JP3306434B2

JP3306434B2 - 抗ヒトヘムオキシゲナーゼ−１モノクローナル抗体

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Publication number: JP3306434B2
Application number: JP2000309737A
Authority: JP
Inventors: 誠末松
Original assignee: 学校法人慶應義塾
Priority date: 2000-10-10
Filing date: 2000-10-10
Publication date: 2002-07-24
Anticipated expiration: 2020-10-10
Also published as: WO2002030987A1; JP2002112791A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトヘムオキシゲ
ナーゼ−１（ヒトＨＯ−１）に反応するが、ヒトヘムオ
キシゲナーゼ−２（ヒトＨＯ−２）とは反応せず、ヒト
ＨＯ−１活性を抑制することができるモノクローナル抗
体や、かかるモノクローナル抗体を用いる、ヒトＨＯ−
１の測定方法や検出方法、細胞又は組織におけるストレ
スの検出方法等に関する。

【０００２】

【従来の技術】肝臓は、ヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ）に
よる酵素反応を介して、ヘモグロビンの色素部分である
ヘム分子を分解する主要な臓器であることが報告されて
いる（Maines MD, et al., J. Biol. Chem. 261, 411-4
19, 1986、Maines MD, et al.,FASEB J. 2, 2557-2568,
1988）。このＨＯ酵素がヘム分子をα−メテン位で開
裂することにより、プロトヘムIX（protoheme IX）を分
解し、ビリベルジン−IXα、二価鉄及び一酸化炭素（Ｃ
Ｏ）が生成される。通常、肝臓は、少なくとも２つのＨ
Ｏアイソザイム、ヘムオキシゲナーゼ−１（ＨＯ−１）
やヘムオキシゲナーゼ−２（ＨＯ−２）を含んでいる。
このＨＯ−１は分子量約３３ｋＤａの酵素で、例えばヒ
トＨＯ−１は２８８アミノ酸残基からなり、ラットＨＯ
−１は２８９アミノ酸残基からなることが知られてい
る。このＨＯ−１は、肝臓や脾臓において高レベルで発
現しているが、他の組織（例えば、マクロファージ系な
ど）にも活性がみられ、重金属、環境毒性物質、熱ショ
ック、活性炭素、紫外線、サイトカイン、活性酵素など
多種の生体侵襲物質によるストレスに応答して細胞内に
発現誘導を起こすことが知られている（Mains MD, FASE
B J. 2, 2557-2568, 1988）。他方、上記ＨＯ−２は種
々の組織に存在する分子量約３６ｋＤａの非誘導型の酵
素で、ヒトＨＯ−２は３１６アミノ酸残基からなり、ラ
ットＨＯ−２においては３１５アミノ酸残基からなるこ
とが知られている。

【０００３】最近まで、ＨＯは老化赤血球の主成分であ
るヘモグロビンの分解に必要な異化酵素だと考えられ、
その生成物は有毒廃棄物であると考えられてきた。しか
し、近年の報告からＨＯ反応により得られた生成物の生
物学的作用により、ＨＯによる酵素反応の生理的重要性
が示された。例えば、ＨＯ−１欠損マウスにおいて、肝
臓のエンドトキシンに対する感染性が増大するという報
告がなされているが、この結果はおそらく、内在性のラ
ジカル・スカベンジャーであるビリベルジンやビリルビ
ンの生成減少により組織の抗酸化能力が欠乏したからで
あると考えられている（Poss, K.D., and S. Tonegawa.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 30, 10925, 1997）。そ
の他、ＨＯ反応は鉄調節タンパク質に結合する遊離二価
鉄を生成し、その結果、細胞内での鉄の貯蔵にとって主
なタンパク質である、転写後アップレギュレーションし
たフェリチンを刺激する。（DeRusso PA, et al., J. B
iol. Chem. 270, 15451-15454, 1995）。さらに、鉄の
再利用における酵素の役割として貧血性変化と共に肝臓
において鉄沈着を示すことが、ＨＯ−１欠損マウスの観
察結果と、ヒトによる最初のＨＯ−１欠損症例の観察結
果により証明されている（Yachie, et al., J. Clin. I
nvest. 103, 129-135, 1999）。

【０００４】その他の肝機能の調節において重要なＨＯ
反応の役割としては、ＣＯの生物学的活性に属するもの
である（Suematsu M, et al., Biochem. Biophys. Res.
Commun. 205, 1333-1337, 1994、Suematsu M, et al.,
J. Clin. Invest. 96, 2431-2437, 1995）。本発明者
らにより、無刺激ラットの肝臓において、ＣＯが、シヌ
ソイド状態を減少させ、微小血管潅流の維持に必須であ
る内在性因子としての役割を果たすことが報告されてい
る。この血管の正常な活動状態をコントロールするＣＯ
の役割は、ラットの肝臓において、乏血再潅流及びヘム
の過剰等のストレス条件下でＨＯ−１が誘導されること
によって証明されている。最近、Fernandezらによっ
て、実験的門脈圧亢進症又は硬変の肝臓が著しいＨＯ−
１誘導を示すことが報告されている（Fernandez M, et
al., Hepatology 29, 1672-1679, 1999）が、ＣＯの肝
門脈系循環の調節における生物学的特性はこれらの症例
において未だ調査されていない。さらに、ＨＯアイソザ
イム及び病的状態におけるＨＯアイソザイムの変化に対
する肝臓内局所学は、ヒトにおいては未だ解明されてい
ない。

【０００５】他方、ＨＯ−１等の酵素に対する抗血清や
抗体は多くの研究室で作製されている。本発明者らもラ
ットＨＯ−１に特異的に作用し、ラットＨＯ−２には交
叉反応性を示さない抗ラットＨＯ−１モノクロナール抗
体について既に報告している（J. Clin. Invest. 101,
604-612, 1998）。しかし、ヒトＨＯ−１を特異的に検
出し、且つヒトＨＯ−２と交叉反応性を示さない特異性
の高い抗ヒトＨＯ−１モノクローナル抗体は未だ作製さ
れていなかった。一方、細胞や組織におけるＨＯの酵素
活性の測定は、従来、基質であるprotoheme IXの添加に
よる生成物ビリベルジンあるいはビリルビンの測定によ
る分光分析で行われている。しかし、この方法ではＨＯ
−１とＨＯ−２との識別は不可能であり、ストレス応答
の指標としてのヒトＨＯ−１活性のみを定量的に測定す
る方法は確立されていなかった。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】本発明の課題は、スト
レス非誘導型酵素ヒトＨＯ−２と交叉反応性を示さず、
ストレス誘導型酵素ヒトＨＯ−１を特異的に検出するこ
とができる抗ヒトＨＯ−１モノクローナル抗体、特にヒ
トＨＯ−１活性を抑制することができるモノクローナル
抗体や、かかるモノクローナル抗体を用いたヒトＨＯ−
１の測定方法や検出方法、細胞又は組織におけるストレ
スの検出方法等を提供することにある。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、本発明者
らによる前記の方法（J. Clin. Invest. 101, 604-612,
1998）により、ラットＨＯ−１で免疫したマウスのＢ
リンパ球とマウス骨髄腫細胞とから調製したハイブリド
ーマ細胞が産生するモノクローナル抗体を用いて、ラッ
ト肝臓におけるＨＯアイソフォームの分布等の実験中、
抗ラットＨＯ−１モノクローナル抗体の１つがヒトＨＯ
−１に結合し、ヒトＨＯ−２と交叉反応せず、かつ、ヒ
トＨＯ−１の酵素活性を選択的に阻害することを偶々見
い出した。また、本発明者らは、かかるモノクローナル
抗体を用いて、ヒト肝臓におけるＨＯ−１及びＨＯ−２
等のＨＯアイソザイムの発現分布を確認し、さらに、肝
硬変症（ＬＣ）及び特発性門脈圧亢進症（ＩＰＨ）等の
異なるタイプの門脈圧亢進症においてそれらの発現パタ
ーンが変化することを観察した。本発明は、以上の知見
に基づいて完成するに至ったものである。

【０００８】すなわち本発明は、ヒトヘムオキシゲナー
ゼ−１と反応し、ヒトヘムオキシゲナーゼ−２とは反応
せず、ヒトヘムオキシゲナーゼ−１活性を抑制すること
ができることを特徴とするモノクローナル抗体又はその
可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメント
（請求項１）や、ハイブリドーマＧＴＳ−３（工業技術
院生命工学工業技術研究所受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７
３１４）又はそれらから誘導された細胞株が産生するこ
とを特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体又は
その可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメ
ント（請求項２）や、ハイブリドーマＧＴＳ−３（工業
技術院生命工学工業技術研究所受託番号ＦＥＲＭＢＰ
−７３１４）又はそれらから誘導された細胞株（請求項
３）に関する。

【０００９】また本発明は、請求項１又は２記載のモノ
クローナル抗体、該モノクローナル抗体の可変領域から
なる抗体結合部位を含む抗体フラグメントからなる群か
ら選ばれる少なくともいずれか１種を用いることを特徴
とするヒトヘムオキシゲナーゼ−１の測定方法（請求項
４）や、請求項１又は２記載のモノクローナル抗体及び
／又はその可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フ
ラグメントと、該モノクローナル抗体又はその可変領域
からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントとは異な
る部位でヒトヘムオキシゲナーゼ−１と反応する少なく
とも１種の第２のモノクローナル抗体及び／又はその可
変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントと
を用いることを特徴とする請求項４記載のヒトヘムオキ
シゲナーゼ−１の測定方法（請求項５）や、請求項１又
は２記載のモノクローナル抗体及び／又はその可変領域
からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントと、該モ
ノクローナル抗体又はその可変領域からなる抗体結合部
位を含む抗体フラグメントとは異なる部位でヒトヘムオ
キシゲナーゼ−１と反応する少なくとも１種の第２のモ
ノクローナル抗体及び／又はその可変領域からなる抗体
結合部位を含む抗体フラグメントのいずれか一方が固相
化されており、他方が標識されていることを特徴とする
請求項４又は５記載のヒトヘムオキシゲナーゼ−１の測
定方法（請求項６）や、請求項１又は２記載のモノクロ
ーナル抗体、該モノクローナル抗体の可変領域からなる
抗体結合部位を含む抗体フラグメントからなる群から選
ばれる少なくともいずれか１種の存在下及び非存在下
に、ヒトヘムオキシゲナーゼの全活性を測定することを
特徴とする請求項４記載のヒトヘムオキシゲナーゼ−１
の測定方法（請求項７）や、請求項１又は２記載のモノ
クローナル抗体、該モノクローナル抗体の可変領域から
なる抗体結合部位を含む抗体フラグメントからなる群か
ら選ばれる少なくともいずれか１種が含まれていること
を特徴とするヒトヘムオキシゲナーゼ−１測定用キット
（請求項８）や、請求項１又は２記載のモノクローナル
抗体及び／又はその可変領域からなる抗体結合部位を含
む抗体フラグメントと、該モノクローナル抗体又はその
可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメント
とは異なる部位でヒトヘムオキシゲナーゼ−１と反応す
る少なくとも１種の第２のモノクローナル抗体及び／又
はその可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグ
メントとが含まれていることを特徴とするヒトヘムオキ
シゲナーゼ−１測定用キット（請求項９）や、請求項１
又は２記載のモノクローナル抗体、該モノクローナル抗
体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメ
ントからなる群から選ばれる少なくともいずれか１種
と、ヒトヘムオキシゲナーゼの全活性を測定することが
できる試薬とが含まれていることを特徴とするヒトヘム
オキシゲナーゼ−１測定用キット（請求項１０）に関す
る。

【００１０】さらに本発明は、請求項１又は２記載のモ
ノクローナル抗体、該モノクローナル抗体の可変領域か
らなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントからなる群
から選ばれる少なくともいずれか１種を用いることを特
徴とするヒトヘムオキシゲナーゼ−１の検出方法（請求
項１１）や、請求項１又は２記載のモノクローナル抗
体、該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合
部位を含む抗体フラグメントからなる群から選ばれる少
なくともいずれか１種を用いて蛍光染色することを特徴
とする請求項１１記載のヒトヘムオキシゲナーゼ−１の
検出方法（請求項１２）や、請求項４〜７のいずれか記
載のヒトヘムオキシゲナーゼ−１の測定方法により、細
胞又は組織中のヒトヘムオキシゲナーゼ−１含量を測定
することを特徴とする細胞又は組織におけるストレスの
検出方法（請求項１３）や、請求項１１又は１２記載の
ヒトヘムオキシゲナーゼ−１の検出方法により、細胞又
は組織におけるヒトヘムオキシゲナーゼ−１を検出する
ことを特徴とする細胞又は組織におけるストレスの検出
方法（請求項１４）に関する。

【００１１】

【発明の実施の形態】本発明のモノクローナル抗体又は
その可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメ
ントとしては、ヒトＨＯ−１と反応し、ヒトＨＯ−２と
は反応せず、ヒトＨＯ−１活性を抑制することができる
抗ヒトＨＯ−１モノクローナル抗体や該モノクローナル
抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグ
メントであればどのようなものでもよいが、実際のＨＯ
−１の機能解析の場合に必要とされるヒトＨＯ−１の細
胞外領域をエピトープとして認識するモノクローナル抗
体や、これらモノクローナル抗体の可変領域からなる抗
体結合部位を含む抗体フラグメントが好ましい。また、
これら抗体フラグメントとしては、モノクローナル抗体
をペプシンで消化して得られるＦ(ａｂ′)₂、Ｆ(ａ
ｂ′)₂を還元して得られるＦａｂ′、モノクローナル
抗体をパパインで消化して得られるＦａｂなどを例示す
ることができる。

【００１２】また、上記モノクローナル抗体の製造方法
としては、前記の方法（J. Clin. Invest. 101, 604-61
2, 1998）を具体的に挙げることができるが、かかる方
法に制限されるものではなく、慣用のプロトコールを用
いて、動物（好ましくはヒト以外）にラット由来のＨＯ
−１、ヒト由来のＨＯ−１若しくはそれらのエピトープ
を含む断片、又はそれらタンパク質を膜表面に発現した
細胞を投与することにより産生させる方法を挙げること
ができ、例えばモノクローナル抗体の製造には、連続細
胞系の培養物により産生される抗体をもたらす、ハイブ
リドーマ法（Nature 256, 495-497, 1975）、トリオー
マ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法（Immunology Today
4, 72, 1983）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法（MONOCL
ONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, pp.77-96, Alan
R.Liss, Inc., 1985）など任意の方法を用いることが
できる。

【００１３】上記本発明の、ヒトＨＯ−１と反応し、ヒ
トＨＯ−２とは反応せず、ヒトＨＯ−１活性を抑制する
ことができるモノクローナル抗体として、モノクローナ
ル抗体ＧＴＳ−３を具体的に挙げることができる。この
モノクローナル抗体ＧＴＳ−３は、本発明のハイブリド
ーマＧＴＳ−３株（工業技術院生命工学工業技術研究所
受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７３１４）又はそれらから誘
導された細胞株を、インビボ又はインビトロで常法によ
り培養することにより生産することができる。例えば、
インビボ系においては、マウス又はラット等の齧歯動
物、好ましくはハイブリドーマと由来を同じくする齧歯
動物の腹腔内で培養することにより、またインビトロ系
においては、動物細胞培養用培地で培養することにより
得ることができる。インビトロ系でハイブリドーマを培
養するための培地としては、ストレプトマイシンやペニ
シリン等の抗生物質を含むＲＰＭＩ１６４０又はＭＥＭ
等の細胞培養培地を例示することができる。

【００１４】本発明関連のペプチドとしては、モノクロ
ーナル抗体ＧＴＳ−３等のヒトＨＯ−１と反応し、ヒト
ＨＯ−２とは反応せず、ヒトＨＯ−１活性を抑制するこ
とができるモノクローナル抗体の可変領域からなる抗体
結合部位を含む抗体フラグメントを構成するアミノ酸配
列の一部の配列からなり、かつヒトＨＯ−１活性を抑制
することができるペプチドを例示することができ、かか
るペプチドは、上記抗体フラグメントの部分分解ペプチ
ドを作製し、本発明のモノクローナル抗体と反応するペ
プチド断片を免疫沈降法等により特定することにより得
ることができる。

【００１５】本発明のハイブリドーマＧＴＳ−３株は、
ラット由来のＨＯ−１の細胞外領域をエピトープとして
認識する抗ＨＯ−１モノクローナル抗体を産生するハイ
ブリドーマとして得られたものであり、具体的には、ラ
ットＨＯ−１のｃＤＮＡをマウスの株化細胞であるＷＲ
１９Ｌ細胞（マウスＴ細胞株）にトランスフェクション
し、安定発現する形質転換細胞を選択・調製し、該形質
転換細胞から得られたミクロソーム画分でマウスを常法
により免疫し、免疫されたマウスのＢリンパ球とマウス
骨髄腫ＰＡＩ細胞とを、常法により細胞融合させ、１０
％ＦＣＳを含むＡＳＦ１０４又はＨＡＴ培地で選択し、
その中からヒトＨＯ−１を発現する細胞に対して特異的
に免疫反応することができるものを免疫染色パターンに
よりスクリーニングすることにより作出することができ
る。

【００１６】本発明のヒトＨＯ−１の測定方法として
は、上記本発明のモノクローナル抗体、該モノクローナ
ル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラ
グメント、ヒトＨＯ−１活性を抑制することができるペ
プチドからなる群から選ばれる少なくともいずれか１種
を用いる方法であれば特に制限されるものではなく、こ
れらモノクローナル抗体等を用いて、ＲＩＡ法、ＥＬＩ
ＳＡ法、蛍光抗体法、プラーク法、スポット法、血球凝
集反応法、オクタロニー法等の免疫学的測定方法を行う
ことによりヒトＨＯ−１を特異的かつ正確に測定するこ
とができる。例えば、固相化された上記本発明のモノク
ローナル抗体及び／又はその可変領域からなる抗体結合
部位を含む抗体フラグメントと、これらモノクローナル
抗体又はその可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体
フラグメントとは認識部位を異にする、標識化された第
２のモノクローナル抗体及び／又はその可変領域からな
る抗体結合部位を含む抗体フラグメントとを用いる方法
を挙げることができる。以下、かかるヒトＨＯ−１分子
の互いに異なるエピトープを認識する２種類の本発明の
モノクローナル抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡ法
について説明する。

【００１７】抗ヒトＨＯ−１モノクローナル抗体を担体
に固相化し（固相化一次抗体）、これにヒト血液（血
清）や尿等の検体を加え、抗原抗体反応により検体中の
ヒトＨＯ−１を抗原抗体反応により固相化一次抗体に結
合させる。次に酵素標識した異なる種類の抗ヒトＨＯ−
１モノクローナル抗体(酵素標識二次抗体) を反応さ
せ、抗原抗体反応により酵素標識二次抗体を上記固相化
一次抗体に結合している抗原に結合させる。その後、抗
原に結合しなかった酵素標識二次抗体を除去し、基質を
加えて酵素反応を行うことにより、既知量のヒトＨＯ−
１と二次抗体に標識した酵素活性との関係を示す検量線
から、検体中のヒトＨＯ−１量を求めることができる。
そして、ヒトＨＯ−１の測定値は、臓器障害の指標とし
て用いることができる。

【００１８】上記サンドイッチＥＬＩＳＡ法において、
モノクローナル抗体に代えて、前記Ｆ(ａｂ′)₂、Ｆａ
ｂなどの該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体
結合部位を含むヒトＨＯ−１に結合する抗体フラグメン
トや、ヒトＨＯ−１活性を抑制することができるペプチ
ドを使用することもできる。また、これらモノクローナ
ル抗体、抗体フラグメント、ペプチドに標識する酵素と
しては、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ア
ルカリフォスファターゼ等を例示することができ、これ
ら酵素は「酵素標識法(生物化学実験法 27 ) 」 (第１
版、石川栄治著、学会出版センター、1991年) などに記
載されている方法で標識することができる。またこれら
酵素に代えて、例えば、¹²⁵Ｉ、³²Ｐ、³⁵Ｓ、³Ｈ等のラ
ジオアイソトープや、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソシ
アネート）、テトラメチルローダミンイソシアネート等
の蛍光物質や、ＧＦＰ（グリーン蛍光タンパク質）等の
蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を
用いることもできる。一方、固相としては、シリコン、
ナイロン、プラスチック、ガラスからなるビーズ、マイ
クロプレート、試験管、フィルター、メンブレン等を用
いることができる。

【００１９】また、本発明のヒトＨＯ−１の測定方法と
して、モノクローナル抗体ＧＴＳ−３等のヒトＨＯ−１
と反応し、ヒトＨＯ−２とは反応せず、ヒトＨＯ−１活
性を抑制することができるモノクローナル抗体、該モノ
クローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位を含む
抗体フラグメント、ヒトＨＯ−１活性を抑制することが
できるペプチドからなる群から選ばれる少なくともいず
れか１種の存在下及び非存在下に、ヒトＨＯの全活性を
測定する方法を挙げることができる。この方法による
と、例えば、毒物に暴露されたヒト個体の臓器検体から
ホモジェネートを作製し、得られるミクロソーム画分を
緩衝液あるいは上記モノクローナル抗体、抗体フラグメ
ント又はペプチドでそれぞれ前処理し、生成ビリルビン
量を比較することにより、ヒトＨＯ−１とヒトＨＯ−２
によるＨＯ全活性のうちのヒトＨＯ−１活性の割合を求
めることができる。ウエスタンブロット法では、ヒトＨ
Ｏ−１の発現量の半定量的測定は可能であるものの酵素
活性自身のアセスメントはできなかったが、この方法に
よると、アイソザイム特異的ＨＯ酵素活性を測定するこ
とができる。

【００２０】本発明のヒトＨＯ−１測定用キットとして
は、本発明のモノクローナル抗体、抗体フラグメント、
ペプチドからなる群から選ばれる少なくともいずれか１
種が含まれている測定用キットであれば特に制限される
ものでなく、例えば、本発明のモノクローナル抗体及び
／又は抗体フラグメントと、該モノクローナル抗体又は
抗体フラグメントとは異なる部位でヒトＨＯ−１と反応
する少なくとも１種の第２のモノクローナル抗体及び／
又は抗体フラグメントとが含まれている測定用キット
や、本発明のヒトＨＯ−１活性を抑制しうるモノクロー
ナル抗体、該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗
体結合部位を含む抗体フラグメント、本発明のペプチド
からなる群から選ばれる少なくともいずれか１種と、ヒ
トヘムオキシゲナーゼの全活性を測定することができる
試薬、例えばビリルビン測定試薬が含まれている測定用
キットなどを挙げることができる。

【００２１】本発明のヒトＨＯ−１の検出方法として
は、本発明のモノクローナル抗体、抗体フラグメント、
ペプチドからなる群から選ばれる少なくともいずれか１
種を用いる検出方法であれば特に制限されるものではな
いが、細胞又は組織をパラホルムアルデヒドで処理し、
次いでサポニンで処理すると同時又は処理した後に、本
発明のモノクローナル抗体、抗体フラグメント、ペプチ
ドからなる群から選ばれる少なくともいずれか１種を用
いて蛍光染色する検出方法を具体的に例示することがで
き、蛍光染色は蛍光標識化２次抗体を用いる方法や蛍光
標識化ペプチドを用いる方法により行うことができる。
かかる検出法により、毒物に暴露された個体のストレス
応答を簡便に検出することができる。

【００２２】本発明の細胞又は組織におけるストレスの
検出方法としては、上記本発明のヒトＨＯ−１の測定方
法により、細胞又は組織中のヒトＨＯ−１含量を測定す
る方法や、あるいは、上記本発明のヒトＨＯ−１の検出
方法により、細胞又は組織におけるヒトＨＯ−１を検出
する方法を挙げることができる。また、ここでストレス
とは、生体内のひずみ、すなわち体外から加えられた物
理的（寒冷、放射線等）、化学的（薬物、酸素不足
等）、生物的（細菌汚染等）有害因子（ストレス作因）
と、それによって生じた防御反応をいう。また、本発明
のヒトＨＯ−１活性を抑制しうるモノクローナル抗体、
該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合部位
を含む抗体フラグメント、本発明のペプチドからなる群
から選ばれる少なくともいずれか１種を有効成分とする
製剤は、本発明のストレスに起因する疾病の予防又は症
状改善剤としての使用が期待できる。

【００２３】

【実施例】以下に、実施例を挙げてこの発明を更に具体
的に説明するが、この発明の技術的範囲はこれらの実施
例に限定されるものではない。実施例１［形質転換細胞の調製］オスのウィスターラット（２６０〜３００ｇ；埼玉動物
研究所）から単離した肝細胞を、文献（Science 212, 1
041-4042, 1981）記載の方法に基づき培養した。次い
で、４２℃で４時間熱処理して熱ショックをかけた培養
細胞から、ＩＳＯＧＥＮ（Nippon Gene製）を用いて全
細胞ＲＮＡを抽出し、逆転写酵素と、oligo(dT)₂₀プラ
イマー及びランダムプライマー（ヘキサマー；pd[N]₆）
の混合物とを用いて一本鎖ｃＤＮＡを合成した。次にAm
pliWax PCR Gem 100（Takara Biomedicals製）を用いた
ＰＣＲ法により、この一本鎖ｃＤＮＡから以下のプライ
マーを用いてラットＨＯ−１を増幅した。ラットＨＯ−
１のＰＣＲプライマー（５′−ｄ［ＧＣＣＴＧＡＡＣ
ＴＡＧＣＣＣＡＡＴＴＧＣＧＣＧＡＴＧＧＡＧ
ＣＧＣ］−３′：配列番号１、５′−ｄ［ＣＴＣＴＧ
ＧＧＧＧＣＣＡＡＧＴＣＧＡＣＡＴＴＴＡＣＡ
ＴＧＧＣＡＴ］−３′：配列番号２）は、文献（Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 82, 7865-7869, 1985、J. Bi
ol. Chem. 265, 7501-7506, 1990）記載の塩基配列に基
づき合成した。

【００２４】上記のＰＣＲ産物の３′末端側に位置する
ＳａｌＩ部位にアダプターを付加することによりＮｏｔ
Ｉ認識部位を構築し、文献（Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 91, 158-162, 1994）記載の方法により、ＥＦ−１ａ
プロモーターを含むｐＥＦ−ｎｅｏプラスミドベクター
のマルチプルクローニングサイトに存在するＮｏｔＩ部
位に挿入した。これらプラスミドベクターに挿入された
各ＰＣＲ産物の塩基配列を確認し、ラットＨＯ−１ｃＤ
ＮＡを有するプラスミドベクターをｐＥＦｎｅｏ−ラッ
トＨＯ−１と名付けた。この発現プラスミドベクター
を、文献（Cell.75, 1169-1178, 1993）記載の方法と同
様にエレクトロポレーション法によりＷＲ１９Ｌ細胞
（マウスＴ細胞株：ＡＴＣＣＴＩＢ−５２）にトラン
スフェクションした。トランスフェクションされた細胞
（ＷＲ１９Ｌ−ｒＨＯ−１）を５％のＣＯ₂下において
１０％のＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０で培養し、２４
時間後、安定した形質転換細胞を得るために、最終濃度
が０．９ｍｇ／ｍｌになるようにgeneticin（Gibco-BRL
製）を培地に加えて培養し、以下の実験に用いた。

【００２５】実施例２［ラット由来のＨＯアイソフォームに対するモ
ノクローナル抗体産生ハイブリドーマの作製］上記得られた形質転換細胞、ＷＲ１９Ｌ−ｒＨＯ−１か
ら得られたミクロソーム画分のタンパク質１ｍｇを、生
後６週のＢＡＬＢ／ｃ由来のメスマウス（Charles Rive
r Japan Inc）のフットパッド（foot pads）に毎週注射
する操作を５〜１０回行い免疫化した。なお、１回目の
注射には上記タンパク質１ｍｇとフロイント完全アジュ
バンドとを混合し乳状化したものを、２回目以降の注射
には上記タンパク質１ｍｇとフロイント不完全アジュバ
ンドとを混合し乳状化したものを用いた。最終注射から
４８時間後、免疫したマウスの両鼠蹊部及び腹部体壁部
のリンパ節を採取した。このリンパ節から得られたＢリ
ンパ球と、マウス骨髄腫ＰＡＩ細胞とを１：３〜５の割
合で５０％のポリエチレングリコール４０００（Boehri
nger Mannheim製）に加えて融合させた。この融合によ
り得られたハイブリドーマ細胞を、１０％のＦＣＳを含
むＡＳＦ１０４（味の素製）及びＨＡＴ培地で２週間培
養した。

【００２６】ハイブリドーマ細胞を含む培地の上清画分
と、前記細胞膜上にラットＨＯ−１を発現している細
胞、ＷＲ１９Ｌ−ｒＨＯ−１とを用いて、以下の方法に
よりラットＨＯ−１に対するモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマ細胞のスクリーニングを行った。ラ
ットＨＯ−１を発現しているＷＲ１９Ｌ細胞を採取し、
２％のパラホルムアルデヒドを含むｐＨ７．４のＰＢＳ
中において４℃で１０分間固定した。この細胞をＰＢＳ
で２回洗浄し、１０％のＦＣＳを添加したＲＰＭＩ１６
４０中において４℃で２０分間ブロックした。このブロ
ックした細胞を、ハイブリドーマ細胞を含む培地の上清
と０．５％のサポニンといっしょに４℃で３０分間イン
キュベーションし、その後ＰＢＳで２回洗浄し、フルオ
レセインが結合したヒツジ抗マウスＩｇＧ抗体のＦ(ａ
ｂ′)₂フラグメント（Organan-Teknika-Cappel）といっ
しょに４℃で３０分間インキュベーションした。インキ
ュベーション後ＰＢＳですすいだ後、これら細胞をＥＰ
ＩＣＳフローサイトメトリー（Coulter Electronics）
によりスクリーニングした。得られた細胞の中から、優
れた抗ラットＨＯ−１モノクローナル抗体を産生する単
一クローンを得るために、ハイブリドーマ細胞のサブク
ローニングを限界希釈法により行った。その結果、ＧＴ
Ｓ−１株、ＧＴＳ−３株、ＧＴＳ−４株、ＧＴＳ−５
株、ＧＴＳ−６株、ＧＴＳ−７株等の６個のクローンを
得ることができた。これらのクローンのうち１つＧＴＳ
−３株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関
するブタペスト条約に基づいて、工業技術院生命工学工
業技術研究所（茨城県つくば市）において、平成１２年
９月２８日に受託番号「ＦＥＲＭＢＰ−７３１４」と
して寄託されている。

【００２７】実施例３［モノクローナル抗体の精製］２，６，１０，１４−テトラメチルペンタデカンで前処
理した生後８週のＣＲＪ（ＣＤ−１ｎｕ）由来のメスマ
ウス（Charles River Japan Inc）に、一匹当たり２×
１０⁶個の上記ハイブリドーマ細胞（ＦＥＲＭＢＰ−
７３１４）を腹膜内注射することにより腹水症を誘発さ
せた。その後、このマウスから腹水を採取し、文献（J.
Immunol. Methods. 96, 271-278. 1987）記載の方法に
準じて、カプリル酸と４５％の硫酸アンモニウムを用い
るシークエンシャル・プレシピテーション（sequential
precipitation）により抗ラットＨＯ−１モノクローナ
ル抗体（ＧＴＳ−３）を精製した。この精製したモノク
ローナル抗体の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認し、ま
た、マウス・モノクローナル・アイソタイプ・キット
（ＲＰＮ２９；Amersham International）を用いて精製
したモノクローナル抗体のサブクラスを確認した。

【００２８】実施例４［ウエスタンブロッティング分析］上記得られた抗ラットＨＯ−１モノクローナル抗体（Ｇ
ＴＳ−３）のヒトＨＯ−１に対する反応性を調べるため
に、抗原として数種の細胞株を用いてウエスタンブロッ
ト分析を行った。ヒトＨＯ−１（ＮＣＢＩのアクセッシ
ョンナンバー：ＮＭ＿００２１３３）及びヒトＨＯ−２
（ＮＣＢＩのアクセッションナンバー：ＮＭ＿００２１
３４）のｃＤＮＡを用いて、実施例１と同様の方法によ
りｈＨＯ−１及びｈＨＯ−２を発現するＷＲ１９Ｌ細胞
（ＷＲ１９Ｌ−ｈＨＯ−１、ＷＲ１９Ｌ−ｈＨＯ−２）
をそれぞれ作製した。これらの細胞株と実施例１により
得られたＷＲ１９Ｌ−ｒＨＯ−１とを、ｐＨ７．０のＰ
ＢＳで２回洗浄した。これらの洗浄した細胞の不溶画分
を除去するために、細胞の体積の４倍量の１％のノニデ
ットＰ−４０溶液（１％のノニデットＰ−４０、１５０
ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＰＭＳＦ、５０ｍＭのＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ；ｐＨ８．０）中において氷上で溶解した。
この１％のノニデットＰ−４０溶液を１０，０００ｇ×
１５分間の遠心分離により上清を回収した。これら上清
に含まれるタンパク質を１０％ゲルのＳＤＳ−ＰＡＧＥ
法により分離した後、Immobilon polyvinylidene diflu
oridetransfer membrane（Daiichi Pure Chemicals）に
移した。

【００２９】上記の膜をBlock-Ace（Dainippon Pharm.
Co.）で少なくとも３時間ブロックし、１μｇ／ｍｌの
ＧＴＳ−３を含むＰＢＳ中、４℃で一晩インキュベーシ
ョンした。０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗
浄後、１％のＢＳＡを含むＰＢＳで希釈したビオチン化
した抗マウスＩｇＧ抗体のＦ(ａｂ′)₂フラグメント（R
PN 1061；Amersham International）溶液に上記インキ
ュベーションした膜を浸した。その後、製造業者のプロ
トコル（Vectastain Elite ABC kit；Vector Laborator
ies, Inc.）に基づき、ビオチンを結合した西洋ワサビ
ペルオキシダーゼにアビジンを反応させた複合体を反応
させ、抗原特異的ＨＲＰ反応により生じた化学ルミネッ
センスをMolecular Imager（GS-525, Nippon Bio-Rad.
Co.）とECL detection kit（Amersham International）
により視覚化した。その結果を図１Ａに示す。なお、図
１Ａ中のｍは分子マーカを、ＰＣは親細胞ＷＲ１９Ｌを
用いた場合の結果をそれぞれ表す。

【００３０】また、ＨＯ−１誘導刺激を与えたヒトＵ９
３７細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−１５９３）についても、
免疫反応性を示すかどうかを調べてみた。図１Ｂに示さ
れている所定の濃度のヘミン又は塩化カドミウム（Ｃｄ
Ｃｌ₂、シグマ製）で１２時間処理することによりＵ９
３７細胞にＨＯ−１の発現を誘導させ、誘導した細胞を
回収した後、ＰＢＳで洗浄した。これら刺激した細胞を
溶解溶液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭの
ＮａＣｌ、１％のノニデットＰ−４０；ｐＨ８．０）で
溶解し、この細胞溶解物を上記と同様に、１０％ゲルの
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法により分離し、Immobilon polyviny
lidene difluoride transfer membraneに移してＧＴＳ
−３により視覚化した。この結果を図１Ｂに示す。な
お、図中のvehicleはＰＢＳを意味し、ポジティブコン
トロールとしてはラットから得られた脾臓の溶解物を用
いた。

【００３１】これらの結果から、ＧＴＳ−３はＷＲ１９
Ｌ−ｒＨＯ−１又はＷＲ１９Ｌ−ｈＨＯ−１から得られ
た細胞溶解物と特異的に交叉反応し、ＷＲ１９Ｌ−ｈＨ
Ｏ−２から得られた細胞溶解物とは反応性を示さなかっ
た。また、強力なＨＯ−１の誘導剤であるヘミンやＣｄ
Ｃｌ₂で前処理したヒトＵ９３７細胞は、ヘミンやＣｄ
Ｃｌ₂の濃度の増加に対して著しいＨＯ−１タンパク質
の誘導を示した。これらのことから、ＧＴＳ−３は、ヒ
トＨＯ−２と交叉反応せず、ＨＯ−１に特異的に反応す
ることから、ヒトＨＯ−１タンパク質の発現を検出する
のに有効であることがわかった。

【００３２】実施例５［ＧＴＳ−３処理によるトランスフェクタント
のＨＯ活性］実施例４により得られたＷＲ１９Ｌ−ｒＨＯ−１及びＷ
Ｒ１９Ｌ−ｈＨＯ−１の上清それぞれ５０μｌに、５０
μｌのＰＢＳ（vehicle）、図１Ｃ及びＤに示す濃度に
なるようにＧＴＳ−３又はマウスＩｇＧ抗体を含むＰＢ
Ｓ各５０μｌを加え、室温で１０分間前処理し、その
後、これらの上清に反応溶液（１ｍＭのグルコース６−
リン酸、０．１６７Ｕ／ｍｌのグルコース６−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ、０．８ｍＭのＮＡＤＰ、１５μＭのヘ
ミン、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．０１ｍｇ／ｍｌのＮＡ
ＤＰＨ−シトクロムＰ４５０還元酵素（Gentest製）、
３３ｍｇ-protein／ｍｌのラット肝臓シトソル、２７ｍ
Ｍのリン酸カリウム溶液；ｐＨ７．４）２００μｌを加
えて３７℃で３０分間インキュベーションした。その
後、３００μｌのクロロホルムを加えて反応を停止さ
せ、生成したビリルビンをクロロホルム画分へ抽出し、
１０，０００ｇで１５分間遠心分離した後、クロロホル
ムエキス中のビリルビン量を、吉田及び菊池らにより報
告されている文献（J. Biol. Chem. 253, 8479-8482, 1
978）記載の方法で測定した（図１Ｃ，Ｄ）。

【００３３】上記の結果から、抗ＨＯ−１モノクローナ
ル抗体ＧＴＳ−３には、ＨＯ−１酵素活性を抑制するは
たらきがあることがわかった。図１Ｃ及びＤからもわか
るように、ＧＴＳ−３の投与量に応じてＷＲ１９Ｌ−ｒ
ＨＯ−１又はＷＲ１９Ｌ−ｈＨＯ−１から採取した細胞
溶解物中のＨＯ活性は減少していた。また、過剰濃度で
ある１．０ｍｇ／ｍｌのＧＴＳ−３におけるＨＯ活性は
概ね抑制されていたが、同濃度の非特異的なマウスＩｇ
Ｇ抗体では抑制効果はみられなかった。これらのことか
ら、このモノクローナル抗体は、細胞におけるヒトＨＯ
−１の免疫学的検出のためだけではなく、以下に示す表
１からもわかるように細胞や組織等のサンプルにおける
アイソザイム特異的なＨＯ活性を定量的に測定するのに
用いることができることがわかった。

【００３４】実施例６［組織標本の免疫組織化学的分析］インフォームドコンセントを実施した患者から、肝臓生
検サンプルを採取した。コントロールグループとして、
肝内胆汁うっ滞患者及び転移性肝腫瘍患者の肝臓の無傷
箇所から５標本を採取した。硬変症患者においては、３
つの異なった肝臓組織を採取した。この内２標本は、胆
嚢切除又は遠位胃切除時にそれぞれ採取したものである
が、３つ目の標本は、肝細胞癌のために切除された組織
の非悪性部位から採取したものである。肝臓生検標本と
してのウェッジバイオプシー（wedge biopsy）をＩＰＨ
患者５人から脾臓摘出時に採取した。生物学的及び臨床
的調査結果に基づき肝硬変症（ＬＣ）の診断を行い、Ｉ
ＰＨの診断は門脈血流異常における特定疾患の臨床調査
研究事業（日本の厚生省）により確立されたＩＰＨ診断
基準に基づいて行った。また、上記５人のＩＰＨ患者か
ら、免疫組織化学的分析のために摘出した組織から１つ
の脾臓サンプルを採取した。必要に応じて、本発明者ら
の報告した以前の方法により、肝臓組織のＨＯ活性を測
定した（Wakabayashi Y, et al., Am. J. Physiol. 27
7, G1088-G1096, 1999）。また、進行した胃癌治療のた
めの治療手術時に採取した脾臓組織の一部を、免疫組織
化学のためや、酵素活性を測定するためのコントロール
サンプルとして以下の実験に用いた。なお、これらの３
グループ間においては、統計上著しい年齢差はなかっ
た。

【００３５】上記得られた組織標本を、過ヨウ素酸塩−
リジン−パラホルムアルデヒド溶液（ＰＬＰ）にて４℃
で４時間固定し、これら試料を１０、１５及び２０％の
スクロースを含むＰＢＳでそれぞれ４時間洗浄し、ＯＣ
Ｔコンパウンド（Miles Laboratories）で包埋した。こ
れら試料をそれぞれ７μｍの厚さで切断し、非特異的な
染色を最小限にするためにアビジン、ビオチン及び正常
なウマ血清を用いて切片を処理した。これらの組織を、
１％のＢＳＡを含むＰＢＳにＧＴＳ−３（最終濃度１０
μｇ／ｍｌ）又は抗ヒトＣＤ６８モノクローナル抗体Ｋ
Ｐ−１（１：１，０００希釈、ＤＡＫＯ製）を溶解させ
た溶液中で２時間、室温でインキュベーションした。イ
ンキュベーション後、ＰＢＳで３回洗浄した後、これら
切片をビオチン化抗マウスＩｇＧ抗体（Vectastain Eli
te ABC kit；Vector Laboratories, Inc.）で３０分
間、室温で染色した。内在性のペルオキシダーゼ反応を
防ぐために、上記染色した切片を、２％のニトロプルシ
ドナトリウム（ＳＮＰ、シグマ社製）及び２％の酢酸
（Wako Pure Chemical Industries, Ltd.）を含む冷却
メタノールで１５分間処理し、その後、ビオチンを結合
した西洋ワサビペルオキシダーゼにアビジンを反応させ
た複合体を用いて３０分間インキュベーションした。イ
ンキュベーション後、最終濃度０．１ｍｇ／ｍｌの３，
３′−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）四塩酸塩溶液中で
５分間発色反応させ、これら切片を２０％のホルムアル
デヒドで２０分間固定した後メチルグリーンにより対比
染色し、この対比染色した切片を、スライドガラス上に
水溶性封入剤といっしょに載せ、カバーガラスをかけて
観察した。図２にコントロールとしての肝臓におけるＨ
Ｏ−１分布を示す（参考写真１参照）。図２Ａから、不
規則に、かつ、樹状の形態をなし、細胞質の類洞の内腔
への突起を特徴とする非実質細胞においてのみＨＯ−１
の免疫反応がみられたことから、クッパー細胞における
酵素の存在が明らかとなった。また、図２Ｂのモノクロ
ーナル抗体ＫＰ−１を用いた実験から、クッパー細胞の
分布がＨＯ−１の分布に匹敵することがわかった。な
お、図中のＰは傍門脈領域を、Ｃは中心細静脈領域をそ
れぞれ意味する。

【００３６】上記のことから、非実質細胞間においてＨ
Ｏ−１を発現する細胞型を特定するために、一次抗体と
してＧＴＳ−３又はＫＰ−１を、二次抗体として肝星細
胞のマーカーであるα-smooth muscle actin（α−ＳＭ
Ａ、ＤＡＫＯ製）に対するモノクローナル抗体を用い
て、文献（Am. J. Pathol. 149, 1271-1286, 1996）記
載の方法で上記組織標本をＤＡＢと塩化ニッケルで二重
染色した。この結果を図３に示す（参考写真２参照）。
なお、薄茶色に染まった部分は一次抗体にのみ反応した
細胞を、明るい紫色に染まった部分は二次抗体にのみ反
応した細胞を、暗紫色に染まった部分は両方の抗体が反
応した細胞をそれぞれ示す。図３Ａより、αＳＭＡ陽性
細胞分布は、ＧＴＳ−３陽性細胞分布と全く異なってい
ることがわかった。さらに、図３Ｂより、ＫＰ−１陽性
細胞と肝星細胞は重なり合ってはいないが、近接してい
ることがわかった。これは、上記プロトコルに基づくα
ＳＭＡ染色が、ヒト肝臓組織においてクッパー細胞に対
して交叉反応せずに特異的に肝星細胞を染色することを
示唆するものである。上記ダブル免疫染色法により、肝
星細胞よりもクッパー細胞の方が、ＨＯ−１の原因とな
る主要な細胞成分を構成することがわかった。

【００３７】また、ヒトＨＯ−２抗原（Stressgen Biot
echnologies Corporation製）に対して交叉反応を示す
ウサギ抗ラットＨＯ−２ポリクローナル抗体を用いて、
上記の免疫組織化学分析と同様にＨＯ−２のタンパク質
発現についても調べてみた。なお、ＨＯ−２結合免疫反
応を、デキストランポリマー（ＤＡＫＯ）標識化ペルオ
キシダーゼを結合させた抗ウサギ免疫グロブリンヤギ血
清により視覚化した。また、ウサギ免疫グロブリンによ
り陰性染色したコントロールとしての組織を視覚化し
た。その結果を図４に示す（参考写真３参照）。図４Ａ
において、ＨＯ−２は実質細胞において顕著に発現し、
全小葉に渡って均一に分布していることが確認できた。
これに対し、図４Ｂにおいては、非特異的ウサギ免疫グ
ロブリンはいかなる免疫反応性も検出することができな
かった。これらのことから、ＨＯアイソザイム分布は独
特な局所解剖学的パターンを有することを示唆してい
る。すなわち、クッパー細胞においてＨＯ−１を選択的
に検出することができたが、ＨＯ−２はクッパー細胞で
はなく実質細胞に分布し、この結果は本発明者らの以前
の報告（J. Clin. Invest. 101, 604-612, 1998）と良
く一致していた。

【００３８】実施例７［ヒト肝臓及び脾臓におけるアイソザイム特異
的ＨＯ活性］実施例６により得られたコントロールとしての肝臓組
織、肝硬変患者の肝臓組織及び脾臓組織から、文献（Wa
kabayashi Y, et al., Am. J. Physiol. 277, G1088-G1
096, 1999、Goda N, et al., J. Clin. Invest. 101, 6
04-612, 1998）記載の方法に変更を加えた方法によりそ
れぞれのミクロソーム画分を単離した。これらミクロソ
ーム画分５０μｌを用いて、実施例５と同様にＰＢＳ又
はＧＴＳ−３により前処理し、反応溶液を加えて３７℃
で３０分間反応させ、１ｍｇのミクロソームタンパク質
当たりどれだけのビリルビン（ｎｍｏｌ）が生成される
かを、文献（Wakabayashi Y, et al., Am. J. Physiol.
277, G1088-G1096, 1999、J. Biol. Chem. 253, 8479-
8482, 1978）と同様の方法で測定した。この結果を表１
に示す。

【００３９】

【表１】

【００４０】表１の結果から、肝臓ミクロソームにおけ
る総ＨＯ活性は約０．３ユニット／ｍｇ・ミクロソーム
タンパク質であり、以前報告されたヒト又はラットの肝
臓サンプルにおける値に匹敵していた（Maines MD, et
al., J. Biol. Chem. 261, 411-419, 1986、Wakabayash
i Y, et al., Am. J. Physiol. 277, G1088-G1096, 199
9）。最終濃度１ｍｇ／ｍｌになるようにＧＴＳ−３を
反応混合物に加えた場合、ＨＯ活性は上記活性の約３０
％まで低下した。この結果は、上記ラットの肝臓サンプ
ルにおける結果と良く一致し、ヒトＨＯ−１及びヒトＨ
Ｏ−２の活性比率は肝臓において約１：２であった。こ
れに対して、硬変症患者から採取した肝臓におけるヒト
ＨＯ−１活性は著しく上昇していた。最終濃度１ｍｇ／
ｍｌになるようにＧＴＳ−３を反応混合物に加えた場
合、ヒトＨＯ全活性は２．４倍に上昇しており、これら
のサンプルにおけるヒトＨＯ全活性の上昇は、ヒトＨＯ
−１の上昇に起因するものであり、またヒトＨＯ全活性
に占めるヒトＨＯ−１活性も約６５％まで増加してい
た。すなわち、硬変におけるヒトＨＯ−１特異的酵素活
性は、コントロールのサンプルよりも５倍程高くなって
いた。また、上記と同じ方法でコントロールの脾臓サン
プルにおけるＨＯ活性を測定した結果、全酵素活性は
０．８０ユニット／ｍｇ・ミクロソームタンパク質であ
り、過剰量のＧＴＳ−３を用いると活性が８０％減少し
ていた。これは、ＨＯ−１が脾臓において発現している
主要なアイソザイムであることを示している。

【００４１】実施例８［硬変及びＩＰＨにおける肝臓ＨＯ−１発現の
変化］実施例６で得られた硬変症患者及びＩＰＨ患者の肝臓組
織標本を用いて、同様の方法により硬変症患者における
肝臓のＨＯ−１タンパク質の発現の変化を観察した。こ
の結果を図５（参考写真４参照）及び図６（参考写真５
参照）に示す。図５の結果から、類洞の内腔への突起を
特徴とする非実質細胞において最も顕著な免疫反応がみ
られ（図５Ａ）、同様の発現パターンがＫＰ−１による
染色においても認められた（図５Ｂ）。これらの組織標
本の結果から、クッパー細胞と肝細胞との相違が、ＨＯ
−１発現の差異の原因となっていることがわかった。以
下の形態計測分析により、ＨＯ−１陽性非実質細胞の絶
対量は、コントロールサンプルにおいて観察されたもの
よりもわずかに多かった。同時に、著しいＨＯ−１発現
を示さなかった肝細胞は、わずかではあるが顕著な免疫
反応を示した。これに対して、ＨＯ−２免疫反応は肝細
胞においてほぼコントロールサンプルと同様に起こって
いた。これらの結果は、硬変肝臓組織におけるＨＯ全活
性の上昇が、誘導アイソザイムであるＨＯ−１の誘導に
主として依拠していることを示している。

【００４２】図６の結果から、ＩＰＨ患者の肝臓組織に
おけるＨＯ−１タンパク質発現細胞数は、コントロール
としての肝臓組織におけるものと比べ著しく少なかった
（図６Ａ）。また、クッパー細胞において減少したＨＯ
−１の免疫反応が、細胞のＨＯ−１発現の減少に起因す
るもの、又はクッパー細胞の密度それ自体の減少に起因
するものであるどうかを確認するために、モノクローナ
ル抗体ＫＰ−１を用いてクッパー細胞の個体数を免疫組
織化学により確認した（図６Ｂ）。この結果から、ＩＰ
Ｈ患者の肝臓組織におけるＫＰ−１陽性細胞（クッパー
細胞）の分布パターンは、コントロールとしての肝臓組
織又は硬変症患者の肝臓組織において観察したものと同
様であったが、ＩＰＨ患者の肝臓組織におけるＫＰ−１
陽性細胞の密度はコントロールのものと比べわずかに低
いことがわかった。これらのことから、ＨＯ−１の免疫
反応の低下は、細胞数ではなく、クッパー細胞における
ＨＯ−１の発現の減少に起因するものであることがわか
った。

【００４３】上記３つのグループ間（コントロールグル
ープ、硬変症グループ、ＩＰＨグループ）でのクッパー
細胞におけるＨＯ−１発現の差異を確認するために、Ｈ
Ｏ−１陽性細胞及びＫＰ−１陽性細胞（クッパー細胞）
の密度の形態計測分析を行い、その結果を表２に示し
た。表２より、コントロールとしての肝臓組織切片にお
けるＨＯ−１陽性細胞の密度は約１６０細胞／ｍｍ²で
あるのに対して、同肝臓組織切片におけるクッパー細胞
の密度は２１５細胞／ｍｍ²であった。ＨＯ−１の顕著
な発現を示す全ての細胞がクッパー細胞であるとする
と、これらの値から、定常状態においてクッパー細胞の
約７５％が誘導アイソザイムを発現したことになる。一
方、硬変症患者の肝臓組織切片においては、コントロー
ルとしての肝臓組織切片で観察されたものとはいくつか
の異なる特徴を示した。まず、硬変症患者の肝臓組織切
片におけるＨＯ−１陽性細胞の密度は２１０細胞／ｍｍ
²であり、これはコントロールとしてのものよりわずか
に大きかったとはいえ統計上有意なものではなかった。
ところが、ＫＰ−１陽性細胞の密度においてはコントロ
ールとして測定されたものとほぼ同一の値であった。上
記のようにＨＯ−１の顕著な発現を示す全ての細胞がク
ッパー細胞であるとすると、硬変症患者の肝臓における
主要なクッパー細胞がＨＯ−１を発現することを示すこ
とになる。ＫＰ−１陽性細胞の密度の値を基準とし、Ｈ
Ｏ−１陽性細胞対ＫＰ−１陽性細胞（ＨＯ−１（＋）／
ＫＰ−１（＋））の密度比率を求めると、硬変症グルー
プ及びコントロールグループ間の差異は顕著であること
がわかった。

【００４４】

【表２】

【００４５】これに対して、ＩＰＨ患者の肝臓における
ＨＯ−１陽性細胞の密度は５５細胞／ｍｍ²と小さく、
コントロールにおける値のおよそ３０％であったが、ク
ッパー陽性細胞の密度についてもコントロールのものと
比較すると、比較的わずかに減少していたが統計上有意
なものではなかった。また、ＨＯ−１陽性細胞対ＫＰ−
１陽性細胞の密度比率は、コントロール及び硬変症患者
の肝臓での値と比べるとかなり減少していることがわか
った。これらの結果から、硬変やＩＰＨの病状が門脈圧
亢進症等と同様の症状を示すとはいえ、硬変症及びＩＰ
Ｈグループ間では、クッパー細胞におけるＨＯ−１の発
現は全く異なっていることを示唆している。

【００４６】実施例９［ＩＰＨ患者の脾臓におけるＨＯ−１発現］上記のＩＰＨ患者の肝臓においてＨＯ−１発現の減少を
示す結果から、この変化が本来のタンパク質発現の欠如
によるものか、又は肝臓シヌソイドにおいて本質的に生
ずる間接的あるいは局所的影響によるものかを調べるた
めに、悪性胃癌を治療するため脾臓摘出により得られた
コントロールとしての脾臓組織と、重症の汎血球減少症
を制御するための脾臓摘出により治療したＩＰＨ患者か
ら採取した脾臓組織とを用いて免疫組織化学分析を行っ
た。この結果を図７に示す（参考写真６参照）。この結
果から、コントロールとしての脾臓組織において、ＨＯ
−１結合免疫反応は複数の不調和な発現を示し、赤色髄
において顕著に分布していたが、白色髄においては少し
しか存在が確認できなかった。一方、ＩＰＨ患者から採
取した脾臓においては、赤色髄領域のマクロファージに
おける免疫反応を著しく上昇し、コントロールとしての
肝臓と比べ赤色髄の横断領域が拡大していることがわか
った。これらの結果から、ＩＰＨ患者の肝臓におけるＨ
Ｏ−１タンパク質の発現の減少は肝マクロファージにお
いて局部的に起こることが多いが、脾臓等の肝臓以外の
臓器においてＨＯ−１タンパク質の発現の減少は起こら
ないことがわかった。

【００４７】

【発明の効果】本発明のヒトＨＯ−２と交叉反応性を示
さず、ヒトＨＯ−１を特異的に検出することができる抗
ヒトＨＯ−１モノクローナル抗体、特にヒトＨＯ−１活
性を抑制することができるモノクローナル抗体を用いる
ことにより、ヒトＨＯ−１の測定や検出が可能となり、
細胞又は組織におけるストレス応答を簡便に検出するこ
とができる。

【００４８】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> KEIO UNIVERSITY <120> Anti-Human Heme Oxygenase 1 mAb <130> keio2 <140> <141> <160> 2 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:rHO-1 Primer <400> 1 gcctgaacta gcccaattgc gcgatggagc gc 32 <210> 2 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:rHO-1 Primer <400> 2 ctctgggggc caagtcgaca tttacatggc at 32

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のＧＴＳ−３のヒト抗原に対する交叉反
応性及び酵素活性を抑制する結果を示す図である。

【図２】正常なヒトの肝臓におけるＨＯ−１発現の免疫
組織化学分析の結果を示す図である。

【図３】正常なヒトの肝臓におけるＨＯ−１発現の免疫
組織化学分析の結果を示す図である。

【図４】正常なヒトの肝臓におけるＨＯ−２発現の免疫
組織化学分析の結果を示す図である。

【図５】硬変症患者の肝臓におけるＨＯ−１発現の免疫
組織化学分析の結果を示す図である。

【図６】ＩＰＨ患者の肝臓におけるＨＯ−１発現の免疫
組織化学分析の結果を示す図である。

【図７】コントロール及びＩＰＨ患者の脾臓におけるＨ
Ｏ−１発現の免疫組織化学分析の結果を示す図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＣ１２Ｑ 1/26 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/573 Ｃ 33/577 5/00 Ｂ (56)参考文献ＳＣＨＵＬＬＥＲ，ＤＪｅｔａｌ．，Ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅ −１，ＰｒｏｔｅｉｎＳｃｉ，Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．８，ｐ．1836−1838 ＧＯＤＡ，Ｎｅｔａｌ．，Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｏｆｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅｉｓｏｆｏｒｍｓｉｎｒａｔｌｉｖｅｒ．Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｉｃｂａｓｉｓｆｏｒｃａｒｂｏｎｍｏｎｏｘｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅ，ＪＣｌｉｎＩｎｖｅｓｔ，Ｖｏｌ．101，Ｎｏ．３，ｐ．604− 612 ＹＯＳＨＩＤＡ，Ｔｅｔａｌ．, ＨｕｍａｎｈｅｍｅｏｘｙｇｅｎａｓｅｃＤＮＡａｎｄｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｉｔｓｍＲＮＡｂｙｈｅｍｉｎ，ＥｕｒＪＢｉｏｃｈｅｍ，Ｖｏｌ．171，Ｎｏ．３，ｐ．457 −461 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C07K 16/40 C12P 21/08 ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒトヘムオキシゲナーゼ−１と反応し、
ヒトヘムオキシゲナーゼ−２とは反応せず、ヒトヘムオ
キシゲナーゼ−１活性を抑制することができることを特
徴とするモノクローナル抗体又はその可変領域からなる
抗体結合部位を含む抗体フラグメント。
【請求項２】ハイブリドーマＧＴＳ−３（工業技術院
生命工学工業技術研究所受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７３
１４）又はそれらから誘導された細胞株が産生すること
を特徴とする請求項１記載のモノクローナル抗体又はそ
の可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメン
ト。
【請求項３】ハイブリドーマＧＴＳ−３（工業技術院
生命工学工業技術研究所受託番号ＦＥＲＭＢＰ−７３
１４）又はそれらから誘導された細胞株。
【請求項４】請求項１又は２記載のモノクローナル抗
体、該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合
部位を含む抗体フラグメントからなる群から選ばれる少
なくともいずれか１種を用いることを特徴とするヒトヘ
ムオキシゲナーゼ−１の測定方法。
【請求項５】請求項１又は２記載のモノクローナル抗
体及び／又はその可変領域からなる抗体結合部位を含む
抗体フラグメントと、該モノクローナル抗体又はその可
変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントと
は異なる部位でヒトヘムオキシゲナーゼ−１と反応する
少なくとも１種の第２のモノクローナル抗体及び／又は
その可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメ
ントとを用いることを特徴とする請求項４記載のヒトヘ
ムオキシゲナーゼ−１の測定方法。
【請求項６】請求項１又は２記載のモノクローナル抗
体及び／又はその可変領域からなる抗体結合部位を含む
抗体フラグメントと、該モノクローナル抗体又はその可
変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントと
は異なる部位でヒトヘムオキシゲナーゼ−１と反応する
少なくとも１種の第２のモノクローナル抗体及び／又は
その可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメ
ントのいずれか一方が固相化されており、他方が標識さ
れていることを特徴とする請求項４又は５記載のヒトヘ
ムオキシゲナーゼ−１の測定方法。
【請求項７】請求項１又は２記載のモノクローナル抗
体、該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合
部位を含む抗体フラグメントからなる群から選ばれる少
なくともいずれか１種の存在下及び非存在下に、ヒトヘ
ムオキシゲナーゼの全活性を測定することを特徴とする
請求項４記載のヒトヘムオキシゲナーゼ−１の測定方
法。
【請求項８】請求項１又は２記載のモノクローナル抗
体、該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結合
部位を含む抗体フラグメントからなる群から選ばれる少
なくともいずれか１種が含まれていることを特徴とする
ヒトヘムオキシゲナーゼ−１測定用キット。
【請求項９】請求項１又は２記載のモノクローナル抗
体及び／又はその可変領域からなる抗体結合部位を含む
抗体フラグメントと、該モノクローナル抗体又はその可
変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメントと
は異なる部位でヒトヘムオキシゲナーゼ−１と反応する
少なくとも１種の第２のモノクローナル抗体及び／又は
その可変領域からなる抗体結合部位を含む抗体フラグメ
ントとが含まれていることを特徴とするヒトヘムオキシ
ゲナーゼ−１測定用キット。
【請求項１０】請求項１又は２記載のモノクローナル
抗体、該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結
合部位を含む抗体フラグメントからなる群から選ばれる
少なくともいずれか１種と、ヒトヘムオキシゲナーゼの
全活性を測定することができる試薬とが含まれているこ
とを特徴とするヒトヘムオキシゲナーゼ−１測定用キッ
ト。
【請求項１１】請求項１又は２記載のモノクローナル
抗体、該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結
合部位を含む抗体フラグメントからなる群から選ばれる
少なくともいずれか１種を用いることを特徴とするヒト
ヘムオキシゲナーゼ−１の検出方法。
【請求項１２】請求項１又は２記載のモノクローナル
抗体、該モノクローナル抗体の可変領域からなる抗体結
合部位を含む抗体フラグメントからなる群から選ばれる
少なくともいずれか１種を用いて蛍光染色することを特
徴とする請求項１１記載のヒトヘムオキシゲナーゼ−１
の検出方法。
【請求項１３】請求項４〜７のいずれか記載のヒトヘ
ムオキシゲナーゼ−１の測定方法により、細胞又は組織
中のヒトヘムオキシゲナーゼ−１含量を測定することを
特徴とする細胞又は組織におけるストレスの検出方法。
【請求項１４】請求項１１又は１２記載のヒトヘムオ
キシゲナーゼ−１の検出方法により、細胞又は組織にお
けるヒトヘムオキシゲナーゼ−１を検出することを特徴
とする細胞又は組織におけるストレスの検出方法。