JP3263051B2 - 改善されたクレアチニン検出方法 - Google Patents
改善されたクレアチニン検出方法Info
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Description
【０００１】
【従来の技術】本発明は、体液試料中のクレアチニンを
検出する方法に対する改良である。米国特許第５，３７
４，５６１号明細書には、クレアチニンを含有する疑い
のある尿試料を、第二銅イオン、ヒドロペルオキシド、
ならびに酸素フリーラジカル及びヒドロペルオキシドの
存在下で色応答を発する被酸化性染料と接触させる工程
を含む、尿中クレアチニンを検出する方法が開示されて
いる。この検定では、第一の工程は、Ｃｕ+ +・クレアチ
ニンキレート錯体の形成を含む。被酸化性染料は、そこ
からＣｕ+ +・クレアチニン錯体への電子の移動によって
酸化されて、非反応性Ｃｕ+・クレアチニン形態を提供
し、この形態が、ヒドロペルオキシドへの電子の損失に
よってＣｕ+ +・クレアチニンに再生される。この検定
は、ヘモグロビン及びアスコルベートの非存在下ではう
まく作用するが、臨床尿試料中に普通に存在するヘモグ
ロビン及び／又はアスコルベートの存在下では、ヘモグ
ロビン及び／又はアスコルベートが染料を酸化させ、そ
れによって偽陽性を生じさせる傾向により、検定精度が
影響を受ける。加えて、酸化還元染料は、銅イオンの存
在下では時間とともに自動酸化し、それにより、このタ
イプの検定の貯蔵寿命を減らすおそれがある。したがっ
て、試料中のヘモグロビン及び／又はアスコルベートが
偽陽性の結果を生じさせる傾向及び酸化還元染料の自動
酸化が軽減される、流体試料中のクレアチニンを検出す
るための改良された試薬系を提供することが望まれ、そ
れを提供することが本発明の目的である。
検出する方法に対する改良である。米国特許第５，３７
４，５６１号明細書には、クレアチニンを含有する疑い
のある尿試料を、第二銅イオン、ヒドロペルオキシド、
ならびに酸素フリーラジカル及びヒドロペルオキシドの
存在下で色応答を発する被酸化性染料と接触させる工程
を含む、尿中クレアチニンを検出する方法が開示されて
いる。この検定では、第一の工程は、Ｃｕ+ +・クレアチ
ニンキレート錯体の形成を含む。被酸化性染料は、そこ
からＣｕ+ +・クレアチニン錯体への電子の移動によって
酸化されて、非反応性Ｃｕ+・クレアチニン形態を提供
し、この形態が、ヒドロペルオキシドへの電子の損失に
よってＣｕ+ +・クレアチニンに再生される。この検定
は、ヘモグロビン及びアスコルベートの非存在下ではう
まく作用するが、臨床尿試料中に普通に存在するヘモグ
ロビン及び／又はアスコルベートの存在下では、ヘモグ
ロビン及び／又はアスコルベートが染料を酸化させ、そ
れによって偽陽性を生じさせる傾向により、検定精度が
影響を受ける。加えて、酸化還元染料は、銅イオンの存
在下では時間とともに自動酸化し、それにより、このタ
イプの検定の貯蔵寿命を減らすおそれがある。したがっ
て、試料中のヘモグロビン及び／又はアスコルベートが
偽陽性の結果を生じさせる傾向及び酸化還元染料の自動
酸化が軽減される、流体試料中のクレアチニンを検出す
るための改良された試薬系を提供することが望まれ、そ
れを提供することが本発明の目的である。
【０００２】
【課題を解決するための手段】本発明は、試料を、第二
銅イオン、ヒドロペルオキシド及び第二銅イオンとクレ
アチニンとが結合してペルオキシダーゼ活性を有する錯
体を形成すると酸化されて検出可能な色応答を発する被
酸化性染料と接触させる工程を含む、流体試料中のクレ
アチニンの検出又は測定方法に対する改良である。この
タイプの検定は二つの欠点を抱えている。まず、被酸化
性染料は、遷移状態金属の存在下で自動酸化を受けるこ
とがあり、それによって検定試薬の貯蔵寿命を短縮す
る。加えて、流体試料中のヘモグロビン及び／又はアス
コルベートの存在が、クレアチニンの非存在下で被酸化
性染料を酸化させるそれらの能力により、偽陽性の結果
を生じさせることがある。今、特定のキノリン化合物を
検定試薬に添加することによってこれらの問題を軽減し
うることがわかった。通常、２〜５位にメチル基及び／
又は２〜６位にメトキシ基を有するキノリン類が、自動
酸化の問題を軽減又は解消することがわかった。特定の
キノリン化合物、すなわち、少なくとも１個のニトロ、
アミン、ハロゲン又はヒドロキシル基を２〜８位に有
し、メチル又はメトキシ基を２〜６位に有するものが、
自動酸化の問題に対してプラスの効果を有し、また、ヘ
モグロビン及び／又はアスコルベートが染料を酸化させ
る傾向を実質的に軽減し、それにより、検定における偽
陽性の結果の発生を減らすことがわかった。
銅イオン、ヒドロペルオキシド及び第二銅イオンとクレ
アチニンとが結合してペルオキシダーゼ活性を有する錯
体を形成すると酸化されて検出可能な色応答を発する被
酸化性染料と接触させる工程を含む、流体試料中のクレ
アチニンの検出又は測定方法に対する改良である。この
タイプの検定は二つの欠点を抱えている。まず、被酸化
性染料は、遷移状態金属の存在下で自動酸化を受けるこ
とがあり、それによって検定試薬の貯蔵寿命を短縮す
る。加えて、流体試料中のヘモグロビン及び／又はアス
コルベートの存在が、クレアチニンの非存在下で被酸化
性染料を酸化させるそれらの能力により、偽陽性の結果
を生じさせることがある。今、特定のキノリン化合物を
検定試薬に添加することによってこれらの問題を軽減し
うることがわかった。通常、２〜５位にメチル基及び／
又は２〜６位にメトキシ基を有するキノリン類が、自動
酸化の問題を軽減又は解消することがわかった。特定の
キノリン化合物、すなわち、少なくとも１個のニトロ、
アミン、ハロゲン又はヒドロキシル基を２〜８位に有
し、メチル又はメトキシ基を２〜６位に有するものが、
自動酸化の問題に対してプラスの効果を有し、また、ヘ
モグロビン及び／又はアスコルベートが染料を酸化させ
る傾向を実質的に軽減し、それにより、検定における偽
陽性の結果の発生を減らすことがわかった。
【０００３】
【発明の実施の形態】流体試料中のクレアチニンの比色
測定のための新規な方法が米国特許第５，３７４，５６
１号明細書に開示されている。この方法は、クレアチニ
ン／第二銅イオン金属錯体のペルオキシダーゼ活性を利
用する。この検定では、クレアチニンによる第二銅イオ
ンのキレート化が、ヒドロペルオキシド、たとえばジイ
ソプロピルベンゼンジヒドロペルオキシドによる被酸化
性染料、たとえばテトラメチルベンジジンの酸化を触媒
し、それにより、色応答を発することができるペルオキ
シダーゼ様の活性を有する錯体を作り出す。より最近、
この検定の精度が、酸素供給源による酸化還元指示薬の
酸化を電子移動によって触媒する金属の存在下における
酸化性染料の自動酸化によって悪影響を受け、それによ
り、試薬の貯蔵寿命を減らすことがわかった。より関心
のある問題は、クレアチニンの非存在下で染料を酸化さ
せて偽陽性の結果を生じさせる、試験流体中のヘモグロ
ビン及び／又はアスコルベートの存在である。
測定のための新規な方法が米国特許第５，３７４，５６
１号明細書に開示されている。この方法は、クレアチニ
ン／第二銅イオン金属錯体のペルオキシダーゼ活性を利
用する。この検定では、クレアチニンによる第二銅イオ
ンのキレート化が、ヒドロペルオキシド、たとえばジイ
ソプロピルベンゼンジヒドロペルオキシドによる被酸化
性染料、たとえばテトラメチルベンジジンの酸化を触媒
し、それにより、色応答を発することができるペルオキ
シダーゼ様の活性を有する錯体を作り出す。より最近、
この検定の精度が、酸素供給源による酸化還元指示薬の
酸化を電子移動によって触媒する金属の存在下における
酸化性染料の自動酸化によって悪影響を受け、それによ
り、試薬の貯蔵寿命を減らすことがわかった。より関心
のある問題は、クレアチニンの非存在下で染料を酸化さ
せて偽陽性の結果を生じさせる、試験流体中のヘモグロ
ビン及び／又はアスコルベートの存在である。
【０００４】Traylorらは、Tetrahedron 40: 1984; 553
-68で、ペルオキシダーゼ活性を高める芳香族ピリジン
類の能力を論じている。この教示は、キノリンのような
芳香族アミン類がヘモグロビンの存在下で酸化還元染料
の酸化を生じさせることを示唆する。Rittersdorfへの
米国特許第３，８５３，４７２号明細書には、キノリン
類が、酸化還元染料の酸化の増大によって示されるよう
に、ペルオキシダーゼ活性を増大させることを示す、尿
中の血液を検出するための方法が開示されている。
-68で、ペルオキシダーゼ活性を高める芳香族ピリジン
類の能力を論じている。この教示は、キノリンのような
芳香族アミン類がヘモグロビンの存在下で酸化還元染料
の酸化を生じさせることを示唆する。Rittersdorfへの
米国特許第３，８５３，４７２号明細書には、キノリン
類が、酸化還元染料の酸化の増大によって示されるよう
に、ペルオキシダーゼ活性を増大させることを示す、尿
中の血液を検出するための方法が開示されている。
【０００５】今、特定のキノリン化合物が、ペルオキシ
ダーゼ活性を増すのではなく、酸化性染料の自動酸化に
伴う問題を軽減しうるということがわかった。この目的
に有用であるキノリン類は、２〜５位がメチルで置換さ
れている、及び／又は、２〜６位がメトキシで置換され
ていることを特徴とする。したがって、これらのキノリ
ン化合物の１種以上を１０〜３００mM、好ましくは５０
〜１５０mMの濃度で試薬配合に加えることにより、試薬
系の貯蔵寿命を延ばすことができる。
ダーゼ活性を増すのではなく、酸化性染料の自動酸化に
伴う問題を軽減しうるということがわかった。この目的
に有用であるキノリン類は、２〜５位がメチルで置換さ
れている、及び／又は、２〜６位がメトキシで置換され
ていることを特徴とする。したがって、これらのキノリ
ン化合物の１種以上を１０〜３００mM、好ましくは５０
〜１５０mMの濃度で試薬配合に加えることにより、試薬
系の貯蔵寿命を延ばすことができる。
【０００６】もう一つの、より限定されたクラスのキノ
リン類をＣｕ+ +・クレアチニン試薬系に添加して、被酸
化性染料に対するヘモグロビン及び／又はアスコルベー
トの悪影響を抑制することができる。自動酸化の影響を
減らす効果をも有するこれらのキノリン類は、キノリン
の２〜８位における少なくとも１個のニトロ、アミノ、
ハロゲン又はヒドロキシル基ならびに２〜５位における
メチル基又は２〜６位におけるメトキシ基を特徴とす
る。これらは通常、上述した量で検定配合物に添加され
る。
リン類をＣｕ+ +・クレアチニン試薬系に添加して、被酸
化性染料に対するヘモグロビン及び／又はアスコルベー
トの悪影響を抑制することができる。自動酸化の影響を
減らす効果をも有するこれらのキノリン類は、キノリン
の２〜８位における少なくとも１個のニトロ、アミノ、
ハロゲン又はヒドロキシル基ならびに２〜５位における
メチル基又は２〜６位におけるメトキシ基を特徴とす
る。これらは通常、上述した量で検定配合物に添加され
る。
【０００７】銅+ +検定では、第二銅イオンの供給源は、
そのアニオンがクレアチニンの比色検出の反応に有害に
作用しないならば、いかなる可溶性の銅塩であってもよ
い。適当な塩は、銅の硫酸塩、硝酸塩、酸化物、水酸化
物、リン酸塩、ヨウ化物、塩化物、臭化物、酢酸塩又は
シュウ酸塩を含む。ＣｕII・クレアチニン錯体の形成を
許すならば、他の可溶性の第二銅塩を使用することもで
きる。アニオンが銅に強く結合しすぎる塩は、銅II・ク
レアチニン錯体を形成させないであろう。したがって、
第二銅イオンと、ＥＤＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及び
ＤＴＰＡとの間で形成されるようなＣｕII錯体は、Ｃｕ
II・クレアチニン錯体の形成に十分なＣｕIIを放出しな
いであろう。クエン酸塩及び硫酸塩が最も低いブランク
反応性を有し、したがって、これらが好ましいことが認
められた。クエン酸第二銅が、最小のブランク反応性及
び最大のＣｕII・クレアチニン錯体の形成を示すため、
特に好ましい。クレアチニンの非存在下で染料を酸化さ
せる塩は、それほど望ましくない。第二銅２，２′−ビ
ピリジンのような塩は、クレアチニンの非存在下でＴＭ
Ｂの有意な酸化を生じさせるおそれがあり、したがっ
て、本発明に使用するのには不適当である。クエン酸銅
を第二銅イオン源として使用するとき、クエン酸イオン
の濃度は、少なくとも銅の濃度にあるべきである。クエ
ン酸イオンによるＣｕIIの完全な錯化を保証するために
は、銅イオンの少なくとも２倍のクエン酸イオンが好ま
しい。
そのアニオンがクレアチニンの比色検出の反応に有害に
作用しないならば、いかなる可溶性の銅塩であってもよ
い。適当な塩は、銅の硫酸塩、硝酸塩、酸化物、水酸化
物、リン酸塩、ヨウ化物、塩化物、臭化物、酢酸塩又は
シュウ酸塩を含む。ＣｕII・クレアチニン錯体の形成を
許すならば、他の可溶性の第二銅塩を使用することもで
きる。アニオンが銅に強く結合しすぎる塩は、銅II・ク
レアチニン錯体を形成させないであろう。したがって、
第二銅イオンと、ＥＤＴＡ、ＨＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ及び
ＤＴＰＡとの間で形成されるようなＣｕII錯体は、Ｃｕ
II・クレアチニン錯体の形成に十分なＣｕIIを放出しな
いであろう。クエン酸塩及び硫酸塩が最も低いブランク
反応性を有し、したがって、これらが好ましいことが認
められた。クエン酸第二銅が、最小のブランク反応性及
び最大のＣｕII・クレアチニン錯体の形成を示すため、
特に好ましい。クレアチニンの非存在下で染料を酸化さ
せる塩は、それほど望ましくない。第二銅２，２′−ビ
ピリジンのような塩は、クレアチニンの非存在下でＴＭ
Ｂの有意な酸化を生じさせるおそれがあり、したがっ
て、本発明に使用するのには不適当である。クエン酸銅
を第二銅イオン源として使用するとき、クエン酸イオン
の濃度は、少なくとも銅の濃度にあるべきである。クエ
ン酸イオンによるＣｕIIの完全な錯化を保証するために
は、銅イオンの少なくとも２倍のクエン酸イオンが好ま
しい。
【０００８】通常、尿が試験される水性流体であると
き、尿中クレアチニンの基準範囲が３〜２０mMであるた
め、第二銅イオンの濃度は５〜３０mMである。この範囲
は、他の流体、たとえば、好ましくは０．０５〜０．３
０mMの範囲の第二銅イオンの濃度を用いるであろう血清
では異なる。第一銅イオンは、クレアチニンの非存在下
における染料の酸化により、いくらかバックグラウンド
干渉を生じさせる傾向にある。したがって、Ｃｕ+塩は
使用することができない。
き、尿中クレアチニンの基準範囲が３〜２０mMであるた
め、第二銅イオンの濃度は５〜３０mMである。この範囲
は、他の流体、たとえば、好ましくは０．０５〜０．３
０mMの範囲の第二銅イオンの濃度を用いるであろう血清
では異なる。第一銅イオンは、クレアチニンの非存在下
における染料の酸化により、いくらかバックグラウンド
干渉を生じさせる傾向にある。したがって、Ｃｕ+塩は
使用することができない。
【０００９】適当な酸化性指示薬は、たとえば、ベンジ
ジン、ｏ−トリジン、３，３′，５，５′−テトラアル
キルベンジジン（アルキル基が炭素原子１〜約６個を含
む）、ｏ−ジアニシジン、２，７−ジアミノフルオレ
ン、ビス−（ｎ−エチルキノル−２−オン）−アジン、
（Ｎ−メチル−ベンズチアゾール−２−オン）−（１−
エチル−３−フェニル−５−メチルトリアゾール−２−
オン）−アジン又はそれらの組み合わせを含む。
ジン、ｏ−トリジン、３，３′，５，５′−テトラアル
キルベンジジン（アルキル基が炭素原子１〜約６個を含
む）、ｏ−ジアニシジン、２，７−ジアミノフルオレ
ン、ビス−（ｎ−エチルキノル−２−オン）−アジン、
（Ｎ−メチル−ベンズチアゾール−２−オン）−（１−
エチル−３−フェニル−５−メチルトリアゾール−２−
オン）−アジン又はそれらの組み合わせを含む。
【００１０】本発明に使用するのに適したヒドロペルオ
キシドは、クメンヒドロペルオキシド、５−ブチルヒド
ロペルオキシド、ジイソプロピルベンゼンヒドロペルオ
キシド、１−ヒドロキシシクロヘキサン−１−ヒドロペ
ルオキシド、２，５−ジメチルヘキサン−２，５−ジヒ
ドロペルオキシド、パラメンタンヒドロペルオキシド、
１，４−ジイソプロピルベンゼンモノヒドロペルオキシ
ド、ｐ−tert−ブチルイソプロピルベンゼンヒドロペル
オキシド、２−（α−ヒドロペルオキシイソプロピル）
−６−イソプロピルナフタレン、テトラリンヒドロペル
オキシド又はそれらの組み合わせを含む。
キシドは、クメンヒドロペルオキシド、５−ブチルヒド
ロペルオキシド、ジイソプロピルベンゼンヒドロペルオ
キシド、１−ヒドロキシシクロヘキサン−１−ヒドロペ
ルオキシド、２，５−ジメチルヘキサン−２，５−ジヒ
ドロペルオキシド、パラメンタンヒドロペルオキシド、
１，４−ジイソプロピルベンゼンモノヒドロペルオキシ
ド、ｐ−tert−ブチルイソプロピルベンゼンヒドロペル
オキシド、２−（α−ヒドロペルオキシイソプロピル）
−６−イソプロピルナフタレン、テトラリンヒドロペル
オキシド又はそれらの組み合わせを含む。
【００１１】通常、可溶性銅塩、ヒドロペルオキシド及
び酸化性指示薬を含む試薬系は、水に溶解させる。しか
し、検定機構に干渉しないならば、有機溶媒を系に組み
込むこともできる。ヒドロペルオキシド及び酸化性指示
薬の濃度は、通常１０〜１５０mMの範囲であり、６０〜
１００mMの範囲が好ましい。
び酸化性指示薬を含む試薬系は、水に溶解させる。しか
し、検定機構に干渉しないならば、有機溶媒を系に組み
込むこともできる。ヒドロペルオキシド及び酸化性指示
薬の濃度は、通常１０〜１５０mMの範囲であり、６０〜
１００mMの範囲が好ましい。
【００１２】本発明の実施において、検定は、湿式フォ
ーマット又は乾式フォーマット（試験片）のいずれかで
実施することができる。検定を実施する際には、試薬試
験片又は試薬の水溶液もしくはアセトニトリル溶液の使
用により、試料を、緩衝したpH、好ましくは４．０〜
９．０で銅塩、たとえばクエン酸第二銅、染料及びヒド
ロペルオキシドと混合する。試薬試験片は、吸収性支持
体を第二銅塩及び緩衝剤の水溶液に浸漬し、支持体を乾
燥させ、それを染料及びヒドロペルオキシドの有機溶液
に浸漬したのち乾燥させる従来の方法で調製される。
ーマット又は乾式フォーマット（試験片）のいずれかで
実施することができる。検定を実施する際には、試薬試
験片又は試薬の水溶液もしくはアセトニトリル溶液の使
用により、試料を、緩衝したpH、好ましくは４．０〜
９．０で銅塩、たとえばクエン酸第二銅、染料及びヒド
ロペルオキシドと混合する。試薬試験片は、吸収性支持
体を第二銅塩及び緩衝剤の水溶液に浸漬し、支持体を乾
燥させ、それを染料及びヒドロペルオキシドの有機溶液
に浸漬したのち乾燥させる従来の方法で調製される。
【００１３】
【実施例】以下の例によって本発明をさらに説明する。 例Ｉ ０．５cm（１／５インチ）×１．３cm（１／２インチ）
ポリスチレン取っ手に取り付けたWhatmanセルロースろ
紙グレード３MMパッドの試験片（０．５cm（１／５イン
チ）×０．５cm（１／５インチ））を第一の浸漬溶液に
浸漬し、１００℃で１０分間乾燥させたのち、第二の浸
漬溶液に浸漬し、乾燥させる二浸漬法により、この実験
に使用するためのクレアチニン試験を調製した。浸漬溶
液の配合は以下のとおりであった。
ポリスチレン取っ手に取り付けたWhatmanセルロースろ
紙グレード３MMパッドの試験片（０．５cm（１／５イン
チ）×０．５cm（１／５インチ））を第一の浸漬溶液に
浸漬し、１００℃で１０分間乾燥させたのち、第二の浸
漬溶液に浸漬し、乾燥させる二浸漬法により、この実験
に使用するためのクレアチニン試験を調製した。浸漬溶
液の配合は以下のとおりであった。
【００１４】 第一回浸漬 成分 濃度 ＣｕＳＯ4 ３０mM クエン酸塩 ５０mM 緩衝剤：グリセロール−２−ホスフェート ７５０mM 界面活性剤：Aerosol IB-45 １．５％ pH ６．８０ 水
【００１５】 第二回浸漬 成分 濃度 ３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ） ３３mM ジイソプロピルベンゼンジヒドロペルオキシド（ＤＢＤＨ） ８０mM ポリマー：Plasdone ２．５％ キノリン；４−ヒドロキシ−２−メチルキノリン １００mM エチルオレンジ ０．３２％ アルコール
【００１６】このクレアチニン試薬は、表１に示す大き
な安定性シフトを示した。
な安定性シフトを示した。
【００１７】
【表１】
【００１８】クレアチニン３０、１００又は２００mg/d
lを含有する試料は、試験片の貯蔵寿命にわたって予想
どおりの結果を読ませるはずである。しかし、表１によ
って実証する安定性シフトでは、クレアチニン３０mg/d
lを含有する試料で２４の高さの数値指定が認められ
た。目視による結果は、クレアチニン濃度３０、１００
及び２００mg/dlに対応する色の数値指定１０、２０及
び３０を有するカラーチャートを使用する補間によって
測定されたため、この結果は許容できないほど高い。た
とえば、２５０mg/dlの試料の結果は、２５の数値指定
結果又はクレアチニン１００mg/dlを含有する試料に予
想される結果と、クレアチニン２００mg/dlを含有する
試料に予想される結果との中間の数値指定結果を出すは
ずである。表１から判断することができるように、１０
の読みを出すはずのクレアチニン３０mg/dlを含有する
試料で、２４の高さの数値指定（ＮＤ）が認められた。
lを含有する試料は、試験片の貯蔵寿命にわたって予想
どおりの結果を読ませるはずである。しかし、表１によ
って実証する安定性シフトでは、クレアチニン３０mg/d
lを含有する試料で２４の高さの数値指定が認められ
た。目視による結果は、クレアチニン濃度３０、１００
及び２００mg/dlに対応する色の数値指定１０、２０及
び３０を有するカラーチャートを使用する補間によって
測定されたため、この結果は許容できないほど高い。た
とえば、２５０mg/dlの試料の結果は、２５の数値指定
結果又はクレアチニン１００mg/dlを含有する試料に予
想される結果と、クレアチニン２００mg/dlを含有する
試料に予想される結果との中間の数値指定結果を出すは
ずである。表１から判断することができるように、１０
の読みを出すはずのクレアチニン３０mg/dlを含有する
試料で、２４の高さの数値指定（ＮＤ）が認められた。
【００１９】安定性シフトの原因に関し、いくつかの理
論を追求した。成分の除去により、問題が酸化還元指示
薬の自動酸化に関連すると判断し、レピジン（４−メチ
ルキノリン）１００mMをクレアチニン配合物に加える
と、表２のデータによって実証されるように、検定の目
視安定性が劇的に改善するということを見いだした。
論を追求した。成分の除去により、問題が酸化還元指示
薬の自動酸化に関連すると判断し、レピジン（４−メチ
ルキノリン）１００mMをクレアチニン配合物に加える
と、表２のデータによって実証されるように、検定の目
視安定性が劇的に改善するということを見いだした。
【００２０】
【表２】
【００２１】表２から判断することができるように、理
想的には１０の読みを出すであろう３０mg/dlを含有す
る試料で１０〜１２の数値指定（ＮＤ）が観察された。
想的には１０の読みを出すであろう３０mg/dlを含有す
る試料で１０〜１２の数値指定（ＮＤ）が観察された。
【００２２】レピジン含有配合物でより良好な安定性が
達成されたが、同時に、いくつか問題が提示された。レ
ピジンの添加は、試験のダイナミックレンジを３０〜３
００mg/dlから約３０〜２００mg/dlに低下させた。レピ
ジンの目的はヘモグロビンに対する化学作用の感度を高
めることであるため、レピジンの存在がクレアチニン配
合物を潜血試験に転用させた。１mg/dlヘモグロビンの
存在が、レピジン含有配合物をして、クレアチニン３０
mg/dlを含有する配合物を、３００mg/dlを超えるものと
して読ませた。ヘモグロビンによるこの干渉の量は、血
液を含有することが多い臨床尿で使用するのには許容で
きない。
達成されたが、同時に、いくつか問題が提示された。レ
ピジンの添加は、試験のダイナミックレンジを３０〜３
００mg/dlから約３０〜２００mg/dlに低下させた。レピ
ジンの目的はヘモグロビンに対する化学作用の感度を高
めることであるため、レピジンの存在がクレアチニン配
合物を潜血試験に転用させた。１mg/dlヘモグロビンの
存在が、レピジン含有配合物をして、クレアチニン３０
mg/dlを含有する配合物を、３００mg/dlを超えるものと
して読ませた。ヘモグロビンによるこの干渉の量は、血
液を含有することが多い臨床尿で使用するのには許容で
きない。
【００２３】ヘモグロビン感度及びダイナミックレンジ
の減少を起こさずに安定性の問題を解消する誘導体を見
いだすため、レピジンに類似した他のキノリン化合物の
選別を実施した。３０種のキノリン誘導体を２５及び１
００mMの濃度で選別した。キノリン類の一覧を表３に掲
載する。
の減少を起こさずに安定性の問題を解消する誘導体を見
いだすため、レピジンに類似した他のキノリン化合物の
選別を実施した。３０種のキノリン誘導体を２５及び１
００mMの濃度で選別した。キノリン類の一覧を表３に掲
載する。
【００２４】
【表３】
【００２５】２又は８位の置換が立体因子によるヘモグ
ロビン干渉の減少に効果的であると推測されたため、評
価のために選択したキノリン類は、レピジン（４−メチ
ルキノリン）に類似していたが、キノリン環の別の位置
にメチル基を有し、アミン、ヒドロキシ又はニトロ基を
キノリン環上に有するか、２又は８位を置換されてい
た。各キノリン誘導体を、例Ｉに記載の配合物に２５及
び１００mMの濃度で組み込み、配合適合性（浸漬適合
性、含浸紙の見かけ及び発色）に関して試験し、１mg/d
lヘモグロビンでヘモグロビン感度に関して試験し、熱
安定性に対するその効果に関して評価した。
ロビン干渉の減少に効果的であると推測されたため、評
価のために選択したキノリン類は、レピジン（４−メチ
ルキノリン）に類似していたが、キノリン環の別の位置
にメチル基を有し、アミン、ヒドロキシ又はニトロ基を
キノリン環上に有するか、２又は８位を置換されてい
た。各キノリン誘導体を、例Ｉに記載の配合物に２５及
び１００mMの濃度で組み込み、配合適合性（浸漬適合
性、含浸紙の見かけ及び発色）に関して試験し、１mg/d
lヘモグロビンでヘモグロビン感度に関して試験し、熱
安定性に対するその効果に関して評価した。
【００２６】試験したキノリン類のうち、１２種が、キ
ノリンなしのクレアチニン配合物よりも良好なヘモグロ
ビン耐性を提供することがわかった。これらのキノリン
類は、２−クロロレピジン、２−クロロキノリン、２−
ヒドロキシキノリン、８−メチルキノリン、８−ニトロ
キノリン、３−アミノキノリン、４−クロロキナルジ
ン、５−ニトロキノリン、６−ニトロキノリン、４−ヒ
ドロキシ−２−メチルキノリン、８−ヒドロキシキノリ
ン及び３−ブロモキノリンであった。これら１２種のキ
ノリン類の比較が、環上の２又は８位におけるハロゲ
ン、ニトロ、ヒドロキシル又はアミン基の置換が、クレ
アチニン試薬に対するヘモグロビン干渉を防ぐ最も効果
的な手段であるという仮説を構造的に裏付けた。
ノリンなしのクレアチニン配合物よりも良好なヘモグロ
ビン耐性を提供することがわかった。これらのキノリン
類は、２−クロロレピジン、２−クロロキノリン、２−
ヒドロキシキノリン、８−メチルキノリン、８−ニトロ
キノリン、３−アミノキノリン、４−クロロキナルジ
ン、５−ニトロキノリン、６−ニトロキノリン、４−ヒ
ドロキシ−２−メチルキノリン、８−ヒドロキシキノリ
ン及び３−ブロモキノリンであった。これら１２種のキ
ノリン類の比較が、環上の２又は８位におけるハロゲ
ン、ニトロ、ヒドロキシル又はアミン基の置換が、クレ
アチニン試薬に対するヘモグロビン干渉を防ぐ最も効果
的な手段であるという仮説を構造的に裏付けた。
【００２７】３種のキノリン類、すなわち６−メトキシ
キノリン、３−メチルキノリン及び４−ヒドロキシ−２
−メチルキノリンだけが、レピジンのそれに類似した、
クレアチニン配合物における安定性の改善を実証し、必
要な安定性の改善を提供するためには２、３、４もしく
は５位におけるメチル又は２、３、４、５もしくは６位
におけるメトキシが必要であることを示唆した。３種の
キノリン類の２種、すなわち６−メトキシキノリン及び
３−メチルキノリンが、レピジンのそれに類似した安定
性及び反応性の性能を与えた。これらの化合物は全体的
な反応性を高め、試験のダイナミックレンジを減少させ
た。他の化合物４−ヒドロキシ−２−メチルキノリン
は、レベルの間により大きな解像度を有する対照に類似
した反応性を与えたため、レピジンに類似した性能を示
さなかった。これはまた、ヘモブロビン耐性及び所望の
安定性改善を提供することがわかった唯一のキノリン化
合物であった。このキノリンはレピジンよりも危険が少
なく、無臭であった。安定性及びヘモグロビン耐性にお
ける有意な改善に基づくと、４−ヒドロキシ−２−メチ
ルキノリンが、本発明で使用するのに好ましいキノリン
である。２〜８位をアミノ、ニトロ、ヒドロキシルもし
くはハロゲンで、２〜６位をメトキシで、及び／又は、
２〜５位をメチルで置換されたキノリン類が、ヘモグロ
ビンとで配位するキノリンの能力に干渉するそれらの能
力により、同様な改善を提供する。
キノリン、３−メチルキノリン及び４−ヒドロキシ−２
−メチルキノリンだけが、レピジンのそれに類似した、
クレアチニン配合物における安定性の改善を実証し、必
要な安定性の改善を提供するためには２、３、４もしく
は５位におけるメチル又は２、３、４、５もしくは６位
におけるメトキシが必要であることを示唆した。３種の
キノリン類の２種、すなわち６−メトキシキノリン及び
３−メチルキノリンが、レピジンのそれに類似した安定
性及び反応性の性能を与えた。これらの化合物は全体的
な反応性を高め、試験のダイナミックレンジを減少させ
た。他の化合物４−ヒドロキシ−２−メチルキノリン
は、レベルの間により大きな解像度を有する対照に類似
した反応性を与えたため、レピジンに類似した性能を示
さなかった。これはまた、ヘモブロビン耐性及び所望の
安定性改善を提供することがわかった唯一のキノリン化
合物であった。このキノリンはレピジンよりも危険が少
なく、無臭であった。安定性及びヘモグロビン耐性にお
ける有意な改善に基づくと、４−ヒドロキシ−２−メチ
ルキノリンが、本発明で使用するのに好ましいキノリン
である。２〜８位をアミノ、ニトロ、ヒドロキシルもし
くはハロゲンで、２〜６位をメトキシで、及び／又は、
２〜５位をメチルで置換されたキノリン類が、ヘモグロ
ビンとで配位するキノリンの能力に干渉するそれらの能
力により、同様な改善を提供する。
【００２８】低めのレベルがより良好な高温安定性を提
供するかどうかを判定するため、４−ヒドロキシ−２−
メチルキノリンの濃度を５０mMから１２０mMまで１０mM
きざみで変化させた。この配合物の見かけ最適キノリン
濃度が８０〜１１０mMである状態で、キノリン濃度と熱
安定性との間に明瞭な関係が認められた。表４から判断
することができるように、クレアチニン１０〜３００mg
/dlを含有する試料で認められた数値指定（ＮＤ）は、
改善された配合の予想ＮＤにより近いものであった。キ
ノリン添加によって認められたＮＤ値は、４０℃で４週
間の貯蔵によっても影響を受けなかったが、元の配合で
認められたＮＤ値は影響を受けた。改良された配合の分
析範囲もまた、より大きかった。
供するかどうかを判定するため、４−ヒドロキシ−２−
メチルキノリンの濃度を５０mMから１２０mMまで１０mM
きざみで変化させた。この配合物の見かけ最適キノリン
濃度が８０〜１１０mMである状態で、キノリン濃度と熱
安定性との間に明瞭な関係が認められた。表４から判断
することができるように、クレアチニン１０〜３００mg
/dlを含有する試料で認められた数値指定（ＮＤ）は、
改善された配合の予想ＮＤにより近いものであった。キ
ノリン添加によって認められたＮＤ値は、４０℃で４週
間の貯蔵によっても影響を受けなかったが、元の配合で
認められたＮＤ値は影響を受けた。改良された配合の分
析範囲もまた、より大きかった。
【００２９】
【表４】
【００３０】アスコルビン酸及びヘモグロビンを用いて
干渉試験を実施した。ヘモグロビン１〜１０mg/dl及び
アスコルビン酸２５〜４４０mg/dlの濃度を、改善され
たクレアチニン配合物及び元のクレアチニン試薬によ
り、クレアチニン尿基準５０mg/dl中で試験した。CLINI
TEK（登録商標）-50反射分光計を使用した干渉試験の結
果を表５にまとめる。
干渉試験を実施した。ヘモグロビン１〜１０mg/dl及び
アスコルビン酸２５〜４４０mg/dlの濃度を、改善され
たクレアチニン配合物及び元のクレアチニン試薬によ
り、クレアチニン尿基準５０mg/dl中で試験した。CLINI
TEK（登録商標）-50反射分光計を使用した干渉試験の結
果を表５にまとめる。
【００３１】
【表５】
【００３２】表５を参照すると、標準クレアチニン配合
物が、本発明の改善された配合よりも高いヘモグロビン
感度及びアスコルベート感度を示すことがわかった。本
発明のキノリンなしの試験は、１０mg/dlのヘモグロビ
ン濃度で、キノリン含有配合物の場合の５２％に比べ、
１４７％の反応性の増加を示した。一般に、改善された
クレアチニン試験により、試験したすべてのヘモグロビ
ン濃度でヘモグロビン耐性における３倍の改善が認めら
れた。実際には、この種の検定に使用される試験具は、
ヘモグロビン約５mg/dlで起こる目視できるほどの血尿
に対しては使用しないよう注意書きを貼られているた
め、試験される尿試料は、そのような高濃度のヘモグロ
ビンを含有することはないであろう。
物が、本発明の改善された配合よりも高いヘモグロビン
感度及びアスコルベート感度を示すことがわかった。本
発明のキノリンなしの試験は、１０mg/dlのヘモグロビ
ン濃度で、キノリン含有配合物の場合の５２％に比べ、
１４７％の反応性の増加を示した。一般に、改善された
クレアチニン試験により、試験したすべてのヘモグロビ
ン濃度でヘモグロビン耐性における３倍の改善が認めら
れた。実際には、この種の検定に使用される試験具は、
ヘモグロビン約５mg/dlで起こる目視できるほどの血尿
に対しては使用しないよう注意書きを貼られているた
め、試験される尿試料は、そのような高濃度のヘモグロ
ビンを含有することはないであろう。
【００３３】アスコルベート耐性に関しては、現在のク
レアチニン試験は、アスコルベート２５mg/dlの存在下
での反応性において８２％の増加を示した。それに比較
して、改善されたクレアチニン試験は、２５mg/dlアス
コルベート及び、臨床尿中に正常に見られる量の２０倍
である濃度４４０mg/dlのアスコルベートに対して耐性
を実証した。したがって、本発明に試薬により、ヘモグ
ロビン及びアスコルベート耐性の両方が有意に改善され
る。
レアチニン試験は、アスコルベート２５mg/dlの存在下
での反応性において８２％の増加を示した。それに比較
して、改善されたクレアチニン試験は、２５mg/dlアス
コルベート及び、臨床尿中に正常に見られる量の２０倍
である濃度４４０mg/dlのアスコルベートに対して耐性
を実証した。したがって、本発明に試薬により、ヘモグ
ロビン及びアスコルベート耐性の両方が有意に改善され
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平10−62412（ＪＰ，Ａ) 特開 昭49−54094（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/70 G01N 33/493 G01N 33/52
Claims (27)
- 【請求項１】 クレアチニンを含有する疑いのある流体
試料を、第二銅イオン、ヒドロペルオキシド及び被酸化
性染料と接触させる工程を含む、流体試料中のクレアチ
ニンの検定法において、第二銅イオンの存在下での被酸
化性染料の自動酸化を抑止する置換キノリン化合物を測
定系に含めることを特徴とする検定法。 - 【請求項２】 該置換キノリンが、式 【化１】 （式中、分子の２〜５位を占める炭素原子の少なくとも
一つがメチル基で置換されている、及び／又は、分子の
２〜６位を占める、メチル基で置換されていない炭素原
子の少なくとも一つがメトキシ基で置換されている）で
示される、請求項１記載の検定法。 - 【請求項３】 該置換キノリンが、一個のメチル基及び
／又は一個のメトキシ基で置換されている、請求項２記
載の検定法。 - 【請求項４】 該キノリン化合物が、４−ヒドロキシ−
２−メチルキノリン、６−メトキシキノリン又は３−メ
チルキノリンである、請求項３記載の検定法。 - 【請求項５】 該置換キノリンが、測定系中に１０〜３
００mMの濃度で存在する、請求項１記載の検定法。 - 【請求項６】 該濃度が、５０〜１５０mMである、請求
項５記載の検定法。 - 【請求項７】 該流体試料が尿を含む、請求項１記載の
検定法。 - 【請求項８】 クレアチニンをヘモグロビン及び／又は
アスコルベートとともに含有する疑いのある流体試料中
のクレアチニンの検定法において、流体試料を、第二銅
イオン、ヒドロペルオキシド及び被酸化性染料を含む試
薬系と接触させる工程を含み、該測定系がさらに、式 【化２】 （式中、２〜８位の少なくとも一つの位置がアミノ、ニ
トロ、ヒドロキシルもしくはハロゲンで置換されてい
る、２〜５位の少なくとも一つの位置がメチルで置換さ
れている、及び／又は、２〜６位の少なくとも一つの位
置がメトキシ基で置換されている）で示される置換キノ
リン化合物を含むことを特徴とする検定法。 - 【請求項９】 該キノリンが、２−クロロレピジン、２
−クロロキノリン、２−ヒドロキシキノリン、８−メチ
ルキノリン、８−ニトロキノリン、３−アミノキノリ
ン、８−ヒドロキシキノリン、４−クロロキノリン、５
−ニトロキノリン、４−ヒドロキシ−２−メチルキノリ
ン、６−ニトロキノリン及び３−ブロモキノリンであ
る、請求項８記載の検定法。 - 【請求項１０】 該キノリンが、４−ヒドロキシ−２−
メチルキノリンである、請求項９記載の検定法。 - 【請求項１１】 該キノリン化合物が、測定系中に１０
〜３００mMの濃度で存在する、請求項８記載の検定法。 - 【請求項１２】 該濃度が５０〜１５０mMである、請求
項１１記載の検定法。 - 【請求項１３】 該試薬配合物を吸収性材料片上で乾燥
させて乾燥試験片を提供し、その試験片を流体試料と接
触させる、請求項８記載の検定法。 - 【請求項１４】 尿を、４−ヒドロキシ−２−メチルキ
ノリンとともに、第二銅イオン、ヒドロペルオキシド及
び被酸化性染料を含む試薬系と接触させることを特徴と
する、尿中のクレアチニンの検定法。 - 【請求項１５】 ４−ヒドロキシ−２−メチルキノリン
が測定系中に１０〜３００mMの濃度で存在し、該ヒドロ
ペルオキシドがジイソプロピルベンゼンジヒドロペルオ
キシドであり、該被酸化性染料が３，３′，５，５′−
テトラメチルベンジジンである、請求項１４記載の検定
法。 - 【請求項１６】 該試薬配合物を吸収性材料片上で乾燥
させて乾燥試験片を提供し、その試験片を尿と接触させ
る、請求項１４記載の検定法。 - 【請求項１７】 尿を、第二銅イオン、ヒドロペルオキ
シド、被酸化性染料及び４−ヒドロキシ−２−メチルキ
ノリンを含有する試薬系と接触させる、尿中クレアチニ
ンの検定法。 - 【請求項１８】 ４−ヒドロキシ−２−メチルキノリン
が、測定系中に１０〜３００mMの濃度で存在し、ヒドロ
ペルオキシドが、ジイソプロピルベンゼンジヒドロペル
オキシドであり、また被酸化性染料が、３，３′，５，
５′−テトラメチルベンジジンである、請求項１７記載
の検定法。 - 【請求項１９】 試薬系を吸収性材料試験片上に乾燥さ
せて乾燥試験片を提供し、その試験片を尿と接触させ
る、請求項１７記載の検定法。 - 【請求項２０】 クレアチニンをヘモグロビン及び／又
はアスコルベートとともに含有する疑いのある尿試料中
のクレアチニンの検定法であって、尿試料を、第二銅イ
オン、ヒドロペルオキシド、被酸化性染料及び４−ヒド
ロキシ−２−メチルキノリンを含有する試薬系と接触さ
せる工程を含む検定法。 - 【請求項２１】 ４−ヒドロキシ−２−メチルキノリン
が、測定系中に１０〜３００mMの濃度で存在し、ヒドロ
ペルオキシドが、ジイソプロピルベンゼンジヒドロペル
オキシドであり、また被酸化性染料が、３，３′，５，
５′−テトラメチルベンジジンである、請求項２０記載
の検定法。 - 【請求項２２】 試薬系を吸収性材料試験片上に乾燥さ
せて乾燥試験片を提供し、その試験片を尿と接触させ
る、請求項２０記載の検定法。 - 【請求項２３】 第二銅イオン又は塩、ヒドロペルオキ
シド、被酸化性染料及び被酸化性染料の自動酸化を抑制
する置換キノリン化合物を含有する、クレアチニン検定
試薬。 - 【請求項２４】 該置換キノリンが、請求項２〜４のい
ずれか一項記載の化合物である、請求項２３記載のクレ
アチニン検定試薬。 - 【請求項２５】 クレアチニンをヘモグロビン及び／又
はアスコルベートとともに含有する疑いのある流体試料
中のクレアチニン検定試薬であって、第二銅イオン又は
塩、ヒドロペルオキシド、被酸化性染料及び置換キノリ
ン化合物を含有する検定試薬。 - 【請求項２６】 置換キノリン化合物が、請求項８〜１
０のいずれか一項記載の化合物である、請求項２５記載
の検定試薬。 - 【請求項２７】 第二銅イオン又は塩、ヒドロペルオキ
シド、被酸化性染料及び４−ヒドロキシ−２−メチルキ
ノリンを含有する、尿中クレアチニン検定試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US09/161,768 US6001656A (en) | 1998-09-28 | 1998-09-28 | Method for the detection of creatinine |
| US09/161768 | 1998-09-28 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000105238A JP2000105238A (ja) | 2000-04-11 |
| JP3263051B2 true JP3263051B2 (ja) | 2002-03-04 |
Family
ID=22582642
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP27206699A Expired - Lifetime JP3263051B2 (ja) | 1998-09-28 | 1999-09-27 | 改善されたクレアチニン検出方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6001656A (ja) |
| EP (1) | EP0992795B1 (ja) |
| JP (1) | JP3263051B2 (ja) |
| AT (1) | ATE220798T1 (ja) |
| AU (1) | AU757569B2 (ja) |
| CA (1) | CA2281166C (ja) |
| DE (1) | DE69902134T2 (ja) |
| ES (1) | ES2181351T3 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US6210971B1 (en) * | 1999-01-25 | 2001-04-03 | Bayer Corporation | Assay for the detection of creatinine |
| US6872573B2 (en) * | 2003-01-02 | 2005-03-29 | Bayer Corporation | Fluorescent creatinine assay |
| US20060281188A1 (en) * | 2005-06-13 | 2006-12-14 | Cornell Research Foundation, Inc. | Ratiometric test strip and method |
| CA2709143A1 (en) * | 2007-12-14 | 2009-06-25 | Cornell University | Method of determing excretion of sodium and other analytes |
| CN102661949A (zh) * | 2012-04-23 | 2012-09-12 | 南京工业大学 | 一种尿液肌酐检测试纸及其制备方法 |
| US9804154B2 (en) | 2013-03-12 | 2017-10-31 | Epinex Diagnostics, Inc. | Rapid test for urine albumin and urine creatinine |
| CN104568931A (zh) * | 2014-12-24 | 2015-04-29 | 中国科学院苏州生物医学工程技术研究所 | 一种检测尿液中肌酐含量的试剂条及其制备方法 |
| US20210033605A1 (en) | 2018-04-03 | 2021-02-04 | Sanofi | Lateral flow immunoassay strip device |
| CN114034693A (zh) * | 2021-11-04 | 2022-02-11 | 广州达安基因股份有限公司 | 一种检测尿肌酐尿微量白蛋白半定量的联检试纸、其制备方法及用途 |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA1143634A (en) * | 1980-06-02 | 1983-03-29 | Alan E. Burkhardt | Interference-resistant test device for determining a peroxidately active substance in a test sample and method for preparing it |
| EP0196743A3 (en) * | 1985-01-31 | 1988-10-19 | Savyon Diagnostics Ltd. | Stable chemical compositions containing chromogenic materials and peroxides, and method for obtaining them |
| US4755472A (en) * | 1986-01-16 | 1988-07-05 | Miles Inc. | Stable composition for the determination of peroxidatively active substances |
| US5081040A (en) * | 1987-06-29 | 1992-01-14 | Helena Laboratories Corporation | Composition and kit for testing for occult blood in human and animal excretions, fluids, or tissue matrixes |
| US5318894A (en) * | 1990-01-30 | 1994-06-07 | Miles Inc. | Composition, device and method of assaying for peroxidatively active substances |
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