JP3292387B2

JP3292387B2 - 新規ｄｎａ、それがコ−ドするポリペプチド及びそれらの検出方法

Info

Publication number: JP3292387B2
Application number: JP28552092A
Authority: JP
Inventors: 操大木; 喜美子菊地; 浩之三好; 知子神津
Original assignee: SRL, INC.
Current assignee: SRL, INC.
Priority date: 1992-09-29
Filing date: 1992-09-29
Publication date: 2002-06-17
Anticipated expiration: 2017-06-17
Also published as: JPH06113863A; DE69333331D1; DE69333331T2; EP0625573A4; EP0625573A1; EP0625573B1; US5580727A; WO1994008005A1

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、新規ＤＮＡ、それがコ
ードするポリペプチド及びそれらの検出方法に関する。
本発明は、ｔ（８；２１）転座型骨髄性白血病の診断に
有用である。

【０００２】

【従来の技術】ｔ（８；２１）転座型急性骨髄性白血病
は、第２１染色体上に第８染色体上の遺伝子が転座する
ことを伴う急性骨髄性白血病（以下、「ＡＭＬ」という
ことがある）であり、ｔ（１５；１７）転座型急性骨髄
性白血病と並んで世界的に最も頻度の高い転座型急性骨
髄性白血病である。ｔ（８；２１）（ｑ２２；ｑ２２）
転座型急性骨髄性白血病は、ＡＭＬのＦＡＢ−Ｍ２サブ
タイプと形態学的に関連する（「白血病における染色体
に関する第４回国際ワークショップ、１９８２」Cancer
Genet. Cytogenet. 11,284(1984); J.D.Rowley,Sem.He
matol.27,122(1990)。ｔ（８；２１）転座を有する白血
病細胞は、高い頻度のＡｕｅｒｒｏｄｓ及び顆粒球系
の突然変異を伴う(R.Berger et al., Blood 59, 171 (1
982)) 。細胞遺伝学的には、この転座はしばしば性染色
体の欠失を伴い、これはｔ（８；２１）転座を有さない
ＡＭＬにおいては稀にしか見られない特徴である。

【０００３】ｔ（８；２１）転座型ＡＭＬの診断は、上
記特徴及び白血病細胞の染色体解析により可能ではある
が、手間がかかり、診断の感度も満足できるものではな
い。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、簡便な操作で感度良くｔ（８；２１）転座型急性骨
髄性白血病を診断することができる手段を提供すること
である。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本願発明者らは、鋭意
研究の結果、ｔ（８；２１）転座型急性骨髄性白血病の
白血病細胞中に、第２１染色体上の遺伝子ＡＭＬ１（H.
Miyoshi et al., Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 8, 1
0431 (1991)) と、この遺伝子の隣に転座する第８染色
体上の未知の遺伝子の融合遺伝子の転写産物が存在する
ことを見出し、この融合遺伝子の塩基配列を決定するこ
とに成功した。また、この融合遺伝子又はその転写産物
の存在を特異的に検出することによりｔ（８；２１）転
座型ＡＭＬの診断を行う方法を見出し本発明を完成し
た。

【０００６】すなわち、本発明は、配列番号１で示され
る塩基配列を有するＡＭＬ１−ＭＴＧ８融合ＤＮＡ及び
該ＡＭＬ１−ＭＴＧ８融合ＤＮＡの断片であって、配列
番号１の第２１１０番目と第２１１１番目の塩基の間の
融合部を含むｔ（８；２１）転座型ＡＭＬの検出に用い
ることができるＤＮＡ断片を提供する。なお、ＭＴＧ８
は、ｔ（８；２１）転座において、第２１染色体上のＡ
ＭＬ１遺伝子に隣接する第８染色体上の未知の遺伝子を
このように命名したものである。

【０００７】

【０００８】さらに、本発明は、配列番号１で示される
塩基配列中のチミンがウラシルに置換した配列を有する
ＡＭＬ１−ＭＴＧ８融合ｍＲＮＡ及びＡＭＬ１−ＭＴＧ
８融合ｍＲＮＡの断片であって配列番号１の第２１１０
番目と第２１１１番目の塩基の間の融合部を含むｔ
（８；２１）転座型ＡＭＬの検出に用いることができる
ｍＲＮＡ断片を提供する。

【０００９】さらに、本発明は、上記ＤＮＡ断片を標識
してなるプローブ、及び該プローブを用いて上記融合Ｄ
ＮＡを検出する方法を提供する。

【００１０】さらに、本発明は、上記本発明の融合ｍＲ
ＮＡ又はその断片に相補的な配列を有するＤＮＡ又はＲ
ＮＡを標識してなるプローブ、及び該プローブを用いて
上記融合ｍＲＮＡを検出する方法を提供する。

【００１１】さらに、本発明は、上記本発明の融合ＤＮ
Ａ又はその断片を核酸増幅法により増幅し、増幅された
ＤＮＡ断片を検出することから成る、検体中のＡＭＬ１
−ＭＴＧ８融合ＤＮＡ又はその断片の検出方法を提供す
る。

【００１２】さらに、本発明は、上記本発明の融合ｍＲ
ＮＡ又はその断片を核酸増幅法により増幅し、増幅され
たＲＮＡ断片を検出することから成る、検体中のＡＭＬ
１−ＭＴＧ８融合ｍＲＮＡ又はその断片の検出方法を提
供する。

【００１３】さらに、本発明は、上記本発明のポリペプ
チドに特異的な抗体を用いた免疫測定法により上記ポリ
ペプチドを検出する方法を提供する。

【００１４】以下、本発明をより詳細に説明する。

【００１５】本発明のＡＭＬ１−ＭＴＧ８融合ＤＮＡの
塩基配列の決定は、ｔ（８；２１）転座型ＡＭＬ患者の
骨髄細胞の全ＲＮＡを抽出し、これからｃＤＮＡライブ
ラリーを作製し、これをＡＭＬ１遺伝子に特異的なプロ
ーブ（H. Miyoshi et al. 上掲）でスクリーニングして
その塩基配列を決定することにより行われた。なお、確
認のため、ＭＴＧ８部分に特異的なプローブも作製し、
このプローブとＡＭＬ１遺伝子に特異的な上記プローブ
の両方をスクリーニングに用いて同様な操作を行った。
さらに、ｔ（８；２１）転座型ＡＭＬ患者のＲＮＡから
ｃＤＮＡを合成し、上記決定された塩基配列の情報に基
づいてｃＤＮＡの融合部分を含むｃＤＮＡ断片をＰＣＲ
法により増幅し、増幅されたＤＮＡ断片を検出すること
によりｔ（８；２１）転座型ＡＭＬの診断が可能である
ことを確認した。従って、本発明のＤＮＡがｔ（８；２
１）転座型ＡＭＬに特徴的なＡＭＬ１−ＭＴＧ８融合Ｄ
ＮＡであることが確認された。なお、上記操作は下記実
施例１に詳細に述べられている。

【００１６】上記のようにして塩基配列が決定された、
本発明のＤＮＡは配列番号１に示す塩基配列を有する。
この塩基配列を、第２１染色体上のＡＭＬ１遺伝子の塩
基配列と比較すると、第２１１０番目のアデニンまでの
塩基配列が、ＡＭＬ１遺伝子の塩基配列と完全に一致し
ており、第２１１１番目移行の塩基配列は従来から知ら
れていなかったものであり、この遺伝子は第８染色体上
のものが転座したものと考えられる。上述のようにこの
遺伝子をＭＴＧ８と命名したので、このＤＮＡはＡＭＬ
１−ＭＴＧ８融合ＤＮＡと呼ぶことができる。なお、本
明細書において、ＤＮＡの「融合部」とは、第２１１０
番目のアデニンと第２１１１番目のアデニンとの間を言
う。また、上記融合ＤＮＡがコードする推定アミノ酸配
列も配列番号１に示されている。このアミノ酸配列を有
するポリペプチドにおいて、「融合部」とは第１７７番
目のアルギニンと第１７８番目のアスパラギンの間を言
う。

【００１７】なお、上記した本発明の融合ＤＮＡは、下
記実施例に詳細に説明する方法によっても調製できる
し、配列番号１に示された塩基配列の情報に基づき、ｔ
（８；２１）転座型ＡＭＬ患者の骨髄細胞を材料にして
例えばＰＣＲ法のような核酸増幅法を行うことにより容
易に調製することができる。

【００１８】配列番号１に示される全塩基配列を含むＤ
ＮＡは言うに及ばず、この塩基配列の融合部を含む、こ
のＤＮＡの断片も本発明の範囲に包含される。この融合
部がｔ（８；２１）転座型ＡＭＬに特徴的であるので、
この融合部を含むＤＮＡ断片は、たとえ完全長でなくて
もｔ（８；２１）転座型ＡＭＬの診断にとって同様に有
用であるからである。上記融合部を含むＤＮＡ断片は、
ｔ（８；２１）転座型ＡＭＬ患者の骨髄細胞を材料と
し、配列番号１に示される塩基配列の情報に基づいてＰ
ＣＲ法のような核酸増幅法を行うことにより、任意のＤ
ＮＡ断片を調製することができる。

【００１９】また、本発明の上記融合ＤＮＡは、ｔ
（８；２１）転座型ＡＭＬ患者の骨髄細胞中のｍＲＮＡ
を材料にして得られたものであるので、配列番号１のチ
ミンがウラシルに置換された塩基配列を有する、ＡＭＬ
１−ＭＴＧ８融合ｍＲＮＡが実在することが明らかであ
る。本発明は、このようなｍＲＮＡ、及び融合部を含む
その断片をも提供する。このようなｍＲＮＡ及びその断
片は下記実施例１に詳述する方法により得ることもでき
るし、その塩基配列が決定されており、また、３ＳＲ法
（特表平２−５００５６５号）やＮＡＳＢＡ法（特開平
２−００５８６４号）等の核酸増幅法によりｍＲＮＡ自
体を増幅することも可能であるので、ｔ（８；２１）転
座型ＡＭＬ患者の骨髄細胞を材料にして、これらの方法
により任意のｍＲＮＡ断片を得ることもできる。

【００２０】上記ＤＮＡ、ポリペプチド及びｍＲＮＡの
融合部はｔ（８；２１）転座型ＡＭＬに特徴的なもので
ある。ＡＭＬ１遺伝子及びＭＴＧ８遺伝子は、正常細胞
や他の転座型ＡＭＬ患者の細胞においてもそれぞれ第２
１染色体及び第８染色体上に存在するので、これらを個
別に検出してもｔ（８；２１）転座型ＡＭＬの診断を行
うことはできない。しかしながら、上記融合部は正常細
胞や他の転座型ＡＭＬ患者の細胞には存在せず、ｔ
（８；２１）転座型ＡＭＬ患者の細胞中にのみ存在する
ので、この融合部を検出することによりｔ（８；２１）
転座型ＡＭＬを特異的に診断することができる。

【００２１】この融合部を検出する手段として、本発明
は、まず、上記融合ＤＮＡ又は、融合部を含むその断片
を標識したプローブ及び上記融合ｍＲＮＡ又は、融合部
を含むその断片に相補的なＤＮＡ又はＲＮＡを標識した
プローブを提供する。このプローブ用いて、このプロー
ブと相補的な配列が存在するか否か、すなわち、上記融
合ＤＮＡ又は融合ｍＲＮＡが存在するか否かを調べるこ
とにより、上記融合部が細胞中に存在するか否か、ひい
ては、その患者がｔ（８；２１）転座型ＡＭＬか否かを
診断することができる。なお、標識の方法は当業者にと
って周知である。

【００２２】また、配列番号１に示す塩基配列が本発明
により決定されたので、この情報に基づき、融合ＤＮＡ
の全部若しくは融合部を含むその断片又は融合ｍＲＮＡ
の全部若しくは融合部を含むその断片を核酸増幅法によ
り増幅し、増幅された核酸断片を電気泳動後、エチジウ
ムブロミド染色等により検出することにより配列番号１
に示す融合ＤＮＡ又は融合ｍＲＮＡの存在を検出するこ
とができ、ひいてはｔ（８；２１）転座型ＡＭＬを診断
することができる。後述の実施例２では、第２００４番
目のグアニンから第２０２３番目のグアニンまでの配列
をプライマー１（センス）とし、第２４６８番目のシト
シンから第２４５１番目のグアニンの相補的オリゴヌク
レオチドをプライマー２（アンチセンス）として用い
て、第２００４番目のグアニンと第２４６８番目のシト
シンまでの配列をＰＣＲ法により増幅し、これを検出す
ることによりｔ（８；２１）転座型ＡＭＬの診断に成功
した。なお、増幅する領域は下記実施例２に記載の領域
に限定されるものではないことは言うまでもなく、融合
部をまたぐあらゆる領域を増幅することができる。この
方法は極めて感度が高く、１０⁸ 個の細胞中に１個のｔ
（８；２１）転座を有する細胞が存在すればこれを検出
することができる。

【００２３】また、本発明の融合ＤＮＡは、ｔ（８；２
１）ＡＭＬ患者の骨髄細胞中のｍＲＮＡから調製された
ものであるので、このＤＮＡがコードするポリペプチド
が細胞中で発現していると考えられる。従って、該ポリ
ペプチド又は融合部を含むその断片に対する抗体、好ま
しくはモノクローナル抗体を常法により調製し、これを
用いて免疫測定により特異的に上記ポリペプチドを検出
することによってもｔ（８；２１）転座型ＡＭＬを診断
することができる。

【００２４】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づき、さらに具体
的に説明する。もっとも、本発明は下記実施例に限定さ
れるものではない。

【００２５】実施例１ＡＭＬ１−ＭＴＧ８融合ＤＮＡの単離１．ＲＮＡの抽出分離染色体転座ｔ（８：２１）を持つ急性骨髄性白血病細胞
株Ｋａｓｕｍｉ−１（Ｈ．Ａｓｏｕｅｔａｌ．，
Ｂｌｏｏｄ，７７，２０３１（１９９１））から、ＡＧ
ＰＣ法（ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉらＡｎａｌ．Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．１６２．１５６−１５９（１９８７））により
ＲＮＡを分離した。以下にその方法を述べる。

【００２６】１）Ｋａｓｕｍｉ−１細胞を遠心操作により沈澱として
回収し、１０⁷個の細胞あたり１ｍｌのＳｏｌｕｔｉｏ
ｎＤ（４Ｍグアニジンチオシアネート、２５ｍＭク
エン酸ナトリウム、０．５％サルコシル、０．１Ｍ２
−メルカプトエタノール）を加え可溶化する。２）以下の試薬を順次加え、添加ごとに混和する。・２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）１／１０量・水飽和フェノール等量・クロロホルム／イソアミルアルコール（４９：１）
１／５量３）１０秒間激しく振とうし、１５分間氷冷する。４）遠心管に移し４℃で１０，０００ｇ、２０分間遠心
する。５）水層を別の遠心管に移し、等量のイソプロパノール
を加え、よく混和する。６）−２０℃で１時間静置する。７）４℃で１０，０００ｇ、２０分間遠心する。８）上清を捨て、ＲＮＡの沈澱にＳｏｌｕｔｉｏｎＤ
を１０⁷個細胞あたり０．１ｍｌ加えて溶解し、等量の
イソプロパノールを加え、混和する。９）−２０℃で１時間静置する。１０）４℃で１０，０００ｇ、１０分間遠心する。１１）上清を捨て、ＲＮＡの沈澱を７５％エタノールで
洗浄後、乾燥させる。１２）適量のＤＥＰＣ処理蒸留水に溶解する。 poly(A)⁺RNA の精製は、分離したＲＮＡよりOligotex-d
T30 （日本ロシュ）を用いて、同社のプロトコールに従
い行った。

【００２７】２．ｃＤＮＡライブラリーの作製 Kasumi-1細胞より精製したpoly(A)⁺RNA 約５μｇを用
いて以下の操作によりｃＤＮＡライブラリーを作製し
た。１）poly(A)⁺RNA 約５μｇとオリゴd(T)_12-18 （ファル
マシア）２．５μｇをＤＥＰＣ処理蒸留水中で７０℃、
１０分間加熱した後、氷冷する。２）５０μｌの反応液（５０mM Tris-HCl（pH 8.3）、
４０mM KCl、１０mM DTT、６mM MgCl₂、０．５mM dNTP
）を調製し、４０単位のRNase Inhibitor （ベーリン
ガー）と５００単位のM-MLV H^-逆転写酵素（ＢＲＬ）を
加え、３７℃で１時間加温し、ss-cDNA を合成する。３）４００μｌの反応液（２０mM Tris-HCl (pH 6.9)、
９０mM KCl、５ｍＭ MgCl₂、 0.15mM β−ＮＡＤ、10
mM（ＮＨ₄ ）₂SO₄、５mM DTT、0.25mM dNTP ）を調製
し、３０単位のE. coli DNA リガーゼ（ＮＥＢ）と４０
単位のE. coli DNAポリメラーゼＩと４単位の E. coli
RNaseH （ＢＲＬ）を加え、１６℃で２時間加温した
後、１０単位の T4 DNA ポリメラーゼ（ＢＲＬ）を加
え、３７℃で１５分間加温することにより ds-cDNAを合
成する。４）0.5M EDTA (pH8.0) を１６μｌ加える。５）４００μｌフェノール／クロロホルム混液で抽出す
る。６）４００μｌクロロホルムで抽出する。７）1/10量の３Ｍ酢酸ナトリウム (pH5.2)と2.5 倍量の
エタノールを加えて遠心することにより、ds-cDNA を沈
澱として回収する。８）EcoRI/NotIアダプター（ファルマシア）と４００単
位のT4 DNAリガーゼ（ＮＥＢ）を加え、１６℃で１６時
間反応させることにより連結する。９）２０単位の T4 ポリヌクレオチドキナーゼ（ＢＲ
Ｌ）と３７℃で３０分間反応させリン酸化する。１０）６５℃で１０分間加温する。１１）５）〜７）の操作を行う。１２）酢酸カリウムによる濃度勾配法にり、cDNAのサイ
ズによる分画を行い、２kb以上の長さの画分を回収す
る。１３）制限酵素 EcoRIで切断し、ホスファターゼで処理
したλZAP IIベクター（Stratagene）１μｇと２００単
位の T4 DNA リガーゼ（ＮＥＢ）を加え、１６℃で一晩
反応させる。１４）反応液を Gigapack II Packging Extracts (Stra
tagene) を用いてパッケージングした後、大腸菌 XL1-B
lue を宿主としたλプラークから成るライブラリーを作
製する。

【００２８】３．融合遺伝子 cDNA のスクリーニング約１００万のプラークから成る cDNA ライブラリーを用
いたスクリーニングを以下の操作で行った。１）ライブラリーの作製は、直径約１５cmのプレートを
用い、１枚のプレートに４〜５万個のプラークが生ずる
ように調製する。２）プラークの生じたプレートの上に、ナイロンメンブ
レン Hybond-N （アマシャム）をのせ、１分間静置す
る。３）ナイロンメンブレンを静かにプレートからはがし、
変性液（0.5N NaOH 、1.5M NaCl ）に５分間浸す。４）中和液（0.5M Tris-HCl (pH7.5) 、1.5M NaCl ）に
５分間浸す。５）２×SSC （１×SSC:0.15M NaCl、15mMクエン酸ナト
リウム）で洗い、風乾した後、３１２nmの紫外線を照射
してDNA をナイロンメンブレンに固定する。６）AML1 cDNA プローブ（C6E6H2、 (H. Miyoshi et a
l., 上掲）またはRT/PCR法により単離したCH15クローン
の一部（CH15H2S、第２２４７〜２７０１塩基）をマルチ
プライムラベリングキット（アマシャム）を用いて³²Ｐ
放射線標識した後、煮沸急冷し変性させる。７）標識したプローブとナイロンメンブレンをハイブリ
ダイゼーション液（６×SSC 、１０％硫酸デキストラ
ン、１％ＳＤＳ、１×デンハルト溶液、５０％ホルムア
ミド）中で、４２℃一晩ハイブリダイゼーションする。８）メンブレンを２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ溶液で洗う。９）メンブレンを 0.1×ＳＳＣ、 0.1％ＳＤＳ溶液で６
５℃、１時間洗う。１０）メンブレンをサランラップ（登録商標）にはさ
み、Ｘ線フィルムと重ねてオートラジオグラフィーを行
う。１１）ポジティブクローンのファージＤＮＡを精製す
る。１２）ファージＤＮＡを制限酵素 NotI で消化し、その
インサート部分をpBluescript II KS⁺ (Stratagene) の
NtoI サイトにリクローニングする。

【００２９】４．ＤＮＡ塩基配列の決定 pBluescript II KS⁺にリクローニングされた cDNA イン
サートの塩基配列は、AutoRead Sequencing Kit （ファ
ルマシア）を用い、A.L.F. DNA Sequencer（ファルマシ
ア）によって決定した。すべての実験操作および反応
は、ファルマシアのプロトコールに従って行った。

【００３０】実施例２ RT-PCR法によるｔ（８；２１）
転座型骨髄性白血病の診断および Minimal Residual De
sease （最小残存白血病）の検出−実施例１．逆転写反応白血病患者の骨髄細胞より得られた全ＲＮＡを１から５
μｇ使用し、逆転写酵素により cDNA を合成した。反応
溶液（２０μｇ）の組成は、以下のとおりである。１０
mMトリス−塩酸(pH 8.3)、７５mM塩化カリウム、３mM塩
化マグネシウム、１mMジチオスレイトール、１mM dATP
、１mM dGTP、１mM dCTP 、１mM dTTP、１０ユニット
ＲＮＡ分解酵素阻害剤、２５pmolランダムヘキサマー、
２００ユニットの逆転写酵素、および１〜５μｇＲＮ
Ａ。反応液を室温で１０分間放置し、プライマーを鋳型
ＲＮＡにアニールさせた後に、３７℃で１時間反応させ
た。反応終了後、９９℃で５分間加熱し、逆転写酵素を
失活させ、また生成した cDNA を鋳型ＲＮＡより解離さ
せた。

【００３１】２．ＰＣＲ逆転写反応産物（cDNA）を1/10量（２μｌ）使用し、Ａ
ＭＬ１配列であるプライマーＡＭＬ１−Ｃと、ＭＴＧ８
の配列であるプライマーＭＴＧ８−２を用いて、ｔ
（８；２１）転写産物上の融合部近傍の配列を、耐熱性
ＤＮＡポリメラーゼにより増幅させた。ＰＣＲ反応溶液
（２５μｌ）の組成は以下のとおりである。１０mMトリ
ス−塩酸 (pH 8.3) 、５０mM塩化カリウム、３mM塩化マ
グネシウム、0.2mM dATP 、0.2mM dGTP、0.2mM dCTP、
0.2mM TTP 、５pmol AML1-C (5'-GAGGGAAAAGCTTCACTCTG
-3' ）、5pmol MTG8-2(5'-GCGAACTCTTTCTCCTATC-3') お
よび1.25ユニットのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ。反応
溶液の蒸発を防ぐため、流動パラフィンを１滴上層し
た。反応溶液を初めに、９５℃で２分間熱変性した後
に、アニーリングを６２℃３０秒、伸長反応を７２℃１
分、熱変性を９５℃２０秒を１サイクルとする反応を、
ＰＣＲ自動化装置を用いて、３４サイクル行った。サイ
クル終了後、更に６２℃３０秒アニーリングを行い、７
２℃で７分間伸長させた。

【００３２】３．ＰＣＲ増幅産物の解析ＰＣＲ反応後に１／５量の６×ローディングバッファー
（３０％グリセロール、0.25％ブロムフェノールブル
ー、0.25ザイレンシアノールを含む）を加え、よく撹拌
した後に、その半量を３％ Nusieve ３：１アガロース
ゲル電気泳動に用いた。電気泳動は、0.5 μｇ／ｍｌエ
チジウムブロマイドを含むバッファー溶液中で行い、泳
動後、ゲルを紫外線照射し、エチジウムブロマイドによ
り染色されたＤＮＡ産物を検出した。プライマーとして
AML1-C と MTG8-2 を用いた場合、４５７塩基対のＤＮ
Ａが増幅されることが、ｔ（８；２１）転座の有無の指
標となった。この方法により、感度良くｔ（８；２１）
転座型ＡＭＬの診断を行うことができた。

【００３３】

【発明の効果】本発明により、ｔ（８；２１）転座型Ａ
ＭＬにおいて特異的に生じる融合ＤＮＡ及びその断片並
びにそれによってコードされるポリペプチド及びその断
片並びにこれらの検出方法が提供された。本発明によ
り、ｔ（８；２１）転座型ＡＭＬを特異的に、感度良
く、簡便な操作で診断できるようになった。

【００３４】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：４２８７鎖の数：両形態トポロジー：直鎖状起源：ヒトｔ（８；２１）転座型急性骨髄性白血病患者
の骨髄細胞配列 CATAGAGCCA GCGGGCGCGG GCGGGACGGG CGCCCCGCGG CCGGACCCAG CCAGGGCACC 60 ACGCTGCCCG GCCCTGCGCC GCCAGGCACT TCTTTCCGGG GCTCCTAGGG ACGCCAGAAG 120 GAAGTCAACC TCTGCTGCTT CTCCTTGGCC TGCGTTGGAC CTTCCTTTTT TTGTTGTTTT 180 TTTTTGTTTT TCCCCTTTCT TCCTTTTGAA TTAACTGGCT TCTTGGCTGG ATGTTTTCAA 240 CTTCTTTCCT GGCTGCGAAC TTTTCCCCAA TTGTTTTCCT TTTACAACAG GGGGAGAAAG 300 TGCTCTGTGG TCCGAGGCGA GCCGTGAAGT TGCGTGTGCG TGGCAGTGTG CGTGGCAGGA 360 TGTGCGTGCG TGTGTAACCC GAGCCGCCCG ATCTGTTTCG ATCTGCGCCG CGGAGCCCTC 420 CCTCAAGGCC CGCTCCACCT GCTGCGGTTA CGCGGCGCTC GTGGGTGTTC GTGCCTCGGA 480 GCAGCTAACC GGCGGGTGCT GGGCGACGGT GGAGGAGTAT CGTCTCGCTG CTGCCCGAGT 540 CAGGGCTGAG TCACCCAGCT GATGTAGACA GTGGCTGCCT TCCGAAGAGT GCGTGTTTGC 600 ATGTGTGTGA CTCTGCGGCT GCTCAACTCC CAACAAACCA GAGGACCAGC CACAAACTTA 660 ACCAACATCC CCAAACCCGA GTTCACAGAT GTGGGAGAGC TGTAGAACCC TGAGTGTCAT 720 CGACTGGGCC TTCTTATGAT TGTTGTTTTA AGATTAGCTG AAGATCTCTG AAACGCTGAA 780 TTTTCTGCAC TGAGCGTTTT GACAGAATTC ATTGAGAGAA CAGAGAACAT GACAAGTACT 840 TCTAGCTCAG CACTGCTCCA ACTACTGAAG CTGATTTTCA AGGCTACTTA AAAAAATCTG 900 CAGCGTACAT TAATGGATTT CTGTTGTGTT TAAATTCTCC ACAGATTGTA TTGTAAATAT 960 TTTATGAAGT AGAGCATATG TATATATTTA TATATACGTG CACATACATT AGTAGCACTA 1020 CCTTTGGAAG TCTCAGCTCT TGCTTTTCGG GACTGAAGCC AGTTTTGCAT GATAAAAGTG 1080 GCCTTGTTAC GGGAGATAAT TGTGTTCTGT TGGGACTTTA GACAAAACTC ACCTGCAAAA 1140 AACTGACAGG CATTAACTAC TGGAACTTCC AAATAATGTG TTTGCTGATC GTTTTACTCT 1200 TCGCATAAAT ATTTTAGGAA GTGTATGAGA ATTTTGCCTT CAGGAACTTT TCTAACAGCC 1260 AAAGACAGAA CTTAACCTCT GCAAGCAAGA TTCGTGGAAG ATAGTCTCCA CTTTTTAATG 1320 CACTAAGCAA TCGGTTGCTA GGAGCCCATC CTGGGTCAGA GGCCGATCCG CAGAACCAGA 1380 ACGTTTTCCC CTCCTGGACT GTTAGTAACT TAGTCTCCCT CCTCCCCTAA CCACCCCCGC 1440 CCCCCCCCAC CCCCCGCAGT AATAAAGGCC CCTGAACGTG TATGTTGGTC TCCCGGGAGC 1500 TGCTTGCTGA AGATCCGCGC CCCTGTCGCC GTCTGGTAGG AGCTGTTTGC AGGGTCCTAA 1560 CTCAATCGGC TTGTTGTG ATG CGT ATC CCC GTA GAT GCC AGC ACG AGC CGC 1611 Met Arg Ile Pro Val Asp Ala Ser Thr Ser Arg 1 5 10 CGC TTC ACG CCG CCT TCC ACC GCG CTG AGC CCA GGC AAG ATG AGC GAG 1659 Arg Phe Thr Pro Pro Ser Thr Ala Leu Ser Pro Gly Lys Met Ser Glu 15 20 25 GCG TTG CCG CTG GGC GCC CCG GAC GCC GGC GCT GCC CTG GCC GGC AAG 1707 Ala Leu Pro Leu Gly Ala Pro Asp Ala Gly Ala Ala Leu Ala Gly Lys 30 35 40 CTG AGG AGC GGC GAC CGC AGC ATG GTG GAG GTG CTG GCC GAC CAC CCG 1755 Leu Arg Ser Gly Asp Arg Ser Met Val Glu Val Leu Ala Asp His Pro 45 50 55 GGC GAG CTG GTG CGC ACC GAC AGC CCC AAC TTC CTC TGC TCC GTG CTG 1803 Gly Glu Leu Val Arg Thr Asp Ser Pro Asn Phe Leu Cys Ser Val Leu 60 65 70 75 CCT ACG CAC TGG CGC TGC AAC AAG ACC CTG CCC ATC GCT TTC AAG GTG 1851 Pro Thr His Trp Arg Cys Asn Lys Thr Leu Pro Ile Ala Phe Lys Val 80 85 90 GTG GCC CTA GGG GAT GTT CCA GAT GGC ACT CTG GTC ACT GTG ATG GCT 1899 Val Ala Leu Gly Asp Val Pro Asp Gly Thr Leu Val Thr Val Met Ala 95 100 105 GGC AAT GAT GAA AAC TAC TCG GCT GAG CTG AGA AAT GCT ACC GCA GCC 1947 Gly Asn Asp Glu Asn Tyr Ser Ala Glu Leu Arg Asn Ala Thr Ala Ala 110 115 120 ATG AAG AAC CAG GTT GCA AGA TTT AAT GAC CTC AGG TTT GTC GGT CGA 1995 Met Lys Asn Gln Val Ala Arg Phe Asn Asp Leu Arg Phe Val Gly Arg 125 130 135 AGT GGA AGA GGG AAA AGC TTC ACT CTG ACC ATC ACT GTC TTC ACA AAC 2043 Ser Gly Arg Gly Lys Ser Phe Thr Leu Thr Ile Thr Val Phe Thr Asn 140 145 150 155 CCA CCG CAA GTC GCC ACC TAC CAC AGA GCC ATC AAA ATC ACA GTG GAT 2091 Pro Pro Gln Val Ala Thr Tyr His Arg Ala Ile Lys Ile Thr Val Asp 160 165 170 GGG CCC CGA GAA CCT CGA AAT CGT ACT GAG AAG CAC TCC ACA ATG CCA 2139 Gly Pro Arg Glu Pro Arg Asn Arg Thr Glu Lys His Ser Thr Met Pro 175 180 185 GAC TCA CCT GTG GAT GTG AAG ACG CAA TCT AGG CTG ACT CCT CCA ACA 2187 Asp Ser Pro Val Asp Val Lys Thr Gln Ser Arg Leu Thr Pro Pro Thr 190 195 200 ATG CCA CCT CCC CCA ACT ACT CAA GGA GCT CCA AGA ACC AGT TCA TTT 2235 Met Pro Pro Pro Pro Thr Thr Gln Gly Ala Pro Arg Thr Ser Ser Phe 205 210 215 ACA CCG ACA ACG TTA ACT AAT GGC ACG AGC CAT TCT CCT ACA GCC TTG 2283 Thr Pro Thr Thr Leu Thr Asn Gly Thr Ser His Ser Pro Thr Ala Leu 220 225 230 235 AAT GGC GCC CCC TCA CCA CCC AAT GGC TTC AGC AAT GGG CCT TCC TCT 2331 Asn Gly Ala Pro Ser Pro Pro Asn Gly Phe Ser Asn Gly Pro Ser Ser 240 245 250 TCT TCC TCC TCC TCT CTG GCT AAT CAA CAG CTG CCC CCA GCC TGT GGT 2379 Ser Ser Ser Ser Ser Leu Ala Asn Gln Gln Leu Pro Pro Ala Cys Gly 255 260 265 GCC AGG CAA CTC AGC AAG CTG AAA AGG TTC CTT ACT ACC CTG CAG CAG 2427 Ala Arg Gln Leu Ser Lys Leu Lys Arg Phe Leu Thr Thr Leu Gln Gln 270 275 280 TTT GGC AAT GAC ATT TCA CCC GAG ATA GGA GAA AGA GTT CGC ACC CTC 2475 Phe Gly Asn Asp Ile Ser Pro Glu Ile Gly Glu Arg Val Arg Thr Leu 285 290 295 GTT CTG GGA CTA GTG AAC TCC ACT TTG ACA ATT GAA GAA TTT CAT TCC 2523 Val Leu Gly Leu Val Asn Ser Thr Leu Thr Ile Glu Glu Phe His Ser 300 305 310 315 AAA CTG CAA GAA GCT ACT AAC TTC CCA CTG AGA CCT TTT GTC ATC CCA 2571 Lys Leu Gln Glu Ala Thr Asn Phe Pro Leu Arg Pro Phe Val Ile Pro 320 325 330 TTT TTG AAG GCC AAC TTG CCC CTG CTG CAG CGT GAG CTC CTC CAC TGC 2619 Phe Leu Lys Ala Asn Leu Pro Leu Leu Gln Arg Glu Leu Leu His Cys 335 340 345 GCA AGA CTG GCC AAA CAG AAC CCT GCC CAG TAC CTC GCC CAG CAT GAA 2667 Ala Arg Leu Ala Lys Gln Asn Pro Ala Gln Tyr Leu Ala Gln His Glu 350 355 360 CAG CTG CTT CTG GAT GCC AGC ACC ACC TCA CCT GTT GAC TCC TCA GAG 2715 Gln Leu Leu Leu Asp Ala Ser Thr Thr Ser Pro Val Asp Ser Ser Glu 365 370 375 CTG CTT CTC GAT GTG AAC GAA AAC GGG AAG AGG CGA ACT CCA GAC AGA 2763 Leu Leu Leu Asp Val Asn Glu Asn Gly Lys Arg Arg Thr Pro Asp Arg 380 385 390 395 ACC AAA GAA AAT GGC TTT GAC AGA GAG CCT TTG CAC TCA GAA CAT CCA 2811 Thr Lys Glu Asn Gly Phe Asp Arg Glu Pro Leu His Ser Glu His Pro 400 405 410
AGC AAG CGA CCA TGC ACT ATT AGC CCA GGC CAG CGG TAC AGT CCA AAT 2859 Ser Lys Arg Pro Cys Thr Ile Ser Pro Gly Gln Arg Tyr Ser Pro Asn 415 420 425 AAC GGC TTA TCC TAC CAG CCC AAT GGC CTG CCT CAC CCT ACC CCA CCT 2907 Asn Gly Leu Ser Tyr Gln Pro Asn Gly Leu Pro His Pro Thr Pro Pro 430 435 440 CCA CCT CAG CAT TAC CGT TTG GAT GAT ATG GCC ATT GCC CAC CAC TAC 2955 Pro Pro Gln His Tyr Arg Leu Asp Asp Met Ala Ile Ala His His Tyr 445 450 455 AGG GAC TCC TAT CGA CAC CCC AGC CAC AGG GAC CTC AGG GAC AGA AAC 3003 Arg Asp Ser Tyr Arg His Pro Ser His Arg Asp Leu Arg Asp Arg Asn 460 465 470 475 AGA CCT ATG GGG TTG CAT GGC ACA CGT CAA GAA GAA ATG ATT GAT CAC 3051 Arg Pro Met Gly Leu His Gly Thr Arg Gln Glu Glu Met Ile Asp His 480 485 490 AGA CTA ACA GAC AGA GAA TGG GCA GAA GAG TGG AAA CAT CTT GAC CAT 3099 Arg Leu Thr Asp Arg Glu Trp Ala Glu Glu Trp Lys His Leu Asp His 495 500 505 CTG TTA AAC TGC ATA ATG GAC ATG GTA GAA AAA ACA AGG CGA TCT CTC 3147 Leu Leu Asn Cys Ile Met Asp Met Val Glu Lys Thr Arg Arg Ser Leu 510 515 520 ACC GTA CTA AGG CGG TGT CAA GAA GCA GAC CGG GAA GAA TTG AAT TAC 3195 Thr Val Leu Arg Arg Cys Gln Glu Ala Asp Arg Glu Glu Leu Asn Tyr 525 530 535 TGG ATC CGG CGG TAC AGT GAC GCC GAG GAC TTA AAA AAA GGT GGC GGC 3243 Trp Ile Arg Arg Tyr Ser Asp Ala Glu Asp Leu Lys Lys Gly Gly Gly 540 545 550 555 AGT AGC AGC AGC CAC TCT AGG CAG CAG AGT CCC GTC AAC CCA GAC CCA 3291 Ser Ser Ser Ser His Ser Arg Gln Gln Ser Pro Val Asn Pro Asp Pro 560 565 570 GTT GCA CTA GAC GCG CAT CGG GAA TTC CTT CAC AGG CCT GCG TCT GGA 3339 Val Ala Leu Asp Ala His Arg Glu Phe Leu His Arg Pro Ala Ser Gly 575 580 585 TAC GTG CCA GAG GAG ATC TGG AAG AAA GCT GAG GAG GCC GTC AAT GAG 3387 Tyr Val Pro Glu Glu Ile Trp Lys Lys Ala Glu Glu Ala Val Asn Glu 590 595 600 GTG AAG CGC CAG GCG ATG ACG GAG CTG CAG AAG GCC GTG TCT GAG GCG 3435 Val Lys Arg Gln Ala Met Thr Glu Leu Gln Lys Ala Val Ser Glu Ala 605 610 615 GAG CGG AAA GCC CAC GAC ATG ATC ACA ACA GAG AGG GCC AAG ATG GAG 3483 Glu Arg Lys Ala His Asp Met Ile Thr Thr Glu Arg Ala Lys Met Glu 620 625 630 635 CGC ACG GTC GCC GAG GCC AAA CGG CAG GCG GCG GAG GAC GCA CTG GCA 3531 Arg Thr Val Ala Glu Ala Lys Arg Gln Ala Ala Glu Asp Ala Leu Ala 640 645 650 GTT ATC AAT CAG CAG GAG GAT TCA AGC GAG AGT TGC TGG AAT TGT GGC 3579 Val Ile Asn Gln Gln Glu Asp Ser Ser Glu Ser Cys Trp Asn Cys Gly 655 660 665 CGT AAA GCG AGT GAA ACC TGC AGT GGC TGT AAC ACA GCC CGA TAC TGT 3627 Arg Lys Ala Ser Glu Thr Cys Ser Gly Cys Asn Thr Ala Arg Tyr Cys 670 675 680 GGC TCA TTT TGC CAG CAC AAA GAC TGG GAG AAG CAC CAT CAC ATC TGT 3675 Gly Ser Phe Cys Gln His Lys Asp Trp Glu Lys His His His Ile Cys 685 690 695 GGA CAG ACC CTG CAG GCC CAG CAG CAG GGA GAC ACA CCT GCA GTC AGC 3723 Gly Gln Thr Leu Gln Ala Gln Gln Gln Gly Asp Thr Pro Ala Val Ser 700 705 710 715 TCC TCT GTC ACG CCC AAC AGC GGG GCT GGG AGC CCG ATG GAC ACA CCA 3771 Ser Ser Val Thr Pro Asn Ser Gly Ala Gly Ser Pro Met Asp Thr Pro 720 725 730 CCA GCA GCC ACT CCG AGG TCA ACC ACC CCG GGA ACC CCT TCC ACC ATA 3819 Pro Ala Ala Thr Pro Arg Ser Thr Thr Pro Gly Thr Pro Ser Thr Ile 735 740 745 GAG ACA ACC CCT CGC TAGACGTGAA CTCAGAACTG TCGGAGGAAA GACAACACAA 3874 Glu Thr Thr Pro Arg 750 CCAACGCGAA ACCAATTCCT CATCCTCAGA TGCTCAAAGT TGTTTTTTTT GTTTGTTTGT 3934 TTATTAGATG AATTATCCTA TTTCAGTACT TCAGCAAGAG AGAACCTAAC TGTATCTTGA 3994 GGTGGTAGTA AAACACAGAG GGCCAGTAAC GGGTCGTAAT GACTTATTGT GGATAACAAA 4054 GATATCTTTT CTTTAGAGAA CTGAAAAGAG AGCAGAGAAT ATAACATGAA ATGATAGATT 4114 TGACCTCCTC CCTGTTATTT TCAAGTAGCT GGGATTTTAA ACTAGATGAC CTCATTAACC 4174 GATGCTTTAC CAAACAGCAA ACCAAGAGAT TGCTAATTGC TGTTGAAAGC AAAAATGCTA 4234 ATATTAAAAG TCACAATGTT CTTTATATAC AATAATGGAA AAAAAAAAAA AAA 4287

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳｅｑＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／ＧｅｎｅＳｅｑ

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】配列番号１で示される塩基配列を有する
ＡＭＬ１−ＭＴＧ８融合ＤＮＡ。
【請求項２】請求項１記載のＡＭＬ１−ＭＴＧ８融合
ＤＮＡの断片であって、配列番号１の第２１１０番目と
第２１１１番目の塩基の間の融合部を含むｔ（８；２
１）転座型ＡＭＬの検出に用いることができるＤＮＡ断
片。
【請求項３】配列番号１で示される塩基配列中のチミ
ンがウラシルに置換した配列を有するＡＭＬ１−ＭＴＧ
８融合ｍＲＮＡ。
【請求項４】請求項３記載のＡＭＬ１−ＭＴＧ８融合
ｍＲＮＡの断片であって配列番号１の第２１１０番目と
第２１１１番目の塩基の間の融合部を含むｔ（８；２
１）転座型ＡＭＬの検出に用いることができるｍＲＮＡ
断片。
【請求項５】請求項１記載の融合ＤＮＡ又は請求項２
記載のＤＮＡ断片を標識してなるプローブ。
【請求項６】請求項５記載のプローブを用いて請求項
１記載のＤＮＡを検出する方法。
【請求項７】請求項３記載の融合ｍＲＮＡ又は請求項
４記載のｍＲＮＡ断片に相補的な配列を有するＤＮＡ又
はＲＮＡを標識してなるプローブ。
【請求項８】請求項７記載のプローブを用いて請求項
３記載のｍＲＮＡ又は請求項４記載のｍＲＮＡ断片を検
出する方法。
【請求項９】請求項１記載の融合ＤＮＡ又は請求項２
記載のＤＮＡ断片を核酸増幅法により増幅し、増幅され
たＤＮＡ断片を検出することから成る、検体中のＡＭＬ
１−ＭＴＧ８融合ＤＮＡ又はその断片の検出方法。
【請求項１０】請求項３記載の融合ｍＲＮＡ又は請求
項４記載のｍＲＮＡ断片を核酸増幅法により増幅し、増
幅されたＲＮＡ断片を検出することから成る、検体中の
ＡＭＬ１−ＭＴＧ８融合ｍＲＮＡ又はその断片の検出方
法。
【請求項１１】請求項３記載の融合ｍＲＮＡ又は請求
項４記載のｍＲＮＡ断片のｃＤＮＡを作製し、該ｃＤＮ
Ａを核酸増幅法により増幅し、増幅されたＤＮＡ断片を
検出することから成る、検体中のＡＭＬ１−ＭＴＧ８融
合ｍＲＮＡ又はその断片の検出方法。