JP3283509B2 - インターフェロンαのレセプターの遺伝子をコードするｃＤＮＡフラグメント及び対応するタンパク質の製造方法 - Google Patents
インターフェロンαのレセプターの遺伝子をコードするｃＤＮＡフラグメント及び対応するタンパク質の製造方法Info
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- C07K14/7156—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interferons [IFN]
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は配列、特にインターフェロンαのレセプター
の遺伝子をコードするcDNA配列に関する。
の遺伝子をコードするcDNA配列に関する。
インターフェロンは、特に抗ウイルス状態を誘発し感
受性菌の増殖を抑制することができるα、β及びγとい
う３種類の抗原性タンパク質を指す属名である。
受性菌の増殖を抑制することができるα、β及びγとい
う３種類の抗原性タンパク質を指す属名である。
ウイルス感染の結果産生されるインターフェロンα及
びβの間には、これら２つの型のインターフェロンが同
一の細胞レセプターを介して反応できるような十分に高
度の構造的相同が存在する。
びβの間には、これら２つの型のインターフェロンが同
一の細胞レセプターを介して反応できるような十分に高
度の構造的相同が存在する。
ヒトインターフェロンαは、構造の異なる遺伝子によ
ってコードされる高度の相同を有する12のタンパク質の
混合物である。これらのサブタイプは同一の機能範囲を
有するが、比活性はそれぞれ異なる。
ってコードされる高度の相同を有する12のタンパク質の
混合物である。これらのサブタイプは同一の機能範囲を
有するが、比活性はそれぞれ異なる。
活性化リンパ球によって産生されるインターフェロン
γはインターフェロンα／βに対する相同を全く有して
おらず、これらのインターフェロンのレセプターとは反
応しない。
γはインターフェロンα／βに対する相同を全く有して
おらず、これらのインターフェロンのレセプターとは反
応しない。
現在、インターフェロンの構造（約165個のアミノ酸
を有する）はアミノ酸配列のレベルでは十分に解明され
ており、これらのタンパク質の機能領域を分析するため
に多くの研究が行われてきた。高親和性インターフェロ
ン及び低親和性インターフェロンをコードするDNAの制
限部位を用いてこれらのインターフェロンの間で形成し
たハイブリッド分子は、該分子のＮ末端部分が該分子の
細胞レセプターに対する結合親和性を決定し、従ってイ
ンターフェロンαの比活性を決定することを立証するの
に使用されてきた。
を有する）はアミノ酸配列のレベルでは十分に解明され
ており、これらのタンパク質の機能領域を分析するため
に多くの研究が行われてきた。高親和性インターフェロ
ン及び低親和性インターフェロンをコードするDNAの制
限部位を用いてこれらのインターフェロンの間で形成し
たハイブリッド分子は、該分子のＮ末端部分が該分子の
細胞レセプターに対する結合親和性を決定し、従ってイ
ンターフェロンαの比活性を決定することを立証するの
に使用されてきた。
ウイルス性の呼吸器系疾患は公衆衛生にとって重要な
経済問題である。臨床試験では、インターフェロンαが
種々のライノウイルスに感染した志願被験者を100％防
御することが立証された。また、インターフェロンαで
処理し且つコロナウイルスに感染させた志願被験者のう
ちの風邪の症状を起こしたのは６％であったが、擬薬で
処理した被験者では前記症状が37％見られた。
経済問題である。臨床試験では、インターフェロンαが
種々のライノウイルスに感染した志願被験者を100％防
御することが立証された。また、インターフェロンαで
処理し且つコロナウイルスに感染させた志願被験者のう
ちの風邪の症状を起こしたのは６％であったが、擬薬で
処理した被験者では前記症状が37％見られた。
ヒトインターフェロンαはこれらの試験で効果を示し
ているが、このインターフェロンには鼻腔粘膜に毒性を
及ぼすという重要な問題がある。
ているが、このインターフェロンには鼻腔粘膜に毒性を
及ぼすという重要な問題がある。
インターフェロンはまた、ヒトの体内で抗腫瘍活性を
示し、現在ではある種の癌の優れた治療薬となってい
る。しかしながら、一般的経路で投与したインターフェ
ロンは神経系に対する毒性も示すため、治療の可能性が
限定されている。
示し、現在ではある種の癌の優れた治療薬となってい
る。しかしながら、一般的経路で投与したインターフェ
ロンは神経系に対する毒性も示すため、治療の可能性が
限定されている。
実際、現時点では、治療活性と低毒性とを得るために
使用すべきインターフェロンがどのようなものであるか
を決定する手段はない。低毒性で大きな活性を示す改質
インターフェロンを形成するために、多くの研究所が多
大な努力を払ってきた。
使用すべきインターフェロンがどのようなものであるか
を決定する手段はない。低毒性で大きな活性を示す改質
インターフェロンを形成するために、多くの研究所が多
大な努力を払ってきた。
このような試みを成功させるためには、アゴニストの
構造を想像できるようにインターフェロンレセプターの
構造を知る必要があることは明らかである。活性が大き
く且つ鼻腔粘膜に対する毒性が低いアゴニストは、ウイ
ルス性の呼吸器系疾患の治療に関して極めて重要な市場
を見いだすであろう。
構造を想像できるようにインターフェロンレセプターの
構造を知る必要があることは明らかである。活性が大き
く且つ鼻腔粘膜に対する毒性が低いアゴニストは、ウイ
ルス性の呼吸器系疾患の治療に関して極めて重要な市場
を見いだすであろう。
そのため、本発明はより特定的には、インターフェロ
ンαのレセプターの構造を有するタンパク質の製造と、
特に細胞表面における該タンパク質の発現と、該タンパ
ク質をコードするDNA配列とに関する。
ンαのレセプターの構造を有するタンパク質の製造と、
特に細胞表面における該タンパク質の発現と、該タンパ
ク質をコードするDNA配列とに関する。
本発明はまず、第４図の配列か、又はこの配列との差
が３つ以下のアミノ酸に見られるにすぎない対立変形配
列（variant alllique）に対応することを特徴とする
ヒトインターフェロンαのレセプターに関する。
が３つ以下のアミノ酸に見られるにすぎない対立変形配
列（variant alllique）に対応することを特徴とする
ヒトインターフェロンαのレセプターに関する。
前述のごとき対立変形配列の一例としては、第４図の
配列の位置164のトレオニンがアルギニンで置換されて
おり且つ位置479のアスパラギン酸と位置480のグルタミ
ン酸との間にアスパラギン酸が挿入されている配列が挙
げられる。
配列の位置164のトレオニンがアルギニンで置換されて
おり且つ位置479のアスパラギン酸と位置480のグルタミ
ン酸との間にアスパラギン酸が挿入されている配列が挙
げられる。
本発明は、ヒトインターフェロンαのレセプターをコ
ードするDNA配列にも関する。
ードするDNA配列にも関する。
このDNA配列は、第４図の配列か又は該配列対立の配
列と一致しているのが好ましい。
列と一致しているのが好ましい。
ヒトインターフェロンαのレセプターをコードするDN
A配列の構造は実施例で分析する。この構造は主にシグ
ナルペプチドを含んでいる。場合によっては、このシグ
ナルペプチドを除去するか又は別のシグナルペプチドで
置換し得るが、通常はこの第４図のシグナルペプチドを
保持するのが好ましく、従って対応するコーディング配
列を保持するのが好ましい。
A配列の構造は実施例で分析する。この構造は主にシグ
ナルペプチドを含んでいる。場合によっては、このシグ
ナルペプチドを除去するか又は別のシグナルペプチドで
置換し得るが、通常はこの第４図のシグナルペプチドを
保持するのが好ましく、従って対応するコーディング配
列を保持するのが好ましい。
この配列は、適当な宿主細胞中で特にトランスメンブ
ランのレベルでその細胞発現を起こさせるようなシステ
ムに挿入するのが好ましい。
ランのレベルでその細胞発現を起こさせるようなシステ
ムに挿入するのが好ましい。
本発明は特に、インターフェロンαのレセプターの遺
伝子をコードすることを特徴とするDNAフラグメント、
特にcDNAフラグメントに関する。このフラグメントは主
に、第４図の配列又はその対立配列に合致する。
伝子をコードすることを特徴とするDNAフラグメント、
特にcDNAフラグメントに関する。このフラグメントは主
に、第４図の配列又はその対立配列に合致する。
このようなフラグメントとしては例えば、第４図のDN
A配列の位置569のシトシンがグアニンで置換されており
且つ位置1514のアデニンと位置1515のチミンとの間にコ
ドンTGAが挿入されているものが挙げられる。
A配列の位置569のシトシンがグアニンで置換されており
且つ位置1514のアデニンと位置1515のチミンとの間にコ
ドンTGAが挿入されているものが挙げられる。
本発明は、前述のようなヒトインターフェロンαのレ
セプターを発現することを特徴とする非ヒト細胞と、こ
れらの細胞の製造方法とにも関する。
セプターを発現することを特徴とする非ヒト細胞と、こ
れらの細胞の製造方法とにも関する。
この方法は、前記レセプターをコードするDNA配列を
含むDNAエレメントと宿主細胞中で前記配列を発現させ
得るエレメントとで、相容性宿主細胞のトランフェクシ
ョン又は感染を行うことからなる。
含むDNAエレメントと宿主細胞中で前記配列を発現させ
得るエレメントとで、相容性宿主細胞のトランフェクシ
ョン又は感染を行うことからなる。
後述の実施例は、ヒトインターフェロンα（IFN−α
ｈ）のレセプターをコードするこの配列がヒト以外の哺
乳動物、特にマウスの細胞中でどのようにして発現され
得たかを明らかにする。外来DNA配列の細胞発現を生起
させる方法は公知である。これらの方法としては、宿主
細胞に応じて、プラスミドのような自己複製ベクターを
使用するか、又はインテグレイティブベクター（vecteu
r integratif）、例えばDNA配列もしくはウイルスベク
ターを使用する方法が挙げられる。ヒトINFαレセプタ
ーを発現する細胞系を得たい場合には、１つの系を求め
るに過ぎないため、使用する方法が効率の低いものであ
ってもよい。これに対し、タンパク質を単独で得たい場
合には、増幅を起こさせるベクター、特に複製起源を含
むプラスミドベクター又はマルチコピー組込みシステム
を使用するのが好ましい。
ｈ）のレセプターをコードするこの配列がヒト以外の哺
乳動物、特にマウスの細胞中でどのようにして発現され
得たかを明らかにする。外来DNA配列の細胞発現を生起
させる方法は公知である。これらの方法としては、宿主
細胞に応じて、プラスミドのような自己複製ベクターを
使用するか、又はインテグレイティブベクター（vecteu
r integratif）、例えばDNA配列もしくはウイルスベク
ターを使用する方法が挙げられる。ヒトINFαレセプタ
ーを発現する細胞系を得たい場合には、１つの系を求め
るに過ぎないため、使用する方法が効率の低いものであ
ってもよい。これに対し、タンパク質を単独で得たい場
合には、増幅を起こさせるベクター、特に複製起源を含
むプラスミドベクター又はマルチコピー組込みシステム
を使用するのが好ましい。
本発明は、ヒトINFαレセプターの製造方法にも関す
る。
る。
例えば、このタンパク質を単独で得たい場合には、宿
主細胞中での当該DNA配列の転写のプロモーターの制御
下で前記レセプターをコードするDNA配列と前記タンパ
ク質を翻訳せしめるエレメントとを含む前記タンパク質
の発現ベクターで形質転換、トランフェクション又は感
染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し、次いで
得られたタンパク質を任意の適当な手段で分離し得る。
主細胞中での当該DNA配列の転写のプロモーターの制御
下で前記レセプターをコードするDNA配列と前記タンパ
ク質を翻訳せしめるエレメントとを含む前記タンパク質
の発現ベクターで形質転換、トランフェクション又は感
染させた宿主細胞を適当な培養培地中で培養し、次いで
得られたタンパク質を任意の適当な手段で分離し得る。
このタンパク質は、抗体、特に前記レセプターに対す
るモノクローナル抗体の製造に使用し得る。対応する技
術は公知であるためここでは詳述しない。
るモノクローナル抗体の製造に使用し得る。対応する技
術は公知であるためここでは詳述しない。
本発明では従って、 − ヒトインターフェロンαのレセプター、 − 前記レセプターに対する抗体、及び − 前記レセプターを発現する細胞 を得ることができる。
これらのエレメントの用途は極めて多様である。ま
ず、単独のレセプター又は細胞表面に発現されたレセプ
ターは、より良いアゴニストを決定するためにヒトイン
ターフェロンαの類似体の試験に使用できる。
ず、単独のレセプター又は細胞表面に発現されたレセプ
ターは、より良いアゴニストを決定するためにヒトイン
ターフェロンαの類似体の試験に使用できる。
この種の試験は、プレート、ビーズ等のような固体支
持体に固定した対応するタンパク質を用いて行うことも
できる。これは、別のレセプター又は抗原−抗体定量に
関して既に知られている方法である。
持体に固定した対応するタンパク質を用いて行うことも
できる。これは、別のレセプター又は抗原−抗体定量に
関して既に知られている方法である。
レセプターアゴニスト定量は、直接的固定の測定又は
例えばヒトINFαのような基準化合物に対するアゴニス
トの親和性を評価するための置換（ｄplacement）の
測定によって実施し得る。
例えばヒトINFαのような基準化合物に対するアゴニス
トの親和性を評価するための置換（ｄplacement）の
測定によって実施し得る。
抗体は、レセプターの定量、又はイメージ形成（imag
erie）の場合のレセプターの可視化に使用し得る。これ
は、例えばインターフェロンαでの治療が妥当である特
定の病理状態の評価、又はこれらレセプターの割合の変
化が見られる特定状態の評価を行うための方法である。
erie）の場合のレセプターの可視化に使用し得る。これ
は、例えばインターフェロンαでの治療が妥当である特
定の病理状態の評価、又はこれらレセプターの割合の変
化が見られる特定状態の評価を行うための方法である。
そこで本発明は、１つ又は複数の前述のエレメントを
診断用の物質又はイメージを得るための物質として含む
か、又はヒトインターフェロンαに由来する生成物を試
験するための薬理学的モデルとして含む診断キットも提
供する。
診断用の物質又はイメージを得るための物質として含む
か、又はヒトインターフェロンαに由来する生成物を試
験するための薬理学的モデルとして含む診断キットも提
供する。
レセプターのタンパク質又は対応する抗体は、ヒトIF
Nαレセプターをブロックしたい場合、又はヒトインタ
ーフェロンαの過剰発現（hyperexpression）が有害で
あり得る特定の状態でヒトINFαをブロックするための
ルアー（leurre）として前記タンパク質を使用する場合
に、薬理学的物質として使用し得る。
Nαレセプターをブロックしたい場合、又はヒトインタ
ーフェロンαの過剰発現（hyperexpression）が有害で
あり得る特定の状態でヒトINFαをブロックするための
ルアー（leurre）として前記タンパク質を使用する場合
に、薬理学的物質として使用し得る。
また、抗体は、該抗体に結合した主成分をヒトINFα
のレセプターの近傍に挿入するためのパイロット物質
（agentde pilotage）として使用し得る。
のレセプターの近傍に挿入するためのパイロット物質
（agentde pilotage）として使用し得る。
本発明の他の利点及び特徴を明らかにするために、以
下に図面を参照しながら非限定的実施例を挙げる。
下に図面を参照しながら非限定的実施例を挙げる。
第１図は、一次トランスフェクション細胞10BH7
（Ａ）又は親細胞BTG9A（Ｂ）に対するヒトインターフ
ェロンαＢ（黒い符号）又はハイブリッドBDBB（白い符
号）の結合を曲線で示している。
（Ａ）又は親細胞BTG9A（Ｂ）に対するヒトインターフ
ェロンαＢ（黒い符号）又はハイブリッドBDBB（白い符
号）の結合を曲線で示している。
第２図は、一次及び二次トランスフェクション細胞の
ゲノムDNAの「サザンブロット」分析を示している。第
２図ＡのウェルNo.1はAluプローブとハイブダイズした
一次クローン10BH7のDNAのEcoR I消化に係わり、ウェル
No.2はλプローブとハイブリダイズした同じDNAに係わ
る。第２図ＢのウェルNo.1及び３はAluプローブとハイ
ブリダイズした２つの二次トランスフェクション細胞IB
4D10及び2A415のDNAのBamH I消化に係わり、ウェルNo.2
及び４はAluプローブとハイブリダイズした２つの陰性
二次トランスフェクション細胞のDNAのBamH I消化に係
わり、ウェルNo.5はAluプローブとハイブリダイズした
親細胞BTG9AのDNAのBamH I消化に係わる。
ゲノムDNAの「サザンブロット」分析を示している。第
２図ＡのウェルNo.1はAluプローブとハイブダイズした
一次クローン10BH7のDNAのEcoR I消化に係わり、ウェル
No.2はλプローブとハイブリダイズした同じDNAに係わ
る。第２図ＢのウェルNo.1及び３はAluプローブとハイ
ブリダイズした２つの二次トランスフェクション細胞IB
4D10及び2A415のDNAのBamH I消化に係わり、ウェルNo.2
及び４はAluプローブとハイブリダイズした２つの陰性
二次トランスフェクション細胞のDNAのBamH I消化に係
わり、ウェルNo.5はAluプローブとハイブリダイズした
親細胞BTG9AのDNAのBamH I消化に係わる。
第３図は、5kbのEcoR Iプローブとハイブリダイズし
た２つの二次トランスフェクション細胞（ウェルNo.1及
び３）及び親細胞（ウェルNo.2）のRNA polyA＋の「ノ
ーザンブロット」分析を示している。
た２つの二次トランスフェクション細胞（ウェルNo.1及
び３）及び親細胞（ウェルNo.2）のRNA polyA＋の「ノ
ーザンブロット」分析を示している。
第４図は、ヒトインターフェロンαのレセプターのcD
NAのヌクレオチド配列とアミノ酸配列とを示している。
シグナルペプチド及びトランスメンブラン領域は枠で囲
んで示した。窒素に結合したグリコシル化部位には点線
で下線を付した。２つのポリアデニル化部位及びSma I
制限部位は下線を付けて示した。
NAのヌクレオチド配列とアミノ酸配列とを示している。
シグナルペプチド及びトランスメンブラン領域は枠で囲
んで示した。窒素に結合したグリコシル化部位には点線
で下線を付した。２つのポリアデニル化部位及びSma I
制限部位は下線を付けて示した。
実施例1: ヒトインターフェロンαＢに対して感受性を示すトラン
スフェクションしたマウス細胞BTGの選択 マウス細胞BTG 9Aを、ネオバクテリア遺伝子と高分
子量のDaudiゲノムDNAとをも1:1の比で含む哺乳動物の
発現ベクターλファージ中でクローン化したヒトcDNAバ
ンクと一緒に同時トランスフェクションする。ヒトイン
ターフェロンレセプターの発現がヒトゲノムDNA及び／
又はヒトcDNAに由来し得るこの同時トランスフェクショ
ンシステムは、所期のトランスフェクション細胞の単離
の機会を増加させるのに使用する。
スフェクションしたマウス細胞BTGの選択 マウス細胞BTG 9Aを、ネオバクテリア遺伝子と高分
子量のDaudiゲノムDNAとをも1:1の比で含む哺乳動物の
発現ベクターλファージ中でクローン化したヒトcDNAバ
ンクと一緒に同時トランスフェクションする。ヒトイン
ターフェロンレセプターの発現がヒトゲノムDNA及び／
又はヒトcDNAに由来し得るこの同時トランスフェクショ
ンシステムは、所期のトランスフェクション細胞の単離
の機会を増加させるのに使用する。
安定なトランスフェクション細胞のクローンを培地G4
18中で頻度10-2〜10-3で選択する。ヒトインターフェロ
ンαに対して感受性を示す細胞クローンを検出するため
に、トランスフェクションしたクローンを30,000単位/m
lのヒトインターフェロンαＢで処理し、VSVに感染させ
る。この濃度では、マウス細胞BTGはインターフェロン
αＢに対して感受性を示さないが、ヒトインターフェロ
ンαレセプター遺伝子を発現するトランスフェクション
細胞クローンは抗ウイルス段階にあるはずである。
18中で頻度10-2〜10-3で選択する。ヒトインターフェロ
ンαに対して感受性を示す細胞クローンを検出するため
に、トランスフェクションしたクローンを30,000単位/m
lのヒトインターフェロンαＢで処理し、VSVに感染させ
る。この濃度では、マウス細胞BTGはインターフェロン
αＢに対して感受性を示さないが、ヒトインターフェロ
ンαレセプター遺伝子を発現するトランスフェクション
細胞クローンは抗ウイルス段階にあるはずである。
インターフェロンの力価が感染の多重度に逆比例する
という事実に鑑みて、このウイルス選択は、所期の細胞
のクローンの抗ウイルス状態を消滅させる不適当な細胞
のクローンの大部分によって産生したVSVを大量に中和
することができる。この方法は、ウイルスを細胞上に迅
速に吸着させ、次いで過剰量のウイルスを中和すべきウ
サギ抗VSV抗血清で処理し、半固体ゲロース培地を含む
ウサギ抗VSV抗血清中で細胞変性効果を発生させる操作
を含む。生き残った細胞クローンは個々に単離する。慢
性的VSV感染を防止するために、細胞クローンはマウス
インターフェロンα／βで処理し、抗VSV抗血清は培地
Ｇ−418中に１週間維持する。次いで、VSV又はEMC感染
に関して、ヒトインターフェロンαＢに対する感受性を
再検査する。トランスフェクションしたこれらの細胞の
大部分はヒトインターフェロンαＢに対して感受性を示
さない。しかしながら、あるクローンはヒトインターフ
ェロンαＢに対して所期の感受性を示す。これはサブク
ローンであり、10B H7と称する。
という事実に鑑みて、このウイルス選択は、所期の細胞
のクローンの抗ウイルス状態を消滅させる不適当な細胞
のクローンの大部分によって産生したVSVを大量に中和
することができる。この方法は、ウイルスを細胞上に迅
速に吸着させ、次いで過剰量のウイルスを中和すべきウ
サギ抗VSV抗血清で処理し、半固体ゲロース培地を含む
ウサギ抗VSV抗血清中で細胞変性効果を発生させる操作
を含む。生き残った細胞クローンは個々に単離する。慢
性的VSV感染を防止するために、細胞クローンはマウス
インターフェロンα／βで処理し、抗VSV抗血清は培地
Ｇ−418中に１週間維持する。次いで、VSV又はEMC感染
に関して、ヒトインターフェロンαＢに対する感受性を
再検査する。トランスフェクションしたこれらの細胞の
大部分はヒトインターフェロンαＢに対して感受性を示
さない。しかしながら、あるクローンはヒトインターフ
ェロンαＢに対して所期の感受性を示す。これはサブク
ローンであり、10B H7と称する。
種々のヒト及びマウスインターフェロンαに対する細
胞10B H7の感受性を測定し、次いでこれらの細胞の挙
動をマウス親細胞BTGと比較する。
胞10B H7の感受性を測定し、次いでこれらの細胞の挙
動をマウス親細胞BTGと比較する。
表１は、ウイルスとしてVSV又はEMCを用いて、マウス
親細胞BTG上、トランスフェクションしたクローン10B
H7上及びヒト細胞Wish上で検査したマウスインターフェ
ロンα／β、ヒトインターフェロンαＢ、ヒトインター
フェロンβ及びヒトインターフェロンγの活性を示して
いる。
親細胞BTG上、トランスフェクションしたクローン10B
H7上及びヒト細胞Wish上で検査したマウスインターフェ
ロンα／β、ヒトインターフェロンαＢ、ヒトインター
フェロンβ及びヒトインターフェロンγの活性を示して
いる。
マウスインターフェロンに関しては、細胞10B H7が
親細胞BTGと同程度の感受性を示す。その一方で、細胞1
0B H7はヒトインターフェロンαＢに対しては親細胞の
64,000倍以上の感受性を示す。ヒトインターフェロンβ
の活性も細胞10B H7上では８倍に増加するが、別のレ
セプターによって認識されるヒトインターフェロンγの
抗ウイルス活性は親細胞BTG上でもトランスフェクショ
ンしたクローン10B H7上でも全く観察されない。細胞1
0B H7上のインターフェロンαＢの抗ウイルス比活性
（4.7x106単位/mg）はヒト細胞上のヒトインターフェロ
ンαの比活性とほぼ同じである。
親細胞BTGと同程度の感受性を示す。その一方で、細胞1
0B H7はヒトインターフェロンαＢに対しては親細胞の
64,000倍以上の感受性を示す。ヒトインターフェロンβ
の活性も細胞10B H7上では８倍に増加するが、別のレ
セプターによって認識されるヒトインターフェロンγの
抗ウイルス活性は親細胞BTG上でもトランスフェクショ
ンしたクローン10B H7上でも全く観察されない。細胞1
0B H7上のインターフェロンαＢの抗ウイルス比活性
（4.7x106単位/mg）はヒト細胞上のヒトインターフェロ
ンαの比活性とほぼ同じである。
実施例2: ヒトインターフェロンレセプターを発現する、インター
フェロンに対して感受性のあるマウス細胞BTGのトラン
スフェクション細胞 ヒトインターフェロンαＢは細胞10B H7上では、ヒ
ト細胞上のインターフェロンαＤと同様の挙動、類似の
比活性及び類似の見掛け結合親和性を示す。細胞10B H
7へのヒトインターフェロンαＢの結合は、ヒト細胞上
のインターフェロンαＤと同様に、37℃で測定できる。
フェロンに対して感受性のあるマウス細胞BTGのトラン
スフェクション細胞 ヒトインターフェロンαＢは細胞10B H7上では、ヒ
ト細胞上のインターフェロンαＤと同様の挙動、類似の
比活性及び類似の見掛け結合親和性を示す。細胞10B H
7へのヒトインターフェロンαＢの結合は、ヒト細胞上
のインターフェロンαＤと同様に、37℃で測定できる。
ヒトレセプターのプローブとして使用するヨード化イ
ンターフェロンαＢ並びに陽性対照としてマウス親細胞
系上でもクローン10B H7上でも活性を示すヨード化ハ
イブリッドインターフェロンBDBBとの結合に関する複数
の実験を行う。マウス細胞上で、細胞10B H7上のヒト
インターフェロンαＢと類似の比活性を示す前記ハイブ
リッドインターフェロンは、親細胞BTG上でもトランス
フェクションした細胞10B H7上でもヒト及びマウスの
レセプターのプローブとなり得る。
ンターフェロンαＢ並びに陽性対照としてマウス親細胞
系上でもクローン10B H7上でも活性を示すヨード化ハ
イブリッドインターフェロンBDBBとの結合に関する複数
の実験を行う。マウス細胞上で、細胞10B H7上のヒト
インターフェロンαＢと類似の比活性を示す前記ハイブ
リッドインターフェロンは、親細胞BTG上でもトランス
フェクションした細胞10B H7上でもヒト及びマウスの
レセプターのプローブとなり得る。
第１図が示すように、BDBBの細胞BTGへの結合及び細
胞10B H7への結合は互いに類似している。これに対
し、細胞10B H7はインターフェロンαＢに特異的に結
合するが細胞BTGは結合しない。Scatchardのデータに従
って計算した結合パラメータによれば、細胞10B H7は
インターフェロンαＢに関しては細胞当たり約500の結
合部位を示し、2x10-10Mの見掛けKdを有する。これは、
マウス親細胞上でもクローン10B H7上でも活性を示す
インターフェロンBDBBに近い値である（BDBBは細胞当た
りの結合部位が1,500、見掛けKDが5.10-10M）。
胞10B H7への結合は互いに類似している。これに対
し、細胞10B H7はインターフェロンαＢに特異的に結
合するが細胞BTGは結合しない。Scatchardのデータに従
って計算した結合パラメータによれば、細胞10B H7は
インターフェロンαＢに関しては細胞当たり約500の結
合部位を示し、2x10-10Mの見掛けKdを有する。これは、
マウス親細胞上でもクローン10B H7上でも活性を示す
インターフェロンBDBBに近い値である（BDBBは細胞当た
りの結合部位が1,500、見掛けKDが5.10-10M）。
これらの結果を別の研究で補完すると、ヒトインター
フェロンαＢは細胞10B H7上の特異的レセプターとは
結合するがマウス親細胞上では結合しないという結論が
得られる。
フェロンαＢは細胞10B H7上の特異的レセプターとは
結合するがマウス親細胞上では結合しないという結論が
得られる。
実施例3: ヒトインターフェロンαレセプターの遺伝子をカバーす
るプローブを、二次トランスフェクションした細胞のク
ローン中でクローン化する操作。
るプローブを、二次トランスフェクションした細胞のク
ローン中でクローン化する操作。
細胞10B H7が、マウス細胞上で結合部位及びインタ
ーフェロンαＢの抗ウイルス活性を付与するのに必要な
トランスフェクションしたヒト遺伝子を発現するという
仮説に基づいて、トランスフェクションしたゲノム10B
H7中のヒトDNAの分布を調べた。
ーフェロンαＢの抗ウイルス活性を付与するのに必要な
トランスフェクションしたヒト遺伝子を発現するという
仮説に基づいて、トランスフェクションしたゲノム10B
H7中のヒトDNAの分布を調べた。
第２図Ａは、ヒトゲノムDNAを検出するヒトAlu配列を
使用するか又は組込まれたcDNAを検出するためのλDNA
プローブを使用したクローン10B H7のDNAでの「サザン
ブロット」である。
使用するか又は組込まれたcDNAを検出するためのλDNA
プローブを使用したクローン10B H7のDNAでの「サザン
ブロット」である。
これによって、トランスフェクション細胞が、1000以
上のヒトDaudiDNAと100コピー分の哺乳動物発現バンク
ヒトcDNAコピーとを組込んだことを明らかにした。この
クローンはヒトDNAの量が多いため、初期クローン10B
H7中でのレセプターの発現に関係のあるDNA配列をクロ
ーン化すべく、二次トランスフェクション細胞を単離す
る必要があった。そのために、マウス細胞BTGをクロー
ン10B H7及びneopSV2のゲノムDNAと一緒に同時トラン
スフェクションした。ヒトインターフェロンに対して感
受性を示す細胞を単離した。安定な二次トランスフェク
ション細胞を４サイクル分のインターフェロンαＢ処理
とVSV感染とにかける。サブクローニングの後で、２つ
の独立した二次クローン1B4D10及び2A415が得られた。
これら２つの二次クローンは独立してはいるが、同一の
初期クローンに由来する。これらの二次クローンは初期
クローン10B H7と同じ特性を有する。即ち、ヒトイン
ターフェロンαと表面の発現レセプターとに対して感受
性を示す。これら２つの二次クローンは、λファージに
結合した配列をゲノム中に保持せず、従ってヒトインタ
ーフェロンαのレセプターの発現は、最初に細胞BTG中
でトランスフェクションされたDaudi細胞のゲノムDNAに
よって起こる。実際、これらの細胞はヒトゲノム配列を
保持した。第２図Ｂは、反復配列ALUを検出するプロー
ブALUとハイブリダイズした二次DNAクローンのBamH I消
化を示している。２つの陽性二次クローン1B4D10及び2A
415は18kbの主バンドを共有している。
上のヒトDaudiDNAと100コピー分の哺乳動物発現バンク
ヒトcDNAコピーとを組込んだことを明らかにした。この
クローンはヒトDNAの量が多いため、初期クローン10B
H7中でのレセプターの発現に関係のあるDNA配列をクロ
ーン化すべく、二次トランスフェクション細胞を単離す
る必要があった。そのために、マウス細胞BTGをクロー
ン10B H7及びneopSV2のゲノムDNAと一緒に同時トラン
スフェクションした。ヒトインターフェロンに対して感
受性を示す細胞を単離した。安定な二次トランスフェク
ション細胞を４サイクル分のインターフェロンαＢ処理
とVSV感染とにかける。サブクローニングの後で、２つ
の独立した二次クローン1B4D10及び2A415が得られた。
これら２つの二次クローンは独立してはいるが、同一の
初期クローンに由来する。これらの二次クローンは初期
クローン10B H7と同じ特性を有する。即ち、ヒトイン
ターフェロンαと表面の発現レセプターとに対して感受
性を示す。これら２つの二次クローンは、λファージに
結合した配列をゲノム中に保持せず、従ってヒトインタ
ーフェロンαのレセプターの発現は、最初に細胞BTG中
でトランスフェクションされたDaudi細胞のゲノムDNAに
よって起こる。実際、これらの細胞はヒトゲノム配列を
保持した。第２図Ｂは、反復配列ALUを検出するプロー
ブALUとハイブリダイズした二次DNAクローンのBamH I消
化を示している。２つの陽性二次クローン1B4D10及び2A
415は18kbの主バンドを共有している。
λファージEMBL3中でクローン化した二次クローン1B4
D10のDNAの完全なBamH I消化のフラクション化サイズ
（20〜15kb）のゲノムバンクをふるいにかける（crible
r）ためにプローブALUを使用した。18kbのBamH Iフラグ
メントを含む反復配列ALUを単離し、次いでプラスミド
ベクターpUC中でサブクローン化した。
D10のDNAの完全なBamH I消化のフラクション化サイズ
（20〜15kb）のゲノムバンクをふるいにかける（crible
r）ためにプローブALUを使用した。18kbのBamH Iフラグ
メントを含む反復配列ALUを単離し、次いでプラスミド
ベクターpUC中でサブクローン化した。
このフラグメントは、11kb及び2kbの２つの末端フラ
グメントと5kbの中央フラグメントとを与える２つのEco
R I部位を含んでいる。これら３つのフラグメントには
ヒト反復配列ALUが存在し、従って中央の5kbフラグメン
トからマウスのDNA配列を除去しなければならない。中
央の5kbのEcoR Iフラグメントは、同一の初期クローン
から独立して得た２つの二次クローン1B4D10及び2A4 1
5のDNAのEcoR I消化中に存在する。
グメントと5kbの中央フラグメントとを与える２つのEco
R I部位を含んでいる。これら３つのフラグメントには
ヒト反復配列ALUが存在し、従って中央の5kbフラグメン
トからマウスのDNA配列を除去しなければならない。中
央の5kbのEcoR Iフラグメントは、同一の初期クローン
から独立して得た２つの二次クローン1B4D10及び2A4 1
5のDNAのEcoR I消化中に存在する。
実施例4: ヒトインターフェロンαレセプターのcDNAのクローニン
グ及びヌクレオチド配列 第３図は、プローブEcoR I 5kbが二次クローン中
で、親細胞BTGのRNApolyA＋を欠失した同じ大きさの転
写体を検出することを示している。
グ及びヌクレオチド配列 第３図は、プローブEcoR I 5kbが二次クローン中
で、親細胞BTGのRNApolyA＋を欠失した同じ大きさの転
写体を検出することを示している。
Zap II λファージベクター中で二次クローン1B4 D
10のRNAから形成したcDNAバンクをふるいにかけ、プロ
ーブEcoR I 5kbとハイブリダイズするcDNAを単離す
る。同じ3'末端を有する８つの独立したcDNAクローンを
配列決定によって分析する。最長クローン（1,900bp）
は、コーディング配列のみをカバーする400bpのHind II
I制限フラグメントを5'末端に有し、反復エレメントを
欠失している。プローブとして使用されるこのフラグメ
ントは、二次クローン中にもDaudiヒト細胞中にも存在
するがマウス細胞BTG中には存在しない転写体2.5kbpを
検出する。トランスフェクションした遺伝子中の突然変
異点が出現し得ることから、この400bpのプローブHind
IIIを用いて、ヒト転写体に対応する完全cDNAクローン
を単離するためにDaudiヒト細胞からのZap II λcDNA
バンクを調べた。
10のRNAから形成したcDNAバンクをふるいにかけ、プロ
ーブEcoR I 5kbとハイブリダイズするcDNAを単離す
る。同じ3'末端を有する８つの独立したcDNAクローンを
配列決定によって分析する。最長クローン（1,900bp）
は、コーディング配列のみをカバーする400bpのHind II
I制限フラグメントを5'末端に有し、反復エレメントを
欠失している。プローブとして使用されるこのフラグメ
ントは、二次クローン中にもDaudiヒト細胞中にも存在
するがマウス細胞BTG中には存在しない転写体2.5kbpを
検出する。トランスフェクションした遺伝子中の突然変
異点が出現し得ることから、この400bpのプローブHind
IIIを用いて、ヒト転写体に対応する完全cDNAクローン
を単離するためにDaudiヒト細胞からのZap II λcDNA
バンクを調べた。
ヒトDaudicDNAバンクから単離した。cDNAの重なり合
いは、補助ファージf1によるλZap IIからのin vivo切
除に由来するプラスミド“pBluescript"中に保持されて
いた。プラスミド“pBluescript"を含む細菌から中間フ
ァージM13の存在下で回収した一重鎖DNAは、鎖終結法
（Ｍthode de terminaison de chane,Sangerら,197
7）によりcDNAの一端で配列決定され、このcDNAの他端
の配列はプラスミド上の二重鎖配列から得られる。オリ
ゴヌクレオチドを合成し、特に配列中に「ギャップ」が
生じた時のDNAの配列決定に使用した。
いは、補助ファージf1によるλZap IIからのin vivo切
除に由来するプラスミド“pBluescript"中に保持されて
いた。プラスミド“pBluescript"を含む細菌から中間フ
ァージM13の存在下で回収した一重鎖DNAは、鎖終結法
（Ｍthode de terminaison de chane,Sangerら,197
7）によりcDNAの一端で配列決定され、このcDNAの他端
の配列はプラスミド上の二重鎖配列から得られる。オリ
ゴヌクレオチドを合成し、特に配列中に「ギャップ」が
生じた時のDNAの配列決定に使用した。
第４図に示した２つの最長cDNAの２つの鎖は完全に配
列決定された。
列決定された。
このcDNA配列は約2784bpであり、２つのポリアデニル
化配列ATTAAAを含む1035p3'の非翻訳領域を含んでい
る。読取り枠の配列は、5'がコドンSTOPで終わっている
ため完全なものである。位置79及び82には２つのコドン
ATGが並んで存在している。
化配列ATTAAAを含む1035p3'の非翻訳領域を含んでい
る。読取り枠の配列は、5'がコドンSTOPで終わっている
ため完全なものである。位置79及び82には２つのコドン
ATGが並んで存在している。
末端アミノ基の疎水性領域の他に、第２の疎水性領域
が同定された（アミノ酸456〜476）。潜在的窒素結合グ
リコシル化部位が15個存在し、そのうち12個は推定上の
細胞外領域に、３つは推定上の細胞内領域にある。
が同定された（アミノ酸456〜476）。潜在的窒素結合グ
リコシル化部位が15個存在し、そのうち12個は推定上の
細胞外領域に、３つは推定上の細胞内領域にある。
レセプターとして提案する配列（シグナルペプチドを
含む）の分子量は63,485ダルトンであり、グリコシル化
は天然レセプターのタンパク質の約95,000〜100,000ダ
ルトンを説明し得る。
含む）の分子量は63,485ダルトンであり、グリコシル化
は天然レセプターのタンパク質の約95,000〜100,000ダ
ルトンを説明し得る。
ヒトインターフェロンαのレセプターは非反復タンパ
ク質であると思われる。しかしながらその配列は特定の
対立変形を有する。このような変形配列は例えば、レセ
プターの２つの対立遺伝子を発現するヘテロ接合子をも
つDaudi細胞中に検出される。前記２つの対立遺伝子の
うち一方は第４図に示した配列に合致し、もう１つは位
置569でシトシンがグアニンに置換されており且つ位置1
514のアデニンの後に３つの塩基Ｔ、Ｇ及びＡが挿入さ
れている。そのためタンパク質レベルでは、トレオニン
164がアルギニンに置換されており且つアスパラギン酸4
79の後にアスパラギン酸が挿入されている。
ク質であると思われる。しかしながらその配列は特定の
対立変形を有する。このような変形配列は例えば、レセ
プターの２つの対立遺伝子を発現するヘテロ接合子をも
つDaudi細胞中に検出される。前記２つの対立遺伝子の
うち一方は第４図に示した配列に合致し、もう１つは位
置569でシトシンがグアニンに置換されており且つ位置1
514のアデニンの後に３つの塩基Ｔ、Ｇ及びＡが挿入さ
れている。そのためタンパク質レベルでは、トレオニン
164がアルギニンに置換されており且つアスパラギン酸4
79の後にアスパラギン酸が挿入されている。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ 33/50 15/00 Ａ (72)発明者 リユトウフアラ，ジヨルジユ フランス国、75007・パリ、リユ・ド ウ・ソルフエリノ・５―ビス (72)発明者 グレセール，イオン フランス国、75007・パリ、リユ・ムツ シユー・11 (56)参考文献 ＩＳＣＵ ｓｈｏｒｔ ｒｅｐｏｒ ｔ，Ｖｏｌ．４，Ｐ．362−365（1986) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．81，Ｐ．5504− 5508（1984) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/715 C07K 16/28 C12N 5/10 C12N 15/09 C12P 21/02 G01N 33/15 G01N 33/50 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (16)
- 【請求項１】第４図の配列に対応するか、又はこの配列
との相異が３つ以下のアミノ酸にしか見られない前記配
列の対立変形配列の１つに対応することを特徴とするヒ
トインターフェロンαのレセプター。 - 【請求項２】シグナルペプチドをも含んでいることを特
徴とする請求項１に記載のヒトインターフェロンαのレ
セプター。 - 【請求項３】シグナルペプチドが第４図のシグナルペプ
チドに対応することを特徴とする請求項２に記載のヒト
インターフェロンαのレセプター。 - 【請求項４】第４図の配列に対応することを特徴とする
請求項１から３のいずれか一項に記載のヒトインターフ
ェロンαのレセプター。 - 【請求項５】位置164のトレオニンがアルギニンで置換
されており且つ位置479のアスパラギン酸と位置480のグ
ルタミン酸との間にアスパラギン酸が挿入されている第
４図の配列に対応することを特徴とする請求項１から３
のいずれか一項に記載のヒトインターフェロンαのレセ
プター。 - 【請求項６】請求項１から５のいずれか一項に記載のレ
セプターをコードすることを特徴とするDNA配列。 - 【請求項７】第４図のDNA配列であることを特徴とする
請求項６に記載のDNA配列。 - 【請求項８】位置569のシトシンがグアニンで置換され
ており且つ位置1514のアデニンと位置1515のチミンとの
間にコドンTGAが挿入されている第４図のDNA配列である
ことを特徴とする請求項６に記載のDNA配列。 - 【請求項９】請求項１から５のいずれか一項に記載のレ
セプターを発現することを特徴とする非ヒト細胞。 - 【請求項１０】哺乳動物の細胞であることを特徴とする
請求項９に記載の細胞。 - 【請求項１１】マウスの細胞であることを特徴とする請
求項10に記載の細胞。 - 【請求項１２】請求項６から８のいずれか一項に記載の
DNA配列を含むDNAエレメントと宿主細胞中で前記配列を
発現させ得るエレメントとで、相容性宿主細胞の形質転
換、トランスフェクション又は感染を行うことを特徴と
する、請求項１から５のいずれか一項に記載のレセプタ
ーを発現する細胞の製造方法。 - 【請求項１３】ヒトIFNαのレセプターの製造方法であ
って、宿主細胞中で請求項６から８のいずれか一項に記
載のDNA配列の転写のプロモーターの制御下で前記DNA配
列を含む前記タンパク質を発現するベクターと前記タン
パク質を翻訳するエレメントとによって形質転換、トラ
ンスフェクション又は感染させた宿主細胞を適当な培養
培地で培養し、培養後に前記タンパク質を分離すること
を特徴とする方法。 - 【請求項１４】請求項１から５のいずれか一項に記載の
レセプターに対する抗体。 - 【請求項１５】請求項14に記載の少なくとも１つの抗体
か又は請求項１から５のいずれか一項に記載のレセプタ
ーを含むことを特徴とする診断キット。 - 【請求項１６】請求項１から５のいずれか一項に記載の
レセプター又は請求項９から11のいずれか一項に記載の
細胞に対する化合物の親和性をヒトインターフェロンα
との比較において測定することによりヒトインターフェ
ロンαのアゴニストをスクリーニングする方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR89/13770 | 1989-10-20 | ||
| FR898913770A FR2653445B1 (fr) | 1989-10-20 | 1989-10-20 | Fragment d'adnc codant pour le gene du recepteur de l'interferon alpha et procede de preparation d'une proteine correspondante. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05504468A JPH05504468A (ja) | 1993-07-15 |
| JP3283509B2 true JP3283509B2 (ja) | 2002-05-20 |
Family
ID=9386616
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP51516890A Expired - Lifetime JP3283509B2 (ja) | 1989-10-20 | 1990-10-19 | インターフェロンαのレセプターの遺伝子をコードするｃＤＮＡフラグメント及び対応するタンパク質の製造方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0495907B1 (ja) |
| JP (1) | JP3283509B2 (ja) |
| AT (1) | ATE169057T1 (ja) |
| DE (1) | DE69032526T2 (ja) |
| DK (1) | DK0495907T3 (ja) |
| ES (1) | ES2121754T3 (ja) |
| FR (1) | FR2653445B1 (ja) |
| WO (1) | WO1991005862A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| EP0563487A1 (en) | 1992-03-31 | 1993-10-06 | Laboratoire Europeen De Biotechnologie S.A. | Monoclonal antibodies against the interferon receptor, with neutralizing activity against type I interferon |
| US5821078A (en) | 1992-09-03 | 1998-10-13 | Yeda Research And Development Co. Ltd. | Nucleic acid encoding interferon-α/β binding protein |
| IL108584A (en) * | 1994-02-07 | 2008-03-20 | Yeda Res & Dev | Cloning of the interferon-binding protein ALPHA / BETA |
| EP0725654A1 (en) * | 1993-09-17 | 1996-08-14 | Laboratoire Europeen De Biotechnologie S.A. | Pharmaceutical composition comprising monoclonal antibodies against the interferon receptor, with neutralizing activity against type i interferon |
| AU2004232362C1 (en) | 2003-04-23 | 2008-05-29 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Compositions and methods for the therapy of inflammatory bowel disease |
| PL2662390T3 (pl) | 2004-06-21 | 2017-12-29 | E. R. Squibb & Sons, L.L.C. | Antyciała receptora interferonu alfa I oraz ich zastosowania |
| WO2019040674A1 (en) | 2017-08-22 | 2019-02-28 | Sanabio, Llc | SOLUBLE INTERFERON RECEPTORS AND USES THEREOF |
-
1989
- 1989-10-20 FR FR898913770A patent/FR2653445B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-10-19 DE DE69032526T patent/DE69032526T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-19 AT AT90916311T patent/ATE169057T1/de not_active IP Right Cessation
- 1990-10-19 JP JP51516890A patent/JP3283509B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-19 ES ES90916311T patent/ES2121754T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-19 EP EP90916311A patent/EP0495907B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1990-10-19 WO PCT/FR1990/000758 patent/WO1991005862A1/fr active IP Right Grant
- 1990-10-19 DK DK90916311T patent/DK0495907T3/da active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| ＩＳＣＵ ｓｈｏｒｔ ｒｅｐｏｒｔ，Ｖｏｌ．４，Ｐ．３６２−３６５（１９８６） |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．８１，Ｐ．５５０４−５５０８（１９８４） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE169057T1 (de) | 1998-08-15 |
| EP0495907A1 (fr) | 1992-07-29 |
| DE69032526T2 (de) | 1999-03-04 |
| JPH05504468A (ja) | 1993-07-15 |
| ES2121754T3 (es) | 1998-12-16 |
| DE69032526D1 (de) | 1998-09-03 |
| FR2653445A1 (fr) | 1991-04-26 |
| FR2653445B1 (fr) | 1994-07-29 |
| EP0495907B1 (fr) | 1998-07-29 |
| DK0495907T3 (da) | 1999-04-26 |
| WO1991005862A1 (fr) | 1991-05-02 |
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