JP3449030B2 - 液体クロマトグラフィー用検出器とそれを用いた測定方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、測定対象物質が通過す
ることによって光学的に変化する物質を溶媒に不溶性の
透明支持体に固定化し、その透明支持体を検出器内に組
み込んだ液体クロマトグラフィー用の検出器、およびそ
れらの検出器を用いた特定の物質を特異的に測定する方
法に関する。

【０００２】

【従来の技術】液体クロマトグラフィーを用いた分析に
於いて、カラムによって分離された物質はカラムに紫外
線吸収検出器、可視吸収検出器、蛍光検出器や旋光度検
出器等を接続し、その物質がもつ紫外線吸収、可視吸
収、蛍光光度や旋光度を測定することにより検出するこ
とができる。紫外線、可視吸収、蛍光、旋光度を持たな
い物質の検出には反応試薬をプレカラム、ポストカラム
法で用いて測定したい物質を検出可能な化合物に誘導体
化する方法が用いられている。しかし、プレカラム法で
は液体クロマトグラフィーで分析する前に試料と反応試
薬を処理する必要があることから、作業が煩雑になる。
試料によっては高温で長時間反応させなければならず、
分析時間が長くなる。また試料を、検出したい誘導体化
した後の過剰な反応試薬がその後の液体クロマトグラフ
ィーによる分析において試料の分離を妨げる場合もあ
る。

【０００３】一方、ポストカラム法では反応試薬を常に
第２のポンプで流し続けなければならないので分析の装
置が大型になり、また試薬を大量に使用しなければなら
ない。さらに溶離液に反応試薬が加わることでカラムで
分離した試料のピークも広がってしまう。例えば反応試
薬として、ｐＨ指示薬をポンプで流し続けて有機酸を分
析する方法があるが、（特告昭５７−３４５０２）この
方法はｐＨ指示薬を常に流し続けなければならない。遷
移金属イオンについても、ポストカラム法では反応試薬
を流し続けなければならない。

【０００４】さて酵素活性は、基質の減少量または生成
物の増加量を分析することで測定することができるが、
その方法としては例えば反応前後の基質を含む酵素溶液
を吸光光度計を用いて直接吸光度で測定比較する方法、
反応試薬で発色させて測定する方法がある。その他、基
質を放射性の元素で標識して検出する方法がある。また
は液体クロマトグラフィーを用いて基質の減少量または
生成物の増加量を測定する方法など色々ある。酵素活性
を測定する意義としては、例えば臨床診断分野に於いて
は、血液、尿等の体液中の様々な体内の酵素の活性を測
定することによって疾患の早期発見や治療の経過のモニ
タリングを行うことがあげられる。抗原抗体反応等を用
いたタンパク質としての酵素それ自身の物質量ではな
く、酵素のもつ活性量が疾患との相関性をもっていると
考えられる。また、工業用酵素や医療用酵素として用い
られている酵素の活性量を測定することは商品管理の上
からも有意義である。

【０００５】酵素活性を液体クロマトグラフィーで測定
する場合、試料と基質を測定以前に反応させて反応液を
測定する方法があるが、測定前の反応時間と液体クロマ
トグラフィーを用いた分析時間を合わせた時間がかかる
ので測定時間が長い。または、試料中の他の不純物をカ
ラムによって分離しながら測定対象酵素に対応する基質
溶液を系内へ流し続けることによって同時に酵素の活性
を測定することも可能である。その場合、測定する酵素
に対応する基質を同時に大量に試薬液として流さなれば
ならない（J.Chromatography 374,1986,45-50 ）。ま
た、基質固定化カラムを用いた酵素活性測定法（特開平
１−２９６９９７）では、試料中の他の不純物をカラム
で分離した後、分離用のカラムに基質固定化カラムを接
続することで、基質固定化カラム内で酵素が反応して、
分解し溶出される基質を検出することで分離しながら同
時に酵素の活性を測定することが可能である。しかし、
固定化されていた基質が酵素によって分解され、さらに
分解された基質が光学的に検出可能でなければ活性が測
定できない。分解された基質が光学的に検出可能であっ
ても、検出器で検出されるまでに溶離液によって拡散す
ることにより感度が低下するといった問題点もある。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は前記従
来の欠点を克服して、液体クロマトグラフィーの装置の
簡略化と反応試薬を節約し、液体クロマトグラフィーに
よる分離を行いながら、簡便迅速かつ精度高く、目的と
する物質を特異的に測定する方法を提供することにあ
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明は測定対象物質が
通過することによって光学的に変化する物質を溶媒に不
溶性の透明支持体に固定化し、検出器内に組み込んだ液
体クロマトグラフィー用の検出器、およびそれを用いる
ことにより、液体クロマトグラフィー用カラムで分離し
た物質のうち、固定化した物質を光学的に変化させる測
定対象物質を特異的に測定する方法に関する。測定対象
物質が検出器のセル内を通過することにより、物質の量
に比例して光学的変化が検出器に感知される。通過とは
液体クロマトグラフィーの移動相とともに測定対象物質
が移動することをいう。以下、本発明に於ける改良検出
器、及びそれを用いた測定方法について説明する。

【０００８】本発明の検出器は特定の測定対象物質によ
って光学的に変化する物質を溶媒に不溶性の透明支持体
に固定化し、検出器内に組み込んだ液体クロマトグラフ
ィー用検出器である。測定対象物質とは酸性物質やアル
カリ性物質などのｐＨ指示薬により検出される物質、金
属イオンなどの金属指示薬により検出される物質、酸化
還元酵素などの補酵素要求酵素、糖分解酵素、タンパク
質分解酵素、リン酸エステル分解酵素、糖異性化酵素ま
たは糖転移酵素等の基質が光学的に変化することにより
検出される物質等があげられる。一方、測定対象物質に
対応して、光学的に変化する物質としては例えば、ｐＨ
指示薬、金属指示薬、ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド（以下ＮＡＤ）、ニコチンアミドアデニンジヌク
レオチドリン酸（以下ＮＡＤＰ）、糖分解酵素の基質、
タンパク質分解酵素の基質、リン酸エステル分解酵素の
基質、糖異性化酵素の基質または糖転移酵素の基質など
があげられる。

【０００９】溶媒に不溶性の透明支持体は、ポーラスま
たはノンポーラスのいずれであってもよく、従来しばし
ば用いられてきたセルロース、アガロース、デキストラ
ン等の多糖体またはポリアクリルアミドのようないわゆ
るソフトビーズ、シリカゲル、ガラスビーズ、コントロ
ールドポアグラスのような無機ビーズ、スチレン系重合
体、ビニルアルコール系重合体及びメタクレレート系重
合体やこれらの共重合体などのような合成高分子ビーズ
等があげられる。透明とは測定に使用される光を透過す
るものの意であって、可視光を透過するものにかならず
しも限定されない。形状にも特に制限はなく、球状、破
砕状等特に制限はない。粒径にも特に制限はないが3 〜
100 μｍの範囲が好ましい。

【００１０】また、溶媒に不溶性の透明支持体とは、液
体クロマトグラフィー用検出器のセルそのものも含む。
液体クロマトグラフィー用セルとして、一般的にはガラ
ス製が用いられる。ガラスは紫外線吸収のない石英ガラ
スが望ましい。セルの形状は各々の検出器によって異な
るが、目的に応じて適宜決めればよく特に制限はない
が、一般には、形状は中空の直方体で中空の部分を溶離
液が流れる。

【００１１】光学的に変化する物質を固定化する方法と
して、上記支持体が有する官能基、例えば、水酸基、ア
ミノ基等に直接結合させるか、または物質が結合可能な
官能基例えばエポキシ基、ヒドラジン基、カルボキシル
基、ホルミル基を有する結合基を支持体が有する官能基
にさらに導入することも可能である。これらの結合基を
支持体に導入する方法は公知の方法で適切な溶媒の存在
下で容易に行なうことができる。例えばエポキシ基を有
する官能基としてはエピクロロヒドリンのようなエピハ
ロヒドリン類、1,4-ブタンジオールジグリシジルエーテ
ルのようなジグリシジルエーテル類、1,7-オクタジエン
ジエポキシドのようなジエポキシド類等が上げられる
が、これらは支持体上の水酸基、アミノ基とアルカリ条
件下で速やかに反応しエポキシ基を支持体に導入するこ
とができる。また、得られたエポキシ基を有する支持体
は、アンモニア、ヒドラジン、あるいはプロパンジアミ
ンのようなジアミノアルカン類、ポリアスパラギンやポ
リグルタミンのような塩基性ポリアミノ酸、ポリビニル
アミン、ポリエチレンイミンのようなポリアミン類等と
反応させることによりアミノ基を支持体に導入すること
ができる。またアミノ酪酸のようなアミノカルボン酸
類、あるいはポリグルタミン酸のような酸性ポリアミノ
酸などと反応させることでカルボキシル基を支持体に導
入することができる。また、エポキシ基を加水分解し過
ヨウ素酸酸化を行うことでホルミル基を有する支持体を
与える。また、無水コハク酸のような酸無水物、あるい
は無水マレイン酸とそれと重合し得るビニルモノマーか
ら成る無水マレイン酸共重合体と反応させることにより
アミノ基を有する支持体にカルボキシル基を導入するこ
とができる。本共重合体にエチレンジアミンなどのジア
ミン類を反応させることで上記のアミノ基を有する支持
体を得ることもできる。以上の官能基を導入した結合基
の長さとしては特に制限はないが、固定化する光学的に
変化する物質とそれと相互作用を持つ測定物質との相互
作用の際の立体障害を除去し、さらに光学的に変化する
物質を高濃度に結合させるためには、原子数１〜３００
０が望ましい。結合基に結合している官能基の数は特に
限定されないが、結合基１分子あたり複数個以上が望ま
しい。

【００１２】これらの官能基を有する支持体に光学的に
変化する物質は、結合基が有する官能基に応じて必要で
あれば、適宜触媒や反応試薬等を用いて適当な溶媒下で
固定化させることができる。例えば触媒としては、塩酸
や炭酸ナトリウムまたは炭酸水素ナトリウムなどの酸、
アルカリが主として官能基がエポキシ基の場合に用いら
れ、また、例えば反応試薬としては、ジシクロヘキシル
カルボジイミド、1-エチル-3- （3-ジメチルアミノプロ
ピル）カルボジイミドまたはカルボニルイミダゾールの
ような縮合剤が官能基がカルボキシル基またはアミノ基
の場合に、また水素化シアノホウ素ナトリウムのような
還元剤が官能基がアルデヒド基の場合に用いられる等々
を例示することができる。また溶媒としては通常水が用
いられるが必要に応じてリン酸や酢酸緩衝液として用い
ることもでき、また塩化ナトリウムなどの無機塩類を添
加して用いることも可能である。

【００１３】上記のように固定化様式としては共有結合
が望ましいがイオン結合、疎水結合等であっても支持体
に固定化した光学的に変化する物質の脱落がなければ用
いることが可能である。

【００１４】光学的に変化する物質としては支持体と共
有結合可能な官能基またはイオン結合、疎水結合等をす
る基が分子内に存在または導入されていればよく、固定
化後も光学的に変化する性質を失っていなければ特に制
限されない。

【００１５】液体クロマトグラフィー用検出器のセルそ
のものに光学的に変化する物質を固定化する場合を示
す。液体クロマトグラフィー用セルとしては石英ガラス
が一般的なので、その例を示すが何等それに限定される
ものではない。石英ガラスをアルカリ性水溶液中または
酸性水溶液中で浸水させ、ガラス表面の結合導入基であ
る水酸基量を増加させる。この時、加熱をした方が水酸
基量が増加する。アミノ基等を分子内に有する光学的に
変化する物質を例えばカルボニルジイミダゾールをもち
いて水酸基と反応することにより、石英ガラスからなる
液体クロマトグラフィー用検出器内に使用されているセ
ルに結合することができる。また例えばカルボニルジイ
ミダゾールをもちいて、ヘキサメチレンジアミンのよう
なアミノアルカン類、ポリリジンのような塩基性ポリア
ミン類等のアミノ基を２以上もつ物質を反応させること
によりガラス表面にアミノ基を担持させることができ
る。さらに導入されたアミノ基にカルボキシル基等を分
子内に有する光学的に変化する物質をジシクロヘキシル
カルボジイミド等の縮合剤を用いることで結合すること
ができる。またガラス表面の水酸基にアミノプロピルト
リメトキシシラン、γ−グリシドキシプロピルトリメト
キシシランの様なシランカップリング剤を反応させるこ
とにより、アミノ基、グリシジル基を導入することがで
き、導入したアミノ基、グリシジル基に光学的に変化す
る物質を結合させることができる。固定化様式としては
共有結合が望ましいがイオン結合、疎水結合等であって
もガラス表面に固定化した光学的に変化する物質の脱落
がなければ用いることができる。

【００１６】上記のようにして得られた光学的に変化す
る物質を固定化した溶媒に不溶性の透明支持体を検出器
内に組み込むには、通常は吸引法等の常法に従って検出
器セル内に充填する方法があげられる。この時、支持体
がセル中から漏れないようにメンブランフィルター等を
適宜装着する。セルを各々の検出器に応じた装着方法を
用いて、装着することによって検出器が完成する。透明
支持体がセルそのものの場合も同様に光学的に変化する
物質が固定化されたセルを各々の検出器に応じた装着方
法を用いて、装着することにより検出器が完成する。

【００１７】上記の発明によって得られた検出器は通常
の液体クロマトグラフィー装置用の検出器として用いる
ことが可能である。すなわちポンプ、カラム、検出器の
順にチューブで接続し、溶離液を流し、試料をインジェ
クター等によってカラムの直前で注入し、固定化された
光学的に変化する物質を変化させる測定対象物質がセル
中を通過した時にその光学的変化を検出器が感知し定量
する。測定対象物質が該セルを通過するに伴い、対象物
質の量に対応して固定化された物質の光学的変化がおこ
る。検出器は得られる光学的変化にあわせて紫外線吸
収、可視吸収、蛍光検出器、旋光度検出器等を用いる。
光学的変化がセル中でおこっているので実際に反応する
と同時に測定できるので誤差が少ない。測定温度は、特
に制限はないが、通常は 4〜60℃の範囲が望ましい。測
定対象物質は、光学的変化を引きおこす物質であれば特
に制限はなく適用できる。

【００１８】本発明の光学的に変化する物質を溶媒に不
溶性の支持体に固定化された物質と測定対象物質の組み
合わせをさらに詳しく例示する。例えば光学的に変化す
る物質としてｐＨ指示薬を用いた場合、測定対象物質と
して試料中の酸性物質または塩基性物質を測定できる。
ｐＨによって吸光度の変化、蛍光光度の変化または発光
を示すｐＨ指示薬として、２，６−ジクロロ−４’−ヒ
ドロキシ−３’，３”−ジメチル−３−スルホフクシン
−５’，５−ジカルボキシリックアシッド（以下クロマ
ズロールＳ）、アリザリンコンプレクソン、ヒドロキシ
ルナフトールブルー、ジンコン、カルセイン、フェノー
ルフタレインコンプレクソン、フルオキシン、グリシン
チモルブルー、グリシンクレゾールレッド、キシレノー
ルオレンジ、フタレインコンプレクソン等を例示するこ
とができ、これを支持体に固定化して、検出器に組み込
み、酸性物質または塩基性物質が通過することによりお
こる光学的変化を検出することができる。例えば飲料中
の有機酸を測定したい場合、カラムで有機酸を分離した
後に上記のセルを組み込んだ検出器をカラムに接続する
と酸性物質である有機酸がセル内を通過することでセル
に固定化されたｐＨ指示薬が光学的に変化し、個々の有
機酸をピークとして検出することができる。この様にし
てワイン中やビール中の有機酸もポストカラム法に比べ
て反応液を流すこと無く測定することができる。

【００１９】また、光学的に変化する物質として金属指
示薬を用いた場合、測定対象物質は試料中の金属イオン
である。金属指示薬としてアリザリンコンプレクソン、
カルボキシアルセナゾ、ディエービ、フルオキシン、グ
リシンクレゾールレッド、グリシンチモールブルー、キ
シレノールオレンジ、ジンコン、パタレインコンポレク
ソン、ヒドロキシナフトールブルー、カルセイン、フェ
ノールフタレインコンプレクソン等例示することがで
き、これを支持体に固定化してそれらを組み込んだ検出
器を用いて測定できる。特定の金属イオンにのみ色調の
変化を示す金属指示薬を数種類固定して検出器に用いる
ことにより、一度に数種類の金属の検出を行なうことが
できる。例えば、水道水、河川水中の金属イオンの測定
や血液中の金属イオンの測定に用いることができる。

【００２０】光学的に変化する物質としてＮＡＤ、ＮＡ
ＤＰ等の補酵素を用いた場合、補酵素を要求する酵素の
活性を測定することができる。例えばＮＡＤを要求する
酵素の活性を測定する場合、ＮＡＤを固定化した支持体
を組み込んだ検出器を用いて、ＮＡＤを固定化した支持
体に基質を固定化するかまたは基質溶液を流すことによ
り、活性測定対象酵素として、ラクテートデヒドロゲナ
ーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、ヒドロキシステロ
イドデヒドロゲナーゼ、グリセロールデヒドロゲナー
ゼ、３−ヒドロキシピルベートデヒドロゲナーゼ、マレ
ートデヒドロゲナーゼ、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、
グルタメートデヒドロゲナーゼ、アセトアルデヒドデヒ
ドロゲナーゼなどのような酸化還元酵素をあげることが
できる。これらの酵素によって支持体に固定化されたＮ
ＡＤが還元型ニコチンアミドジヌクレオチド（ＮＡＤＨ
と略す。）に変化する。ＮＡＤＨは紫外吸収検出器また
は蛍光検出器で検出できる。本発明に係る酵素及び基質
は、酵素と基質の通過により固定化されているＮＡＤが
ＮＡＤＨに光学的に変化するもの、または酵素の通過に
より固定化された基質と固定化されたＮＡＤが反応して
固定化されたＮＡＤがＮＡＤＨに変化するものであれば
特に制限はない。また、ＮＡＤＰを固定化した支持体を
組み込んだ検出器を用いた場合、ＮＡＤＰを固定化した
支持体に基質を固定化するかまたは基質溶液を流すこと
によりマリックエンザイム、グルコース−６−フォスフ
ェートデヒドロゲナーゼ等のデヒドロゲナーゼの酵素活
性を測定できる。

【００２１】さらに、本発明に於て補酵素を固定化した
支持体を組み込んだ検出器を用いて測定可能な活性測定
対象酵素類の活性比較を行うことが可能である。例え
ば、ＮＡＤを固定化した支持体を用いた場合、ＮＡＤに
対して特異的な作用を有する酵素は全て活性測定対象酵
素類として例示することができる。

【００２２】また、固定化した補酵素を再生するには酸
化還元の逆反応を行うことによって再生された補酵素を
再度使用することができる。

【００２３】一般に、ほとんど同一の補酵素特異性を有
するにも拘らず、活性が非常に異なっている酵素は数多
く知られているが、本法はそれらの酵素の簡便な識別に
も用いることができる。また、ある特定の補酵素特異性
を有する酵素を、多数の酵素群の中から選別するための
簡便なスクリーニング方法として、またその補酵素に対
する活性の相違を識別する為の簡便なスクリーニング方
法として用いることができる。あるいは、同一の酵素に
関しては、各精製段階に於ける活性を検出するために用
いることもできる。さらに数種類の補酵素固定化カラム
を用いることで特定の酵素に関する特異性の相違の検
討、あるいは逆に特異性の相違から新規な酵素を同定す
ることも可能である。従って、上述の活性測定対象酵素
類は、精製した単一標品の他、粗精製標品でもよく、ま
た、生体試料中に存在している一成分であってもよい。
例えばラクテイトデヒドロゲナーゼのように数種類のア
イソザイムをもち、アイソザイムの増減のパターンをみ
ることで疾患の診断となる場合に非常に有効である。試
料中に他の夾雑タンパク質などの他物質が存在している
ような場合には、ゲル濾過、イオン交換、疎水性クロマ
トグラフィーなどの分離カラムを用い、光学的に変化す
る物質を溶媒に不溶性の透明支持体に固定化して組み込
んだ検出器で検出することで、分離カラムによって分離
されたピークのどの部分に活性が存在しているかを直ち
に知ることができる。本法を高速液体クロマトグラフィ
ー装置に組み込んだ場合は少量の試料で感度よく、短時
間で容易に酵素活性を測定することができ、また他の様
々の分離カラムとの組合せも有利となる。

【００２４】試料中の分解酵素の活性を測定する場合、
一般に液体クロマトグラフィーで測定する以前に試料と
基質を反応させて反応液を注入するか、試料を測定して
いる間基質溶液を流し続けなければならないが、基質を
固定化した支持体を組み込んだ検出器を用いた場合、基
質溶液を流し続ける必要はなく、測定しようとする試料
を注入するだけで良い。活性測定対象酵素は、精製した
単一標品の他、粗精製標品でもよく、また、生体試料中
に存在している一成分であってもよい。従って、液体ク
ロマトグラフィー装置さらには高速液体クロマトグラフ
ィー装置を用いることで少量の試料で感度よく、短時間
で酵素活性を測定することができ、他の様々の分離カラ
ムの組み合わせも分離同定、検出感度等の面で有利とな
り、臨床検査の測定にも適していると思われる。また補
酵素要求酵素と同様に同じ基質を分解する酵素のスクリ
ーニングまたは精製段階の酵素活性を追うこともでき
る。

【００２５】分解酵素の例を示す。血中のβ−ガラクト
シダーゼの測定を行なうと遺伝病であるゴージュ病の検
査ができる。さらにβ−ガラクトシダーゼを標識酵素と
してもちいている試薬の活性もカラムで分離しながら同
時に知ることができる。血清中、または尿中のβ−グル
クロニダーゼの活性を測定することにより遺伝的ムコ多
糖症のみならず、悪性腫瘍、肝疾患、甲状腺疾患などの
診断の基準となる。尿中のＮ−アセチル−β−グルコサ
ミニダーゼを測定することで近位尿細管の基質障害を伴
う腎病変のスクリーニングとなる。ムラミダーゼの活性
を測定することにより急性単球性白血病、非典型的結核
症等の診断できる、またシアルダーゼ活性の測定は細菌
感染症の診断に有効な情報を与える。

【００２６】転移酵素を測定する場合、基質が支持体上
に転移することにより光学的に変化がおこれば、この変
化を検出器内で検出できる。例えばβー１、４ガラクト
シルトランスフェラーゼの場合、ガラクトシル基が支持
体に転移することにより活性を測定することが可能にな
り、癌の進行度を知ることができる。糖異性化酵素であ
るグルコース−６−リン酸イソメラーゼを測定すること
で癌、肝炎の進行を知ることができる。

【００２７】

【実施例】以下、本発明について代表的な例を示しさら
に具体的に説明する。尚、これらは説明のための単なる
例示であって本発明はこれらに何ら制限されるものでな
いことはいうまでもない。

【００２８】実施例１ アミノ活性化アガロースゲル（ファルマシア製）１ｇと
クロマズロールＳ（同仁化学製）３０ｍｇを２ｍｌのｐ
Ｈ４．５の酢酸緩衝液に溶かし、１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドを３０ｍｇ
加えて分散させ２５℃で５時間振とうさせた。次いでア
ガローズゲルをＨ₂ Ｏ、１ＭＮａＣｌ、Ｈ₂ Ｏ各々１０
ｍｌで洗浄しクロマゾールＳ固定化アガロースを得た。
さらにイオン交換水１Ｌに分散し一晩攪拌してゲルを洗
浄した。さらにＨ₂ Ｏ、１ＭＮａＣｌ、Ｈ₂ Ｏ各々１０
ｍｌで洗浄した。得られたゲルをＳｈｏｄｅｘＭ−３１
５（昭和電工製、液体クロマトグラフィー用スペクトル
モニター）のセル内にエバポレーターで吸入充填し、セ
ルの流路の前後にメンブランフィルターを挿入し、検出
器に装着した。図１に示される高速液体クロマトグラフ
ィー装置に、ＳｈｏｄｅｘＤＥ−６１３（昭和電工製）
を分離カラム４として用い、図１の５改良検出器Ｍ−３
１５を接続した。

【００２９】本システムを用いて有機酸の分析を試み
た。アセトニトリル：Ｈ₂ Ｏ＝９：１の溶液に、１ｍＭ
のカプリル酸、ミリスチン酸、ステアリン酸をそれぞれ
３３μl を本装置に注入し、５８０ｎｍで検出したクロ
マトグラフが図２（ａ）である。さらに改良検出器にＭ
３１５を接続して２１０ｎｍでも検出したクロマトグラ
フが図２（ｂ）である。尚、クロマト条件は以下に示し
た通りである。 溶離液 ： アセトニトリル：Ｈ₂ Ｏ＝９０：１０ 流速 ： ０．７５ｍｌ／ｍｉｎ 検出 ： ５８０ｎｍ 、２１０ｎｍ 測定温度： ｒ．ｔ．

【００３０】実施例２ アミノ活性化アガロース１ｇとβ−ガラクトシルウンベ
リフェロンを０．１８ｇ溶解した３ｍｌのｐＨ４．５の
酢酸緩衝液に溶かし、１−エチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミドを０．１８ｇ加えて分
散させ２５℃で５時間振とうさせた。次いでアガルーズ
をＨ₂ Ｏ、１ＭＮａＣｌ、Ｈ₂ Ｏ各々１０ｍｌで洗浄し
た。さらに１ＭＮａＣｌ１Ｌ中に分散し、一晩攪拌し
た。次いで、 １ＭＮａＣｌ、Ｈ₂ Ｏで洗浄して、β−
ガラクトシルウンベリフェロン結合アガロースゲルを得
た。得られたゲルは乾燥ゲル１ｇあたりβ−ガラクトシ
ルウンベリフェロンが約５０μｍｏｌ固定化しているこ
とが確かめられた。

【００３１】得られたゲルを蛍光検出器（日立製作所
製）のセルに充填し、検出器に装着した。その改良検出
器を用いてβ−ガラクトシダーゼの検量線を求めた（図
３）。β−ガラクトシダーゼがセルを通過するとβ−ガ
ラクトシルウンベリフェロン結合アガロースゲルのβ−
ガラクトースが遊離し、蛍光が増加していく。β−ガラ
クトシダーゼ標識抗体（コスモバイオ社）の試料中のβ
−ガラクトシダーゼ標識抗体と他の不純物を分離カラム
ＳｈｏｄｅｘＫＷ−８０３（昭和電工製）で分離したの
ち、改良検出器と紫外線吸収検出器を接続して検出し
た。改良検出器はＥｍ４００ｎｍ、Ｅｘ４５０ｎｍの条
件で図４（ａ）に示すようにβ−ガラクトシダーゼの活
性を測定し、紫外線吸収検出器は２８０ｎｍで測定し
た。図４（ｂ）の１２より１３がβ−ガラクトシダーゼ
標識抗体の溶出位置だということが分かる。 溶離液：５０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．０＋０．３ＭＮ
ａＣｌ カラム：ＳｈｏｄｅｘＫＷ−８０３（昭和電工製） 流速：０．２５ｍｌ／ｍｉｎ 検出：Ｅｍ４００ｎｍ、Ｅｘ４５０ｎｍ， ２８０
ｎｍ

【００３２】

【発明の効果】本発明は光学的に変化する物質を固定化
した溶媒に不溶の透明支持体を組み込んだ検出器および
それを用いることで光学的に変化させる物質を特異的に
測定する方法に関する。光学的に変化する物質を支持体
に固定化することにより、簡便迅速で精度の高い測定方
法を提供できる。またこの検出器を用いることで装置の
小型化、操作性の向上が得られる。ｐＨにより光学的に
変化するｐＨ指示薬を固定化した支持体を組み込んだ検
出器または金属イオンより光学的に変化する金属指示薬
を固定化した支持体を組み込んだ検出器を液体クロマト
グラフィーに用いることで、試料中の酸性物質、アルカ
リ性物質、金属イオンの特異的検出に於て有用な手段を
提供するばかりでなく、装置全体の小型化、簡便化を図
り、さらに、反応試薬を連続使用することなく検出が可
能となる。

【００３３】光学的に変化する補酵素、または分解酵素
による分解されることにより光学的に変化する基質、及
び転移酵素によって基質を転移されることにより光学的
に変化する物質を溶媒に不溶性の透明支持体に固定化
し、検出器内に組み込んだ液体クロマトグラフィーの検
出器を用いることで酵素の活性測定の簡便化が行われ、
さらに酵素の分離精製に関わる様々な分野だけでなく類
似酵素の識別等、簡便なスクリーニング方法に応用する
ことも可能である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明による応用例の一つであるｐＨ指示薬を
固定化した支持体を組み込んだ検出器を用いた酸性物質
の測定装置の概略を示したものである。

【図２】（ａ）は、本発明によるｐＨ指示薬を固定化し
た支持体を組み込んだ改良検出器を用いて、有機酸を５
８０ｎｍで分析したクロマトグラフである。（ｂ）は、
紫外線吸収検出器を用いて、有機酸を２１０ｎｍで分析
したクロマトグラフである。

【図３】本発明によるβ−ガラクトシダーゼ活性測定用
検出器を用いたβ−ガラクトシダーゼの検量線である。 縦軸は応答の高さ ｃｍ 横軸は酵素の活性 単位 ｕｎｉｔ／ｍｌ

【図４】（ａ）はβ−ガラクトシダーゼ活性測定用改良
検出器を用いたβ−ガラクトシダーゼ標識抗体のβ−ガ
ラクトシダーゼ活性を測定したものである。応答の高さ
が活性に相当する。（ｂ）はβ−ガラクトシダーゼ活性
測定用改良検出器に紫外線吸収検出器をつなげ、２８０
ｎｍでβ−ガラクトシダーゼ標識抗体を検出したクロマ
トグラムである。

【図５】補酵素要求酵素の活性を測定する際に用いる補
酵素ＮＡＤ固定化支持体のスペクトル１５と補酵素ＮＡ
ＤＨ固定化支持体の紫外線吸収スペクトル１６を比較し
たものである。縦軸は吸収、横軸は波長である。

【符号の説明】

１ 溶離液 ２ ポンプ ３ 試料注入部 ４ 分離カラム ５ 改良検出器 ６ カプリル酸のピーク ７ ミスチリン酸のピーク ８ パルミチン酸のピーク ９ カプリル酸のピーク １０ ミスチリン酸のピーク １１ パルミチン酸のピーク １２ β−ガラクトシダーゼ標識抗体の活性 図３の検量線より３７unit/ml に値する １３ β−ガラクトシダーゼ標識抗体のピーク １４ 不純物のピーク １５ 補酵素ＮＡＤ固定化支持体のスペクトル １６ 補酵素ＮＡＤＨ固定化支持体のスペクトル

フロントページの続き (56)参考文献 特開 平５−34330（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−296997（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−39096（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−76949（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−229998（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 30/74 G01N 30/88

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】測定対象物質が通過することによって光学
   的に変化する物質として、ｐＨ指示薬を溶媒に不溶性の
   透明支持体に固定化し、その透明支持体を検出器内に組
   み込んだ液体クロマトグラフィー用の検出器。
2. 【請求項２】請求項１記載の検出器を用いた液体クロマ
   トグラフィー装置で酸性物質またはアルカリ性物質を測
   定する方法。