ES2229605T3 - Metodo mejorado para determinar la cantidad de estradiol en una muestra liquida y kit para este efecto. - Google Patents
Metodo mejorado para determinar la cantidad de estradiol en una muestra liquida y kit para este efecto.Info
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Abstract
Se describe un procedimiento mejorado para determinar la cantidad de estradiol en una muestra líquida y un conjunto respectivo para ello. En particular, la invención describe las condiciones específicas de pretratamiento que mejoran la precisión de los ensayos de estradiol llevados a cabo en muestras líquidas. De manera similar, se describen disoluciones de pretratamiento apropiadas que se incorporan en un conjunto de ensayo mejorado.
Description
Método mejorado para determinar la cantidad de
estradiol en una muestra líquida y kit para este efecto.
El estradiol
[1,3,5(10)-Estratrien-3,17a-diol]
es secretado por el ovario y la placenta. Se sintetiza por la
aromatización de andrógenos en las células de la teca y de la
granulosa del ovario y placenta. La aromatización es estimulada
mediante la folitropina (FHS). A su vez, la síntesis del estradiol
estimula la producción de receptores de lutropina (LH), necesarios
para la síntesis de precursores de andrógenos.
El estradiol es importante para la diferenciación
sexual femenina durante la gestación, el desarrollo sexual en el
comienzo de la pubertad, y la regulación del ciclo menstrual. El
ciclo menstrual es el resultado de una coordinación precisa de las
características funcionales del Sistema Nervioso Central, el
hipotálamo, la pituitaria, el ovario, y el endometrio, los cuales
regulan la liberación cíclica de la Hormona Liberadora de
Gonadotropinas (GnRH), la LH y la FSH, y los esteroides ováricos
(Estradiol y Progesterona). El estradiol está implicado en la
estimulación e inhibición de la liberación de las gonadotropinas,
ejerciendo una retroalimentación positiva y una negativa.
Tempranamente en la fase folicular, es modesta la secreción ovárica
del estradiol a partir de las células de la teca y de la granulosa.
Durante la fase folicular, el estradiol estimula el crecimiento
endometrial (reparando el endometrio después de la menstruación).
Hacia mitad del ciclo, aumenta la producción de LH y produce la
liberación del óvulo mediante la ruptura del folículo desarrollado.
Después de la ovulación, disminuye un poco la secreción de
estradiol. Durante la fase luteínica, el estradiol junto con
progesterona son secretados por el cuerpo lúteo, estimulando además
el crecimiento endometrial. Si el óvulo no está fertilizado, hay
una caída adicional de estradiol y progesterona. Esta caída de
estradiol y progesterona inicia la menstruación.
La medición de estradiol es importante para la
evaluación del desarrollo sexual normal (menarquía), el motivo de la
infertilidad (anovulación, amenorrea, dismenorrea), y la
menopausia. Los niveles normales de estradiol son ínfimos en la
menstruación y durante la fase folicular temprana
(25-75 pg/ml). Los niveles aumentan en la fase
folicular tardía hasta un valor máximo de 200-600
pg/ml, justo antes de que la oleada de LH inicie la ovulación. A
medida que la LH alcanza su valor máximo, el estradiol empieza a
disminuir antes de subir nuevamente durante la fase luteínica
(100-300 pg/ml). Si no tiene lugar la concepción,
el estradiol cae además a sus niveles ínfimos, iniciándose de ese
modo la menstruación. Si ocurre la concepción, los niveles de
estradiol continúan aumentando, alcanzado niveles de
1-5 ng/ml durante el primer trimestre,
5-15 ng/ml durante el segundo trimestre, y
10-40 ng/ml durante el tercer trimestre. Durante la
menopausia, los niveles de estradiol permanecen bajos.
Hay varios métodos para medir los niveles de
estradiol en suero. Sin embargo, cada uno de estos métodos utiliza
elementos radiactivos como marcadores, y adolecen de varias
desventajas. Los métodos requieren varias etapas diferentes,
incluyendo etapas manuales, recipientes diversos, y son no
automatizados o solamente semiautomatizados. Los radiomarcadores
son problemáticos porque los gastos involucrados en tales ensayos
son mucho mayores que en los formatos de ensayo no radiomarcados.
Por ejemplo, se requiere personal de laboratorio más altamente
especializado, y la evacuación de desechos está más estrechamente
controlada y regulada. Los siguientes son métodos de
radioinmunoensayo disponibles comercialmente para determinar el
nivel de estradiol en muestras de suero.
Un ensayo para estradiol (disponible
comercialmente por Pantex) es un ensayo competitivo directo sin
extracción. El trazador de estradiol radiomarcado, el anticuerpo
anti-estradiol y la muestra son mezclados e
incubados durante dos horas. Se añade anticuerpo
anti-anticuerpo y se incuba la mezcla durante 15
minutos para formar un precipitado. Se centrifuga la mezcla para
sedimentar el precipitado formado. Se decanta el sobrenadante y se
mide la radiactividad del precipitante. La radiactividad medida se
compara con un gráfico de radiactividad frente a concentración de
estradiol, para determinar la concentración de estradiol en la
muestra. Los compuestos siguientes son conocidos por reaccionar
cruzadamente en el ensayo: \alpha-Estradiol (1'4%)
y Danazol (0'6%).
Otro ensayo para estradiol
[Coat-A-Count Radioimmunoassay (RIA)
para Estradiol, disponible comercialmente por Diagnostic Products
Corporation] es un ensayo competitivo directo en tubo recubierto
con anticuerpo, sin extracción. Cada tubo se recubre con anticuerpo
anti-estradiol. El trazador de estradiol
radiomarcado y la muestra son incubados en el tubo durante tres (3)
horas. Después de decantar la mezcla y lavar el tubo, se mide la
radiactividad del tubo. La radiactividad medida se compara con un
gráfico de radiactividad frente a concentración de estradiol, para
determinar la concentración de estradiol en la muestra. Los
compuestos siguientes son conocidos por reaccionar cruzadamente en
el ensayo: Etinil Estradiol (1'8%), Estrona (1'1%),
Estradiol-3\beta-D-glucurónido
(0'7%), Estradiol-3-Sulfato (0'3%),
y 19-Nortestosterona (0'25%).
Todavía otro ensayo para estradiol (Estradiol
MAIA, disponible comercialmente por Serono) es también un ensayo
competitivo directo sin extracción. El trazador de estradiol
radiomarcado, el anticuerpo anti-estradiol y la
muestra son incubados durante una a tres horas (dependiendo de la
sensibilidad del ensayo y precisión deseados) para permitir la
formación de complejos de anticuerpo-estradiol. Los
complejos son separados de la muestra mediante incubación de la
mezcla de reacción con partículas magnéticas recubiertas con
anticuerpo anti-anticuerpo, seguido por
sedimentación de las partículas magnéticas mediante la aplicación de
un campo magnético. Luego, se lavan las partículas separadas. El
nivel de radiactividad medido de las partículas se compara con un
gráfico de radiactividad frente a concentración de estradiol, para
determinar la concentración de estradiol en la muestra. Los
compuestos siguientes son conocidos por reaccionar cruzadamente en
el ensayo: Estrona (2'6%), Estradiol-Dipropionato
(0'3%),
Estradiol-3\beta-D-glucurónido
(0'2%), y Estriol (0'2%).
Se ha informado de algunos inmunoensayos no
radiomarcados, pero no tienen la sensibilidad o especificidad
necesaria para medir exacta y precisamente los niveles de
estradiol. Dawson y col., (Steroids, 31: 357-366,
1978) ensayaron anticuerpos policlonales
anti-estradiol de conejo utilizando peroxidasa de
rábano picante acoplada a estrona en el carbono 11. Las
reactividades cruzadas de los anticuerpos por la estrona oscilaron
desde el 5% al 120%. Tales reactividades no serían aceptables en un
ensayo específico para estradiol. De este modo, un inmunoensayo
enzimático que utilice un conjugado donde la enzima esté acoplada
en la posición 11 de la estrona no produciría, probablemente, un
ensayo satisfactorio.
Pandey y col. (Clinica Chimica Acta, 190:
175-184, 1990) informaron de un ensayo
inmunoabsorbente por unión enzimática (ELISA) utilizando el
conjugado
estradiol-6-(O-carboximetil)oxima,
unido a penicilinasa, con pocillos de una placa de microtitulación
recubiertos con anticuerpo anti-estradiol. El ensayo
tuvo un límite de sensibilidad inferior de 25 pg/ml, pero necesitó
unas dos (2) horas de incubación de la mezcla de reacción a 37ºC y,
después de lavar, la reacción sustrato enzimático/enzima necesitó
incubación a 37ºC durante una (1) hora. De este modo, el tiempo
total del ensayo fue superior a tres (3) horas. Maurel y col. (J.
Immunolog. Methods, 102: 165-172, 1987) también
informaron de un ELISA utilizando una
estradiol-6-(O-carboximetil)oxima
conjugada a \beta-galactosidasa, el cual había
mejorado la sensibilidad sobre el ensayo de Pandey y col. Sin
embargo, como en el método de Pandey y col., el método de Maurel y
col. necesita extensos tiempos de incubación. El anticuerpo
anti-estradiol recubierto en pocillos de
microtitulación es incubado con la muestra durante noventa (90)
minutos a 37ºC, incubado luego con conjugado durante noventa (90)
minutos y, después de lavar, se determinó la actividad enzimática
después de dos (2) horas a 42ºC. Así, el tiempo del ensayo fue bien
superior a tres (3) horas.
De Boever y col. (Clin. Chem., 32:
1.895-1.900, 1986) informaron de un inmunoensayo de
quimioluminiscencia para estradiol, con un límite de sensibilidad
de aproximadamente 49 pg/ml y un tiempo de ensayo superior a
noventa (90) minutos. Roda y col. (Anal. Biochem., 156:
267-273, 1986) informaron de un inmunoensayo
enzimático luminiscente para estradiol, que necesitaba por encima
de cuatro (4) horas para realizarse.
De Lauzon y col. (J. Immunoassay, 10:
339-357, 1989) informaron de un inmunoensayo
enzimático competitivo para estradiol, utilizando pocillos de una
placa de microtitulación recubiertos con estradiol acoplado con
albúmina de suero bovino (BSA). La muestra y anticuerpo
anti-estradiol marcado con peroxidasa fueron
incubados en los pocillos durante dos (2) horas a temperatura
ambiente. Alternativamente, se utilizaron anticuerpos
anti-estradiol biotinilados seguido por una segunda
incubación de tres (3) horas con avidina acoplada a peroxidasa.
Claramente, existe la necesidad de un
inmunoensayo sin radiomarcador para estradiol que sea rápido,
exacto, sensible, fácil de realizar, libre de interferencias y
relativamente insensible a variables experimentales tales como el
pH y la temperatura. Un objeto de la presente invención es
desarrollar un método de ensayo y reactivos para realizar
mediciones de estradiol, exactamente y con precisión, sin la
necesidad de un trazador radiomarcado. Debido a las muy bajas
concentraciones de estradiol presentes en muestras de fluidos
biológicos (0'025-40 ng/ml), cualquier método
alternativo tiene que ser muy sensible. Los métodos existentes
utilizan tiempos de incubación largos para superar este requisito de
sensibilidad. Otro objeto de esta invención es eliminar los largos
tiempos de incubación necesarios en los inmunoensayos no
radiomarcados.
La presente invención tiene que ver con la
medición de estradiol utilizando métodos de inmunoensayo enzimático
competitivo que implican el empleo de estrona conjugada a un
marcador en la posición 6. Los inventores descubrieron
inesperadamente que la estrona y sus derivados, conjugados a un
marcador en la posición 6, pueden ser utilizados junto con
anticuerpos específicos para estradiol para determinar los niveles
de estradiol en muestras de fluidos. La presente invención también
utiliza 5\alpha-dihidrotestosterona para
intensificar la ejecución del ensayo.
La presente invención se refiere a métodos y
reactivos útiles en la medición de estradiol en muestras de fluidos.
Los inventores descubrieron inesperadamente que la estrona y sus
derivados, conjugados a un marcador, pueden ser utilizados junto
con miembros de unión específica a estradiol para medir los niveles
de estradiol en muestras de fluidos tales como sangre, plasma,
sangre íntegra, fluido cerebroespinal, saliva, orina, y otros. La
presente invención implica únicamente la medición de
concentraciones de estradiol en muestras de fluidos utilizando
tales conjugados de estrona y marcador. Además, el estradiol es
conocido por unirse a la Globulina de Unión a la Hormona Sexual
(SHBG) (Philip y col., Steroids, 47: 373-379,
1986), que está presente en muestras de fluidos tales como suero,
plasma, sangre íntegra y otros. Para medir el estradiol total en
una muestra conteniendo SHBG, se tiene que liberar el estradiol
unido a la SHBG. Los inventores descubrieron que el empleo de una
solución tamponada de 5\alpha-dihidrotestosterona
liberará sustancialmente todo el estradiol unido a la SHBG.
La testosterona (Philip y col., J. Steroid
Biochem., 32: 865-872, 1989) y sus derivados son
conocidos por desplazar al estradiol de la SHBG a pH 8'0 (De Boever
y col. (Clin. Chem., 32: 1.895-1.900, 1986). Como De
Boever y col. informaron y los inventores observaron, no todo el
estradiol es desplazado sustancialmente de la SHBG a pH
7'5-8'0 por la
5\alpha-dihidrotestosterona. Sustancialmente,
todo el estradiol es desplazado de la SHBG por la
5\alpha-dihidrotestosterona a una concentración
dentro del intervalo de aproximadamente 1 \mug/ml a unos 5
\mug/ml, preferentemente dentro del intervalo de aproximadamente
1 \mug/ml a unos 3 \mug/ml, muy preferentemente a una
concentración de unos 2 \mug/ml, a un pH dentro del intervalo de
aproximadamente 4'5 hasta aproximadamente 6'7, preferentemente
dentro del intervalo de aproximadamente 5'0 hasta aproximadamente
6'0, muy preferentemente a un pH de aproximadamente 5'7.
Preferentemente, el tampón es una combinación de glicina a una
concentración dentro del intervalo de aproximadamente 0'25M hasta
aproximadamente 1M, más preferentemente dentro del intervalo de
aproximadamente 0'4M hasta aproximadamente 0'6M, y ácido cítrico a
una concentración dentro del intervalo de aproximadamente 0'2M
hasta aproximadamente 0'5M, más preferentemente dentro del
intervalo de aproximadamente 0'2M hasta aproximadamente 0'3M, aunque
son aceptables otros tampones o combinaciones de tampones que sean
capaces de tamponar una solución dentro del anterior intervalo
eficaz de reacción. El tampón también contiene, preferentemente,
saponina a una concentración de al menos un 0'5% (p/v), más
preferentemente dentro del intervalo de aproximadamente el 0'5%
(p/v) hasta aproximadamente el 1'25% (p/v), y muy preferentemente a
una concentración de aproximadamente el 0'75% (p/v). La presencia
de glóbulos rojos en una muestra de suero tendía a originar que los
niveles medidos de estradiol fuesen elevados. La adición de
saponina redujo sustancialmente el efecto de los glóbulos rojos.
Los miembros de unión específica, específicos
para estradiol, incluyen proteínas de unión específica para
estradiol, tales como anticuerpos monoclonales y policlonales, y
otras proteínas sintéticas o recombinantes específicas para
estradiol que se unan específicamente a partículas de colesterol
lipoproteico. Por ejemplo, es conocido por aquellos especializados
en la técnica que se pueden producir anticuerpos monoclonales y
policlonales que se unan específicamente a esteroides tales como el
estradiol. Cuando un inmunógeno constando de estradiol o de un
derivado de estradiol, acoplados típicamente mediante un enlace
covalente a una proteína soporte tal como albúmina y otras, es
inyectado dentro de un animal, el sistema inmune del animal
producirá anticuerpos policlonales que se unen específicamente al
estradiol. Por aquellos especializados en la técnica se conocen
métodos generales para la preparación de anticuerpos monoclonales
para analitos, utilizando ratones o ratas. Más recientemente, se ha
informado de la preparación de proteínas sintéticas y recombinantes
específicas para el analito, y los mismos métodos pueden ser
fácilmente adaptados para la preparación de proteínas sintéticas y
recombinantes de unión específica a estradiol, útiles en esta
invención.
Los inventores descubrieron que un compuesto,
estrona, el cual tiene una reactividad cruzada reportada muy baja
(inferior al 5% y, en algunos casos, inferior al 1% de reactividad
cruzada) con anticuerpo específico para estradiol, actúa
sorprendentemente como un excepcional reactivo marcado para detectar
niveles de estradiol sumamente bajos en un formato de ensayo muy
rápido. El término "conjugado", como se utiliza aquí, se
refiere a cualquier sustancia constando de estrona o de un derivado
de estrona acoplados a un marcador. El acoplamiento es
preferentemente covalente. Un conjugado preferido para su uso en
esta invención consta de
en donde Q es un
marcador.
El término "marcador", como se utiliza aquí,
se refiere a cualquier sustancia que se pueda unir a la estrona o a
sus derivados y que sea capaz de producir una señal que sea
detectable por medios visuales o instrumentales. Los diversos
marcadores apropiados para su uso en la presente invención pueden
incluir catalizadores, enzimas, liposomas u otras vesículas
conteniendo sustancias productoras de señales tales como cromógenos,
catalizadores, compuestos fluorescentes, compuestos
quimioluminiscentes, enzimas y sustratos enzimáticos, y otros. En
la Patente U.S. Nº 4.275.149, incorporada en esto como referencia,
se revelan un gran número de enzimas apropiadas para su uso como
marcadores. Tales enzimas incluyen glucosidasas, galactosidasas,
fosfatasas y peroxidasas, tales como fosfatasa alcalina y peroxidasa
de rábano picante, las cuales son utilizadas junto con sustratos
enzimáticos, tales como fluoresceína di(galactopiranósido),
azul de nitro-tetrazolio,
3,5',5,5'-tetranitrobencidina,
4-metoxi-I-naftol,
4-cloro-I-naftol,
4-metilumbeliferilfosfato,
5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato,
sustratos enzimáticos quimioluminiscentes tales como los dioxetanos
descritos en WO 88100694 y EP
0-254-051-A2 y
derivados y análogos de los mismos. Preferentemente, el marcador es
una enzima y, muy preferentemente, la enzima es la fosfatasa
alcalina.
El conjugado se prepara, preferentemente,
acoplando el marcador al precursor del conjugado (el cual está
disponible comercialmente por Sigma Chemical Company)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
utilizando un compuesto
carbodiimida, tal como
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida,
o formando primero un éster activo, tal como un éster activo de
N-hidroxisuccinimida, y haciendo reaccionar después
el éster activo con el marcador. Para prepara el conjugado también
se pueden utilizar otros métodos y condiciones de acoplamiento
conocidos por aquellos especializados en la
técnica.
Preferentemente, el estradiol se mide, según la
invención, utilizando una fase sólida que tiene un miembro de unión
específica, específico para estradiol, unido a ella. La fase sólida
y la muestra son separadas para que se pueda determinar la cantidad
de conjugado de estrona y enzima unido a la fase sólida, o la
cantidad de conjugado de estrona y enzima que queda en solución. La
cantidad de conjugado de estrona y enzima en la fase sólida o en
solución puede ser correlacionada con la concentración de estradiol
en la muestra utilizando una gráfica de actividad enzimática frente
a concentración de estradiol, mencionada típicamente como curva
patrón. Se prepara una curva patrón realizando el ensayo utilizando
calibradores tales como los descritos en la Tabla 1 (abajo). Se
utilizan controles para verificar que la curva es viable. Cuando se
ensaya una muestra con un nivel de estradiol desconocido, la señal
medida del ensayo se compara con la curva patrón, y el nivel de
estradiol correspondiente a esa señal es el nivel de estradiol de
la muestra.
El miembro de unión específica puede ser unido a
la fase sólida por medios físicos o químicos, preferentemente por
medio de un enlace covalente directo. El miembro de unión
específica debería ser unido a la fase sólida de manera tal que
sustancialmente no se separasen ninguno de los miembros de unión
específica durante las posteriores reacciones y etapas de lavado.
Con respecto al miembro de unión específica y al método de
acoplamiento seleccionados, el miembro de unión específica tiene
que ser capaz de unirse al estradiol y al conjugado de estrona y
enzima después de ser acoplado a la fase sólida.
Según la presente invención, una fase sólida
puede ser una mezcla de micropartículas polímeras con miembros de
unión específica, unidos química o físicamente, específicos para el
estradiol. Las micropartículas que se pueden utilizar incluyen
partículas de poliestireno, poliestireno carboxilado,
polimetilacrilato o similares, con un radio oscilando desde
aproximadamente 0'1 \mum hasta aproximadamente 0'25 pulgadas. Un
método de separación preferido para estas partículas es el empleo
de captura de micropartículas en una matriz porosa tal como fibra
de vidrio (ver abajo).
Otras fases sólidas que se pueden utilizar
incluyen una mezcla de micropartículas polímeras magnetizables con
miembros de unión específica, unidos química o físicamente,
específicos para estradiol. Las micropartículas magnetizables que
se pueden utilizar tienen, preferentemente, núcleos de óxido
férrico u óxido de cromo y un recubrimiento de poliestireno,
poliestireno carboxilado o polimetilacrilato. Son conocidos aún
otros soportes sólidos por aquellos en la técnica, e incluyen las
paredes de pocillos de una bandeja de reacción, tubos, cuentas de
poliestireno, tiras de nitrocelulosa, membranas y otros. Como
material de la fase sólida se pueden utilizar materiales naturales,
sintéticos, o de existencia natural que sean modificados
sintéticamente, incluyendo polisacáridos, por ejemplo, materiales de
celulosa tales como papel y derivados de celulosa tales como
acetato de celulosa y nitrocelulosa; sílice; materiales inorgánicos
tales como alúmina desactivada, tierra de diatomeas, SO_{4}Mg, u
otro material inorgánico finamente dividido y dispersado
uniformemente en una matriz de polímero porosa, con polímeros tales
como cloruro de vinilo, copolímero de cloruro de
vinilo-propileno, y copolímero de cloruro de
vinilo-acetato de vinilo; tela de existencia natural
(por ejemplo, algodón) y sintética (por ejemplo, nylon), geles
porosos tales como gel de sílice, agarosa, dextrano, y gelatina;
películas polímeras tales como poliacrilamida; y otros. En
cualquier caso, el material de la fase sólida debería tener una
resistencia razonable, o se puede proporcionar la resistencia por
medio de un soporte, y no debería interferir con la producción de
una señal detectable.
Un método de separación alternativo preferido
está descrito en las Solicitudes de Patente U.S. copendientes
N^{os} de Serie 150.278 y 375.029, ambas cuales disfrutan de
propiedad común y ambas cuales están incorporadas aquí como
referencia. Estas solicitudes describen el empleo de separación por
captura iónica, en la que los miembros de unión específica
utilizados en el ensayo en cuestión están unidos químicamente a un
primer compuesto poliiónico y una matriz porosa teniendo unido a
ella un segundo compuesto poliiónico que se une al primer compuesto
poliiónico. Se forma un par de unión específica y se separa de la
mezcla de reacción por interacción electrostática entre el primer y
segundo compuestos poliiónicos. Un miembro de unión específica del
par de unión específica está preferentemente acoplado,
covalentemente, al primer compuesto poliiónico.
Preferentemente, el primer compuesto poliiónico
es un ácido polianiónico, tal como ácido poliaspártico, heparina,
carboximetilamilosa, ácido poliglutámico o ácido poliacrílico, y el
segundo compuesto poliiónico es un polímero catiónico tal como
GafQuattm, que es un compuesto de amonio cuaternario polímero (GAF
Corporation, Wayne, NJ, 07470),
dietilaminoetil-dextrano (Sigma Chemical Company,
St. Louis, MO), derivados de celulosa hidrosolubles tales como
Celquat™ L-200 y Celquat™ H-100
(National Starch & Chemical Corporation, Bridgewater, NJ,
08807), que ambos son compuestos cuaternarios polímeros, o Merquat®
100 (disponible comercialmente por Calgon Corporation). La matriz
porosa se trata con el polímero catiónico para hacer la matriz
cargada positivamente. El polímero catiónico se une a la matriz por
absorción, adsorción, o acoplamiento covalente o iónico. La
separación de los productos de reacción se lleva a cabo por
interacción electrostática entre la almohadilla cargada
positivamente y el complejo polianiónico cargado negativamente.
Una matriz porosa para su uso en esta invención
puede incluir cualquier material poroso apropiado. Mediante
"poroso" se quiere decir que el material es uno a través del
cual puedan fluir líquidos y puedan pasar fácilmente. En la presente
invención, la matriz puede incluir una almohadilla de
polipropileno, polietileno, teflón, fibra de vidrio, celulosa, o
nylon, u otro material poroso bien conocido por aquellos
especializados en la técnica, para su uso en un dispositivo de
ensayo para vertido y flujo a través, teniendo una o más capas
conteniendo uno o más de los reactivos del ensayo.
Los materiales porosos preferidos incluyen un
material de fibra de vidrio poroso, tal como un papel de filtro
"Whatman 934-AH", que tiene un espesor nominal
de 0'33 mm, o los dispositivos TestPack™ (matriz de fibra) y de
cartucho desechable IMx® de Abbott Laboratories (Abbott Park, IL,
60064). No es crítico el espesor de tal material, y será un asunto
de elección basado, en gran parte, en las propiedades de la muestra
o el analito a ensayar, tales como la fluidez de la muestra de
ensayo.
Algunos sustratos enzimáticos se transforman en
compuestos fluorescentes, tal como la
4-metilumbeliferona, mediante la enzima adecuada. La
cantidad o velocidad a la que se forman los compuestos
fluorescentes con el tiempo es una indicación de la cantidad de
enzima presente en la reacción. Cuando la enzima es un marcador, la
cantidad de enzima presente está relacionada con la cantidad de
estradiol presente en la muestra. De este modo, la medición de la
fluorescencia puede ser relacionada con la cantidad de estradiol
presente en la muestra. La fluorescencia se puede medir mediante
cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, es conveniente
un espectrómetro de fluorescencia, aunque el espectro de
fluorescencia se puede observar con un espectrómetro visual o
fotografiar con un espectrógrafo de alto poder fotocaptador.
En una forma de realización preferida, la
fluorescencia se detecta utilizando un analizador de sobremesa
automatizado IMx® (Abbott Laboratories, Inc.) que contiene un
montaje óptico que es un fluorómetro que utiliza una lámpara de arco
de mercurio como fuente de luz. Este instrumento está descrito por
Fiore y col. (Clin. Chem., 34/9: 1.726-1.732,
1988), el contenido del cual está incorporado aquí como referencia.
El instrumento utiliza un cartucho desechable IMx® (disponible
comercialmente por Abbott Laboratories, IL) que contiene una matriz
porosa para capturar micropartículas conteniendo anticuerpos
anti-estradiol, las cuales han sido expuestas a un
conjugado y a la muestra. El marcador utilizado para el conjugado
es, preferentemente, fosfatasa alcalina. El conjugado y el
estradiol en la muestra compiten por los sitios de unión
disponibles en las micropartículas. Las micropartículas son
separadas de la muestra y se determina la cantidad de conjugado
presente en las micropartículas a partir de la velocidad a la que
el 4-metilumbeliferilfosfato se transforma en
4-metilumbeliferona. A partir de una curva patrón de
velocidad de formación de 4-metilumbeliferona
frente a la concentración de estradiol, se puede determinar la
cantidad de estradiol en la muestra.
La curva patrón, conocida también como curva de
calibración, de la velocidad de formación de
4-metilumbeliferona frente a la concentración de
estradiol se prepara generalmente a partir de soluciones de
calibradores conteniendo concentraciones conocidas de estradiol.
Preferentemente, se utilizan seis calibradores para obtener una
curva de calibración, aunque se pueden utilizar más o menos
calibradores dependiendo de la exactitud y precisión del resultado
deseado. Preferentemente, los calibradores contienen cantidades
crecientes de estradiol. Por ejemplo, la Tabla 1 ilustra la
composición de un conjunto de calibradores (ver el Ejemplo 4).
Generalmente se utilizan controles junto con un ensayo para
confirmar la viabilidad de una curva de calibración o los reactivos
del ensayo. Preferentemente, la formulación de los controles es la
misma que la de los calibradores, con la excepción de que la
concentración de estradiol puede no ser idéntica con alguna de los
calibradores. Por ejemplo, los controles teniendo una concentración
de estradiol de 150, 500 y 1.125 pg/ml serían unos controles
apropiados para los calibradores de la Tabla 1. Un especializado en
la técnica sería capaz de idear otras formulaciones de calibradores
y de control.
| Calibrador | Concentración de estradiol (pg/ml) |
| F | 3.000 |
| E | 1.500 |
| D | 750 |
| C | 250 |
| B | 50 |
| A | 0 |
Para mantener condiciones asépticas por todo el
procedimiento, puede ser conveniente añadir al sistema una pequeña
cantidad de agente antimicrobiano, el cual puede incluir
disolventes, antibióticos y venenos.
Los ejemplos siguientes son ilustrativos de la
invención y no son de ningún modo para ser interpretados como
limitantes del campo de aplicación de la invención, como se define
en las reivindicaciones. Se comprenderá que un especializado en la
técnica pueda concebir muchos otros dispositivos y métodos de empleo
a los que se puedan aplicar los conceptos inventivos presentes.
El formato de ensayo siguiente fue realizado en
un cartucho desechable IMx®, mediante un instrumento IMx® (ambos
disponibles comercialmente por Abbott Laboratories, IL, y descritos
en EP-A-288 793 y en Fiore y col.,
Clin. Chem., 34/9: 1.726-1.732, 1988, ambos cuales
están incorporados aquí como referencia). Se mezclaron setenta y
cinco microlitros (75 \mul) de una muestra de suero con 35 \mul
de tampón de 5\alpha-dihidrotestosterona (Tampón
DHT: 2 \mug de 5\alpha-dihidrotestosterona y
saponina al 0'75% (p/v) por mililitro de tampón de glicina 0'5mM y
0'25mM de citrato a pH 4'5), 50 \mul de micropartículas
recubiertas con anticuerpo anti-estradiol de conejo,
como se preparan como en el Ejemplo 2, y 90 \mul de Tampón IMx®
(disponible comercialmente por Abbott Laboratories, IL). La mezcla
fue incubada durante unos 27'5 minutos a 37ºC. Se transfirieron
ciento setenta y cinco microlitros (175 \mul) de la mezcla a la
matriz de fibra de un cartucho desechable IMx® (la matriz de fibra
está en comunicación líquida con una almohadilla absorbente). Las
partículas fueron capturadas por la matriz de fibra y la solución
fue absorbida por la almohadilla absorbente. Entonces, se lavaron
las partículas con Tampón IMx®. Se añadió sesenta microlitros (60
\mul) de conjugado a la matriz, se incubó durante 12 segundos, y
se lavó luego la matriz nuevamente con Tampón IMx®. A la matriz se
añadió sesenta y cinco microlitros (65 \mul) de una solución
1'2mM de 4-metilumbeliferilfosfato en tampón de
2-amino-2-metil-1-propanol
0'1M a pH 9, y se midió la velocidad de formación de
4-metilumbeliferona mediante reflectancia de la
fluorescencia. La fluorescencia fue medida con un fluorómetro que
utiliza una lámpara de arco de mercurio como fuente de luz (como se
describió por Fiore, M. y col., Clin. Chem., 34/9:
1.726-1.732, 1988, el contenido de los cuales están
incorporados aquí mediante referencia). Utilizando los calibradores
de la Tabla 1, se observó que este formato de ensayo en el
instrumento IMx® tiene una sensibilidad media de 13'9 \pm 4'3
pg/ml.
Se prepararon micropartículas recubiertas con
anti-estradiol como sigue:
a. Se prepararon anticuerpos policlonales de
conejo anti-estradiol inyectando a conejos con
estradiol-6-(O-carboximetil)oxima
acoplada a albúmina de suero bovino (disponible comercialmente por
Sigma Chemical Company, MO) en adyuvante completo de Freund, y
estimulando con adyuvante incompleto de Freund.
b. Los anticuerpos policlonales fueron aislados
del suero de conejo siguiendo procedimientos estándar para
precipitación de anticuerpos con sulfato amónico al 35%.
c. Se miden suficientes micropartículas de látex
(disponibles comercialmente por Seradyne, IN) para producir una
concentración final de la reacción del 1% (p/v) de sólidos. Se
mezclaron con tampón de ácido
2-[N-morfolino]etanosulfónico (MES) 50mM a
pH 4-5, se añadió anticuerpo de la etapa b hasta una
concentración de 0'9 mg/ml, y luego se añadió
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDAC) hasta una concentración de 0'5 mg/ml. La mezcla fue incubada
durante 30 minutos y diluida luego en tampón Tris 0'1M a pH 7'4,
conteniendo 0'1% (p/v) de Tween 20 y cloruro sódico 0'1M. Las
partículas fueron filtradas y resuspendidas hasta aproximadamente 9
\mug/ml de anticuerpo, lo cual es aproximadamente el 0'01% en
sólidos, con
bis[2-hidroxietil]imino-tris[hidroximetil]metano
0'1M (Bis-Tris) a pH 6'5, conteniendo cloruro
sódico 0'1M, 13'6% (p/v) de sacarosa, y 0'2 mg/ml de IgG de conejo
normal.
Se preparó conjugado de
estrona-6-(O-carboximetil)oxima
y fosfatasa alcalina como sigue:
a. Se disolvieron diez microgramos (10 \mug) de
estrona-6-(O-carboximetil)oxima
(disponible comercialmente por Sigma Chemical Company, MO) y 10
\mug de N-hidroxisuccinimida en 100 \mul de
dimetilformamida (anhidra). Se añadió cuarenta microgramos (40
\mug) de EDAC.
b. Se añadió una alícuota de la mezcla de la
etapa a a fosfatasa alcalina en tampón de carbonato a pH 8, para que
la relación de estrona a fosfatasa sea 10:1. El conjugado
resultante fue purificado en una columna Sephadex G25, y el
conjugado purificado fue diluido hasta una concentración de
aproximadamente 1-10 \mug/ml en tampón
Bis-Tris 0'1M, a pH 6'5, conteniendo cloruro sódico
0'5M, 1% (p/v) de caseína, cloruro magnésico 1mM y cloruro de zinc
0'1mM.
Se prepararon los calibradores listados en la
Tabla 1 como sigue:
a. Se preparó suero depurado de esteroides
elevando el pH del suero a pH 11 con hidróxido sódico 6N, y se dejó
la mezcla estar durante unas 18 horas a 2-8ºC. El
pH fue ajustado luego hasta un pH de aproximadamente
7'4-8. Se añadió cincuenta gramos (50 g) de carbón
vegetal activado por litro de suero, y se agitó la mezcla durante 2
horas a temperatura ambiente. Después, el carbón vegetal fue
separado por filtración del suero depurado de esteroides.
b. Luego se añadió bastante estradiol a alícuotas
de suero depurado de esteroides, para fabricar la concentración
final de cada calibrador listado en la Tabla 1. Los controles se
preparan de la misma manera.
Para demostrar la eficacia de desplazar el
estradiol unido a SHBG con
5\alpha-dihidrotestosterona (DHT), se añadió una
cantidad conocida de estradiol en muestras de suero humano normal,
y luego se ensayaron las muestras según el formato descrito en el
Ejemplo 1 de esto. Se añadió estradiol a muestras de suero humano
normal para que aumentase el nivel de estradiol en 300 pg/ml. Antes
de ensayar las muestras reforzadas, se trató una alícuota de cada
muestra con 5\alpha-dihidrotestosterona a pH 5'7 y
a pH 7'5. La Tabla 2 lista un muestreo representativo de las
muestras ensayadas. El % de recuperación se calculó como sigue:
Porcentaje de
recuperación = \frac{Valor \ reforzado - Valor \ nascente}{300} x
100
El Valor reforzado es la concentración de
estradiol medida en la muestra después de que la muestra sea
reforzada con estradiol. El Valor nascente es la concentración de
estradiol medida en la muestra antes de que la muestra sea
reforzada con estradiol.
Se realizaron estudios de reactividad cruzada
utilizando el formato de ensayo descrito en el Ejemplo 1 de esto. A
suero depurado de esteroides, preparado como en el Ejemplo 4 de
esto, se añadieron esteroides reaccionantes potenciales
cruzadamente, y se ensayaron las muestras. La Tabla 3 lista los
esteroides ensayados, la concentración máxima ensayada y el
porcentaje de reactividad cruzada observado.
Utilizando el formato de ensayo del Ejemplo 1 de
esto, y el ensayo Coat-A-Count
Estradiol (disponible comercialmente por Diagnostic Products
Corporation), se ensayaron 434 muestras de suero individuales para
estradiol y, como se muestra en la Tabla 4, se correlacionaron los
niveles de estradiol medidos por cada método.
La invención también abarca juegos para la
determinación de estradiol en una muestra de fluido. Los juegos
constan de una fase sólida acoplada a un anticuerpo específico para
estradiol, un conjugado de la fórmula
en donde Q es un marcador.
Preferentemente, Q es una enzima y el juego incluiría adicionalmente
un sustrato enzimático. Los juegos también pueden incluir una
solución de pretratamiento de la muestra, constando de
5\alpha-dihidrotestosterona a una concentración
dentro del intervalo de aproximadamente 1 \mug/ml hasta
aproximadamente 5
\mug/ml.
Las formas de realización descritas y las formas
de realización alternativas presentadas son pretendidas como
ejemplos antes que como limitaciones. De este modo, la descripción
de la invención no pretende limitar la invención a las formas de
realización concretas reveladas, solamente pretende abarcar todas
las equivalentes y la materia asunto dentro del espíritu y ámbito
de aplicación de la invención como se describió arriba, y como se
expone en las reivindicaciones siguientes.
Claims (5)
1. Un método para determinar la cantidad de
estradiol en una muestra de fluido, comprendiendo las etapas
siguientes:
a. pretratar la muestra incubando la muestra,
sospechosa de contener estradiol, con
5\alpha-dihidrotestosterona a una concentración
dentro del intervalo de aproximadamente 1 \mug/ml hasta
aproximadamente 5 \mug/ml, en un tampón a un pH dentro del
intervalo desde aproximadamente 4'5 hasta aproximadamente 6'7; y
b. medir la cantidad de estradiol en la
mezcla.
2. El método de la Reivindicación 1, en donde
dicho tampón es una combinación de glicina y ácido cítrico.
3. Un juego para determinar la cantidad de
estradiol en una muestra de fluido, comprendiendo una solución de
pretratamiento de la muestra constando de
5\alpha-dihidrotestosterona a una concentración
dentro del intervalo de aproximadamente 1 \mug/ml hasta
aproximadamente 5 \mug/ml.
4. Un juego según la Reivindicación 3, constado
además de un tampón a un pH dentro del intervalo de pH 4'5 a
6'7.
5. Un juego según la Reivindicación 4, en donde
dicho tampón es una combinación de glicina y ácido cítrico.
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| CA2204027C (en) * | 1994-11-28 | 2006-03-14 | Gregg T. Williams | Stabilized aqueous steroid immunoassay standards |
| US5663054A (en) * | 1995-03-03 | 1997-09-02 | Abbott Laboratories | Determination of steroids by competitive immunoassay |
| US5977319A (en) * | 1996-10-21 | 1999-11-02 | Cambridge Antibody Technology Limited | Specific binding members for estradiol; materials and methods |
| US7745142B2 (en) | 1997-09-15 | 2010-06-29 | Molecular Devices Corporation | Molecular modification assays |
| JP4228095B2 (ja) * | 1999-12-17 | 2009-02-25 | 東ソー株式会社 | 免疫測定方法および免疫測定試薬 |
| US6509462B2 (en) * | 2000-07-18 | 2003-01-21 | Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. | Estradiol derivative and immunoassy using the same |
| US7410807B2 (en) * | 2000-07-24 | 2008-08-12 | D Aurora Vito J | Pregnancy and sex identification test based on saliva or other bodily fluids |
| GB0029729D0 (en) * | 2000-12-06 | 2001-01-17 | Ids Ltd | Method for detection of vitamin D metabolites |
| WO2003074704A1 (fr) * | 2002-03-01 | 2003-09-12 | Japan Envirochemicals, Ltd. | Proteines capables de se lier aux hormones sexuelles feminines et procede de preparation |
| US20070259376A1 (en) * | 2005-12-22 | 2007-11-08 | Toru Yoshimura | Homocysteine immunoassay |
| JP6221466B2 (ja) * | 2013-07-29 | 2017-11-01 | 東ソー株式会社 | ハプテンの測定方法 |
| JP6222295B2 (ja) * | 2016-06-23 | 2017-11-01 | 東ソー株式会社 | ハプテン標準液およびそれを含むハプテン定量試薬 |
| SG11201911598WA (en) | 2017-06-05 | 2020-01-30 | ObsEva SA | Gonadotropin-releasing hormone antagonist dosing regimens for the treatment of endometriosis |
| CN107607702A (zh) * | 2017-07-21 | 2018-01-19 | 上海科华生物工程股份有限公司 | 甾醇类半抗原‑碱性磷酸酶交联物的制备方法及其应用 |
| CN108982835A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-12-11 | 湖南远璟生物技术有限公司 | 一种雌二醇磁微粒化学发光免疫定量检测试剂盒及其制备方法 |
| CN109030811A (zh) * | 2018-05-31 | 2018-12-18 | 湖南远璟生物技术有限公司 | 一种睾酮酶结合物的制备方法 |
| CN110579615A (zh) * | 2019-09-06 | 2019-12-17 | 广州科方生物技术股份有限公司 | 一种通用于血清中类固醇激素的释放剂及其制备方法 |
| CN112394182A (zh) * | 2020-10-29 | 2021-02-23 | 深圳市辰纳生物科技有限公司 | 一种雌二醇释放试剂及其检测试剂盒 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4097586A (en) * | 1970-06-11 | 1978-06-27 | Biological Developments, Inc. | Immunochemical assay method |
| DD220201A3 (de) * | 1976-06-18 | 1985-03-20 | Berlin Chemie Veb | Verfahren zur vorbereitung loesungsmittelhaltiger extrakte zur analytischen bestimmung |
| US4275149A (en) * | 1978-11-24 | 1981-06-23 | Syva Company | Macromolecular environment control in specific receptor assays |
| US4477577A (en) * | 1980-03-17 | 1984-10-16 | University Of Southern California | Non-contaminating direct serum assay of steroid hormones |
| US4962192A (en) * | 1986-07-17 | 1990-10-09 | Board Of Governors Of Wayne State University | Chemiluminescent 1,2-dioxetane compounds |
| US4857652A (en) * | 1986-07-17 | 1989-08-15 | Board Of Governors Of Wayne State University | Chemiluminescent 1,2-dioxetane compounds |
| US4978614A (en) * | 1988-10-26 | 1990-12-18 | Tropix, Inc. | Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes |
| US4931223A (en) * | 1986-07-24 | 1990-06-05 | Tropix, Inc. | Methods of using chemiluminescent 1,2-dioxetanes |
| US4931569A (en) * | 1988-09-14 | 1990-06-05 | Tropix, Inc. | Purification of stable water-soluble dioxetanes |
| JPH02213766A (ja) * | 1989-02-15 | 1990-08-24 | Mochida Pharmaceut Co Ltd | 免疫測定用試薬および免疫測定器具 |
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