JP3313000B2 - Process for producing S-(+)-mandelamide and its derivatives - Google Patents

Process for producing S-(+)-mandelamide and its derivatives

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JP3313000B2
JP3313000B2 JP25156294A JP25156294A JP3313000B2 JP 3313000 B2 JP3313000 B2 JP 3313000B2 JP 25156294 A JP25156294 A JP 25156294A JP 25156294 A JP25156294 A JP 25156294A JP 3313000 B2 JP3313000 B2 JP 3313000B2
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cyanohydrin
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mandelamide
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  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は微生物を用いてラセミ体
のシアンヒドリンまたはこのシアンヒドリンに対応する
アルデヒドと青酸から光学活性なS−(+)−マンデル
アミドおよびその誘導体を製造する方法に関する。S−
(+)−マンデルアミドおよびその誘導体は、加水分解
することによりS−(+)−マンデル酸およびその誘導
体に変換することができる。S−(+)−マンデルアミ
ドおよびS−(+)−マンデル酸ならびにこれらの誘導
体は医・農薬の合成原料として重要な物質である。
The present invention relates to a process for producing optically active S-(+)-mandelamide and its derivatives from racemic cyanohydrin or an aldehyde corresponding to the cyanohydrin and hydrocyanic acid using a microorganism. S-
(+)-Mandelamide and its derivatives can be converted to S-(+)-mandelic acid and its derivatives by hydrolysis. S-(+)-mandelamide and S-(+)-mandelic acid and their derivatives are important substances as raw materials for synthesis of medical and agricultural chemicals.

【0002】[0002]

【従来技術】微生物によりニトリル化合物を水和して対
応するアミドを生産する技術に関する発明は多く、不斉
炭素を分子内に有するニトリルからのアミドの生産に関
しては、バチルス属、バクテリジューム属、マイクロコ
カス属、ブレビバクテリウム属に属する微生物をD,L
−α−アミノニトリルに作用させL−α−アミノ酸とD
−α−アミノアミドの混合物を得る方法(特表昭56−
50031号公報参照)、ブレビバクテリウム属R31
2株のA4変異株を用いてラセミ体のα−アミノ−γ−
メチルチオブチロニトリル、α−アミノプロピオニトリ
ル、α−アミノブチロニトリル、α−アミノ−β−フェ
ニルプロピオニトリル、α−アミノ−γ−メチルペンチ
ルニトリルおよびα−アミノイソバレロニトリルから対
応するL−体のアミノ酸とD−体のアミノアミドを50
%づつの混合比で得る方法〔Adv.Biochem. Engineer.
14 1(1980)参照)、シュードモナス属、ロド
コッカス属、ノカルディア属によるD,L−アミノニト
リルから光学活性なα−アミノ酸および/またはα−ア
ミノアミドを生産する方法(特開平2−31694号公
報参照)、およびD,L−α−アミノニトリルから立体
特異的加水分解酵素により約40%eeのL−α−アミノ
アミドを得る方法(特表昭63−500004号公報参
照)などが知られている。
2. Description of the Related Art Hydration of nitrile compounds by microorganisms
Many inventions related to the technology to produce the corresponding amide
Production of amides from carbon-containing nitriles
Bacillus, Bacterium, Microco
Microorganisms belonging to the genus Kas and Brevibacterium are D, L
L-α-amino acid and D
-Method of obtaining a mixture of α-aminoamides (Table 1)
No. 50031), Brevibacterium R31
Using two A4 mutants, racemic α-amino-γ-
Methylthiobutyronitrile, α-aminopropionitrile
, Α-aminobutyronitrile, α-amino-β-fe
Nylpropionitrile, α-amino-γ-methyl pent
From nitrile and α-aminoisovaleronitrile
The corresponding L-form amino acids and D-form aminoamides are
A method of obtaining the mixture at a mixing ratio of% [Adv. Biochem. Engineer.
14 1 (1980)), Pseudomonas, Rhodo
D, L-Aminonito by the genus Coccus and Nocardia
Optically active α-amino acid and / or α-amino acid
Method for producing minoamide (JP-A-2-31694)
) And D, L-α-aminonitrile
About 40% ee of L-α-amino by specific hydrolase
Method for obtaining amide (see Japanese Patent Publication No. 63-500004)
Are known.

【0003】また、α−アミノニトリル類からL−アミ
ノ酸類を製造する際に、対応するアルデヒドを存在させ
ることによりアミド類の副生を抑え、L−アミノ酸を選
択的に産生させる方法(特開平1−317393号公報
参照)があるが、この方法におけるアルデヒドの添加は
アミド類の副生を防止することを意図したものであり、
対応するアルデヒドを添加することによる反応速度およ
び生産性の改良を目的としたものではない。
Further, when producing L-amino acids from α-aminonitriles, a method of selectively producing L-amino acids by suppressing the by-production of amides by the presence of the corresponding aldehyde (Japanese Patent Laid-Open No. However, the addition of aldehyde in this method is intended to prevent by-products of amides,
It is not intended to improve the reaction rate and productivity by adding the corresponding aldehyde.

【0004】一方、本発明者の一部らは、これらの方法
が光学活性なアミドとアミノ酸の混合物を与えるため
に、純粋な一方の化合物を取得するには煩雑な分離操作
が要求されること、また原理的にもアミドの収率が半分
にしか達し得ないことなど、製造上、技術的に解決すべ
き諸々の問題が見られることから、原料のすべてを一方
の光学活性体に変換する手法の開発を行い、微生物を用
いてラセミ体のマンデロニトリルおよびその誘導体、ま
たはベンズアルデヒドおよびその誘導体と青酸の混合物
から直接優位量の光学活性なS−(+)−マンデルアミ
ドおよびその誘導体を製造する方法(特開平4−222
591号公報参照)を提案した。
[0004] On the other hand, some of the present inventors have argued that since these methods give a mixture of an optically active amide and an amino acid, a complicated separation operation is required to obtain one pure compound. In terms of production, there are various problems that need to be solved technically, such as the fact that the yield of amide can only reach half in principle, so all of the raw materials are converted to one optically active substance Development of a method to produce superior dominant amounts of optically active S-(+)-mandelamide and its derivatives directly from racemic mandelonitrile and its derivatives, or a mixture of benzaldehyde and its derivatives and hydrocyanic acid, using microorganisms (Japanese Patent Laid-Open No. 4-222)
No. 591).

【0005】[0005]

【発明が解決しようとする課題】この特開平4−222
591号公報記載の方法は、原料のラセミ体シアンヒド
リンが水溶液中でベンズアルデヒドと青酸に解離平衡す
ることにより容易にラセミ化する性質を利用し、このラ
セミ化と光学特異的なニトリル水和活性を有する微生物
とを組合わせることにより、シアンヒドリンの全てをS
−体マンデルアミドおよびその誘導体に変換するもので
ある。しかしながら、反応時に酵素活性が除々に低下
し、菌体当りのマンデルアミド生産性が充分に高いもの
ではなかった。したがって、如何に酵素の失活を抑制
し、S−(+)−マンデルアミドおよびその誘導体の生
産性を上昇させるかが課題であった。
The problem to be solved by the present invention is disclosed in Japanese Patent Laid-Open No. 4-222.
The method described in No. 591 utilizes the property that racemic cyanohydrin as a raw material easily racemizes by dissociation equilibrium into benzaldehyde and hydrocyanic acid in an aqueous solution, and has a racemization and optically specific nitrile hydration activity. By combining with microorganisms, all of the cyanohydrin can be converted to S
-Conversion to mandelamide and its derivatives. However, the enzyme activity gradually decreased during the reaction, and the productivity of mandelamide per cell was not sufficiently high. Therefore, a problem was how to suppress the inactivation of the enzyme and increase the productivity of S-(+)-mandelamide and its derivatives.

【0006】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく研究を重ねた結果、反応時に原料のシアン
ヒドリンに対応するアルデヒドを特定量添加することに
より酵素の失活を抑制し得ることを見い出し本発明を完
成した。
Means for Solving the Problems The present inventors have conducted studies to solve the above problems, and as a result, it has been found that by adding a specific amount of aldehyde corresponding to the starting material cyanohydrin during the reaction, the inactivation of the enzyme is suppressed. We have found that we have completed the present invention.

【0007】すなわち、本発明は、下記一般式(1)で
示されるラセミ体のシアンヒドリン、または該シアンヒ
ドリンに対応する下記一般式(2)で示されるアルデヒ
ドと青酸に、中性または塩基性の水性媒体中で、該シア
ンヒドリンのシアン基を立体特異的に水和する能力を有
する微生物またはその処理物を作用させることにより、
一般式(1)で示されるラセミ体のシアンヒドリンまた
は一般式(2)で示されるアルデヒドと青酸から直接優
位量の下記一般式(3)で示される光学活性なS−
(+)−マンデルアミドまたはその誘導体を製造する方
法において、該シアンヒドリンに対応する一般式(2)
で示されるアルデヒドを、反応系内に溶解し得る範囲内
で、且つ一般式(1)で示されるラセミ体のシアンヒド
リンに対しては1〜10倍モル、また青酸に対しては2
〜11倍モル添加することを特徴とするS−(+)−マ
ンデルアミドおよびその誘導体の製造法、である。
That is, the present invention provides a neutral or basic aqueous solution of a racemic cyanohydrin represented by the following general formula (1) or an aldehyde and a hydrocyanic acid represented by the following general formula (2) corresponding to the cyanohydrin. In a medium, a microorganism having the ability to stereospecifically hydrate the cyano group of the cyanohydrin or a treated product thereof is allowed to act,
The optically active S- represented by the following general formula (3), which is directly superior to the racemic cyanohydrin represented by the general formula (1) or the aldehyde represented by the general formula (2) and hydrocyanic acid,
In a process for producing (+)-mandelamide or a derivative thereof, a compound represented by the general formula (2) corresponding to the cyanohydrin:
Is within the range in which the aldehyde can be dissolved in the reaction system, and is 1 to 10 moles relative to the racemic cyanohydrin represented by the general formula (1), and 2 moles relative to the hydrocyanic acid.
A method for producing S-(+)-mandelamide and its derivatives, characterized in that the compound is added in an amount of about 11-fold mol.

【0008】[0008]

【化2】 〔Xは水素、メチル基、メトキシ基、イソプロピル基、
ヒドロキシル基、ニトロ基、スルホン基またはハロゲン
を表す〕
Embedded image [X is hydrogen, methyl, methoxy, isopropyl,
Represents a hydroxyl group, a nitro group, a sulfone group or a halogen]

【0009】本発明においては、微生物反応の基質とし
て、一般式(1)で示されるラセミ体のシアンヒドリ
ン、またはこのシアンヒドリンに対応する、すなわち水
溶液中で該シアンヒドリンと解離平衡する下記一般式
(2)で示されるアルデヒドと青酸を使用する。
In the present invention, as a substrate for a microbial reaction, racemic cyanohydrin represented by the general formula (1) or the following general formula (2) corresponding to the cyanohydrin, that is, dissociating equilibrium with the cyanohydrin in an aqueous solution: The aldehyde and hydrocyanic acid represented by are used.

【0010】一般式(1)のシアンヒドリンとしては、
例えば、マンデロニトリル、2−メチルマンデロニトリ
ル、2−メトキシマンデロニトリル、4−イソプロピル
マンデロニトリル、4−ヒドロキシマンデロニトリル、
3−および4−ニトロマンデロニトリル、3−スルホマ
ンデロニトリル、2−、3−および4−クロルマンデロ
ニトリル、2−、3−および4−ブロムマンデロニトリ
ルが挙げられ、一般式(2)で示されるアルデヒドは、
ベンズアルデヒド等のそれぞれ一般式(1)のシアンヒ
ドリンに対応するアルデヒドである。
As the cyanohydrin of the general formula (1),
For example, mandelonitrile, 2-methylmandelonitrile, 2-methoxymandelonitrile, 4-isopropylmandelonitrile, 4-hydroxymandelonitrile,
3- and 4-nitromandelonitrile, 3-sulfomandelonitrile, 2-, 3- and 4-chloromandelonitrile, 2-, 3- and 4-bromomandelonitrile, and the general formula (2) The aldehyde represented by
These are aldehydes corresponding to cyanohydrin of the general formula (1), such as benzaldehyde.

【0011】基質としてシアンヒドリンを用いる場合、
シアンヒドリンの濃度は、通常0.1〜10重量%、好
ましくは0.2〜5.0重量%であり、このシアンヒド
リンに対応するアルデヒドを反応系内に溶解し得る範囲
内で、且つ該シアンヒドリンに対して1〜10倍モル、
好ましくは1〜5倍モル添加する。また、基質としてア
ルデヒドと青酸を用いる場合には、青酸濃度は、通常
0.1〜1.0重量%、好ましくは0.1〜0.5重量
%であり、アルデヒドを反応系内に溶解し得る範囲内
で、且つ青酸に対して2〜11倍モル、好ましくは2〜
6倍モル添加する。
When using cyanhydrin as a substrate,
The concentration of the cyanohydrin is usually 0.1 to 10% by weight, preferably 0.2 to 5.0% by weight, and is within a range in which the aldehyde corresponding to the cyanohydrin can be dissolved in the reaction system. 1 to 10 times the molar amount,
Preferably, it is added in a molar amount of 1 to 5 times. When aldehyde and hydrocyanic acid are used as substrates, the hydrocyanic acid concentration is usually 0.1 to 1.0% by weight, preferably 0.1 to 0.5% by weight, and the aldehyde is dissolved in the reaction system. Within the range to be obtained, and 2 to 11 times mol, preferably 2 to 1 mol of hydrocyanic acid.
Add 6 times mol.

【0012】アルデヒドの添加量は、使用する基質の種
類、濃度により異なるが、上記範囲内で適宜決めること
ができる。添加量が反応系内に溶解し得る範囲を越える
と、アルデヒドの油滴が生成し、この油滴に基質が移行
するためか、反応速度が低下する。また、上記下限値未
満では効果が少なく、一方上限値地を越えても効果は頭
打ちとなる。
The amount of the aldehyde to be added varies depending on the type and concentration of the substrate used, but can be appropriately determined within the above range. If the amount added exceeds the range that can be dissolved in the reaction system, oil droplets of aldehyde will be generated, and the reaction rate will decrease, probably because the substrate is transferred to these oil droplets. The effect is small when the value is less than the above lower limit, while the effect level out even when the value exceeds the upper limit.

【0013】反応媒体としては、基質であるシアンヒド
リンのラセミ化を促進するために、水または緩衝液など
の水性媒体を用い、反応系を中性付近ないしは塩基性、
すなわちpH4〜11、好ましくはpH6〜10に調整
する。
As a reaction medium, an aqueous medium such as water or a buffer is used to promote the racemization of cyanhydrin as a substrate.
That is, the pH is adjusted to 4 to 11, preferably 6 to 10.

【0014】本発明に用いられる微生物としては、例え
ば、ロドコッカス属の微生物としてATCC 3327
8、ロドコッカス sp.HN6−1(微工研菌寄第1
1773号)、ロドコッカス sp.HT40−6(
ERM BP−5231)、ロドコッカス sp.PN
42−2(微工研菌寄第11775号)およびシュード
モナス属の微生物としてシュードモナス クロロラフィ
ス B23(微工研条寄第187号)を挙げることがで
きる。
The microorganism used in the present invention is, for example, ATCC 3327 as a microorganism belonging to the genus Rhodococcus.
8, Rhodococcus sp. HN6-1
1773), Rhodococcus sp. HT40-6 ( F
ERM BP-5231 ), Rhodococcus sp. PN
42-2 (Piercian Laboratories No. 11775) and Pseudomonas microorganisms include Pseudomonas chlororafis B23 (Pierce Laboratories No. 187).

【0015】次に本発明の一般的実施態様について説明
する。本発明に使用される微生物の培養は資化し得るグ
ルコース、グリセロール、サッカロースなどの炭素源、
尿素、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの窒素
源、生育に必須の塩化マグネシウム、塩化カルシウム、
塩化鉄などの無機栄養素などを含有した通常の培地を用
いて行なわれる。また、これらの培地に酵母エキス、肉
エキス、糖蜜などの天然培地を添加したものも使用する
ことができる。さらに、培養初期から中期に生育を大き
く阻害しない濃度のベンゾニトリル、ベンジルシアニ
ド、イソブチロニトリルなどのニトリル類、ε−カプロ
ラクタムなどのラクタム類、イソブチルアミド、フェニ
ルアセトアミドなどのアミド類を酵素誘導物質として、
またコバルトイオン、鉄イオンなどを酵素の補欠分子族
として添加することにより高い酵素活性が得られる。
Next, a general embodiment of the present invention will be described. Culture of microorganisms used in the present invention can be assimilated glucose, glycerol, a carbon source such as saccharose,
Nitrogen sources such as urea, ammonium sulfate and ammonium nitrate, magnesium chloride and calcium chloride essential for growth,
The reaction is performed using a normal medium containing an inorganic nutrient such as iron chloride. Further, those obtained by adding a natural medium such as yeast extract, meat extract, molasses, etc. to these mediums can also be used. Furthermore, enzymatic induction of nitriles such as benzonitrile, benzyl cyanide, isobutyronitrile, lactams such as ε-caprolactam, and amides such as isobutylamide and phenylacetamide at concentrations that do not significantly inhibit growth from the initial to the middle of culture. As a substance,
In addition, high enzyme activity can be obtained by adding cobalt ions, iron ions and the like as prosthetic groups of the enzyme.

【0016】使用する培地のpHは4〜10、培養温度
は5〜50℃の範囲で選べばよく、培養は1〜14日程
度好気的に行い活性が最大となるまで継続すればよい。
The pH of the medium to be used may be selected in the range of 4 to 10 and the culture temperature in the range of 5 to 50 ° C. The culture may be performed aerobically for about 1 to 14 days and continued until the activity is maximized.

【0017】一般式(1)で示されるシアンヒドリン等
の水和反応は、上記の方法にて培養した微生物の菌体ま
たは菌体処理物(菌体の破砕物、粗・精製酵素、固定化
菌体・酵素等)を所定のpHに調製した水または緩衝液
などの水性媒体中で、所定量の基質およびアルデヒドに
接触させることによって行われる。
The hydration reaction of the cyanohydrin or the like represented by the general formula (1) is carried out according to the method of the present invention. (Body, enzyme, etc.) in an aqueous medium such as water or a buffer solution adjusted to a predetermined pH, with a predetermined amount of a substrate and an aldehyde.

【0018】微生物等の使用量は基質に対して乾燥菌体
として0.01〜5.0重量%であり、反応温度は0〜
50℃、好ましくは10〜30℃、反応時間は1〜72
時間程度である。
The amount of microorganisms and the like to be used is 0.01 to 5.0% by weight as dry cells based on the substrate, and the reaction temperature is 0 to 5.0%.
50 ° C., preferably 10-30 ° C., reaction time 1-72
About an hour.

【0019】かくして、一般式(1)で示されるラセミ
体のシアンヒドリンまたは一般式(2)で示されるアル
デヒドと青酸から高収率で光学活性S−(+)−マンデ
ルアミドおよびその誘導体が生産、蓄積される。生成物
の単離は濃縮、抽出、晶析などの公知の方法を利用して
行うことができる。
Thus, optically active S-(+)-mandelamide and its derivatives are produced in high yield from racemic cyanohydrin of the general formula (1) or aldehyde of the general formula (2) and hydrocyanic acid. Stored. The product can be isolated using a known method such as concentration, extraction, or crystallization.

【0020】[0020]

【実施例】以下、実施例により本発明を具体的に説明す
る。
The present invention will be described below in detail with reference to examples.

【0021】実施例1 (1)培養 下記培地にロドコッカス属のPN42−2、HN6−1
およびHT40−6株を各々接種し30℃で96時間好
気的に培養を行った。 培地(pH7.4) グルコース 27g ポリペプトン 4g 酵母エキス 2g 硫酸アンモニウム 0.2g 硝酸アンモニウム 2g MgCl2 0.2g CaCl2 40mg MnSO4 ・4H2 O 4mg FeCl3 ・7H2 O 0.7mg ZnSO4 ・7H2 O 0.1mg ε−カプロラクタム 4g CoCl2 ・6H2 O 30mg 30mMりん酸緩衝液(pH7.4) 1000ml
Example 1 (1) Culture In the following medium, Rhodococcus sp. PN42-2, HN6-1
And HT40-6 strain were inoculated, respectively, and aerobically cultured at 30 ° C. for 96 hours. Medium (pH 7.4) Glucose 27g polypeptone 4g Yeast extract 2g ammonium sulfate 0.2g ammonium nitrate 2g MgCl 2 0.2g CaCl 2 40mg MnSO 4 · 4H 2 O 4mg FeCl 3 · 7H 2 O 0.7mg ZnSO 4 · 7H 2 O 0 0.1 mg ε-caprolactam 4 g CoCl 2 .6H 2 O 30 mg 30 mM phosphate buffer (pH 7.4) 1000 ml

【0022】(2)活性測定 培地から菌体を採取し、遠心分離により各々の菌体を2
0mMりん酸緩衝液(pH7.5)で3回洗浄した。沈
殿した菌体を上記緩衝液に懸濁し、これを終濃度が10
mMマンデロニトリルと0〜40mMベンズアルデヒド
となるようにりん酸緩衝液(pH7.5)に添加し、3
0℃、30分間攪拌しながら反応を行った。反応の停止
は反応液を遠心分離し菌体を除去することにより行っ
た。上清中のマンデルアミド含量を液体クロマトグラフ
ィー(HPLC)(カラム;SHODEXODS F511A キャリ
ア;0.1M H3 PO4 :アセトニトリル=4:1,モニタ
ー;254nm)で分析した。活性は、30℃において乾燥菌
体1mgが1分間に反応液1ml当り1μmolの生成物
を与える能力を1ユニット(1U)と定義して求めた。
ベンズアルデヒド添加区の活性を無添加区を100とし
たときの相対活性で表−1に示した。
(2) Activity measurement Cells were collected from the culture medium, and each cell was centrifuged to remove 2 cells.
The plate was washed three times with 0 mM phosphate buffer (pH 7.5). The precipitated cells were suspended in the above buffer, and the suspension was added to a final concentration of 10%.
mM mandelonitrile and 0-40 mM benzaldehyde were added to a phosphate buffer (pH 7.5).
The reaction was performed while stirring at 0 ° C. for 30 minutes. The reaction was stopped by centrifuging the reaction solution to remove the cells. The content of mandelamide in the supernatant was analyzed by liquid chromatography (HPLC) (column; SHODEXODS F511A carrier; 0.1MH 3 PO 4 : acetonitrile = 4: 1, monitor; 254 nm). The activity was determined by defining the ability of 1 mg of dried cells at 30 ° C. to give 1 μmol of a product per 1 ml of the reaction solution per minute as 1 unit (1 U).
The activity of the benzaldehyde-added group is shown in Table 1 as a relative activity with respect to the non-added group as 100.

【0023】(3)生産性 10mMマンデロニトリルと0〜40mMベンズアルデ
ヒドを含むりん酸緩衝液(pH7.5)に微量(反応時
OD630 = 0.005)の菌体を添加し、30℃、72時間
攪拌しながら反応させた。反応後、上清中のマンデルア
ミド含量を測定し、使用した菌体重量当たりのアミド生
産量を計算で求めた。ベンズアルデヒド無添加区の生産
性を100としたときの相対生産性で表−1に示した。
(3) Productivity To a phosphate buffer (pH 7.5) containing 10 mM mandelonitrile and 0 to 40 mM benzaldehyde, a very small amount (OD630 = 0.005 at the time of reaction) was added, and the mixture was stirred at 30 ° C. for 72 hours. While reacting. After the reaction, the content of mandelamide in the supernatant was measured, and the amount of amide produced per cell weight used was calculated. Table 1 shows the relative productivity when the productivity in the benzaldehyde-free area was set to 100.

【0024】実施例2 (1)培養 下記培地にシュードモナス クロロラフィス B23株
を接種し25℃で96時間好気的に培養を行った。 培地(pH7.2) シュークロース 10g 味液 10g メタクリルアミド 2g FeSO4 ・7H2 O 10mg MgSO4 ・7H2 O 20mg 蒸留水 1000ml
Example 2 (1) Culture The following medium was inoculated with Pseudomonas chlororafis B23 strain and cultured aerobically at 25 ° C. for 96 hours. Medium (pH 7.2) sucrose 10g taste solution 10g methacrylamide 2g FeSO 4 · 7H 2 O 10mg MgSO 4 · 7H 2 O 20mg Distilled water 1000ml

【0025】(2)活性、生産性測定 実施例1と同様にして行った。結果を表−1に示した。(2) Measurement of activity and productivity The measurement was carried out in the same manner as in Example 1. The results are shown in Table 1.

【0026】実施例3 (1)培養 実施例1と同様にしてロドコッカス HT40−6株を
培養した。
Example 3 (1) Culture Rhodococcus HT40-6 strain was cultured in the same manner as in Example 1.

【0027】(2)活性測定 実施例1と同様に洗浄、懸濁したHT40−6菌体を、
2または3mMのシアンヒドリンおよび各シアンヒドリ
ンに対応するアルデヒド2〜9mMを含む20mMりん
酸緩衝液(pH7.5)に添加し、30℃、30分間攪
拌しながら反応を行い、実施例1と同様に相対活性を求
めた。結果を表−2に示した。
(2) Activity measurement The HT40-6 cells washed and suspended in the same manner as in Example 1 were
The mixture was added to 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 2 or 3 mM of cyanohydrin and 2 to 9 mM of aldehyde corresponding to each cyanohydrin, and the reaction was carried out with stirring at 30 ° C. for 30 minutes. Activity was determined. The results are shown in Table-2.

【0028】(3)生産性測定 実施例1と同様に洗浄、懸濁したHT40−6菌株を、
2または3mMのシアンヒドリンおよび各シアンヒドリ
ンに対応するアルデヒド2〜9mMを含む20mMりん
酸緩衝液(pH7.5)に添加し、30℃で72時間攪
拌しながら反応を行い、実施例1と同様にして相対生産
性を求めた。結果を表−2に示した。
(3) Measurement of Productivity The HT40-6 strain washed and suspended in the same manner as in Example 1 was
It was added to 20 mM phosphate buffer (pH 7.5) containing 2 or 3 mM of cyanohydrin and 2 to 9 mM of aldehyde corresponding to each cyanohydrin, and the reaction was carried out with stirring at 30 ° C. for 72 hours. Relative productivity was determined. The results are shown in Table-2.

【0029】実施例4 (1)培養 実施例1と同様にロドコッカス HT40−6株を培養
した。
Example 4 (1) Culture Rhodococcus HT40-6 strain was cultured in the same manner as in Example 1.

【0030】(2)蓄積反応 実施例1と同様に洗浄、懸濁したHT40−6株(乾燥
菌体として0.6g)を10mMのマンデロニトリルと
30mMのベンズアルデヒドを含む300mlの20m
Mりん酸緩衝液(pH7.5)に添加し、15℃で攪拌
しながら反応を行い、実施例1に示したHPLCにより
反応の進行を確認しながら、マンデロニトリルを手動で
供給し48時間蓄積反応を行った。また、比較のためベ
ンズアルデヒド無添加でも同様な実験を行った。結果を
表−3に示した。
(2) Accumulation reaction The HT40-6 strain (0.6 g as dry cells) washed and suspended in the same manner as in Example 1 was prepared by adding 300 ml of 20 ml of 10 mM mandelonitrile and 30 mM benzaldehyde.
M was added to a phosphate buffer (pH 7.5), the reaction was carried out with stirring at 15 ° C., and while the progress of the reaction was confirmed by HPLC as described in Example 1, mandelonitrile was supplied manually for 48 hours. An accumulation reaction was performed. For comparison, a similar experiment was performed without adding benzaldehyde. The results are shown in Table-3.

【0031】なお、上記実施例1〜4において、生成し
たマンデルアミドおよびその誘導体の光学純度を光学分
割用カラム(CHIRALCEL CA−1,ダイセル
化学工業、キャリア;100%エタノール)を用いて測
定した。その結果、いずれの実施例においても光学純度
はS−(+)体として90%ee以上であった。
In Examples 1 to 4, the optical purity of the produced mandelamide and its derivative was measured using an optical resolution column (CHIRALCEL CA-1, Daicel Chemical Industries, carrier; 100% ethanol). As a result, in each of the examples, the optical purity was 90% ee or more as the S-(+) form.

【0032】[0032]

【表1】 [Table 1]

【0033】[0033]

【表2】 [Table 2]

【0034】[0034]

【表3】 [Table 3]

【0035】[0035]

【発明の効果】本発明によれば、酵素の失活が抑制で
き、ラセミ体のシアンヒドリン、またはアルデヒドと青
酸から直接優位量(50〜100%)のS−(+)−マ
ンデルアミド等を高収率で生産、蓄積することができ、
原料の全てを化学量論的に目的物に変換することも可能
である。
According to the present invention, inactivation of the enzyme can be suppressed, and racemic cyanohydrin, or S-(+)-mandelamide or the like, which is directly superior to aldehyde and hydrocyanic acid (50 to 100%), can be obtained. Can be produced and accumulated in yield,
It is also possible to convert all of the raw materials stoichiometrically to the desired product.

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12P 13/02 CA(STN) REGISTRY(STN) BIOSIS/WPI(DIALOG)Continued on the front page (58) Fields investigated (Int. Cl. 7 , DB name) C12P 13/02 CA (STN) REGISTRY (STN) BIOSIS / WPI (DIALOG)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項1】 下記一般式(1)で示されるラセミ体の
シアンヒドリン、または該シアンヒドリンに対応する下
記一般式(2)で示されるアルデヒドと青酸に、中性ま
たは塩基性の水性媒体中で、該シアンヒドリンのシアン
基をロドコッカス属細菌またはその処理物を作用させる
ことにより、一般式(1)で示されるラセミ体のシアン
ヒドリンまたは一般式(2)で示されるアルデヒドと青
酸から直接優位量の下記一般式(3)で示される光学活
性なS−(+)−マンデルアミドまたはその誘導体を製
造する方法において、該シアンヒドリンに対応する一般
式(2)で示されるアルデヒドを、反応系内に溶解し得
る範囲内で、且つ一般式(1)で示されるラセミ体のシ
アンヒドリンに対しては1〜10倍モル、また青酸に対
しては2〜11倍モル添加することを特徴とするS−
(+)−マンデルアミドおよびその誘導体の製造法。 【化1】 〔Xは水素、メチル基、メトキシ基、イソプロピル基、
ヒドロキシル基、ニトロ基、スルホン基またはハロゲン
を表す〕
1. A racemic cyanohydrin represented by the following general formula (1), or an aldehyde represented by the following general formula (2) and a hydrocyanic acid corresponding to the cyanohydrin, in a neutral or basic aqueous medium: By reacting the cyanohydrin cyanide group with a Rhodococcus genus bacterium or a processed product thereof, a racemic cyanohydrin represented by the general formula (1) or an aldehyde represented by the general formula (2) and an aldehyde and a hydrocyanic acid, which are superior in amount, In a method for producing an optically active S-(+)-mandelamide represented by the formula (3) or a derivative thereof, an aldehyde represented by the general formula (2) corresponding to the cyanohydrin may be dissolved in a reaction system. Within the range, 1 to 10 times the molar amount of racemic cyanohydrin represented by the general formula (1), and 2 to 11 times the molar amount of hydrocyanic acid. S- characterized by adding
A method for producing (+)-mandelamide and its derivatives. Embedded image [X is hydrogen, methyl, methoxy, isopropyl,
Represents a hydroxyl group, a nitro group, a sulfone group or a halogen]
【請求項2】 下記一般式(1)で示されるラセミ体の
シアンヒドリン、または該シアンヒドリンに対応する下
記一般式(2)で示されるアルデヒドと青酸に、中性ま
たは塩基性の水性媒体中で、該シアンヒドリンのシアン
基をシュードモナス クロロラフィスB23またはその
処理物を作用させることにより、一般式(1)で示され
るラセミ体のシアンヒドリンまたは一般式(2)で示さ
れるアルデヒドと青酸から直接優位量の下記一般式
(3)で示される光学活性なS−(+)−マンデルアミ
ドまたはその誘導体を製造する方法において、該シアン
ヒドリンに対応する一般式(2)で示されるアルデヒド
を、反応系内に溶解し得る範囲内で、且つ一般式(1)
で示されるラセミ体のシアンヒドリンに対しては1〜1
0倍モル、また青酸に対しては2〜11倍モル添加する
ことを特徴とするS−(+)−マンデルアミドおよびそ
の誘導体の製造法。 【化2】 〔Xは水素、メチル基、メトキシ基、イソプロピル基、
ヒドロキシル基、ニトロ基、スルホン基またはハロゲン
を表す〕
2. A racemic cyanohydrin represented by the following general formula (1) or an aldehyde represented by the following general formula (2) and a hydrocyanic acid corresponding to the cyanohydrin in a neutral or basic aqueous medium: By reacting the cyano group of the cyanohydrin with Pseudomonas chlororaphis B23 or a processed product thereof, the cyanide group has a direct superiority to the racemic cyanohydrin represented by the general formula (1) or the aldehyde and hydrocyanic acid represented by the general formula (2). In a method for producing an optically active S-(+)-mandelamide represented by the general formula (3) or a derivative thereof, an aldehyde represented by the general formula (2) corresponding to the cyanohydrin is dissolved in a reaction system. Within the range obtained, and in general formula (1)
1 to 1 for the racemic cyanohydrin represented by
A process for producing S-(+)-mandelamide and its derivatives, characterized in that it is added in a molar amount of 0-fold and 2 to 11 times the molar amount of cyanuric acid. Embedded image [X is hydrogen, methyl, methoxy, isopropyl,
Represents a hydroxyl group, a nitro group, a sulfone group or a halogen]
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