JP3432211B2 - 試料チップの作製及び反応試料の分析方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 【０００１】 【発明が属する技術分野】本発明は、基板上にＤＮＡ、
ＲＮＡのポリヌクレオチドや蛋白質等の固定試料をスポ
ット状に多数固定して試料チップを作製し、該試料チッ
プを使用して反応試料を検出する試料チップの作製及び
反応試料の分析方法に関する。 【０００２】 【発明が解決しようとする課題】蛋白質等のような水溶
液中で取り扱わないと変性し、失活し易い物質をスライ
ドガラス等のような基板上に高密度に固定化する際に
は、ＤＮＡマイクロアレイのような数百ピコリットル単
位の微量スポッティングでは、スポッティングした試料
溶液が即座に乾燥してしまうために試料が失活し、更に
基板上への固定化効率が減少するなどの欠点がある。 【０００３】従来、例えば臨床現場における血液検査の
ような蛋白質スクリーニングや定量測定を行う操作にお
いては、マイクロタイタープレート（８０mm×１２０m
m、９６穴）の各穴に試料溶液を注入して固定化反応も
検出反応も液相下で実施し、１回の測定で必要とされる
試料量は数百マイクロリットルと多く必要としている
が、極微量の試料で分析を要求される現在において、上
記したように多量の試料を必要とする分析システムで
は、他の分析システムとの連携に欠くケースも生じてき
た。 【０００４】また、ＤＮＡマイクロアレイ等に代表され
るように、一度に行い得る分析検数も９６では不充分で
あり、更に使用される固定化基板もスライドガラス等の
ような小容量のチップ型のものが望まれるようになっ
た。 【０００５】本発明は、上記した従来の欠点を解決する
ために発明されたものであり、その課題とする処は、ス
ライドガラス（２６mm×７６mm）のように占拠体積が小
さい基板に対して一度の操作で多数の固定試料をスポッ
ティングして多数の試料チップを大量に作製することが
できると共に作製された試料チップを使用して一度の操
作で多数の反応試料をスポッティングして固定試料と反
応させて分析作業を効率化することができる試料チップ
の作製及び反応試料の分析方法を提供することにある。 【０００６】また、本発明の他の課題は、試料チップを
作製する際には基板に対して微少量の固定試料を、各ス
ポットにおける固定試料量のばらつきを抑えてスポッテ
ィングして試料チップを作製することができると共に試
料チップの各固定試料に対して微少量の反応試料をほぼ
均一に分注して各スポットにおける反応のばらつきを最
小限して分析することを可能にする試料チップの作製及
び反応試料の分析方法を提供することにある。 【０００７】更に本発明の他の課題は、固定試料及び反
応試料の使用量を低減して分析コストを低コスト化する
ことを可能にする試料チップの作製及び反応試料の分析
方法を提供することにある。 【０００８】 【課題を解決するための手段】本発明は、スポッティン
グされる固定試料数と一致する多数の吸引部材及び分注
部材と吸引吐出作動部材とを選択的に連通可能に接続
し、各吸引部材と吸引吐出作動部材とを選択的に連通し
た状態で吸引吐出作動部材に固定試料溶液を吸引した後
に各吸引部材と吸引吐出作動部材との流路を閉鎖すると
共に吸引吐出作動部材と分注部材の流路を開放して吸引
吐出作動部材に溜められた固定試料溶液を分注部材から
基板上に被覆形成された薄膜の各穴内に吐出して試料チ
ップを作製する工程と、分注部材、吸引吐出作動部材及
び吸引部材内に洗浄液を流通させて夫々を洗浄する工程
と、各吸引部材と吸引吐出作動部材とを選択的に連通し
た状態で吸引吐出作動部材に反応試料溶液を吸引した後
に各吸引部材と吸引吐出作動部材との流路を閉鎖すると
共に吸引吐出作動部材と分注部材の流路を開放して吸引
吐出作動部材に溜められた反応試料溶液を分注部材から
基板上の各固定試料に対して分注吐出して反応させる工
程とからなる。 【０００９】 【発明の実施形態】以下、本発明の実施形態を図に従っ
て説明する。 【００１０】図１〜図４において、固定試料及び反応試
料のスポッティング装置１は吸引吐出装置３と分注装置
５とから構成される。 【００１１】スポッティング装置１を詳述すると、該ス
ポッティング装置１の本体フレーム７の図示右側には吸
引吐出装置３が配置され、該吸引吐出装置３の第１走行
体９は図示する前後方向へ往復移動可能に支持される。
該第１走行体９には第１上下フレーム１１が設けられ、
該第１上下フレーム１１には第１ホルダ１３が上下方向
へ移動可能に支持される。 【００１２】本体フレーム７に対して第１走行体９及び
第１上下フレーム１１に対して第１ホルダ１３を夫々往
復移動する駆動装置としては、本体フレーム７及び第１
上下フレーム１１に回転可能に支持され、一方にステッ
プモータ等の電動モータが連結された一対のプーリに張
設されたタイミングベルトの一部を第１走行体９および
第１ホルダ１３に固定したベルト駆動機構、本体フレー
ム７及び第１上下フレーム１１に回転可能に支持される
と共に軸端部にステップモータ等の電動モータが連結さ
れた送りねじを第１走行体９及び第１ホルダ１３のナッ
ト部に噛み合わせた送りねじ駆動機構やリニアモータ
（何れも図示せず）等の何れであってもよい。 【００１３】第１ホルダ１３には流路切換装置１４が設
けられ、該流路切換装置１４は固定板１５と、該固定板
１５に密着して移動する切換板１７とから構成される。
該固定板１５には多数（基板５３上にスポッティングさ
れる試料数が９６個の場合にあっては９６個）の吸引吐
出口部２７が所定の間隔をおいて設けられている。ま
た、切換板１７には多数（９６個）の吸引口部１９が吸
引吐出口部２７の間隔と一致する間隔をおいて形成され
ると共に各吸引口部１９に隣設して多数の吐出口部２１
が所定の間隔をおいて形成され、これら吸引口部１９及
び吐出口部２１は対応する吸引吐出口部２７と選択的に
連通するように設定される。 【００１４】なお、流路切換装置１４は第１ホルダ１３
に設け、各吸引口部１９に後述する吸引部材２３を直接
設ける構成としたが、該流路切換装置１４としては第１
ホルダ１３から離れた本体フレーム７に設け、各吸引口
部１９と対応する吸引部材２３とをチューブで夫々接続
する構成であってもよい。 【００１５】そして各吸引口部１９には上下方向に軸線
を有した吸引針や吸引ノズルからなる吸引部材２３が取
り付けられる。なお、基板５３上にスポッティングされ
る試料の数は上記に限定されるものではないことは勿論
である。 【００１６】そして各吸引部材２３はその先端部が本体
フレーム７上の載置台２４に相対し、該載置台２４には
固定試料が溜められる固定試料用容器２５及び反応試料
用容器２６が選択的に載置される。これら容器２５・２
６には例えば上記した９６個の溜り部２５ａ・２６ａが
各吸引部材２３に相対するように設けられ、固定試料用
容器２５の各溜り部２５ａには試料チップを作製する際
に異なる種類或いは同一種類の固定試料溶液が所定量
（例えば１００μl）づつ溜められている。また、反応
試料用容器２６の各溜り部２６ａには作製された試料チ
ップを使用して蛋白質やポリヌクレオチド等を分析する
際に反応試料溶液が上記した所定量づつ溜められる。 【００１７】固定試料溶液としては作製される試料チッ
プに応じて調整され、ＤＮＡ、ＲＮＡ（染色体由来のＤ
ＮＡ断片、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ及びＲＮＡ
等）のポリヌクレオチドや蛋白質を、例えば３×３ＳＳ
Ｃ溶液（０．４５Ｍ塩化ナトリウム、０．０４５Ｍクエ
ン酸ナトリウムでＰＨ：７．００に調整）に溶解した溶
液からなる。また、反応試料溶液は作製された試料チッ
プを試用して分析しようとする被検体から抽出されたポ
リヌクレオチドや蛋白質を、同様に例えば３×３ＳＳＣ
溶液（０．４５Ｍ塩化ナトリウム、０．０４５Ｍクエン
酸ナトリウムでＰＨ：７．００に調整）に溶解した溶液
からなる。 【００１８】一方、固定板１５に密着して移動する切換
板１７には多数（上記した場合にあっては９６個）の吸
引吐出口部２７が上記した吸引口部１９及び吐出口部２
１の配列間隔と一致する間隔をおいて形成され、該切換
板１７を各吸引口部１９と吐出口部２１の間隔と一致す
る距離で移動することにより各吸引吐出口部２７を対応
する吸引口部１９または吐出口部２１に選択的に一致さ
せて連通させる。 【００１９】なお、該切換板１７を吸引口部１９と吐出
口部２１との間隔と一致する距離で往復移動する駆動機
構としてはエアーシリンダや送りねじ機構（図示せず）
であればよい。また、上記説明は切換板１７を移動制御
してそれぞれの吸引吐出口部２７に対して吸引口部１９
及び吐出口部２１を選択的に一致させて連通する構成と
したが、固定板１５を移動制御して一致させる構成であ
ってもよい。 【００２０】各吸引吐出口部２７には本体フレーム７に
設けられた吸引吐出作動部材２９が夫々接続されてい
る。吸引吐出作動部材２９はシリンダー２９ａ内にピス
トン２９ｂを摺動可能に支持した多数（上記の場合にあ
っては９６個）のインジェクターからなり、シリンダー
２９ａと各吸引吐出口部２７とはチューブ３３により接
続される。各吸引吐出作動部材２９のピストン２９ｂに
は作動板３４が一体に連結され、該作動板３４の往復移
動によりチューブ３３を含めたシリンダー２９ａ内に試
料溶液を吸引すると共にこれらに溜められた試料溶液を
吐出するように構成される。 【００２１】具体的には溜り部２５ａ・２６ａ内に溜め
られた固定試料溶液及び反応試料溶液を全量吸引するよ
うに作動板３４を所定の距離で移動して溜り部２５ａ・
２６ａ内の各試料溶液をチューブ３３を含むシリンダー
２９ａ内に吸引させると共に一回の吐出量が、例えば１
０マイクロlとなるように作動板３４を微小移動してチ
ューブ３３を含むシリンダー２９ａ内の各試料溶液を吐
出させる。 【００２２】上記した分注装置５は本体フレーム７の図
示する左側に配置され、該分注装置５はチューブ３５を
介して吸引吐出装置３の各吐出口部２１に接続される。
該分注装置５は本体フレーム７に対して図示する左右方
向へ移動可能に支持された第２走行体３７と、該第２走
行体３７に図示する前後方向へ移動可能に支持された第
３走行体３９と、該第３走行体３９に設けられた第２上
下フレーム４１に上下方向へ移動可能に支持された第２
ホルダ４３と、該第２ホルダ４３に設けられた分注部材
や分注ノズルからなる多数（上記の場合にあっては９６
個）の分注部材４７とから構成される。 【００２３】本体フレーム７に対して第２走行体３７、
第２走行体３７に対して第３走行体３９及び第２上下フ
レーム４１に対して第２ホルダ４３を夫々移動する駆動
機構としては、上記したベルト駆動機構、送りねじ駆動
機構及びリニアモータ等の何れであってもよい。 【００２４】各分注部材４７は先端面の直径が微小径
で、基端部に接続される夫々のチューブ３５を介して上
記した各吐出口部２１に接続されている。そして各分注
部材４７は全ての分注部材４７が基板５３内に位置する
ように図示する左右方向及び前後方向へ微小間隔をおい
てマトリックス状に配列される。 【００２５】なお、各分注部材４７の配列間隔は基板５
３におけるスポッティング面積とスポッティング数との
関係から決定される。 【００２６】多数の分注部材４７がマトリクス状に配列
された分注部材群４９の下方に応じた本体フレーム７に
は基板載置台５１が設けられ、該基板載置台５１には、
試料チップ５５を作製する際にはスライドガラス、膜、
プラスチックス（ポリエチレン、ポリプロピレン）等の
基板５３が位置決め可能に配置される。基板５３の好適
例としては、スライドガラスが挙げられ、好ましくは基
板５３の表面に、各分注部材４７の配列間隔と一致する
間隔をおいて多数の穴５４ａが形成された極薄のブチル
ゴムやシリコンゴムシート等の薄膜５４を被覆し、該薄
膜５４の各穴５４ａ内に固定試料溶液を、相互汚染を防
止して溜めて試料チップ５５に作製される。 【００２７】上記のように構成されたスポッティング装
置１による試料チップの作製及び反応試料の分析方法を
図５〜図８に従って説明する。 【００２８】先ず、試料チップ５５の作製する際におけ
る基板５３に対する固定試料溶液のスポッティング方法
を説明すると、吸引吐出装置３の第１走行体９を移動制
御して夫々の吸引部材２３を固定試料用容器２５の各溜
り部２５ａに相対させる。また、分注装置５の第２走行
体３７及び第３走行体３９を移動制御し、各分注部材４
７の先端を基板載置台５１に位置決めされた状態で多段
集積された最上段に位置する基板５３に被覆形成された
薄膜５４の各穴５４ａに相対させる。 【００２９】なお、基板載置台５１に載置される多数の
基板５３としては、上記した多段集積の他に多数の基板
５１を平面的に配列してもよい。また、吸引吐出装置３
の切換板１７を各吸引吐出口部２７が対応する吸引口部
１９に一致するように移動する。 【００３０】上記状態にて第１上下フレーム１１を下降
制御して各吸引部材２３の先端部を対応する夫々の溜り
部２５ａ内に位置させた後、作動板３４を作動して各吸
引吐出作動部材２９のピストン２９ｂを吸引方向へ移動
してチューブ３３を含むシリンダー２９ａ内に溜り部２
５ａ内に溜められた固定試料溶液を吸引する。（図６参
照） 【００３１】次に、切換板１７を移動して各吸引吐出口
部２７を対応する吐出口部２１に一致させた後に分注装
置５の第２上下フレーム４１を下降制御して各分注部材
４７の先端を基板５３の表面に対して微小間隔をおいて
相対させる。 【００３２】この状態で作動板３４を分注量に応じた距
離で移動制御して夫々のチューブ３３及びシリンダー２
９ａ内に溜められた固定試料溶液を各分注部材４７から
基板５３の各穴５４ａ内に所定量（例えば１０マイクロ
l）づつ、一度にスポッティングする。（図７参照） 【００３３】なお、スポッティング初期においては、シ
リンダー２９ａやチューブ３５及び分注部材４７内の空
気を完全に除去してから試料溶液をスポッティングする
必要があり、チューブ３５及び分注部材４７内の空気量
を考慮して作動板３４の移動ストロークを長く設定する
必要がある。そしてこれらの空気を排除した後にあって
は作動板３４を、上記した所定量に応じたストロークで
微小移動して固定試料溶液を吐出させればよい。 【００３４】そして分注装置５の第２上下フレーム４１
を上方へ戻した後に固定試料溶液が各穴５４ａ内にスポ
ッティングされて溜められた基板５３を取出した後に、
再び、第２上下フレーム４１を下降して各分注部材４７
の先端を次段の基板５３における各穴５４ａに夫々相対
させた後、作動板３４を移動制御して基板５３の各穴５
４ａ内に固定試料溶液を所定量づつ、一度にスポッティ
ングする。上記動作の繰り返しにより一回の操作により
多数枚の基板５３に固定試料溶液を所定量づつ、スポッ
ティングして多数の試料チップ５５を、一回の吸引作用
により一度に作製する。 【００３５】なお、基板５３に対して固定試料を固定す
る必要がある場合には、固定試料用液がスポッティング
された基板５３に対し、例えばＵＶクロスリンカー（Ho
efer社製 ＵＶＣ５００）を使用して紫外光を照射して
固定試料溶液を乾燥して基板５３の表面に固定試料を固
定する乾固処理、ブロック液（例えば無水こはく酸、Ｎ
−メチルピロシノン、ホウ酸ナトリウム溶液等）に浸漬
して基板５３の非スポッティング領域をブロック処理し
て試料チップ５５を作製する。 【００３６】次に、反応試料を分析する際に試料チップ
に反応試料溶液を分注する方法を説明すると、試料チッ
プ５５に対して反応試料溶液を分注してスポッティング
するに先立って流路切換装置１４、吸引部材２３、吸引
吐出作動部材２９、分注部材４７及びこれらを接続する
チューブ３３・３５内の余剰な固定試料溶液を輩出した
り、これらに付着した固定試料を洗浄する。 【００３７】洗浄方法としては、先ず、載置台２４及び
基板載置台５１上に回収容器を夫々載置した状態で流路
切換装置１４により夫々の流路を切換えながら各吸引吐
出作動部材２９を作動して流路切換装置１４、吸引部材
２３、吸引吐出作動部材２９、分注部材４７及びこれら
を接続するチューブ３３・３５内の余剰な固定試料溶液
を吸引部材２３及び分注部材４７から夫々の回収容器内
に夫々吐出して回収する。次に、基板載置台５１に載置
された洗浄液容器内に分注部材４７を浸漬した状態で吸
引吐出作動部材２９を吸引作動して洗浄液を吸引した後
に流路切換装置１４により流路を切換えた後に該吸引吐
出作動部材２９を吐出作動して溜められた洗浄液を吸引
部材２３から回収容器内に吐出する作業を複数回繰り返
して流路切換装置１４、吸引部材２３、吸引吐出作動部
材２９、分注部材４７及びこれらを接続するチューブ３
３・３５に付着した固定試料を洗浄する。 【００３８】これらの洗浄に使用する洗浄液としは、
０．１％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液、超純水、エタ
ノールを順に使用して洗浄した後、分注部材４７を介し
て気相吸引することにより流路切換装置１４、吸引部材
２３、吸引吐出作動部材２９、分注部材４７及びこれら
を接続するチューブ３３・３５内に付着したエタノール
を乾燥させて行なう。 【００３９】上記洗浄後、載置台２４に各溜り部２６ａ
に反応試料溶液が溜められた反応試料用容器２６をセッ
トした後に、上記と同様に各溜り部２６ａ内に吸引部材
２３を浸漬した状態で吸引吐出作動部材２９を吸引作動
して反応試料溶液を吸引吐出作動部材２９のシリンダー
２９ａ内及びチューブ３５内に溜める。（図６参照） 【００４０】一方、基板載置台５１上に上記した方法で
作製された複数枚の試料チップ５５を多段状に載置した
後に吸引吐出作動部材２９を吐出作動して溜められた反
応試料溶液を、所定量づつ、各分注部材４７を介して固
定試料溶液が分注された試料チップ５５の各穴５４ａ内
に吐出して固定試料に対して反応試料を反応させること
により反応試料を分析する。（図８参照） 【００４１】本実施形態は、一度の操作により多数の固
定試料用液を基板５３上に分注して試料チップ５５を作
製することにより各スポットにおける固定試料の量をほ
ぼ均一化して試料チップを作製することができ、各スポ
ット間における反応精度のばらつきを最小限にすること
ができる。 【００４２】また、作製された試料チップ５５における
各固定試料に対する反応試料溶液の分注量のばらつきを
最小限にして測定精度を高めることができる。 【００４３】上記説明は、切換板１７を移動制御して吸
引吐出口部２７を、吸引口部１９及び吐出口部２１に選
択的に一致させる構成としたが、切換方法としては切換
盤を回動して選択的に一致させる方法及びスポッティン
グ数と一致する個数の３ポートバルブを使用した方法で
あってもよい。 【００４４】 【発明の効果】本発明は、占拠体積が小さい基板に対し
て一度の操作で多数の固定試料をスポッティングして多
数の試料チップを大量に作製することができると共に作
製された試料チップを使用して一度の操作で多数の反応
試料をスポッティングして固定試料と反応させて分析作
業を効率化することができる。また、試料チップを作製
する際には基板に対して微少量の固定試料を、各スポッ
トにおける固定試料量のばらつきを抑えてスポッティン
グして試料チップを作製することができると共に試料チ
ップの各固定試料に対して微少量の反応試料をほぼ均一
に分注して各スポットにおける反応のばらつきを最小限
して分析することを可能にする。更に、固定試料及び反
応試料の使用量を低減して分析コストを低コスト化する
ことを可能にする。

【図面の簡単な説明】 【図１】本発明を実施するスポッティング装置の概略を
示す説明図である。 【図２】吸引吐出装置を示す説明図である。 【図３】切換機構を示す説明図である。 【図４】分注装置を示す説明図である。 【図５】試料チップの作製及び反応試料の分析の工程図
である。 【図６】吸引状態を示す説明図である。 【図７】吐出及び分注状態を示す説明図である。 【図８】試料チップに対する反応試料溶液の分注状態を
示す説明図である。 【符号の説明】 １−スポッティング装置、３−吸引吐出装置、５−分注
装置、２３−吸引部材、２５−固定試料用容器、２９−
吸引吐出作動部材、４７−分注部材

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 37/00 １０２ Ｇ０１Ｎ 35/06 Ｊ (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 35/00 - 35/10 G01N 1/00 101 G01N 33/53 G01N 33/566 G01N 37/00 102 ＥＵＲＯＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (1)

1. (57)【特許請求の範囲】 【請求項１】スポッティングされる固定試料数と一致す
   る多数の吸引部材及び分注部材と吸引吐出作動部材とを
   選択的に連通可能に接続し、各吸引部材と吸引吐出作動
   部材とを選択的に連通した状態で吸引吐出作動部材に固
   定試料溶液を吸引した後に各吸引部材と吸引吐出作動部
   材との流路を閉鎖すると共に吸引吐出作動部材と分注部
   材の流路を開放して吸引吐出作動部材に溜められた固定
   試料溶液を分注部材から基板上に被覆形成された薄膜の
   各穴内に吐出して試料チップを作製する工程と、分注部
   材、吸引吐出作動部材及び吸引部材内に洗浄液を流通さ
   せて夫々を洗浄する工程と、各吸引部材と吸引吐出作動
   部材とを選択的に連通した状態で吸引吐出作動部材に反
   応試料溶液を吸引した後に各吸引部材と吸引吐出作動部
   材との流路を閉鎖すると共に吸引吐出作動部材と分注部
   材の流路を開放して吸引吐出作動部材に溜められた反応
   試料溶液を分注部材から基板上の各固定試料に対して分
   注吐出して反応させる工程とからなる試料チップの作製
   及び反応試料の分析方法。