施例】
実施例１〜６および比較例１
間接型ビリルビンの抑制効果
ビリルビンオキシダーゼを作用させる際、１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオン（実施例１）、チオシアン酸イオン（実施例２）、ヒドラジド類（実施例３及び実施例４）、ＮＡＤＨ（実施例５）、ＮＡＤＰＨ（実施例６）を共存させると、間接型ビリルビンの酸化反応が抑制されるかどうかを観察するため以下の実験を行った。なお、比較例１では、これらチオシアン酸イオン等を含まない条件で行った。それらの試薬、試料、測定、結果を以下に示す。
【００３４】

【００３５】
（２）試料
試料は、間接型ビリルビン濃度５０ｍｇ／ｄｌでありかつヒト血清アルブミン濃度６．０ｇ／ｌのものを用いた。その試料は、以下のようにして調整した。
間接型ビリルビン５ｍｇを秤量し０．４ｍｌのジメチルスルホキシドに分散させる。この分散した液に、０．４ｍｌの１００ｍＭ炭酸ナトリウム溶液を加え間接型ビリルビンを溶解させた直後、ヒト血清アルブミンを含む１００ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．００）９．２ｍｌにて希釈して試料を調製した。
【００３６】
（３）比較例１及び実施例１〜６での測定
日立７０７０型自動分析装置において、試料１０μｌ、第１試薬液３００μｌ、第２試薬液７５μｌの条件で、主波長４５０ｎｍ、副波長５４６ｎｍにおける吸光度変化を２ＰｏｉｎｔＥｎｄ法にて求めた。
即ち、自動分析装置上で第１試薬液と試料とを混合し、３７℃で５分間インキュベーションした後、この溶液中のビリルビンに基づく吸光度を主波長４５０ｎｍ、副波長５４６ｎｍにて測定する（吸光度１）。ついで、得られる溶液に、ビリルビンオキシダーゼを含む第２試薬液を添加して３７℃で、５分間ビリルビンの酸化反応を行った後、再度、溶液中のビリルビンに基づく吸光度を前記の波長で測定する（吸光度２）。得られた吸光度１及び吸光度２の値に液量補正等を処した後、酸化反応前後での吸光度減少量を求める。これらの測定及び計算は、自動分析装置で自動的に行われる。
【００３７】
（４）比較例１及び実施例１〜６の結果
比較例１及び実施例１〜６における間接型ビリルビンでの吸光度減少量の結果を表１に示す。また、比較例１及び実施例１〜６における自動分析装置上における反応経過過程（反応タイムコース）を図１〜６に示す。
【００３８】
【表１】

【００３９】
表１及び図１〜図６から明らかなように、本発明に基づく方法（実施例１〜６）では、間接型ビリルビンの酸化に基づく吸光度減少量は、自動分析装置の測定誤差程度であり、反応タイムコースにおいても吸光度の減少は認められない。これに対して、比較例１では明らかな間接型ビリルビンの酸化に伴う吸光度の減少が認められる。
これにより、チオシアン酸イオン、ヒドラジド類、１００ｍＭ〜８００ｍＭのカリウムイオン、ＮＡＤＨ、ＮＡＤＰＨ共存下では、いずれも、ビリルビンオキシダーゼによる間接型ビリルビンの反応が抑制されることが明らかにされた。
【００４０】
実施例７〜１２
直接型及び間接型ビリルビンとを含む試料中の直接型ビリルビンの測定
（１）試料の調製
１００ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．００）中に合成抱合型ビリルビンであるジタウロビリルビンを５ｍｇ／ｄｌ（ビリルビン相当濃度）とヒト血清アルブミンを６．０ｇ／ｌ含む溶液を直接型ビリルビン溶液として調整した。また、それとは別に、１００ｍＭＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．００）中に非抱合型ビリルビンを５ｍｇ／ｄｌとヒト血清アルブミンを６．０ｇ／ｌ含む溶液を間接型ビリルビン溶液として調製した。次いで、直接型ビリルビン溶液を間接型ビリルビン溶液にて希釈し、総ビリルビン濃度が同一（５ｍｇ／ｄｌ）でかつ直接型ビリルビン濃度が異なる種々の試料を調整した。なお、試料は、総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比が０．０、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０の６種のものを調製した。
【００４１】
（２）測定条件
この試料を用いた以外は、実施例１〜６記載の測定試薬、測定条件で、吸光度減少量を測定し、それぞれ、実施例７（カリウムイオン使用）、実施例８（チオシアン酸イオン使用）、実施例９（ヒドラジド類使用）、実施例１０（ヒドラジド類使用）、実施例１１（ＮＡＤＨ）、実施例１２（ＮＡＤＰＨ）とした。
【００４２】
（３）結果
結果を図７〜１２に示す。図７〜１２では、横軸に総ビリルビンに対する直接ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を表わしている。本発明の方法（実施例７〜１２）では、直接型ビリルビンの量に比例して吸光度が大きくなり、原点回帰の良好な希釈直線性が得られた。これは、実施例７〜１２では、間接型ビリルビンの干渉なく、直接型ビリルビンを選択的に測定していることを示している。
【００４３】
比較例２
従来法による直接型ビリルビンと間接型ビリルビンとを含む試料中の直接型ビリルビンの測定
一方、実施例７〜１２に用いた試料を用いて、従来法で直接型ビリルビンを測定した。従来法は、ｐＨ３．５〜４．５の条件でビリルビンオキシダーゼを作用させる測定法（特開昭５９−１２５８９９；Ｓｈｏｇｏｏｔｓｕｊｉ，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１，３３〜３８（１９８８））で行った。即ち、以下の組成の試薬条件によるものである。
【００４４】

【００４５】
（２）測定法
従来法の測定条件は、試薬液以外は、実施例１記載の測定条件と同一とした。
【００４６】
（３）結果
結果を図７〜１２に示す。従来法（比較例２）では、試料中の直接型ビリルビン濃度と測定された吸光度との間に直線性が得られないことが判明した。従来法では、試料中の間接型ビリルビンの干渉を大きく受け、試料中の直接型ビリルビンを正確に測定していないことを示す。
【００４７】
実施例１３〜１８及び比較例３
本発明の測定方法条件下でビリルビン高値患者検体中の間接型ビリルビンが反応しないことをＨＰＬＣで確認した例
（１）試料
試料としてビリルビン高値の患者プール血清検体を用いた。血清検体に対しては、硫酸ナトリウムによる塩析を行わず、未処理のまま分析に処した。試料中のグロブリンがカラムに吸着し劣化を早める結果となるが、ビリルビン画分の変性を防止することを目的とした為である。
【００４８】
（２）試薬
実施例１３（カリウムイオン使用）、実施例１４（チオシアン酸イオン使用）、実施例１５（ヒドラジド類使用）、実施例１６（ヒドラジド類使用）、実施例１７（ＮＡＤＨ使用）、実施例１８（ＮＡＤＰＨ使用）では、それぞれ、実施例１〜６で用いた試薬を使用した。比較例３では、比較例２で用いた試薬を使用した。
【００４９】
（３）ビリルビンオキシダーゼによる試料中のビリルビンの酸化反応
試料１６μｌに対して第１試薬液４８０μｌを添加し、３７℃で５分間加温した。さらに、得られる液に、１２０μｌの第２試薬液を添加し、３７℃で５分間加温後、１２０μｌの２％アスコルビン酸水溶液を添加してビリルビンオキシダーゼの反応を停止させた。
【００５０】
（４）ＨＰＬＣによる分析
ＨＰＬＣの分析は、文献（ＪｏｈｎＪ．Ｌａｕｆｆ，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ，２８（４），６２９〜６３７（１９８２））記載の方法により行い、反応前後における間接型ビリルビンに基づくピーク面積の変化を調べた。反応前のデータは、第２試薬液として生理食塩水を用いた以外は、上記した酸化反応と同様の操作を行い、間接型ビリルビンに基づくピーク面積を求めた。
ＨＰＬＣは、日立ＨＰＬＣシステム（ＣｏｌｕｍｎＯｖｅｎＬ−７３００、ＵＶＤｅｔｅｃｔｏｒＬ−７４００、ＰｕｍｐＬ−７１００、ＩｎｔｅｇｒａｔｏｒＤ−７５００）に関東化学（株）製の逆相系カラムＬｉｃｈｒｓｐｈｅｒ１００ＲＰ−１８（１０μｍ）を接続して使用した。
すなわち、上記の酸化反応で得られる液を、０．４５μｍのメンブランフィルターにてろ過し、ろ液１５０μｌをＨＰＬＣのカラムに注入して反応後の間接ビリルビンに基づくピーク面積を求めた。溶出は、ビリルビン画分を、Ａ液：（精製水９５０容／２−メトキシエタノール５０容／りん酸にてｐＨ２．１に調製）とＢ液：（イソプロパノール９５０容／２−メトキシエタノール５０容／りん酸２．５容）の２液間におけるイソプロパノールの直線勾配により行い、４５０ｎｍの波長により検出した。
【００５１】
（５）結果
反応前のデータを１００とし、そのデータと反応後の間接型ビリルビンに基づくピーク面積のデータとの比較により、間接型ビリルビンの残存比率を求めた。結果を表２に示す。反応前後で間接型ビリルビンに基づくピーク面積がほとんど変わらず、本発明の測定条件下では、間接型ビリルビンが反応しないことが確認された。一方、比較例３（従来法）では、間接型ビリルビンが１６．５％減少していた。従来法の条件下では、間接型ビリルビンの一部が反応したことを示している。
【００５２】
【表２】

【００５３】
【発明の効果】
本発明によれば、試料中の直接型ビリルビンを間接ビリルビンの影響なく選択的に測定することができ、臨床検査の分野において有用である。
【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１及び比較例１での反応タイムコースを示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、縦軸には、吸光度×１００００を示す。
【図２】実施例２及び比較例１での反応タイムコースを示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、縦軸には、吸光度×１００００を示す。
【図３】実施例３及び比較例１での反応タイムコースを示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、縦軸には、吸光度×１００００を示す。
【図４】実施例４及び比較例１での反応タイムコースを示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、縦軸には、吸光度×１００００を示す。
【図５】実施例５及び比較例１でのビリルビンオキシダーゼによる間接型ビリルビンの反応タイムコースを示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、縦軸には、吸光度×１００００を示す。
【図６】実施例６及び比較例１でのビリルビンオキシダーゼによる間接型ビリルビンの反応タイムコースを示す。横軸に測光ポイント（１ポイントは約２０秒）、縦軸には、吸光度×１００００を示す。
【図７】実施例７及び比較例２での結果を示す。横軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を示す。
【図８】実施例８及び比較例２での結果を示す。横軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を示す。
【図９】実施例９及び比較例２での結果を示す。横軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を示す。
【図１０】実施例１０及び比較例２での結果を示す。横軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を示す。
【図１１】実施例１１及び比較例２での結果を示す。横軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を示す。
【図１２】実施例１２及び比較例２での結果を示す。横軸に総ビリルビンに対する直接型ビリルビンの比、縦軸に吸光度減少量を示す。[0001]
TECHNICAL FIELD OF THE INVENTION
The present invention relates to a method for measuring direct bilirubin contained in a sample and a measuring reagent used for the method.
[0002]
[Prior art]
Bilirubin is a metabolite of hemoglobin derived from aged erythrocytes and is a main component of bile pigment. In the blood, a fraction in which the propionic acid group in the side chain is enzymatically esterified mainly with glucuronic acid in the liver to form an ester bond with glucuronic acid to increase water solubility (conjugated form), and the propionic acid group remains free and water soluble The fraction with low affinity (free form) is mainly present. The former is called direct bilirubin because it easily reacts with the diazo reagent, and the latter is regarded as indirect bilirubin because it reacts with the diazo reagent for the first time in the presence of a reaction accelerator such as alcohol. Indirect bilirubin can be determined by subtracting direct bilirubin from total bilirubin obtained by diazo coloring of all bilirubins in the presence of a reaction accelerator.
Differentiation and quantification of the bilirubin concentrations of these conjugated (direct) and free (indirect) forms enables the identification and diagnosis of jaundice due to various liver diseases and hemolytic diseases. It is an important item in clinical tests.
[0003]
As a method for quantifying direct bilirubin, as described below, a method using a diazo reagent, a method using bilirubin oxidase, a method using high performance liquid chromatography, a method using a chemical oxidizing agent, and the like have been reported.
[0004]
A)Method for measuring direct bilirubin with diazo reagent
In the method using a diazo reagent, bilirubin reacts with the diazo reagent to form azobilirubin, and as a result, the maximum absorption of azobilirubin occurs in a longer wavelength region than the intrinsic absorption maximum wavelength of the bilirubin in the visible region. Bilirubin is quantified by the change. Various of these have been reported depending on the type of indirect bilirubin reaction accelerator, reaction termination conditions, and differences in azobilirubin detection conditions (Malloy, HT, Evelyn, KA; . Biol.Chem, 119,481 (1937); The determinationof bilirubin with the photoelectriccolorimeter; Jendrassik, L., Grof, P., Biochem.Z, 297.81 (1938):. Vereinfachte Photometrische Methoden zur Bestimmung des Blutbilirubins; Micha elesson, M., Scand.J. Clin.Lab.Invest., 1 (Supp.56), 1~8 (1937); Bilirubin determination in serum and urine).
[0005]
B)Method for measuring direct bilirubin using bilirubin oxidase
In the method using bilirubin oxidase, bilirubin oxidase is acted on a sample containing bilirubin to oxidize bilirubin to bilirubin.At this time, the absorbance in the maximum absorption wavelength region of bilirubin disappears. It is. In this measurement method, various methods have been devised for the method of suppressing the reaction of indirect bilirubin, and many methods have been reported as described below.
[0006]
B1) A method for measuring direct bilirubin, wherein bilirubin oxidase is allowed to act at pH 3.5 to 4.5 (JP-A-59-125899).
B2) A method for measuring direct bilirubin, wherein bilirubin oxidase is allowed to act in an acidic buffer solution containing an anionic surfactant at a pH of 5 to 6 (Shgo Otsuji: Clin. Biochem., 21, 33 to 38). (1988) and JP-A-60-152555.
B3) A method for quantifying conjugated bilirubin, which comprises measuring the change in absorbance caused by the action of bilirubin oxidase in a buffer solution having a pH of 9 to 10 (Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-58999).
B4) A method for direct bilirubin quantification, which comprises reacting bilirubin oxidase in a buffer solution containing potassium ferrocyanide and / or potassium ferricyanide at a pH of 2.0 to 3.3, and measuring the resulting change in absorbance (Japanese Unexamined Patent Publication (KOKAI) 64-6499).
B5) A method for quantifying direct bilirubin, which comprises coexisting a fluorine compound or a reducing agent together with bilirubin oxidase (JP-A-5-276992).
B6) A direct bilirubin quantification method characterized by coexisting a tetrapyrrole ring compound with bilirubin oxidase (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 7-231795).
[0007]
C)Method for measuring direct bilirubin by high performance liquid chromatography (HPLC)
In the method of measuring direct bilirubin by HPLC, a concentration gradient of an organic solvent is applied to a reversed-phase column to fractionate bilirubin fractions in a hydrophilic / hydrophobic order. According to the HPLC, bilirubin in serum was mainly separated into four fractions, α, β, γ, and δ, where α fraction was free bilirubin and β fraction was two side chain propion in one molecule. Bilirubin in which only one of the acid groups has an ester bond with glucuronic acid (bilirubin monoglucuronide), and the γ fraction has bilirubin in which both propionic acid groups have an ester bond with glucuronic acid (bilirubin diglucuronide) Id) and δ fractions have been identified as having covalent bonds between albumin and bilirubin. It is also presumed that the δ fraction was produced as a result of the non-enzymatic reaction between the γ fraction and albumin (Toshio Yamamoto: Nichinai Gakkai 78 (11), 36-41 (1989)). The α fraction in HPLC is considered to correspond to indirect bilirubin in the method using the diazo reagent of the above A), while the β, γ and δ fractions are considered to correspond to direct bilirubin (John J. Lauff, Clin). Chem., 28 (4) 629-637 (1982)). Improvements have been made to the HPLC method while minimizing the complicated sample pretreatment step as much as possible, and various reports have been made (Nakamura H .: Bunseki kagaku, 36, 352-355 (1987); Yuukihiko Adachi: Gastroenterologia Japana, 23 (3), 268-272 (1988); Yuko Kato: Kinki University Medical Journal Vol. 14, No. 1, 97-112 (1989)).
[0008]
D)Method for measuring direct bilirubin with chemical oxidants
In the case of using a chemical oxidizing agent, instead of bilirubin oxidase, a low molecular weight oxidizing agent is allowed to act to oxidize bilirubin to biliverdin, and the amount is determined by the amount of decrease in absorbance based on bilirubin. Various methods have been devised for suppressing the reaction of indirect bilirubin, and these are reported as follows.
D1) A method for quantifying direct bilirubin, wherein copper ion and thiourea or a derivative thereof are allowed to act on a test solution (JP-A-63-118662).
D2) A method for quantifying bilirubin, characterized in that vanadate ion or trivalent manganese ion acts as an oxidizing agent and the optical change of the sample is measured (JP-A-5-18978). In order to measure direct bilirubin by this method, hydrazines, hydroxylamines, oximes, aliphatic polyamines, phenols, water-soluble polymers and HLB are used as indirect bilirubin reaction inhibitors. One or more compounds selected from the group consisting of the above nonionic surfactants are used.
D3) A method for quantifying bilirubin, wherein nitric acid acts as an oxidizing agent and the optical change of the sample is measured (WO96-17251). In order to measure direct bilirubin by this method, polyoxyethylene (n-alkyl or iso-alkyl) ether having an HLB of 12 to 15, thiourea, hydrazine, polyvinylpyrrolidone, or the like is used as an indirect bilirubin reaction inhibitor. Use
[0009]
Each of the measuring methods A) to D) has advantages and disadvantages, and at present, there is no necessarily satisfactory measuring method. The problems of each measurement method are listed below.
[0010]
In the method A) using a diazo reagent, a reaction in the absence of a reaction accelerator is defined as a diazo direct reaction, which is the origin of the name of direct bilirubin. However, there have been many reports that this diazo direct reaction can also occur for some of the indirect bilirubins (e.g., Killenberg, PG, Gastroenterology, 78, 1011-1015 (1980); Blankaert, N., J. Lab. Clin. Med., 96, 198-212 (1980); Yukio Manabe: Analytical Chemistry, 30, 736-740 (1981); Chan, KM, Clin. Chem., 31, 1560-1563 (1985); Akira Takasaka: Inspection and Technology 14 971-975 (1986); Yukihiko Adachi: Biological sample analysis 933-42 (1986)). Therefore, the measured value of bilirubin defined by the diazo direct reaction cannot be said to accurately measure "direct bilirubin".
[0011]
In the method B) using bilirubin oxidase, a measurement system was developed so as to be able to approximate the measured value of bilirubin defined by the diazo direct reaction. Cannot be said to measure "direct bilirubin". Among them, the method of coexisting a fluorine compound with bilirubin oxidase (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 5-276992) and the method of coexisting a tetrapyrrole ring compound (Japanese Patent Application Laid-open No. Hei 7-231795) can avoid the reaction to indirect bilirubin. . However, the use of a fluorine compound causes a problem of environmental pollution, and the presence of a tetrapyrrole ring compound in a reagent results in a lack of stability and a problem of long-term use in a solution state.
[0012]
The method C) by high performance liquid chromatography has high analytical performance, but requires about one hour to process one sample, and thus is not suitable for processing a large number of samples. Moreover, it requires expensive and special equipment and lacks versatility.
[0013]
Method D) using a chemical oxidizing agent developed a measurement system that can approximate the direct bilirubin measurement value defined by the diazo direct reaction as in the case of bilirubin oxidase. However, an oxidation reaction was observed, and it cannot be said that the measurement of “direct bilirubin” was accurate.
[0014]
As described above, a stable and safe method for directly measuring bilirubin, which completely avoids the reaction to indirect bilirubin, does not always exist at present, and this development has been awaited.
[0015]
[Problems to be solved by the invention]
The present invention has been made in view of the above situation, and has as its object to provide a method and a reagent for measuring direct bilirubin that completely avoid the interference of indirect bilirubin and have no danger of environmental pollution due to waste liquid. I do.
[0016]
[Means for Solving the Problems]
The present inventors have conducted extensive studies on the reactivity of indirect bilirubin and direct bilirubin in the optimal pH range of bilirubin oxidase, and found that when bilirubin oxidase acts on bilirubin, thiocyanate ions, hydrazides, reduced nicotine When amide adenine dinucleotide (NADH), reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), or potassium ion of 100 mM to 800 mM coexist, oxidation of indirect type bilirubin is completely suppressed and direct type bilirubin is suppressed. It has been found that the oxidation of DNA proceeds quantitatively and that direct bilirubin can be accurately measured, and the present invention has been completed.
[0017]
That is, the present invention provides a method for measuring direct bilirubin in a sample by causing bilirubin oxidase to act on the sample and optically changing the sample, wherein thiocyanate ion, hydrazide, reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) is used. Direct bilirubin oxidase in the presence of at least one indirect bilirubin reaction inhibitor selected from reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) and 100 mM to 800 mM potassium ion Is a measuring method.
Further, the present invention, as essential components, is selected from i) bilirubin oxidase and ii) thiocyanate ion, hydrazide, reduced nicotinamide adenine dinucleotide, reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate and 100 mM to 800 mM potassium ion. A direct bilirubin measurement reagent, which comprises at least one indirect bilirubin reaction inhibitor.
[0018]
BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION
In the present invention, the sample is not particularly limited as long as it contains direct bilirubin or indirect bilirubin. Usually, the sample is an ecological fluid sample such as plasma, serum, urine, or a model sample thereof.
[0019]
In the method of the present invention, the thiocyanate ion used as the indirect bilirubin reaction inhibitor is not particularly limited, and examples thereof include alkali metal thiocyanate, alkaline earth metal thiocyanate, and ammonium thiocyanate. And potassium thiocyanate are preferred.
[0020]
Examples of the hydrazides include acetylhydrazide, phthalhydrazide, isophthaloyldihydrazide, terephthalic dihydrazide, benzenesulfonylhydrazide and the like.
[0021]
Reduced nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) or reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) may be directly coexisted in the reaction reagent, or may be alcohol dehydrogenase, glycol-6-phosphate dehydrogenase, or the like. The object of the present invention can also be achieved by using one derived from oxidized nicotinamide adenine dinucleotide by an enzymatic reaction.
[0022]
As the potassium ion, potassium chloride, potassium bromide, potassium acetate, potassium citrate, potassium tartrate, potassium lactate, potassium phthalate, potassium sulfate and the like can be used without limitation.
[0023]
In the present invention, when bilirubin oxidase is allowed to act on bilirubin in a sample, the indirect bilirubin reaction inhibitor to coexist in the enzyme reaction solution is too low to sufficiently obtain the effect of suppressing the reaction of indirect bilirubin when the concentration is too low. On the other hand, if the concentration is too high, the inhibitory effect of bilirubin oxidase is enhanced and the oxidation reaction of direct bilirubin is easily hindered. Therefore, when thiocyanate ions or hydrazides are used as the indirect bilirubin reaction inhibitor, the concentration in the enzyme reaction solution is preferably 0.1 mM to 100 mM, more preferably 0.2 mM to 50 mM.
When NADH or NADPH is used, the concentration ranges from 0.1 mM to 10 mM, preferably from 0.2 mM to 5 mM.
[0024]
When potassium ions are used, the concentration of potassium ions in the enzyme reaction solution is preferably 100 mM to 800 mM, more preferably 110 mM to 600 mM, and particularly preferably 120 to 400 mM. If the potassium ion concentration does not exceed 100 mM, the effect of suppressing the reaction of indirect bilirubin is weakened. The inhibition of bilirubin oxidase having a potassium ion concentration exceeding 800 mM is enhanced, and the oxidation reaction of direct bilirubin is easily hindered.
[0025]
In the method of the present invention, two or more indirect bilirubin reaction inhibitors may be used. For example, two or more reaction inhibitors selected from thiocyanate ions, hydrazides, NADH and NADPH can be used in combination. Further, one or more reaction inhibitors selected from thiocyanate ions, hydrazides, NADH and NADPH can be used in combination with potassium ions.
[0026]
In the method of the present invention, bilirubin oxidase is not particularly limited, but bilirubin oxidase derived from Myrothecium verrucaria (available from Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) or bilirubin oxidase derived from Trachyderma tsunodae (available from Takara Shuzo) or Ple u Bilirubin oxidase (available from Seishin Co., Ltd.) and the like, and the required amount thereof is preferably used at a concentration of 0.001 to 10 U / ml in the final reaction solution. The concentration is more preferably 0.01 to 1 U / ml, and particularly preferably 0.02 to 0.5 U / ml.
[0027]
When bilirubin oxidase is allowed to act, the pH range is not limited as long as the enzyme activity can be expressed in an optimal state, but pH 4.5 to 6.5 is preferable, and pH 5.0 to 6.0 is particularly preferable. The buffer to be used is not particularly limited as long as it has a buffering capacity in this pH range, but potassium hydrogen phthalate / sodium hydroxide buffer, sodium citrate / sodium hydroxide buffer, malic acid / sodium hydroxide buffer And those containing a liquid or the like. In particular, when a potassium salt such as potassium hydrogen phthalate is contained as a component of the buffer solution, potassium ions are preferred because they have an indirect bilirubin reaction inhibitory effect.
[0028]
In the present invention, direct bilirubin in a sample can be measured using, for example, a direct bilirubin measurement reagent containing one or more of bilirubin oxidase and an indirect bilirubin reaction inhibitor.
[0029]
As a reagent for direct bilirubin measurement, for example, a kit containing a solution containing thiocyanate ion or hydrazide as a first reagent solution, and a solution containing bilirubin oxidase as a second reagent solution, and a kit comprising these two reagents It is preferable that It is preferable that the first reagent solution further contains potassium ions.
[0030]
Alternatively, for example, a buffer solution having a pH of 4.5 to 6.5, preferably a buffer solution having a pH of 5.0 to 6.0 is used as the first reagent solution, and a solution containing bilirubin oxidase and NADH, NADPH or potassium ion is used. It is preferable to use the second reagent solution as a kit composed of these two reagents in view of the stability of NADH, NADPH or bilirubin oxidase. When NADH or NADPH is used, the pH of the second reagent solution is preferably 9 or more, and more preferably 9 to 11.0, in view of the stability of NADH or NADPH in a solution state. Further, it preferably contains potassium ions.
When potassium ion is used alone as a reaction inhibitor for indirect bilirubin oxidase, the pH of the second reagent solution containing bilirubin oxidase is preferably 7 to 11 from the viewpoint of stability of bilirubin oxidase.
As described above, examples of the composition of the buffer include those containing potassium hydrogen phthalate / sodium hydroxide buffer, sodium citrate / sodium hydroxide buffer, malic acid / sodium hydroxide buffer, and the like.
It is preferable that the first reagent solution further contains potassium ions.
[0031]
The method of the present invention can be carried out, for example, using the kit described above as follows. The sample and the first reagent solution are mixed, and the absorbance at a specific wavelength, preferably 450 nm, in the wavelength range (430 to 460 nm) based on bilirubin in the mixture is measured (absorbance 1). Next, a second reagent solution containing bilirubin oxidase is added to the obtained solution, and oxidation of bilirubin is performed at 25 to 40 ° C. for 3 to 15 minutes. Then, absorbance at a specific wavelength based on bilirubin in the solution is again measured. Is measured (absorbance 2). After subjecting the obtained absorbance 1 and absorbance 2 values to liquid volume correction and the like, the change in absorbance before and after the oxidation reaction is determined. The direct bilirubin concentration in the sample can be determined from this value and a calibration curve created based on the absorbance change amount obtained by the same operation as above using a standard solution of which the concentration is known in advance. The direct bilirubin measurement method using such a kit can be applied to a general-purpose automatic analyzer such as a Hitachi 7070 automatic analyzer. The sample is preferably 0.005 to 2 ml.
[0032]
The thiocyanate ion, hydrazide, and potassium ion contained in the reagent for direct bilirubin measurement are not particularly unstable in an aqueous solution, and NADH or NADPH and bilirubin oxidase are not particularly unstable in an aqueous solution at pH 9 or more. This reagent can be used as a liquid reagent in the state of an aqueous solution. In addition, other reagents such as preservatives, chelating agents, surfactants and the like can be appropriately selected according to known methods as long as they can be used in ordinary reagents and kits. Can be used.
[0033]
【Example】
Examples 1 to 6 and Comparative Example 1
Inhibitory effect of indirect bilirubin
When bilirubin oxidase is allowed to act, potassium ions of 100 mM to 800 mM (Example 1), thiocyanate ions (Example 2), hydrazides (Examples 3 and 4), NADH (Example 5), NADPH (Example The following experiment was performed to observe whether or not the coexistence of Example 6) suppressed the oxidation reaction of indirect bilirubin. In Comparative Example 1, the test was performed under the condition not including these thiocyanate ions and the like. The reagents, samples, measurements, and results are shown below.
[0034]

[0035]
(2)sample
The sample used had an indirect bilirubin concentration of 50 mg / dl and a human serum albumin concentration of 6.0 g / l. The sample was prepared as follows.
5 mg of indirect bilirubin is weighed and dispersed in 0.4 ml of dimethyl sulfoxide. Immediately after dissolving indirect bilirubin by adding 0.4 ml of 100 mM sodium carbonate solution to this dispersed liquid, the sample was prepared by diluting with 9.2 ml of 100 mM Tris buffer (pH 7.00) containing human serum albumin. did.
[0036]
(3)Measurement in Comparative Example 1 and Examples 1 to 6
In a Hitachi 7070 type automatic analyzer, changes in absorbance at a main wavelength of 450 nm and a sub-wavelength of 546 nm were determined by a two-point end method under the conditions of a sample of 10 μl, a first reagent solution of 300 μl, and a second reagent solution of 75 μl.
That is, after mixing the first reagent solution and the sample on an automatic analyzer and incubating at 37 ° C. for 5 minutes, the absorbance based on bilirubin in this solution is measured at a main wavelength of 450 nm and a sub wavelength of 546 nm (absorbance 1 ). Next, a second reagent solution containing bilirubin oxidase is added to the resulting solution, and the bilirubin oxidation reaction is performed at 37 ° C. for 5 minutes. Then, the absorbance based on bilirubin in the solution is measured again at the above wavelength. (Absorbance 2). After subjecting the obtained absorbance 1 and absorbance 2 values to liquid volume correction and the like, the decrease in absorbance before and after the oxidation reaction is determined. These measurements and calculations are performed automatically by an automatic analyzer.
[0037]
(4)Results of Comparative Example 1 and Examples 1 to 6
Table 1 shows the results of the amount of decrease in absorbance of indirect bilirubin in Comparative Example 1 and Examples 1 to 6. 1 to 6 show the course of reaction (reaction time course) on the automatic analyzer in Comparative Example 1 and Examples 1 to 6.
[0038]
[Table 1]

[0039]
As is clear from Table 1 and FIGS. 1 to 6, in the method according to the present invention (Examples 1 to 6), the amount of decrease in absorbance due to oxidation of indirect bilirubin is about the measurement error of the automatic analyzer, No decrease in absorbance is observed even in the reaction time course. On the other hand, in Comparative Example 1, a clear decrease in absorbance accompanying oxidation of indirect bilirubin is observed.
This revealed that in the presence of thiocyanate ion, hydrazide, 100 mM to 800 mM potassium ion, NADH and NADPH, the reaction of indirect bilirubin by bilirubin oxidase was suppressed in all cases.
[0040]
Examples 7 to 12
Determination of direct bilirubin in samples containing direct and indirect bilirubin
(1)Sample preparation
A solution containing 5 mg / dl of ditaurobilirubin (a concentration equivalent to bilirubin) and 6.0 g / l of human serum albumin in a 100 mM Tris buffer (pH 7.00) was prepared as a direct bilirubin solution. Separately, a solution containing 5 mg / dl of unconjugated bilirubin and 6.0 g / l of human serum albumin in 100 mM Tris buffer (pH 7.00) was prepared as an indirect bilirubin solution. Next, the direct bilirubin solution was diluted with the indirect bilirubin solution to prepare various samples having the same total bilirubin concentration (5 mg / dl) and different direct bilirubin concentrations. In addition, the sample prepared six types of ratios of the direct type bilirubin with respect to the total bilirubin of 0.0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, and 1.0.
[0041]
(2)Measurement condition
Except that this sample was used, the amount of decrease in absorbance was measured under the measurement reagents and measurement conditions described in Examples 1 to 6, and the amount of decrease in absorbance was measured. Example 9 (using hydrazides), Example 10 (using hydrazides), Example 11 (NADH), and Example 12 (NADPH).
[0042]
(3)result
The results are shown in FIGS. 7 to 12, the horizontal axis represents the ratio of direct bilirubin to total bilirubin, and the vertical axis represents the amount of decrease in absorbance. In the method of the present invention (Examples 7 to 12), the absorbance increased in proportion to the amount of direct bilirubin, and good dilution linearity with regression to the origin was obtained. This indicates that in Examples 7 to 12, direct bilirubin was selectively measured without interference of indirect bilirubin.
[0043]
Comparative Example 2
Determination of direct bilirubin in samples containing direct and indirect bilirubin by conventional methods
On the other hand, direct bilirubin was measured by the conventional method using the samples used in Examples 7 to 12. The conventional method was carried out by a measurement method in which bilirubin oxidase was allowed to act under conditions of pH 3.5 to 4.5 (Japanese Patent Laid-Open No. 59-125899; Shogo otsuji, Clin. Biochem., 21, 33 to 38 (1988)). That is, it depends on the reagent conditions of the following composition.
[0044]

[0045]
(2)Measurement method
The measurement conditions of the conventional method were the same as the measurement conditions described in Example 1 except for the reagent solution.
[0046]
(3)result
The results are shown in FIGS. In the conventional method (Comparative Example 2), it was found that linearity could not be obtained between the concentration of the direct bilirubin in the sample and the measured absorbance. In the conventional method, it is shown that the direct type bilirubin in the sample is not accurately measured due to the interference of the indirect type bilirubin in the sample.
[0047]
Examples 13 to 18 and Comparative Example 3
Example in which indirect bilirubin in a bilirubin high-value patient sample did not react under the measurement method conditions of the present invention by HPLC
(1)sample
Serum samples from pooled patients with high bilirubin levels were used as samples. Serum samples were subjected to analysis without treatment by salting out with sodium sulfate. Although globulin in the sample is adsorbed on the column and accelerates deterioration, the purpose is to prevent denaturation of the bilirubin fraction.
[0048]
(2)reagent
Example 13 (using potassium ions), Example 14 (using thiocyanate ions), Example 15 (using hydrazides), Example 16 (using hydrazides), Example 17 (using NADH), Example 18 (using NADPH) Use), the reagents used in Examples 1 to 6 were used, respectively. In Comparative Example 3, the reagent used in Comparative Example 2 was used.
[0049]
(3)Oxidation of bilirubin in samples by bilirubin oxidase
480 μl of the first reagent solution was added to 16 μl of the sample, and the mixture was heated at 37 ° C. for 5 minutes. Further, 120 μl of the second reagent solution was added to the obtained solution, and after heating at 37 ° C. for 5 minutes, 120 μl of a 2% aqueous ascorbic acid solution was added to stop the reaction of bilirubin oxidase.
[0050]
(4)HPLC analysis
HPLC analysis was performed by the method described in the literature (John J. Lauff, Clin. Chem, 28 (4), 629-637 (1982)), and the change in peak area based on indirect bilirubin before and after the reaction was examined. For the data before the reaction, a peak area based on indirect bilirubin was obtained by performing the same operation as the above-described oxidation reaction except that physiological saline was used as the second reagent solution.
HPLC was performed using a Hitachi HPLC system (Column Oven L-7300, UV Detector L-7400, Pump L-7100, Integrator D-7500), a reverse-phase column Lichrpher 100 RP-18 (10 μm) manufactured by Kanto Chemical Co., Ltd. Connected and used.
That is, the solution obtained by the above oxidation reaction was filtered through a 0.45 μm membrane filter, and 150 μl of the filtrate was injected into an HPLC column to determine the peak area based on indirect bilirubin after the reaction. For elution, the bilirubin fraction was separated from solution A: (purified water 950 volumes / 2-methoxyethanol 50 volumes / pH 2.1 with phosphoric acid) and solution B: (isopropanol 950 volumes / 2-methoxyethanol 50 volumes / A linear gradient of isopropanol between the two solutions (2.5 volumes of phosphoric acid) was used and detected at a wavelength of 450 nm.
[0051]
(5)result
The residual ratio of indirect bilirubin was determined by comparing the data before the reaction with 100 with the peak area data based on the indirect bilirubin after the reaction. Table 2 shows the results. The peak area based on indirect bilirubin hardly changed before and after the reaction, and it was confirmed that the indirect bilirubin did not react under the measurement conditions of the present invention. On the other hand, in Comparative Example 3 (conventional method), indirect bilirubin was reduced by 16.5%. This indicates that a part of indirect bilirubin reacted under the conditions of the conventional method.
[0052]
[Table 2]

[0053]
【The invention's effect】
According to the present invention, direct bilirubin in a sample can be selectively measured without the influence of indirect bilirubin, which is useful in the field of clinical examination.
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 shows reaction time courses in Example 1 and Comparative Example 1. The horizontal axis indicates the photometry point (one point is about 20 seconds), and the vertical axis indicates absorbance × 10000.
FIG. 2 shows reaction time courses in Example 2 and Comparative Example 1. The horizontal axis indicates the photometry point (one point is about 20 seconds), and the vertical axis indicates absorbance × 10000.
FIG. 3 shows reaction time courses in Example 3 and Comparative Example 1. The horizontal axis indicates the photometry point (one point is about 20 seconds), and the vertical axis indicates absorbance × 10000.
FIG. 4 shows reaction time courses in Example 4 and Comparative Example 1. The horizontal axis indicates the photometry point (one point is about 20 seconds), and the vertical axis indicates absorbance × 10000.
FIG. 5 shows the reaction time course of indirect bilirubin by bilirubin oxidase in Example 5 and Comparative Example 1. The horizontal axis indicates the photometry point (one point is about 20 seconds), and the vertical axis indicates absorbance × 10000.
FIG. 6 shows a reaction time course of indirect bilirubin by bilirubin oxidase in Example 6 and Comparative Example 1. The horizontal axis indicates the photometry point (one point is about 20 seconds), and the vertical axis indicates absorbance × 10000.
FIG. 7 shows the results of Example 7 and Comparative Example 2. The horizontal axis shows the ratio of direct bilirubin to the total bilirubin, and the vertical axis shows the amount of decrease in absorbance.
FIG. 8 shows the results of Example 8 and Comparative Example 2. The horizontal axis shows the ratio of direct bilirubin to the total bilirubin, and the vertical axis shows the amount of decrease in absorbance.
FIG. 9 shows the results of Example 9 and Comparative Example 2. The horizontal axis shows the ratio of direct bilirubin to the total bilirubin, and the vertical axis shows the amount of decrease in absorbance.
FIG. 10 shows the results of Example 10 and Comparative Example 2. The horizontal axis shows the ratio of direct bilirubin to the total bilirubin, and the vertical axis shows the amount of decrease in absorbance.
FIG. 11 shows the results of Example 11 and Comparative Example 2. The horizontal axis shows the ratio of direct bilirubin to the total bilirubin, and the vertical axis shows the amount of decrease in absorbance.
FIG. 12 shows the results of Example 12 and Comparative Example 2. The horizontal axis shows the ratio of direct bilirubin to the total bilirubin, and the vertical axis shows the amount of decrease in absorbance.

Claims

In a method in which bilirubin oxidase is allowed to act on a sample containing bilirubin, and direct bilirubin in the sample is measured by optical change of the sample, thiocyanate ion, hydrazide, reduced nicotinamide adenine dinucleotide and reduced nicotinamide adenine are used. A method for measuring direct bilirubin, wherein bilirubin oxidase is allowed to act in the presence of at least one indirect bilirubin reaction inhibitor selected from dinucleotide phosphates.

The method for measuring direct bilirubin according to claim 1, wherein the pH at the time of acting bilirubin oxidase is 5.0 to 6.0.

As essential components, i) bilirubin oxidase and ii) one or more indirect bilirubin reaction inhibitors selected from thiocyanate ions, hydrazides, reduced nicotinamide adenine dinucleotide and reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate. A reagent for measuring direct bilirubin, comprising: