JP3486411B2 - コンペティティブイムノアッセイによるエストラジオールの測定 - Google Patents

コンペティティブイムノアッセイによるエストラジオールの測定

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 エストラジオール（1,3,5（10）−エストラトリエン
−3,17a−ジオール）は卵巣及び胎盤によって分泌され
る。エストラジオールは、卵巣及び胎盤の莢膜及び顆粒
膜細胞においてアンドロゲンの芳香化によって合成され
る。芳香化はフォリトロピン（FSH）によって刺激され
る。引き続いてエストラジオール合成がアンドロゲン前
駆体の合成に必要とされる黄体形成ホルモン（LH）レセ
プターの産生を刺激する。
エストラジオールは、妊娠中の雌性分化、思春期初期
の性的な発育及び月経周期の調節に重要である。月経周
期は、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）、LH及びFS
H並びに卵巣ステロイド類（エストラジオール及びプロ
ゲステロン）の周期的放出を調節する中枢神経系、視床
下部、脳下垂体、卵巣及び子宮内膜の機能特性が精密に
協調した結果である。エストラジオールはゴナドトロピ
ン放出の促進と阻害とに係わっており、正及び負のフィ
ードバックどちらにも作用する。小胞期初期には、卵巣
の莢膜及び顆粒膜細胞からのエストラジオール分泌は緩
慢である。小胞期の間、エストラジオールは子宮内膜の
成長（月経後の子宮内膜の修復）を刺激する。中期にな
ると、LH産生が増加し、その結果、発達した小胞の破裂
により卵子が放出される。排卵後、エストラジオールの
分泌はわずかに減少する。黄体期の間、エストラジオー
ルがプロゲステロンと共に黄体によって分泌され、子宮
内膜の成長をさらに刺激する。卵子が受精しないと、エ
ストラジオール及びプロゲステロンがさらに低下する。
このエストラジオール及びプロゲステロンの低下により
月経が始まる。
エストラジオールの測定は、正常な性的発育（初
潮）、不妊症（無排卵、無月経、月経困難症）の原因及
び閉経の鑑定に重要である。標準的なエストラジオール
のレベルは、月経期及び小胞期初期に最低となる（25〜
75pg/ml）。該レベルは、小胞期後期に200〜600pg/mlと
いうピークに上昇し、その直後にLHが急増して排卵が始
まる。LHがピークに達すると、エストラジオールは減少
し始め、その後、黄体期に再び増加する（100〜300pg/m
l）。受胎しないと、エストラジオールはさらにその最
低レベルまで減少し、それによって月経が始まる。受胎
すると、エストラジオールレベルは上昇を続け、最初の
３カ月に１〜5ng/mlレベル、次の３カ月には５〜15ng/m
lレベル、次の３カ月には10〜40ng/mlレベルに達する。
閉経期には、エストラジオールレベルは低く保たれる。
血清中のエストラジオールレベルの測定には種々の方
法がある。しかし、これらの方法はいずれも標識として
放射性元素を用いるものであり、いくつかの不利点があ
る。該方法は手動段階を含む異なる数段階、数個の容器
を要し、且つ全く自動化されていないか又は半自動化さ
れているに過ぎない。放射能標識には問題が多い。とい
うのは、そのような検定法は非放射標識検定形式よりず
っと多大の費用がかかるからである。例えば、より高度
に熟練した検査技師を必要とし、廃棄物はより厳密に管
理且つ制御される。血清試料中のエストラジオールレベ
ルを決定するための市販のラジオイムノアッセイ法につ
いて以下に述べる。
エストラジオール用の検定法の一つ（Pantexから販売
されている）は、直接非抽出コンペティティブアッセイ
（競合検定）である。放射能標識エストラジオールトレ
ーサー、抗エストラジオール抗体及び試料を混合し、２
時間インキュベートする。抗抗体を加え、混合物を15分
間インキュベートして沈降物を生成させる。生成した沈
降物をペレットにするために混合物を遠心分離にかけ
る。上清をデカントし、沈降物の放射能を測定する。測
定された放射能を放射能対エストラジオール濃度曲線と
比較して試料中のエストラジオール濃度を決定する。こ
の検定法において交差反応することが知られている化合
物はα−エストラジオール（1.4％）及びDanazol（0.6
％）である。
もう一つのエストラジオール用検定法［Diagnostic P
roducts Corporationから販売されているCoat−Ａ−Cou
nt Radioimmunoassay（RIA）for Estradiol］は、直接
非抽出抗体被覆チューブコンペティティブアッセイであ
る。各チューブは抗エストラジオール抗体で被覆されて
いる。放射能標識エストラジオールトレーサー及び試料
を該チューブ内で３時間インキュベートする。混合物を
デカントし、チューブを洗浄した後、チューブの放射能
を測定する。測定された放射能を、放射能対エストラジ
オール濃度曲線と比較して、試料中のエストラジオール
濃度を決定する。この検定法において交差反応すること
が知られている化合物はEthinyl Estradiol（1.8％）、
Estrone（1.1％）、Estradiol−３β−Ｄ−glucronide
（0.7％）、Estradiol−３−Sulfate（0.3％）及び19−
Nortestosterone（0.25％）である。
さらにもう一つのエストラジオール用検定法（Serono
から販売されているEstradiol MAIA）も、直接非抽出コ
ンペティティブアッセイである。放射能標識エストラジ
オールトレーサー、抗エストラジオール抗体及び試料を
（所望の検定感度及び精度に応じて）１〜３時間インキ
ュベートして、抗体−エストラジオール複合体を生成さ
せる。反応混合物を抗抗体被覆磁気粒子と共にインキュ
ベートし、次いで磁場を適用して磁気粒子を沈降させる
ことにより複合体を試料から分離する。次いで分離した
粒子を洗浄する。測定された粒子の放射能レベルを放射
能対エストラジオール濃度曲線と比較して、試料中のエ
ストラジオール濃度を決定する。この検定において交差
反応することが知られている化合物はEstrone（2.5
％）、Estradiol−Dipropionate（0.3％）、Estradiol
−３β−Ｄ−glucuronide（0.2％）及びEstriol（0.2
％）である。
いくつかの非放射能標識イムノアッセイが発表されて
いるが、それらは正確且つ精密なエストラジオールレベ
ルの測定に必要とされる感度及び特異性を有していな
い。Dawsonら（Steroids,31:357−366,1978）は、11位
の炭素でエストロンにカップリングされた西洋ワサビの
ペルオキシダーゼを用いて、ウサギの多クローン性抗エ
ストラジオール抗体を試験した。エストロンに対する抗
体の交差反応性は５％〜120％の範囲であった。そのよ
うな交差反応性はエストラジオール特異検定法において
は許容されるものではない。従って、酵素がエストロン
の11位にカップリングされている抱合体を用いる酵素イ
ムノアッセイでは満足すべき検定ができそうもないと思
われる。
Pandeyら（Clinica Chimica Acta,190:175−184,199
0）は、マイクロタイタープレートの抗エストラジオー
ル抗体被覆ウエルと共に、ペニシリナーゼに結合した抱
合体エストラジオール−６−（Ｏ−カルボキシメチル）
オキシムを用いた酵素結合イムノソルバントアッセイ
（ELISA）を発表した。該検定法は、25pg/mlという低い
感度限界を有していたが、37℃で２時間の反応混合物の
インキュベーションを要し、且つ洗浄後の酵素基質／酵
素反応は37℃で１時間のインキュベーションを必要とし
た。従って、全検定時間は３時間を超えるものであっ
た。Maurelら（J.Immunolog.Methods,102:165−172、19
87）も、β−ガラクトシダーゼに結合したエストラジオ
ール−６−（Ｏ−カルボキシメチル）オキシムを用いる
ELISAを発表した。該検定法はPandeyらの検定法により
感度が改良されていた。しかし、Pandeyらの方法と同様
に、Maurelらの方法は長時間のインキュベーションを必
要とする。マイクロタイターのウエル上に被覆された抗
エストラジオール抗体を試料とともに37℃で90分間イン
キュベートし、さらに抱合体と共に90分間インキュベー
ト、次いで洗浄後、酵素活性を42℃で２時間後に決定し
た。このように、検定時間は３時間を優に上回るもので
あった。
De Boeverら（Clin.Chem.,32:1895−1900,1986）は、
感度限界が約49pg/mlであり検定時間が90分を超えるエ
ストラジオール用化学ルミネセンスイムノアッセイを発
表した。Rodaら（Anal.Biochem.,156:267−273,1986）
は、実施に４時間以上を要するエストラジオール用発光
酵素イムノアッセイを発表した。
De Lauzonら（J.Immunoassay,10:339−357,1989）
は、ウシの血清アルブミン（BSA）にカップリングされ
たエストラジオールで被覆したマイクロタイタープレー
トウエルを用いるエストラジオール用コンペティティブ
酵素イムノアッセイを発表した。試料及びペルオキシダ
ーゼ標識抗エストラジオール抗体をウエル内で２時間室
温でインキュベートした。あるいは、ビオチニル化抗エ
ストラジオール抗体を用いて、ペルオキシダーゼにカッ
プリングされたアビジンと共に３時間、第２のインキュ
ベーションを行った。
干渉がなく、pHとか温度のような実験的な変数に対し
て比較的敏感でなく、急速、正確、高感度且つ実施し易
いエストラジオール非放射能標識イムノアッセイが必要
であることは明らかである。本発明の目的は、放射能標
識トレーサーを必要とせずに、正確且つ精密にエストラ
ジオールの測定を行うための検定及び試薬を開発するこ
とである。生物学的流体試料中に存在するエストラジオ
ールは極めて低濃度（0.025〜40ng/ml）のために、いず
れの代替え法も非常に感度のよいものでなければならな
い。現行法は、この感度要求条件を克服するために長時
間のインキュベーションを行っている。本発明のもう一
つの目的は、非放射能標識イムノアッセイに要求される
長いインキュベーション時間をなくすことである。
発明の概要 本発明は、６位で標識に結合したエストロンの使用を
含むコンペティティブ酵素イムノアッセイ法を用いるエ
ストラジオールの測定に関する。エストラジオール特異
抗体と共に６位で標識に結合したエストロン及びその誘
導体を用いて、流体試料中のエストラジオールレベルを
決定し得ることが本願発明者により思いがけず見いださ
れた。さらに本発明は、検定法の効率を向上させるため
に５α−ジヒドロテストステロンを用いる。
発明の詳細な説明 本発明は、流体試料中のエストラジオールの測定に有
用な方法及び試薬に関する。本願発明者は、標識に結合
したエストロン及びその誘導体をエストラジオール特異
結合性要素と共に用いて、血液、血漿、全血、脳脊髄
液、唾液、尿などのような流体試料中のエストラジオー
ルレベルを測定することが可能であることを思いがけず
見いだした。本発明では、その特徴として、そのような
エストロン標識抱合体を用いて流体試料中のエストラジ
オール濃度を測定する。さらに、エストラジオールは、
血清、血漿、全血などのような流体試料中に存在する性
ホルモン結合性グロブリン（Sex Hormone Binding Glob
ulin（SHBG）（Philipら,Steroids,47:373−379,198
6））に結合することが知られている。SHBGを含む試料
中の全エストラジオールを測定するためには、SHBGに結
合したエストラジオールを放出（遊離）させなければな
らない。本願発明者は、５α−ジヒドロテストステロン
の緩衝溶液を用いると、SHBGに結合したエストラジオー
ルが実質的に全て放出されることを見いだした。
テストステロン（Philipら,J.Steroid Biochem.,32:8
65−872,1989）及びその誘導体は、pH8.0でSHBGからエ
ストラジオールを追い出すことが知られている（De Boe
verら,Clin.Chem.,32:1895−1900,1986）。De Boeverら
が発表し、且つ本願発明者が観察したように、pH7.5−
8.0では５α−ジヒドロテストステロンによって実質的
に全てのエストラジオールがSHBGから追い出されるわけ
ではない。実質的に全てのエストラジオールは、約4.5
〜約6.7、好ましくは約5.0〜約6.0の範囲のpH、最も好
ましくは約5.7のpHにおいて、約１μg/ml〜約５μg/ml
の範囲、好ましくは約１μg/ml〜約３μg/mlの範囲、最
も好ましくは約２μg/mlの濃度の５α−ジヒドロテスト
ステロンによってSHBGから追い出される。緩衝液は、好
ましくは、約0.25M〜約1Mの範囲、より好ましくは約0.4
M〜約0.6Mの範囲の濃度のグリシンと、約0.2M〜約0.5M
の範囲、より好ましくは約0.2M〜約0.3Mの範囲の濃度の
クエン酸の組み合わせであるが、上記の有効反応範囲内
の溶液を緩衝し得る他の緩衝液又はその組み合わせも許
容可能である。さらに緩衝液は、好ましくは、約0.5％
（w/v）以上、より好ましくは約0.5％（w/v）〜約1.25
％（w/v）の範囲、最も好ましくは約0.75％（w/v）の濃
度のサポニンを含む。血清試料中に赤血球が存在する
と、測定されるエストラジオールレベルが増大する傾向
がある。サポニンを添加することにより、赤血球の影響
が実質的に減少する。
エストラジオールに特異的な特異結合性要素には、単
クローン性及び多クローン性抗体のようなエストラジオ
ール特異結合性タンパク質及び特異的にリポタンパク質
コレステロール粒子と結合する他のエストラジオール特
異的合成又は組換えタンパク質がある。例えば、エスト
ラジオールのようなステロイド類に特異的に結合する単
クローン性及び多クローン性抗体を産生し得ることは当
業者には周知である。エストラジオール又は一般的に共
有結合によってアルブミンなどのような担体タンパク質
にカップリングされたエストラジオール誘導体を含む免
疫原を動物に注射すると、動物の免疫系はエストラジオ
ールに特異的に結合する多クローン性抗体を産生する。
マウス又はラットを用いて分析物に対する単クローン性
抗体を生成させる一般的な方法は当業者には周知であ
る。最近になって、分析物特異的合成及び組換えタンパ
ク質の製造が発表されており、同方法は、本発明に有用
なエストラジオール特異結合性合成及び組換えタンパク
質の製造に容易に応用することができる。
本願発明者は、驚くべきことには、エストラジオール
特異抗体に対して極めて低い交差反応性（５％未満であ
り、１％未満の交差反応性の場合もある）を有すると言
われている化合物、エストロンが、非常に高速のアッセ
イ形式において極めて低レベルのエストラジオールを検
出するための優れた標識試薬として機能することを見い
だした。本明細書に用いられている「抱合体（conjugat
e）」という用語は、標識にカップリングされたエスト
ロン又はエストロン誘導体を含む任意の物質を指す。カ
ップリングは共有結合であるのが好ましい。本発明に使
用するために好ましい抱合体は、 （ここで、Ｑは標識である）を含む。
本明細書に用いられている用語「標識」とは、エスト
ロン又はその誘導体に結合し得、且つ可視又は器具手段
によって検出可能である信号を生成し得る任意の物質を
指す。本発明に使用するために好適な種々の標識は、触
媒、酵素、リポソーム、又は色素原、触媒、蛍光化合
物、化学発光化合物、酵素及び酵素基質などのような信
号生成物質を含む他のベシクル（小胞）を包含し得る。
標識としての使用に好適な多くの酵素が、本明細書に参
考文献として組み込まれている米国特許第4,275,149号
に開示されている。そのような酵素としては、フルオレ
セイン ジ（ガラクトピラノシド）、ニトロブルーテト
ラゾリウム、3,5′,5,5′−テトラニトロベンジジン、
４−メトキシ−１−ナフトール、４−クロロ−１−ナフ
トール、４−メチルウンベリフェリルホスフェート、５
−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、
WO88100694号及びEP0−254−051−A2号に記載のジオキ
セタンのような化学発光酵素基質並びにその誘導体及び
類似体のような酵素基質と共に用いられるアルカリ性ホ
スファターゼ及び西洋ワサビペルオキシダーゼのような
グルコシダーゼ類、ガラクトシダーゼ類、ホスファター
ゼ類及びペルオキシダーゼ類が挙げられる。標識が酵素
であるのが好ましく、最も好ましいのは酵素がアルカリ
性ホスファターゼの場合である。
抱合体は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミドのようなカルボジイミド化合物
を用いて標識を抱合体前駆体（Sigma Chemical Company
から販売されている） とカップリングするか、又は先ずＮ−ヒドロキシスクシ
ンイミド活性エステルのような活性エステルを生成さ
せ、次いで活性エステルを標識と反応させることにより
製造するのが好ましい。当業者には周知の他のカップリ
ング法及び条件を用いて抱合体を製造してもよい。
本発明においては、エストラジオールに特異的な特異
結合性要素が結合している固相を用いてエストラジオー
ルを測定するのが好ましい。固相及び試料を分離して、
固相に結合しているエストロン酵素抱合体の量又は溶液
中に残留するエストロン酵素抱合体の量を決定すること
が可能である。固相上又は溶液中のエストロン酵素抱合
体の量は、一般的に標準曲線と称される酵素活性対エス
トラジオール濃度曲線を用いて試料中のエストラジオー
ルの濃度に相関させ得る。標準曲線は表１（後記）のよ
うな検量体を用いて検定を行って作成する。対照を用い
て該曲線が有効であることを確認する。エストラジオー
ルレベルが不明の試料を検定する場合、測定される検定
信号を標準曲線と比較し、該信号に対応するエストラジ
オールレベルが試料のエストラジオールレベルである。
特異結合性要素は、物理的又は化学的手段、好ましく
は直接共有結合により固相に結合し得る。特異結合性要
素は、その後の反応及び洗浄段階の間にいかなる特異結
合性要素も実質的に分離することのないように固相に結
合される必要がある。選択される特異結合性要素及びカ
ップリング法のいかんに拘わらず、特異結合性要素は、
固相にカップリングされた後にエストラジオール及びエ
ストロン酵素抱合体に結合可能でなければならない。
本発明の固相は、高分子微粒子と、エストラジオール
に特異的な化学的又は物理的に結合された特異結合性要
素との混合物であってよい。使用可能な微粒子には、約
0.1μｍ〜約0.25インチの範囲の半径を有する、ポリス
チレン、カルボキシル化ポリスチレン、ポリメチルアク
リレート又は同様な粒子がある。これらの粒子の好まし
い分離法は、ガラス繊維のような多孔質マトリックス上
での微粒子捕獲を用いることである（後記）。
使用可能な他の固相には、磁化性高分子微粒子と、エ
ストラジオールに特異的であり、化学的又は物理的に結
合された特異結合性要素との混合物が含まれる。使用可
能な磁化性微粒子は、酸化第二鉄又は酸化クロムの核
と、ポリスチレン、カルボキシル化ポリスチレン又はポ
リメチルアクリレートのコーティングを有するのが好ま
しい。その他の固体支持体は当業者には公知であり、そ
の例としては、反応トレーのウエルの壁、チューブ、ポ
リスチレンビーズ、ニトロセルロースストリップ、膜な
どがある。天然、合成、又は合成により修飾された天然
産生物質を固相材料として用いることが可能であり、例
えば、多糖類、例えば、紙の用いることが可能であり、
例えば、多糖類、例えば、紙のようなセルロース材料並
びに酢酸セルロース及びニトロセルロースのようなセル
ロース誘導体；シリカ；不活化アルミナ、ケイソウ土、
MgSO4又は塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリ
マー及び塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマーのようなポ
リマーを含む多孔質ポリマーマトリックス中に均質に分
散された他の微細分割無機物質のような無機物質；天然
産生布（例えば木綿）及び合成布（例えばナイロン）；
シリカゲル、アガロース、デキストラン及びゼラチンの
ような多孔質ゲル；ポリアクリルアミドのような高分子
フィルムなどがある。いずれにせよ、固相材料は、適度
の強度を有している必要があるか、又はその強度は支持
体から得てもよいが検出可能な信号の生成を妨害しては
ならない。
他の好ましい分離法が、同時係属米国特許出願第150,
278号及び第375,029号に記載されており、両特許許出願
とも同一所有権者に帰し、且つどちらも参考文献として
本明細書に組み込まれている。これらの出願明細書は、
イオン捕獲分離の使用について記載しており、この分離
において、当該検定法に用いられる特異結合性要素は、
第１の高分子イオン（polyionic）化合物、並びに該第
１の高分子イオン化合物と結合する第２の高分子イオン
化合物が結合している多孔質マトリックスに化学的に結
合している。特異結合対が形成され、第１と第２の高分
子イオン化合物間の静電的相互作用により反応混合物か
ら分離する。特異結合対の特異結合性要素は、第１の高
分子イオン化合物に共有結合するのが好ましい。
好ましくは、第１の高分子イオン化合物は、ポリアス
パラギン酸、ヘパリン、カルボキシメチルアミロース、
ポリグルタミン酸又はポリアクリル酸のようなポリアニ
オン性酸であり、第２の高分子イオン化合物は、高分子
第四級アンモニウム化合物であるGafQuattm（GAF Corpo
ration,Wayne,ニュージャージー州,07470）、ジエチル
アミノエチル−デキストラン（Sigma Chemical Compan
y,St Louis,ミズーリ州）、両方とも高分子第四級化合
物であるCelquat（商標）Ｌ−200及びCelquat（商標）
Ｈ−100（National Starch ＆ Chemical Corporation,B
ridgewater,ニュージャージー州,08807）等の水溶性セ
ルロース誘導体又はMerquat（登録商標）100（Calgon C
orporationから販売されている）のようなカチオン性ポ
リマーである。多孔質マトリッの電荷を負荷する。カチ
オン性ポリマーは、吸収、吸着又は共有若しくはイオン
カップリングによりマトリックスに結合する。正に帯電
したパッドと負に帯電したポリアニオン複合体との間の
静電的相互作用により反応生成物の分離が行われる。
本発明に使用するための多孔質マトリックスは、任意
の好適な多孔質物質を包含し得る。「多孔質」物質と
は、流体が該物質を介して流動し、且つ容易に該物質を
通過し得る物質を意味する。本発明においてマトリック
スは、ポリプロピレン、ポリエチレン、テフロン、ガラ
ス繊維、セルロース若しくはナイロンパッド、又は１種
以上の検定試薬を含む一つ以上の層を有する注入及び流
動検定装置に使用するための、当業者には周知の他の多
孔質物質を包含し得る。
好ましい多孔質物質には、公称厚さが0.33mmである
「Whatman 934−AH」濾紙のような多孔質ガラス繊維材
料、又はAbbott Laboratories（Abbott Park,イリノイ
州,60064）の使い捨て式IMx（登録商標）カートリッジ
及びTestPack（商標）（繊維マトリックス）装置があ
る。そのような材料の厚さは重要ではなく、選択の問題
であろうし、大体、試験試料の流動性のような被検定試
料又は分析物の特性に応じて選択される。
ある種の酵素基質は、適切な酵素により、４−メチル
ウンベリフェロンのような蛍光化合物に転換される。経
時的に蛍光化合物が形成される量又は割合が反応中に存
在する酵素の量の指標となる。酵素が標識の場合には、
存在する酵素の量は試料中に存在するエストラジオール
の量に関係する。従って、蛍光の測定は試料中に存在す
るエストラジオールの量と関係付けられる。蛍光は当業
界では公知のいずれの方法によっても測定可能である。
例えば、蛍光分光器が望ましいが、蛍光スペクトルは、
可視分光器を用いて観測してもよいし、又は高集光力を
有する分光器を用いて写真撮影してもよい。
好ましい実施態様においては、光源として水銀アーク
灯を用いる蛍光測定器であるオプチカルアセンブリを収
容しているIMx（登録商標）（Abbott Laboratories,In
c.）自動ベンチトップ分析器を用いて蛍光を検出する。
該器具はFioreら（Clin.Chem.,34/9:1726−1732,1988）
によって記載されており、その内容は本明細書に引用し
て組み込まれている。該器具は、抱合体及び試料に暴露
された抗エストラジオール抗体を含む微粒子を捕獲する
ために多孔質マトリックスを含むIMx（登録商標）使い
捨て式カートリッジ（Abbott Laboratories,ILから市
販）を用いる。抱合体に用いられる標識はアルカリ性ホ
スファターゼであるのが好ましい。抱合体と試料中のエ
ストラジオールとは微粒子上の利用可能な結合部位を求
めて競合する。微粒子は試料から分離され、微粒子上に
存在する抱合体の量は、４−メチルウンベリフェリルホ
スフェートが４−メチルウンベリフェロンに転換される
割合から決定される。４−メチルウンベリフェロン生成
率（速度）対エストラジオール濃度についての標準曲線
から、試料中のエストラジオールの量を決定することが
可能である。
４−メチルウンベリフェロン生成率対エストラジオー
ル濃度についての、検量線としても知られている標準曲
線は、通常、既知のエストラジオール濃度を含む検量溶
液から作成される。６種の検量体を用いて検量線を得る
のが好ましいが、結果についての望ましい正確度及び精
度に応じて、６種以上又は以下の検量体を用いてもよ
い。検量体は増大量のエストラジオールを含むのが好ま
しい。例えば、表１は１組の検量体からなる組成物を示
している（実施例４参照）。一般に、検量線又は検定試
薬の有効性を確認するために検定の際に対照（コントロ
ール）を用いる。対照の処方は検量体と同様であるのが
好ましいが、但し、エストラジオールの濃度は検量体の
いずれのものとも同一ではない。例えば、150、500及び
1125pg/mlのエストラジオール濃度を有する対照が表１
の検量体に対する好適な対照であろう。当業者は他の検
量体及び対照の処方を案出し得るであろう。
手順全体を通して無菌状態を維持するためには、溶
媒、抗生物質及び毒薬とすることができる少量の抗菌剤
を系に添加するのが望ましい。
下記の実施例は本発明を例示するに過ぎず、請求の範
囲に定義される本発明の範囲を限定するものではない。
当業者には、本発明の思想を応用し得る使用についての
多くの他の装置及び方法を考え得ることが理解されよ
う。
実施例１ 下記の検定法はIMx（登録商標）機器によりIMx（登録
商標）使い捨て式カートリッジ（いずれもAbbott Labor
atories,イリノイ州，から販売されており、EP−Ａ−28
8 793及びFioreら,Clin.Chem.34/9:1726−1732,1988に
記載されており、どちらも参考文献として本明細書に組
み込まれている）で行われた。75μｌの血清試料を、35
μｌの５α−ジヒドロテストステロン緩衝液［DHT緩衝
液:0.5mMのグリシン及び0.25mMのクエン酸緩衝液（pH4.
5）1ml当たり２μｇの５α−ジヒドロテストステロン及
び0.75％（w/v）のサポニン］、実施例２におけるよう
に製造された50μｌのウサギの抗エストラジオール抗体
被覆微粒子、並びに90μｌのIMx（登録商標）緩衝液（A
bbott Laboratories,ILから市販）と混合した。混合物
を約27.5分37℃でインキュベートした。175μｌの混合
物をIMx（登録商標）使い捨て式カートリッジの繊維マ
トリックス（該繊維マトリックスは吸収パッドと液体連
結している）に移した。粒子を繊維マトリックスで捕獲
し、溶液を吸収パッドで吸収した。次いで粒子をIMx
（登録商標）緩衝液で洗浄した。60μｌの抱合体をマト
リックスに加え、12秒間インキュベートし、次いでマト
リックスをIMx（登録商標）緩衝液で再度洗浄した。0.1
Mの２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール緩衝液
（pH9）中の1.2mMの４−メチルウンベリフェリルホスフ
ェート溶液65μｌをマトリックスに加え、４−メチルウ
ンベリフェロン形成率を蛍光反射率により測定した。光
源として水銀アーク灯を用いるフルオロメーターで蛍光
を測定した（Fiore,M.ら,Clin.Chem.,34/9:1726−1732,
1988に記載。その内容は本明細書に引用して組み込まれ
ている）。表１の検量体を用いて、IMx（登録商標）機
器でのこの検定法は、13.9±4.3pg/mlという平均感度を
有することが観察された。
実施例２ 下記のようにして抗エストラジオール被覆微粒子を製
造した。
ａ）フロイントの完全アジュバント中のウシ血清アルブ
ミン（Sigma Chemical Company,ミズーリ州から販売さ
れている）にカップリングされたエストラジオール６
（Ｏ−カルボキシメチル）オキシムをウサギに注射し、
フロイントの不完全アジュバントを追加投与して、ウサ
ギの抗エストラジオール多クローン性抗体を製造した。
ｂ）35％硫酸アンモニウムを用いた抗体沈降用の標準手
順に従って多クローン性抗体をウサギの血清から単離し
た。
ｃ）１％固体（w/v）の最終反応濃度を得るに充分なラ
テックス微粒子（インディアナ州のSeradyneから販売さ
れている）を測定して、pH4−５の50mMの２−［Ｎ−モ
ルホリノ］エタンスルホン酸（MES）緩衝液と混合し
て、段階（ｂ）からの抗体を加えて0.9mg/mlの濃度に
し、次いで、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプ
ロピル）カルボジイミド（EDAC）を加えて0.5mg/mlの濃
度にした。混合物を30分間インキュベートし、次いで0.
1％（w/v）のTween 20及び0.1Mの塩化ナトリウムを含む
0.1MのTris緩衝液（pH7.4）中に希釈した。粒子を濾過
し、約９μg/ml抗体に再懸濁した。該抗体は、0.1Mの塩
化ナトリウム、13.6％（w/v）のスクロース及び0.2mg/m
lの正常なウサギIgGを含む0.1Mのビス［２−ヒドロキシ
エチル］イミノトリス［ヒドロキシメチル］メタン（Bi
s−Tris）（pH6.5）で約0.01％の固体としてある。
実施例３ 下記のようにして、エストロン６（Ｏ−カルボキシメ
チル）オキシムアルカリ性ホスファターゼ抱合体を製造
した。
a.10μｇのエストロン６（Ｏ−カルボキシメチル）オキ
シム（Sigma Chemical Company,ミズーリ州から市販）
及び10μｇのＮ−ヒドロキシスクシンイミドを100μｌ
のジメチルホルムアミド（無水物）中に溶解した。40μ
ｇのEDACを添加した。
b.段階ａの混合物のアリコートを炭酸塩緩衝液（pH8）
中のアルカリ性ホスファターゼに添加して、エストロン
とホスファターゼの比率を10:1にした。得られた抱合体
をG25 Sephadexカラム上で精製し、精製された抱合体
を、0.5Mの塩化ナトリウム、１％（w/v）のカゼイン、1
mMの塩化マグネシウム及び0.1mMの塩化亜鉛を含む0.1M
Bis−Tris緩衝液（pH6.5）中に約１−10μg/mlの濃度に
希釈した。
実施例４ 表１にリストした検量体を下記のように製造した。
ａ）6Nの水酸化ナトリウムを用いて血清のpHをpH11に上
げ、混合物を約18時間２〜８℃で放置して、ステロイド
をストリップ（除去）した血清を製造した。次いでpHを
約7.4〜８に調整した。血清１リットル当たり50gの活性
炭を加え、混合物を２時間室温で撹拌した。次いで活性
炭をステロイド除去血清から濾去した。
ｂ）次いで表１にリストした各検量体の最終濃度にする
に充分なエストラジオールをステロイド除去血清のアリ
コートに添加した。同様な方法で対照を調製した。
実施例５ SHBGに結合したエストラジオールを５α−ジヒドロテ
ストステロン（DHT）による置換の有効性を示すため
に、エストラジオールを正常なヒト血清試料中にスパイ
クし、次いで試料を実施例１に記載の方法に従って検定
した。エストラジオールレベルが300pg/ml増大するよう
に、正常なヒト血清試料にエストラジオールを添加し
た。スパイクした試料を検定する前に、各試料のアリコ
ートをpH5.7及びpH7.5の５α−ジヒドロテストステロン
で処理した。表２に、試験した試料の代表的なサンプリ
ングをリストする。回復％を下記のように計算した。
スパイク値は、試料がエストラジオールでスパイクさ
れた後に試料中で測定されたエストラジオール濃度であ
る。初期値は、試料がエストラジオールでスパイクされ
る前に試料中で測定されたエストラジオール濃度であ
る。
実施例６ 実施例１に記載の検定法を用いて交差反応性の研究を
行った。実施例４におけるように調製したステロイド除
去血清に、潜在的交差反応性ステロイドを加えて試料を
検定した。表３に、試験したステロイド、試験した最高
濃度及び観察された交差反応性％をリストする。
実施例７ 実施例１の検定法及びCoat−Ａ−Count Estradiol検
定法（Diagnostic Products Corporationから販売され
ている）を用いて、434個の個別の血清試料を検定し、
各方法により測定されたエストラジオールレベルを表４
に示すように相関連させた。
本発明はさらに、流体試料中のエストラジオールの測
定用キットをも包含する。該キットはエストラジオール
に特異的な抗体にカップリングされた固相；式： （式中、Ｑは標識である）の抱合体を含む。Ｑが酵素で
あり、さらに酵素基質がキットに含まれているのが好ま
しい。キットは、約１μg/ml〜約５μg/mlの範囲内の濃
度の５α−ジヒドロテストステロンを含む試料前処理用
溶液をさらに含んでいることができる。
記載した実施態様及び提示されている他の実施態様は
実施例であり、限定する意図はない。従って、本発明に
ついての記載は、本発明を開示されている特定の実施態
様に限定するのではなく、均等物並びに上記及び下記の
請求の範囲に記載のような本発明の精神及び範囲内の対
象物全てを包含することを意図している。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ガーナー，ウイリアム・ダーウイン アメリカ合衆国、イリノイ・60614、シ カゴ、ウエスト・デイバージー・852 (72)発明者 マツシイ，マイケル・キール アメリカ合衆国、イリノイ・60046、レ イク・ビラ、パーク・レーン・イース ト・406 (72)発明者 ネツクローズ，エリザベス・クリスチー ヌ アメリカ合衆国、イリノイ・60030、グ レイスレイク、チエロキー・トレイル・ 24323 (72)発明者 オシクウイツク，ユージン・ウオルター アメリカ合衆国、イリノイ・60047、レ イク・チユーリツク、ウエスト・メリー デイル・24107 (72)発明者 ラム，サリー・ケイ アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガ ーニー、パイン・グローブ・462 (72)発明者 トラツク，ポーラ アメリカ合衆国、イリノイ・60031、ガ ーニー フインチ・コート・433、アパ ートメント・ナンバー・７ (56)参考文献 特開 昭64−12267（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−143268（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−111798（ＪＰ，Ａ) 米国特許4477577（ＵＳ，Ａ) Ｂ．Ｐｅｌｃ ａｎｄ Ａ．Ｌ．Ｈｏ ｌｍｅｓ，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ 125Ｉ −Ｉｏｄｉｎａｔｅｄ ｔｒａｃｅｒｓ ｆｏｒ ｒａｎｄｉｏｉｍｍｕｎｏａ ｓｓａｙ ｏｆ ｅｓｔｒｏｎｅ，Ｊ. ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｐ ｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，1982年６ 月29日，16／６，731−735 Ｂｅｒｎａｒｄ Ｄｅｓｆｏｓｓｅｓ ｅｔ ａｌ， ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏ ｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒａｔ ａｌｐｈ ａｌ ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｅｒｉｖ ａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｅｓｔｒｏｎｅ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈ ｅ， Ｊ． ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃ ｈｅｍ， 1983年12月27日， 19／６, 1811−1816 Ｍ．−Ｃ． Ｍａｕｒｅｌ ｅｔ ａ ｌ， Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔ ｉｖｅ ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａ ｔｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓ ｓａｙ ｆｏｒ ｏｅｓｔｒａｄｉｏｌ −17β， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍ ｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄ ｓ， 1987年９月24日， 102， 165− 172 Ｈａｎｓ−Ｇｅｒｈａｒｄ Ｌｏｆｆ ｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｈｉｂｉｔ ｉｏｎ ｏｆ Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓ ｅ ｆｒｏｍ Ｈｏｇ Ｋｉｄｎｅｙ ｂｙ ２−ｅｔｈｏｘｙ−１−（ｅｔｈ ｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−１，２−ｄ ｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ， Ｂ ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙ ｌｅｒ， 1987年６月23日， 368／５, 481−485 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ａ）エストラジオールを含む疑いのある流
    体試料、エストラジオール特異結合性要素及びエストロ
    ンの６位に標識が結合したエストロン標識抱合体の混合
    物をインキュベートし、エストラジオール／エストラジ
    オール特異結合性要素複合体及びエストロン標識抱合体
    ／エストラジオール特異結合性要素複合体を形成する段
    階； ｂ）前記複合体を前記混合物から分離する段階； ｃ）前記混合物又は前記複合体中に存在する標識の量を
    測定する段階；及び ｄ）標識の量から、前記試料中のエストラジオールの量
    を決定する段階 を含む流体試料中のエストラジオールの量を決定する方
    法。
  2. 【請求項２】前記試料及び前記特異結合性要素を、前記
    抱合体の添加前にインキュベートする請求項１に記載の
    方法。
  3. 【請求項３】前記特異結合性要素が固相にカップリング
    されている請求項１に記載の方法。
  4. 【請求項４】前記固相が、粒子、微粒子、フィルム、繊
    維、チューブ又はウエルである請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】前記特異結合性要素が第１の高分子イオン
    化合物に結合しており、該第１の高分子イオン化合物は
    固相に結合している第２の高分子イオン化合物に結合す
    る請求項１に記載の方法。
  6. 【請求項６】前記第１の高分子イオン化合物が、ポリア
    スパラギン酸、ヘパリン、カルボキシメチルアミロー
    ス、ポリグルタミン酸又はポリアクリル酸である請求項
    ５に記載の方法。
  7. 【請求項７】前記第２の高分子イオン化合物が、高分子
    第四級アンモニウム化合物、ジエチルアミノエチル−デ
    キストラン又はジメチルジアリルアンモニウムクロリド
    重合体である請求項５に記載の方法。
  8. 【請求項８】前記固相が多孔質マトリックスである請求
    項５に記載の方法。
  9. 【請求項９】前記特異結合性要素が単クローン性又は多
    クローン性抗体である請求項１に記載の方法。
  10. 【請求項１０】前記標識が酵素である請求項１に記載の
    方法。
  11. 【請求項１１】前記酵素がペルオキシダーゼ又はホスフ
    ァターゼである請求項10に記載の方法。
  12. 【請求項１２】インキュベーションの前に前記試料に５
    α−ジヒドロテストステロンを添加することをさらに含
    む請求項１に記載の方法。
  13. 【請求項１３】前記方法が30分以内で行われる請求項１
    に記載の方法。
  14. 【請求項１４】ａ）エストラジオールを含む疑いのある
    血液試料、エストラジオールに特異的な抗体にカップリ
    ングされた固相及び式： 【化１】 （式中、Ｑは酵素である）の抱合体の混合物をインキュ
    ベートして、前記固相上で、エストラジオール／抗体複
    合体及び抱合体／抗体複合体を形成する段階； ｂ）前記混合物から前記固相を分離する段階； ｃ）前記混合物又は前記固相に存在する標識の量を測定
    する段階； ｄ）該標識の量から、前記試料中のエストラジオールの
    量を決定する段階 を含む血液試料中のエストラジオールの量を決定する方
    法。
  15. 【請求項１５】前記固相が微粒子であり、前記分離段階
    が混合物を多孔質マトリックスに通過させることを含む
    請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】エストラジオールに特異的な抗体にカッ
    プリングされた固相； 式： 【化２】 （式中、Ｑは酵素である）の抱合体；及び 酵素基質 を含むエストラジオールコンペティティブ酵素イムノア
    ッセイの実施用キット。
  17. 【請求項１７】前記酵素がペルオキシダーゼ又はホスフ
    ァターゼである請求項16に記載のキット。
  18. 【請求項１８】約１μg/ml〜約５μg/mlの範囲内の濃度
    の５α−ジヒドロテストステロンを含む試料前処理用溶
    液をさらに含む請求項16に記載のキット。
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Families Citing this family (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02213766A (ja) * 1989-02-15 1990-08-24 Mochida Pharmaceut Co Ltd 免疫測定用試薬および免疫測定器具
WO1996017252A1 (en) * 1994-11-28 1996-06-06 Abbott Laboratories Stabilized aqueous steroid immunoassay standards
US5663054A (en) * 1995-03-03 1997-09-02 Abbott Laboratories Determination of steroids by competitive immunoassay
US5977319A (en) * 1996-10-21 1999-11-02 Cambridge Antibody Technology Limited Specific binding members for estradiol; materials and methods
US7745142B2 (en) 1997-09-15 2010-06-29 Molecular Devices Corporation Molecular modification assays
JP4228095B2 (ja) * 1999-12-17 2009-02-25 東ソー株式会社 免疫測定方法および免疫測定試薬
US6509462B2 (en) * 2000-07-18 2003-01-21 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Estradiol derivative and immunoassy using the same
US7410807B2 (en) * 2000-07-24 2008-08-12 D Aurora Vito J Pregnancy and sex identification test based on saliva or other bodily fluids
GB0029729D0 (en) 2000-12-06 2001-01-17 Ids Ltd Method for detection of vitamin D metabolites
AU2003211337A1 (en) * 2002-03-01 2003-09-16 Japan Envirochemicals, Ltd. Proteins capable of binding to female sex hormones and process for producing the same
US20070259376A1 (en) * 2005-12-22 2007-11-08 Toru Yoshimura Homocysteine immunoassay
JP6221466B2 (ja) * 2013-07-29 2017-11-01 東ソー株式会社 ハプテンの測定方法
JP6222295B2 (ja) * 2016-06-23 2017-11-01 東ソー株式会社 ハプテン標準液およびそれを含むハプテン定量試薬
SG11201911598WA (en) 2017-06-05 2020-01-30 ObsEva SA Gonadotropin-releasing hormone antagonist dosing regimens for the treatment of endometriosis
CN107607702A (zh) * 2017-07-21 2018-01-19 上海科华生物工程股份有限公司 甾醇类半抗原‑碱性磷酸酶交联物的制备方法及其应用
CN108982835A (zh) * 2018-05-31 2018-12-11 湖南远璟生物技术有限公司 一种雌二醇磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法
CN109030811A (zh) * 2018-05-31 2018-12-18 湖南远璟生物技术有限公司 一种睾酮酶结合物的制备方法
CN110579615A (zh) * 2019-09-06 2019-12-17 广州科方生物技术股份有限公司 一种通用于血清中类固醇激素的释放剂及其制备方法
CN112394182A (zh) * 2020-10-29 2021-02-23 深圳市辰纳生物科技有限公司 一种雌二醇释放试剂及其检测试剂盒

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4097586A (en) * 1970-06-11 1978-06-27 Biological Developments, Inc. Immunochemical assay method
DD220201A3 (de) * 1976-06-18 1985-03-20 Berlin Chemie Veb Verfahren zur vorbereitung loesungsmittelhaltiger extrakte zur analytischen bestimmung
US4275149A (en) * 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4477577A (en) * 1980-03-17 1984-10-16 University Of Southern California Non-contaminating direct serum assay of steroid hormones
US4962192A (en) * 1986-07-17 1990-10-09 Board Of Governors Of Wayne State University Chemiluminescent 1,2-dioxetane compounds
US4857652A (en) * 1986-07-17 1989-08-15 Board Of Governors Of Wayne State University Chemiluminescent 1,2-dioxetane compounds
US4931223A (en) * 1986-07-24 1990-06-05 Tropix, Inc. Methods of using chemiluminescent 1,2-dioxetanes
US4978614A (en) * 1988-10-26 1990-12-18 Tropix, Inc. Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
US4931569A (en) * 1988-09-14 1990-06-05 Tropix, Inc. Purification of stable water-soluble dioxetanes
JPH02213766A (ja) * 1989-02-15 1990-08-24 Mochida Pharmaceut Co Ltd 免疫測定用試薬および免疫測定器具

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Ｂ．Ｐｅｌｃ ａｎｄ Ａ．Ｌ．Ｈｏｌｍｅｓ，Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ １２５Ｉ−Ｉｏｄｉｎａｔｅｄ ｔｒａｃｅｒｓ ｆｏｒ ｒａｎｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｏｆ ｅｓｔｒｏｎｅ，Ｊ．ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，１９８２年６月２９日，１６／６，７３１−７３５
Ｂｅｒｎａｒｄ Ｄｅｓｆｏｓｓｅｓ ｅｔ ａｌ， ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒａｔ ａｌｐｈａｌ ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ ｏｆ ｅｓｔｒｏｎｅ ｉｎ ｒｅｌａｔｉｏｎ ｔｏ ｔｈｅ， Ｊ． ｓｔｅｒｏｉｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ， １９８３年１２月２７日， １９／６， １８１１−１８１６
Ｈａｎｓ−Ｇｅｒｈａｒｄ Ｌｏｆｆｌｅｒ ｅｔ ａｌ， Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ Ａｍｉｎｏａｃｙｌａｓｅ ｆｒｏｍ Ｈｏｇ Ｋｉｄｎｅｙ ｂｙ ２−ｅｔｈｏｘｙ−１−（ｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ）−１，２−ｄｉｈｙｄｒｏｑｕｉｎｏｌｉｎｅ， Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ， １９８７年６月２３日， ３６８／５， ４８１−４８５
Ｍ．−Ｃ． Ｍａｕｒｅｌ ｅｔ ａｌ， Ａ ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ ｐｌａｔｅ ｅｎｚｙｍｅ ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ ｆｏｒ ｏｅｓｔｒａｄｉｏｌ−１７β， Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ， １９８７年９月２４日， １０２， １６５−１７２

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