JP3451311B2 - 染色体組込み用ｄｎａ断片、ベクター及びそれらを用いた染色体への遺伝子導入方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、原核生物又は真核生物
の染色体への効率的な遺伝子組込み方法及び組込み用ベ
クターに関する。

【０００２】

【従来の技術】微生物プロセスを産業に利用することは
環境問題が深刻になっている現在非常に重要になってい
る。微生物は多様な物質変換を行うが、特定の環境のな
かで特定の変換しかできない。従って、産業的にこの微
生物機能を役立てるには、目的に合うように、改良しな
ければならない。

【０００３】バクテリアに異種遺伝子を導入し、遺伝子
組換えを行う場合、プラスミド、ファージなどの染色体
外ＤＮＡを組み換える方法と、染色体ＤＮＡを組み換え
る方法がある。前者の方が組み換えが容易で、所定の構
造をもって入れられるが、実用的には組み換え体の安定
性が高い、後者の方法が有利とされる。それは前者では
プラスミド、ファージの脱落が容易に起こり、組み換え
体の長期間の維持が困難だからである。

【０００４】一方、染色体ＤＮＡへの組み換えには、染
色体ＤＮＡの断片を、導入したい遺伝子の片側あるいは
両側に付加して、染色体ＤＮＡに組み入れる相同的組み
換えの方法が良く知られているが、組み換えの効率が低
いことが問題であった。近年、トランスポゾンベクター
を使う方法が普及し始めている。これはトランスポゾン
Ｔｎ５やＴｎ１０を利用してプラスミド上の所定配列を
染色体ＤＮＡへ転移させるものであり、従来は、専ら、
特定遺伝子の破壊を目的とする変異導入に用いられてい
た。トランスポゾンの場合には染色体ＤＮＡを必要とし
ないので染色体ＤＮＡを用意する必要はない。しかし、
導入した遺伝子を高レベルで発現するには、従来と同じ
く、莫大な時間と手数を必要とした。それは一つ一つの
細胞クロ−ンの発現レベルを検定するか、または先ず宿
主の染色体ＤＮＡから高発現プロモーターを探し出し、
そのプロモーターの下流に導入目的の遺伝子の構造領域
を配してそのハイブリッド遺伝子を導入するか、の操作
が必要だったからである。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は従来のこのよ
うな煩雑な操作を省いて、単純に高レベル発現の組み換
え体を得る方法を提供することを目的とする。

【０００６】高発現細胞作出の典型的なプロセスは、 １）組み換え目的の細胞から高発現プロモーターを探索
しクローニングする、 ２）そのプロモーターを用いて導入目的遺伝子の発現プ
ラスミドを構築する、及び ３）そのプラスミドによる遺伝子組換えよりなる。

【０００７】１）のプロセスでは通常、プロモーター部
分を欠いた抗生物質耐性遺伝子の入った、いわゆるプロ
モーター探索型ベクターを目的の細胞に導入し、高濃度
の抗生物質を用いて細胞を選抜することによって組み換
え細胞を得た後、プロモーター部分をＰＣＲでクローニ
ングして解析する。

【０００８】２）ではそのプロモーター配列に基づき、
高発現プロモーターと導入目的遺伝子構造部とを連結し
て抗生物質耐性遺伝子とともに導入する。

【０００９】３）ではトランスポゾンまたは相同的遺伝
子組換えを用いて、染色体ＤＮＡに組み入れる。

【００１０】これらのプロセスを忠実に一歩一歩進めれ
ば、目的を達成できる。そこでこれと同等のことを如何
にして効率よく行うかが課題となる。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明は、高発現プロモ
ーターの検索と発現目的遺伝子の導入という二度の組み
換えプロセスを一度で行おうとするものである。即ち、
本発明は、一度の遺伝子導入で確実に目的の組み換え体
が得られる方法を提供するものである。本発明によれ
ば、光合成微生物（ラン藻等）等の生育が極めて遅い微
生物であっても、組み換え体の作出の期間を短縮でき、
効率よく組み換え体を得ることができる。

【００１２】即ち、本発明の特徴は、選択マーカー遺伝
子の構造部と発現目的遺伝子の構造部を直列に配したＤ
ＮＡ断片及び該断片を組み込んだ染色体組込用ベクター
にあり、該ＤＮＡ断片又は該ベクターを用いることによ
って、染色体中に発現目的遺伝子が導入された高発現株
を、例えば、選択マーカーとして、薬剤耐性遺伝子を使
った場合には、薬剤の濃度を高めるなどして、選択条件
を高く設定することによって、自動的に選抜できる点に
ある。

【００１３】よって、本発明は、下記の発明を提供する
ものである。

【００１４】項１． 翻訳停止配列を配した下流に、リ
ボソーム結合配列を冠した遺伝子の構造部を２種以上直
列に配したＤＮＡ断片であって、該遺伝子のいずれかひ
とつが選択マーカー遺伝子であることを特徴とする、染
色体組込用ＤＮＡ断片。（他の遺伝子は、発現目的遺伝
子である。） 項２． 選択マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子である
ことを特徴とする項１に記載のＤＮＡ断片。

【００１５】項３． 項１又は２に記載のＤＮＡ断片を
組み込んだ染色体組込み用ベクター。

【００１６】項４． 該ベクターが相同的組み換え型ベ
クターである項３に記載のベクター。

【００１７】項５． 該ベクターがトランスポゾン型ベ
クターである項３に記載のベクター。

【００１８】項６． 原核生物又は真核生物の染色体中
に外来遺伝子を導入する方法において、項１又は２に記
載のＤＮＡ断片或いは項３〜５のいずれかに記載のベク
ターを用いて行う方法。

【００１９】項７． 項６に記載の方法によって得られ
る形質転換体。

【００２０】項８． 項７に記載の形質転換体を用いる
蛋白質の製造方法。

【００２１】このように、本発明の選択マーカー遺伝子
の構造部と発現目的遺伝子の構造部を含むＤＮＡ断片及
びベクターは、任意の異種遺伝子を、例えば、目的とす
る微生物細胞の染色体ＤＮＡに挿入して高生産株を効率
よく選抜することに有利である。そのようなＤＮＡ断片
及びベクターは、微生物を利用する発酵工業や精密化学
品、医薬品の製造業の微生物改良、あるいは廃水処理、
廃棄物処理に使う高性能工業微生物の開発に広く利用で
きる。

【００２２】例えば、でんぷん工場の廃水にはでんぷん
が多量に含まれこのまま環境中に放出すれば富栄養化の
原因になる。これを有用なサイクロデキストリンに変換
すれば廃水から有用な物質を得ることができ、且つ環境
負荷も低減できる。この変換にはシクロデキストリング
ルカノトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）なる酵素を用いれ
ばよく、Bacillus maceransから分泌される。従ってこ
の廃水を使いこの菌を培養すればサイクロデキストリン
に変換できることになるが、この廃水ではB.maceransは
生育しない。しかし、ラン藻ならば廃液中で生育する。
そこでＣＧＴ遺伝子をラン藻に導入してB. maceranns並
みの高発現株を作出すればよいことになる。本発明はこ
のような要請に応えることができる。

【００２３】

【発明の実施の形態】図１に本発明のＤＮＡ断片の基本
構造の一例を、及び図２に本発明の基本原理を示す。

【００２４】ＤＮＡ断片 本発明のＤＮＡ断片は、図１に示すごとく、基本的に
は、翻訳停止配列（Ａ）並びにその下流に、リボソーム
結合配列（Ｂ）及び薬剤耐性遺伝子等の選択マーカー遺
伝子の構造部（Ｃ）からなる選択マーカー領域に、リボ
ソーム結合配列（Ｂ）及び発現目的遺伝子の構造部
（Ｃ’）からなる発現目的遺伝子領域がタンデムに並ぶ
構造をとる。また、別の発現目的遺伝子領域を直列に並
べても良い。選択マーカー領域と発現目的遺伝子領域
は、その位置が入れ替わってもよい。

【００２５】なお、構造部とは、翻訳を受けて蛋白のア
ミノ酸配列を規定している遺伝子の部分、即ち、コード
領域と呼ぶ部分を意味するものである。

【００２６】翻訳停止配列 翻訳停止配列は、上流からの翻訳を終止させるための配
列で、例えばＴＡＧ ＡＴＧＡＣＴＡＡ のように下線の３通りの終止コドンが任意の１ヌクレオ
チドで繋がっていればよい。

【００２７】該配列は、染色体由来のプロモーターに制
御されている染色体ＤＮＡの構造遺伝子の翻訳を停止さ
せるために必要なものである（図２）。

【００２８】リボソーム結合配列 リボソーム結合配列（ＳＤ配列）は、遺伝子の構造部の
翻訳開始コドンから約１０塩基上流に位置する３〜９ｂ
ｐのＡとＧに富む配列である。大腸菌における典型的な
配列は ＧＧＡＧＧＡ であるが、プリンに富む配列であれば他でもかまわな
い。または、導入目的の微生物の遺伝子、特に発現の高
い遺伝子に使われているＳＤ配列をデータベースで調べ
てそれを採用するのがより好ましい。

【００２９】選択マーカー遺伝子 選択マーカー遺伝子は、それが発現した細胞だけを識別
できるような遺伝子で、例えば、薬剤耐性遺伝子、ＵＶ
耐性遺伝子、高温（低温）耐性遺伝子、高塩濃度耐性遺
伝子、栄養要求株におけるその補足の遺伝子等が挙げら
れる。

【００３０】薬剤耐性遺伝子としては、典型的にはクロ
ラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子
（ＣＡＴ遺伝子）、カナマイシン耐性遺伝子などの抗生
物質耐性遺伝子を使うことができる。抗生物質耐性遺伝
子が環境中に放出されると問題がある場合には、他の薬
剤耐性遺伝子、例えば水銀耐性遺伝子、砒素耐性遺伝
子、ホスフィノスリシン耐性遺伝子(bar)などを使うこ
とが出来る。

【００３１】発現目的遺伝子 発現目的遺伝子としては、例えば、酵素、医薬となりう
る蛋白質、具体的には、プロテアーゼ、キチナーゼなど
の酵素、インスリン、成長ホルモン、成長因子などの医
薬等の遺伝子が挙げられる。

【００３２】このような構造により、染色体ＤＮＡにあ
るプロモーターの制御下、染色体ＤＮＡの構造遺伝子の
中途に上記構造を有するＤＮＡ断片が挿入された場合
に、薬剤耐性遺伝子などの選択マーカー遺伝子と発現目
的遺伝子が同じプロモーター制御のもとで同時に発現す
るようになる（図２）。そして、選択圧、即ち、選択マ
ーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子の場合には、抗生物
質濃度を高めれば、自動的に高発現の組換え体が選抜さ
れる。種々の濃度レベルでこれを行えば、一回の遺伝子
導入によって、最も高発現の組み換え体が得られること
になる。ひとたびそのようなクローンが得られれば、組
換え体を維持するために抗生物質で選択圧をかける必要
はない。発現目的遺伝子の構造部を並べて複数の遺伝子
を同時に高発現させることもできる。

【００３３】本発明の外来遺伝子の染色体ＤＮＡへの導
入方法 １．まず、この基本構造を持つＤＮＡ断片を含むベクタ
ーを、目的とする細胞に導入し、染色体ＤＮＡに組み込
ませる。それには、従来からのいくつかの方法があり、
それを可能ならしめるベクターが用意されており、本発
明のＤＮＡ断片をそのようなベクターに挿入する必要が
ある。効率よく染色体ＤＮＡに組み込むには、相同的組
換え型（Homologous recombination)ベクターとトラン
スポゾン型ベクターがある。

【００３４】１）相同的組換え型 図３に発現目的遺伝子が一種の場合の構造を示す。全体
的には、上記の基本構造を有するＤＮＡ断片に、導入先
染色体ＤＮＡ断片（Ｖ）と、大腸菌内で増幅できるよう
なプラスミドレプリコン（例えばｐＵＣ１９、ｐＢＲ３
２２）が加わった構造になっている。本発明において
は、Ｖは種々のＤＮＡ断片Ｒが挿入されて、実際は混合
物、即ちゲノムライブラリーとなっている。このような
ゲノムライブラリーは、例えば、翻訳停止配列と選択マ
ーカー領域及び発現目的遺伝子領域を含むプラスミド
中、翻訳停止配列の上流に隣接してBamHIサイトを設
け、導入目的先の染色体ＤＮＡをSau3Aなどで切断し
て、得られた染色体ＤＮＡ断片Ｒを、BamHIサイトに挿
入して作る。大腸菌プラスミド部分にある抗生物質耐性
遺伝子は、選択マーカー領域の選択マーカー遺伝子と異
なる方がよい。

【００３５】このように作成されたベクター（図３）
は、上述したようにゲノムライブラリーとなっている
が、プロモーター部位が断片としてＤＮＡ断片の上流に
配置されるとは限らない。そこで先ず大腸菌に導入し
て、選択マーカーによる一次スクリーニングを行う。こ
れによりプロモーターが機能しているプラスミドだけが
選択される。

【００３６】次に、このプラスミド（混合物）を大腸菌
から抽出して、目的とする細胞に電気穿孔法などの方法
で導入する。多くの場合プラスミドはバクテリアのレプ
リコンを持たないので維持されない。選択マーカーに基
づく選択を行うと、ゲノムに転移した細胞のみが選択さ
れる。

【００３７】２）トランスポゾン型（１） 現在トランスポゾンベクターとして使われているのはTn
5とTn10トランスポゾンベクターである。野生型は10kb
近くあり、使い易いように必要最小部位をとって作成し
たものに、mini-Tn5とMini-Tn10がある（Methods in En
zymol., 235, 386 (1994))。トランスポゾンの両端末の
必要部位のみにサイズを縮小してあり、ゲノムに組み入
れたい遺伝子をこの端末の間に挿入する。この端末の外
側にトランスポゼースをコードした配列が配置されてお
り、トランスポゼースの働きにより転移が起こる。この
プロモ−ターは普段は発現しないように工夫されてい
る。例えばtacプロモーター（ptac）を使い、lacIリプ
レサー遺伝子（lacI^Q）を同じプラスミドにコードして
いる。これを利用して作成すると例えばmini-Tn10（M.H
errero, V. de Lorenzo and K. N. Timmis, J. Bacteri
ol., 172, 6557-6567 (1990)）では図４のような構造に
なる。即ち、ふたつのTn10の外側端末(70bp）の間に、
図１と同じくふたつ（またはそれ以上）のプロモーター
部位を欠く遺伝子（発現目的遺伝子領域）で一方が薬剤
耐性等の選択マーカーとなるもの（選択マーカー領域）
をタンデムに並べて挿入する。このような構造のベクタ
ーを接合法あるいは電気穿孔法で目的のバクテリアに導
入し、トランスポゼース遺伝子が発現するようにIPTG
（Isopropyl-β-D-thiogalactoside)を加えると、挿入
部分がゲノムに組み込まれる。

【００３８】３）トランスポゾン型（２） トランスポゼース遺伝子を導入する代わりにトランスポ
ゼースそのものを電気穿孔法やリポソーム法で導入する
ことができる。Tn5のトランスポゼースは市販されてお
り(Epicentre Technologies, USA)、Tn10トランスポゼ
ースはHowardら(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 464
8 (1992))の方法によって調製できる。ミニトランスポ
ゾンベクターはプラスミドとして構築するが、構造が
２）に比べ簡単になる。具体的には、トランスポゼース
遺伝子及びそのリプレッサー遺伝子が不要になるほか、
接合で導入する場合に必要な、複製ori、mobなどの遺伝
子が不要となり、通常使用されるベクターでよい。ま
た、断片の状態であってもよい。

【００３９】宿主細胞としては、１）〜３）のいずれの
場合であっても原核生物、真核生物いずれにも適用でき
る。具体的には、Psedomonas（シュードモナス）属、St
reptomyces（ストレプトミセス）属、Klebsiella（クレ
ブシエラ）属などの微生物、微細藻類、植物細胞、酵
母、動物細胞等を例示することができる。本発明は、特
に、微細藻類等の形質転換に時間を要する細胞に使用す
るのが有用である。

【００４０】２．次に、選択マーカー遺伝子による選択
を行う。選択圧、即ち、選択マーカー遺伝子が抗生物質
耐性遺伝子の場合には、抗生物質濃度、を高めて、高発
現の組換え体を選抜する。

【００４１】宿主と、選択マーカー等の好ましい組み合
わせとしては、一般的にはPsedomonas属、Streptomyces
属、Klebsiella属などの有用な微生物の場合には、クロ
ラムフェニコール耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子
が；微細藻類や植物などの光合成生物には、グルタミン
合成阻害するホスフィノスリシンに耐性を与えるbar遺
伝子が；酵母や動物細胞にはメトトレキセート耐性遺伝
子が、挙げられる。

【００４２】３．こうして得られた形質転換体から遺伝
子産物を細胞外に放出する方法は例えば、以下の通りで
ある。形質転換した細胞を集菌後、プロテアーゼ阻害剤
（フェニルメチルスルホニルフルオリドなど）を含有す
る液に菌を懸濁後、フレンチプレスで細胞を破壊する。
遠心後上清を採取、塩析し、遠心後沈殿を透析して粗蛋
白質を得ることができる。

【００４３】得られた粗蛋白質は、セファロースカラム
等で常法に従い、分離精製することができる。

【００４４】

【発明の効果】本発明の方法は、薬剤耐性等の選択マー
カー遺伝子と発現目的遺伝子の各構造部を複数個タンデ
ムに並べることにより、目的の遺伝子の高レベル発現を
単一工程で実現する遺伝子組換え法である。ここでは原
核生物を対象として、ベクターの構造を提示したが、真
核生物においてもこの原理は適用できる。イントロンの
割合が低い下等真核生物では上記の構造でよいが、イン
トロンの割合が多くなる場合には、その宿主に適用でき
るイントロン認識配列とリボソーム結合部位を翻訳停止
配列の直ぐ上流に配置させ、選択マーカーとなる薬剤耐
性遺伝子も宿主に適用可能な遺伝子を採用するのが好ま
しい。これには、水銀耐性、砒素耐性遺伝子、ホスフィ
ノスリシン耐性遺伝子などがある。翻訳停止配列は原核
生物と同様である。遺伝子導入法としては、植物では、
Ｔｉプラスミド法、パーティクルガン、動物では受精卵
にキャピラリーで導入する方法など、既知の方法を使え
ばよい。

【００４５】本発明はこのようにあらゆる生物細胞の遺
伝子組換えを効率よく行うことを可能にするもので、バ
イオテクノロジーのあらゆる分野に応用できる。特に既
存の微生物工業において微生物の改良に広く利用でき
る。従って、 アミノ酸発酵、核酸発酵 抗生物質、ビタミン、医薬品の生産 工業酵素の生産 廃水処理 などに使われる。将来的には更に、コモデティーケミカ
ルズ、パルプ、食飼料生産など用途が拡がるものと期待
される。

【００４６】

【実施例】以下、本発明の実施例を用いてさらに詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。

【００４７】実施例１ 相同的遺伝子組換えによるラン
藻シネコキスチス（Synechocystissp. PCC6803）のカロ
チン含量の増強 図５に示すようなプラスミド（シネコキスチスのゲノム
ライブラリーにもなっている）を作成し、これをシネコ
キスチスへ導入し、クロラムフェニコール耐性の株を選
別した。即ち、以下の手順でこれを行った。

【００４８】1) ＣＡＴタンデムベクターの構築 翻訳停止及びＳＤ配列の入った下のような２種類の配列
のオリゴヌクレオチドを合成した。 5'-TC GAC TAG ATG ACT AAA AAG GAA AAA CAT ATG CTG CA 3'- G ATC TAC TGA TTT TTC CTT TTT GTA TAC G これは、市販のプロモーター探索用Ｃａｔベクター（ク
ロラムフェニコール耐性遺伝子とアンピシリン耐性遺伝
子を含むpKK232-8、アマーシャムファルマシア）を利用
するために挿入用付着末端SalIとPstIテイルが両端に付
いており、また、発現目的遺伝子の構造部分を挿入する
ためのNdeIサイトがPstIに隣接して設けてある。この一
本鎖オリゴヌクレオチドを1mM含むＴＥ溶液（10mM Tris
-HCl,1mMEDTA）を10μlずつ混合し、１０分間６５℃で
インキュベートすることによってアニーリングさせて二
本鎖にした。

【００４９】次に、pKK232-8をSalIとPstIで切断精製し
て、上記オリゴヌクレオチドと１時間ライゲーション
（Ready-To-Go T4リガーゼ、アマーシャムファルマシ
ア）し、精製した（ジーンクリ−ン（Gene-Clean）、フ
ナコシ製）。これを２０μlの水に溶かし、その２μlを
大腸菌ＪＭ１０９へ電気穿孔法でトランスフォーメーシ
ョンした。こうして得たトランスフォーマントを培養
し、常法にしたがってプラスミド約１０μgを調製し、
このプラスミドをpTANDEMcatと命名した（図６）。

【００５０】2)フィトエン合成酵素遺伝子のクローニン
グとプラスミド構築 シネコキスチス(Synechocystis sp. PCC6803 パスツー
ル研究所カルチャーコレクション)培養液（ＯＤ₇₃₀〜
１）２０ｍｌから染色体ＤＮＡを市販のキット（Wizard
DNA精製キット、プロメガ）を用いて抽出、精製し
た。このＤＮＡをテンプレートとして以下に記載のプラ
イマーを用いてＰＣＲによりフィトエン合成酵素の構造
部分を増幅した（Premix Taq DNAポリメラーゼ、サワ
デイテクノロジー）。フィトエン合成酵素遺伝子pysは
遺伝研データバンクより(DDBJ、Accession No.X69172)
得た。 プライマーＰＳＹ−Ｆ: AAA AAA AAA CAT ATG GCT AAC
GGT CAA ATT TCT CCC CAG CGT GC プライマーＰＳＹ−Ｂ：AAA AAA CTG CAG TTA AAG CAC
CTG GGC CCG CAA CCA GGC CAC 但しＰＳＹ−Ｆと−Ｂの５’−端部分には、1)で構築し
たプラスミドpTANDEMcatに挿入できるように、それぞれ
NdeI、PstIのテイルが追加されている（下線）。５’側
のポリＡ配列は端の制限酵素配列を切断されやすくする
ためである。

【００５１】PCR産物をスピンカラムで精製し、次いでN
deIとPstIで切断、接着末端を作成した後、スピンカラ
ムで精製、約0.2μgを得た。一方pTANDEMCatプラスミド
をこの二つの制限酵素で同様に切断して精製し、0.1μg
を調製した。これらを常法にしたがって１６℃で終夜、
ライゲーション（Ready-To-Go T4リガーゼ、アマーシ
ャムファルマシア）を行い、精製（ジーンクリ−ン（Ge
ne-Clean）、フナコシ製）、後、大腸菌ＪＭ１０９へ電
気穿孔法でトランスフォーメーションした。アンピシリ
ン50μg/mlの寒天プレートに現れたコロニー６コをin
situ PCRで分析し、所定のクローンを選抜した。大腸
菌クロ−ンを２００mlスケールで培養し、プラスミドを
約50μg調製（QIAGENプラスミドキット、QIAGEN）し
た。このプラスミドをpTANDEMpsy-catと命名した。

【００５２】3)ゲノムライブラリーの作成 上記と同様にしてシネコキスチス（PCC6803）を培養し
て集菌し、市販のゲノムＤＮＡ精製キット（Wizardゲノ
ムＤＮＡ精製キット、プロメガ）を用いて染色体ＤＮＡ
を約１０μg調製した。次に、これをSau3Aで部分切断
（３７℃、１５分インキュベーション）し、精製して染
色体ＤＮＡ断片を得た。一方、pTANDEMpsy-catをBamHI
で切断し、精製した。両者を常法に従ってライゲーショ
ンに処した後、大腸菌JN109へ導入し、クロラムフェニ
コール２５μg/mLで選択した。現れたコロニーすべてを
混合してクロラムフェニコール２５μg/mL下で培養し、
プラスミド（図５）を分離精製（QIAGENプラスミドキッ
ト、QIAGEN）した。

【００５３】4)シネコキスチスの遺伝子組換え Synechocystis PCC6803への遺伝子導入は、Dzelzkalns
-Bogorad の(J. Bacteriol., 165, 964-971 (1986))紫
外線照射前処理による自然取り込み法で行った。対数増
殖期のシネコキスチス（OD₇₃₀＝０．８）10mlを直前に
弱いＵＶ（１５Ｗ、10cm離す）で20秒照射後、直ちに集
菌し、グリセロール１０％液で１回洗浄後、プラスミド
（図５）を１０μg/mLの濃度になるように混合し２時間
培地（Kratz & Myers 培地、Methods in Enzymol., 16
7, 81 (1988))でインキュベーションした。それを集菌
してKratz & Myers寒天培地２０mlのプレート４枚に蒔
いて、終日培養した。翌日その上層にクロラムフェニコ
ールが終濃度で５，１０，２０、３０μg/mLになるよう
にクロラムフェニコールの含まれる0.5%ソフトアガー４
mlを重層して2000Lx照明下で培養した。７−１０日後に
コロニーが見え始め、20μg/mLのプレートに出たコロニ
ー３コ（20-1、20-2、20-3クローンと命名）を液体培地
にそれぞれ植菌し、クロラムフェニコール 20μl/mlで
培養した。

【００５４】5)β−カロチンの分析 4)で得られた３つのシネコキスチスクローンを１週間培
養後各３０ml採取し、遠心、集菌した。−２０℃で冷や
した乳鉢で細胞を破砕し、6% KOHのメタノール溶液20ml
で６０℃で１時間攪拌した。その後、石油エーテル10ml
で２回抽出し、併せて蒸発濃縮した。それをアセトン5m
lに溶解しＨＰＬＣ（日立L-6200）で分析した。カラム
としてSpherisorp ODS-1（日立）を用い、溶媒はアセ
トニトリル・メタノール85/15(V/V)を用い、検出はUV-V
IS吸光計（日立L-4200H)を用いた。ピークの特定は市販
のβ−カロチン（和光）を一定量づつ加えることによっ
て行い、添加量とピーク高のグラフを作り、添加量ゼロ
へ内挿して定量した。

【００５５】表１にその結果を示す。含量は同量の細胞
を凍結乾燥して秤量することに求めた。また、遺伝子導
入していない野生株についても同様に測定した。

【００５６】

【表１】

【００５７】実施例２ アナベナによるサイクロデキス
トリングルカノトランスフェラーゼの生産 Bacillus macerans のサイクロデキストリングルカノ
トランスフェラーゼ（ＣＧＴ）遺伝子をＰＣＲでクロー
ニングした後、Cat遺伝子とタンデムにしてMini-Tn10ト
ランスポゾンベクターに挿入し、図７のようなＣＧＴ発
現ベクターを作製し、接合法により、ラン藻アナベナ
（Anabaena sp. PCC7120）へ導入した。即ち、以下の手
順で行った。

【００５８】1)Bacillus macerans CGT遺伝子のクロ
ーニング Bacillus macerans CGT遺伝子の配列データ（DDBJ Ac
cession）を用いて、該遺伝子の構造部分をＰＣＲでク
ローニングするためのプライマーを設計した。CGT-F：A
AA AAA AAC ATA TGA AAT CGC GGT ACA AAC GTT TGACCGT
-B: AAA AAA CTG CAG GCT TAA TTT TGC CAG TCC ACC G
TA CAC５’側にpTANDEMcatへの挿入のための付着末端テ
イルNdeI、PstIとポリAが付いている。

【００５９】Ｂ.macerans（IFO3490）を発酵研究所カル
チャーコレクションから入手し、培養後、常法に従って
染色体ＤＮＡを分離精製（Wizard DNA精製キット、バ
イオラッド）した。約10ngのDNAを鋳型として上記プラ
イマーを用いてＰＣＲ（Premix Taq DNAポリメラー
ゼ、サワデイテクノロジー）を行い、スピンカラムで精
製した。約１μgのPCR産物をNdeI及びPstIで切断し、ス
ピンカラムで精製した。

【００６０】一方pTANDEMcat 0.2μgをNdeI、PstIで切
断し、そのプラスミドＤＮＡをスピンカラムで精製し
た。両者を混合し、常法に従い１６℃で終夜、ライゲー
ション（Ready-To-Go T4リガーゼ、アマーシャムファ
ルマシア）し、電気穿孔法で大腸菌JM109へ導入した。

【００６１】所定のクローンをアンピシリン５０μg/ml
寒天プレートコロニーから選抜後、プラスミドを約1μg
分離精製した（pTANDEMcgt-cat）。

【００６２】２）Tn10トランスポゾンベクターの構築 次に、このcgt-cat部分をPCRで増幅し、mini-Tn10ベク
ター(pLOF/ptt、Methods in Enzymol., 235,386 (199
4))のNotI、XbaIサイトへ挿入できるよう、下記の操作
を行った。

【００６３】先ず、それぞれNotI、XbaIテイルの付いた
ＰＣＲプライマーを設計した。 TANDEM-F：AAA AAA AAA GCG GCC GC TAG ATG ACT AAA A
AG GAA AAA CAT ATGA AAT CGC Cat-B: AAA AAA TCT AGA TTA CGC CCC GCC CTG CCA CTC
ATC GCA G pTANDEMcgt-catプラスミドＤＮＡ１０ngをテンプレート
として、上記プライマーを用いてＰＣＲで増幅し、産物
をスピンカラムで精製、制限酵素NotＩとXbaIで切断し
た。一方、pLOFptt(Methods in Enzymol., 235,386 (19
94))をNotIとXbaIで切断し、スピンカラムで精製した。
両者をライゲーションし、大腸菌c118λpirに電気穿孔
法で導入した。アンピシリン２００μg/mlを含んだ寒天
プレートで現れたコロニーを分析して目的のクローンを
得た。このクローンを大量培養してプラスミド（pLOFCG
TCat）を調製した（図７）。c118λpirは接合のmobiliz
ation機能がなく供与体として使えないので、つぎにこ
のプラスミドを接合供与体大腸菌SM10株へ電気穿孔法で
導入し、pLOFCGTCatの入ったクローンSM10/pLOFCGTCat
を得た。

【００６４】3)ラン藻アナベナの接合による形質転換 この供与体を用いてAnabaena sp. PCC7120（パスツール
研究所カルチャーコレクション）に、次のようにして接
合法により導入した。即ち、生育期(OD₇₃₀〜0.8）の上
記アナベナのカルチャー１０mlを集菌し、グリセロール
２％溶液で３回洗浄後、新しい培地（BG11、Methods in
Enzymol., 167, 81, (1988)) 2mlに懸濁した。

【００６５】一方SM10/pLOFCGTCat４ｍｌを集菌して新
しい培地1mlに懸濁した。両者を混合して濾紙で吸引濾
過した。これを剥がしてBG11培地の寒天プレートに終夜
３０℃でインキュベーションした。翌日これを剥がし、
BG11培地１０ｍｌ中に菌をそぎ落とし、終夜培養した。
翌日集菌後これをクロラムフェニコール 2, 5, 10, 20
μg/mLを含んだBG11培地/０．５％ソフトアガーを用い
て注ぎ、３０℃、３０００ｌｘで培養した。4週間後現
れたコロニーから１０μg/mlのプレートからのもの６コ
を10μg/mlクロラムフェニコールで液体培養培し、形質
転換体を得た。

【００６６】4)ＣＧＴのアッセイ クローン10-a、10-b、10-c、10-d、10-e、10-fの各カル
チャー OD₇₃₀〜１を５ml採取、集菌後、２％グリセロ
ールで２回洗浄、Ｍバッファー（50mM Tris(pH8),50mM
NaCl,10mM EDTA(pH8),5mM Mercaptoethanol)５mlに懸
濁、超音波で粉砕、遠心した後、ライセート1ml採取し
て氷中に保管した。別の５０mM酢酸バッファー（pH5.5)
の０．５％でんぷん溶液1mlを用意し、先のライセート1
00μlを加え、４０℃で４時間インキュベートした。遠
心後上清10μlを採取してＨＰＬＣ（日立Ｌ−６２０
０）で分析した。カラムはOD-AQ307（ＹＭＣ）、溶媒は
エタノール/Ｈ₂Ｏ(7/93,v/v）、検出器は屈折率検出器
（日立Ｌ−７４９０）を用いた。標準として市販のα
−、β−、γ−サイクロデキストリン（和光）を用いて
ピークを特定した結果、約９０％がα−サイクロデキス
トリンであった。

【００６７】各サンプルにおけるαーサイクロデキスト
リン生成をこのピーク面積をカルチャー採取時のＯＤ値
でノーマライズしたもので評価した。また、遺伝子導入
していない野生株についても同様に測定した。

【００６８】

【表２】

【００６９】

【配列表】 <110> Koji Kajimura:Director General, Agency of Industrial Science and T echnology <120> DNA fragment, vector and method for chromosome recombination <130> 113MS0240 <140> <141> <160> 9 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:stop codon and SD sequence <400> 1 tcgactagat gactaaaaag gaaaaacata tgctgca 37 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:stop codon and SD sequence <400> 2 gatctactga tttttccttt ttgtatacg 29 <210> 3 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 3 aaaaaaaaac atatggctaa cggtcaaatt tctccccagc gtgc 44 <210> 4 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 4 aaaaaactgc agttaaagca cctgggcccg caaccaggcc ac 42 <210> 5 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 5 aaaaaaaaca tatgaaatcg cggtacaaac gtttgac 37 <210> 6 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 6 aaaaaactgc aggcttaatt ttgccagtcc accgtacac 39 <210> 7 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 7 aaaaaaaaag cggccgctag atgactaaaa aggaaaaaca tatgaaatcg c 51 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:primer <400> 8 aaaaaatcta gattacgccc cgccctgcca ctcatcgcag 40 <210> 9 <211> 11 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:stop codon <400> 9 tagatgacta a 11

ｔ

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＤＮＡ断片の一例を示す。

【図２】本発明の基本原理を示す。

【図３】本発明のベクターの一例を示す。

【図４】本発明のベクターの一例を示す。

【図５】本発明の実施例１で作製したベクターを示す。

【図６】本発明の実施例１で作製したベクターを示す。

【図７】本発明の実施例２で作製したベクターを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:89） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＰｕｂＭｅｄ ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】翻訳停止配列を配した下流に、リボソーム
   結合配列を冠した遺伝子の構造部を２種以上直列に配し
   たＤＮＡ断片であって、該遺伝子のいずれかひとつがプ
   ロモーター探索用の選択マーカー遺伝子であることを特
   徴とする、染色体組込用ＤＮＡ断片。
2. 【請求項２】選択マーカー遺伝子が、薬剤耐性遺伝子で
   あることを特徴とする請求項１に記載のＤＮＡ断片。
3. 【請求項３】請求項１又は２に記載のＤＮＡ断片を組み
   込んだ染色体組込み用ベクター。
4. 【請求項４】該ベクターが相同的組み換え型ベクターで
   ある請求項３に記載のベクター。
5. 【請求項５】該ベクターがトランスポゾン型ベクターで
   ある請求項３に記載のベクター。
6. 【請求項６】原核生物又は真核生物の染色体中に外来遺
   伝子を導入する方法において、請求項１又は２に記載の
   ＤＮＡ断片或いは請求項３〜５のいずれかに記載のベク
   ターを用いて行う方法。
7. 【請求項７】請求項６に記載の方法によって得られる形
   質転換体。
8. 【請求項８】請求項７に記載の形質転換体を用いる蛋白
   質の製造方法。