JP3262473B2 - 細胞の解析方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、被検細胞表面上のサイ
トカインレセプター(cytokine receptor) の定量方法に
関するものであり、更に詳しくは、従来、定性的解析に
とどまり、定量的解析が困難であったフローサイトメト
リー(flow cytometry)による検出方法を根本的に改善
し、Ｇ−ＣＳＦを含め、エリスロポエチン(Erythropoie
tin)、インターロイキン−２ (Interleukin-2)、インタ
ーロイキン−６ (Interleukin-6)、ｍｐｌリガンド等種
々のサイトカインレセプターのフローサイトメトリーに
よる迅速かつ簡便な定量的解析を可能とする被検細胞表
面上のサイトカインレセプター数の新規定量方法、及び
被検細胞の定性的解析と当該細胞のサイトカインレセプ
ター数の定量とを同時的に行うことを可能とする細胞の
解析方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】近年、臨床上、各種サイトカイン(cytok
ine)が造血器疾患の治療に使われ始め、現在までインタ
ーロイキン−１（Interleukin-1 ）、インターロイキン
−２（Interleukin-2 ）、インターロイキン−３（Inte
rleukin-3 ）、インターロイキン−６（Interleukin-6
）、Ｇ−ＣＳＦ、顆粒球・マクロファージ・コロニー
刺激因子（granulocyte/macrophage colony-stimulatin
g factor）、エリスロポエチン（Erythropoietin）等が
臨床的に利用され、その薬効解析の１つのマーカーとし
て細胞表面上のレセプター（受容体）の解析が重要視さ
れている。また、最近、血小板増加因子として見出され
たｍｐｌリガンド〔Ｎａｔｕｒｅ，３６９，５３３−５
３８，５６５−５７４（１９９４）〕の薬効解析におい
ても同様のレセプター解析が重要となってくる。

【０００３】これらのサイトカインのうち、顆粒球コロ
ニー刺激因子（Granulocyte colony-stimulating facto
r;Ｇ−ＣＳＦ）を例にあげてその重要性を説明する。当
該因子は、Ｏ結合型糖鎖（Ｏ−linked sugar chain）を
有する分子量約１９０００の糖蛋白で、好中球系前駆細
胞の増殖と分化を刺激し、更に成熟好中球の機能を亢進
させる作用を有する〔Ｂｌｏｏｄ，７４，２１４４−２
１４９（１９８９）、及びＢｌｏｏｄ，７４，２７４３
−２７４８（１９８９）〕。このような作用は、Ｇ−Ｃ
ＳＦと細胞膜表面に存在するＧ−ＣＳＦに特異的なレセ
プターとの結合によって開始される〔Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１，３７６５−３７
６９（１９８４）〕。その親和性は単一であり、正常ヒ
ト顆粒球における結合部位は１細胞当り約１０００〜２
０００部位であると報告されている〔Ｂｌｏｏｄ，７
４，２６６８−２６７３（１９８９）、及びＥｘｐ．Ｈ
ｅｍａｔｏｌ．，１８，１０９７−１１０３（１９９
０）〕。

【０００４】一方、Ｇ−ＣＳＦは好中球のみならず、一
部の腫瘍細胞にも作用し、その増殖を促すことが知られ
ている。特に急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）患者の芽球に
はＧ−ＣＳＦに対する特異的なレセプターが存在し、Ｇ
−ＣＳＦの作用により一部の症例では芽球の増殖が刺激
されることが報告されている〔Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ
ｓ．，４７，５６４７−５６４８（１９８７）〕。

【０００５】このＡＭＬ細胞におけるＧ−ＣＳＦレセプ
ターの有無は、今まで、 ¹²⁵Ｉ又は³Ｈで標識したＧ−
ＣＳＦを用いた結合試験（binding assay ）によって行
われてきた。この方法は、レセプターの親和性（recept
or affinity ）、細胞当りの平均レセプター発現数（av
erage number of receptor expression per cell）に関
する情報を与えてくれる。しかしながら、当該方法は、
放射線管理の問題だけでなく、測定に大量の細胞（１０
⁸ 個程度）を使用するため患者側への負担が大きいと言
う問題を有する。また、測定に長時間を要する上、サン
プル中の芽球の割合が低い場合、芽球以外の細胞との分
離、識別が困難であり、測定値が芽球の性質を正確に反
映しない等の問題がある。このため、通常の臨床検体で
Ｇ−ＣＳＦレセプターの解析を行うのは容易ではなかっ
た。

【０００６】従来、一般に、Ｇ−ＣＳＦレセプターの測
定は、主としてラジオアイソトープ標識Ｇ−ＣＳＦを用
いたbinding assay によるところが多かったが、最近、
Ｇ−ＣＳＦを含め、Erythropoietin、Interleukin-2 、
Interleukin-6 等種々のサイトカインレセプターのフロ
サイトメトリーによる検出を試みた例が報告されている
〔Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５２，３０５２−３０５５
（１９９２）、Ｂｌｏｏｄ，７５，６９７−７０５（１
９９０）、及びＢｌｏｏｄ，７５，７６７−７７４（１
９９０）〕。

【０００７】しかしながら、これらは、ＦＩＴＣ又はフ
ィコエリスリン(Phycoerythrin) を標識したサイトカイ
ンを用いた定性的分析が主であり、定量的検出方法の報
告はなく、Ｇ−ＣＳＦに関しては、Escherichia coliに
より発現、精製された糖鎖を含まない遺伝子組換え型Ｇ
−ＣＳＦを使用した定性的解析が主であり、天然型(nat
ural type ) のＧ−ＣＳＦを用いた定量的な測定法は現
在までなされていない。

【０００８】すなわち、現在までの報告を見れば明らか
なとおり、従来、フローサイトメトリーでの解析は、定
量的なものではなく、Ｇ−ＣＳＦレセプターの有無を調
べると言うあくまで定性的な判定にとどまり、また、使
用されたＧ−ＣＳＦは糖鎖をもたない遺伝子組換え型Ｇ
−ＣＳＦにとどまるものであった。

【０００９】前記の如く、ラジオアイソトープを用いた
binding assay では、receptor affinity, average num
ber of receptor expression per cell に関する情報を
与えてくれる反面、放射線管理の問題だけでなく、多く
の細胞数（１０⁸ 個程度）を必要とし、測定に長時間を
要する上、サンプル中の芽球の割合が低い場合、測定値
が芽球の性質を正確に反映しない等のさまざまな問題が
ある。これに対して、フローサイトメトリーによる解析
では、少ない細胞数で簡易に測定することができるが、
これまでのところＧ−ＣＳＦレセプターを含む各種サイ
トカインレセプターに関する詳細な解析はなされていな
かった。従って、サイトカインに関わる作用の解明及び
診断においてフローサイトメトリーによるサイトカイン
レセプターの定量的解析方法を確立することが強く要請
されている状況にあった。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】このような状況を踏ま
え、本発明者らは、これらの問題を解決するために、少
ない細胞数（２×１０⁵ 個程度）で、かつ迅速、簡便に
行い得るフローサイトメトリーによるサイトカインレセ
プター解析の可能性を、Ｇ−ＣＳＦレセプターを代表例
として、より高感度にかつ定量性を求める方向で検討し
た結果、bindingassay で得られたレセプター数とフロ
ーサイトメトリーでの解析結果に一定の相関が見られる
こと、フローサイトメトリーによるＧ−ＣＳＦレセプタ
ーの簡易かつ定量的測定を実現し得る可能性があること
を見い出し、かかる知見をもとに本発明を完成するに至
った。

【００１１】すなわち、本発明は、測定に際し、従来法
の如く患者側への負担を大きくするような多くの細胞
（１０⁸ 個程度）を使用することがなく、少ない細胞数
で、かつ迅速、簡便に行い得るフローサイトメトリーに
よる被検細胞表面上のサイトカインレセプター数を定量
する方法、及び被検細胞の定性的解析と当該細胞のサイ
トカインレセプター数の定量とを同時的に行うことを可
能とする細胞の解析方法を提供することを目的とするも
のである。

【００１２】

【課題を解決するための手段】上記課題を解決するため
に、本発明は、第１の態様として、下記の工程、 被検細胞を含む検体に被検対象のレセプターに対応す
るビオチン標識サイトカインを加えて反応させる、 励起波長と蛍光波長の差が少なくとも５０ナノメータ
ー（ｎｍ）以上の蛍光物質をアビジンに結合した蛍光物
質標識アビジンを添加して反応させ、未反応物質を除去
した後、フローサイトメトリーにより蛍光強度（蛍光強
度Ａ）を測定する、 一方、被検対照として、被検細胞を含む検体に上記ビ
オチン標識サイトカインと大過剰量の非標識サイトカイ
ン及び上記蛍光物質標識アビジンを添加し反応させ、未
反応蛍光物質を除去した後、フローサイトメトリーによ
り蛍光強度（蛍光強度Ｂ）を測定する、 対照との蛍光強度差〔蛍光強度Ａ−蛍光強度Ｂ〕（Ｄ
値）を求め、予めレセプター数とＤ値の関係に基づき作
成した検量線から細胞表面上の該当サイトカインレセプ
ター数を求める、 を含むことを特徴とする細胞表面上のサイトカインレセ
プター数の定量方法を提供するものである。

【００１３】また、本発明は、第２の態様として、上記
方法において、サイトカインが、顆粒球コロニー刺激因
子（Ｇ−ＣＳＦ）又はエリスロポエチン（ＥＰＯ）であ
るサイトカインレセプター数の定量方法を提供するもの
である。また、本発明は、第３の態様として、上記方法
において、蛍光物質が、エネルギー移行型蛍光色素であ
る前記のサイトカインレセプター数の定量方法を提供す
るものである。また、本発明は、第４の態様として、上
記方法において、蛍光物質が、ＲＥＤ６１３、ＲＥＤ６
７０である前記のサイトカインレセプター数の定量方法
を提供するものである。更に、本発明は、第５の態様と
して、前記の方法における蛍光物質と励起波長がほぼ同
じで蛍光波長が異なる蛍光物質で標識した細胞表面抗原
に対するモノクローナル抗体を組み合わせた多重蛍光染
色により、被検細胞の定性的解析と前記の方法に基づく
当該細胞のサイトカインレセプター数の定量とを同時的
に行うことを特徴とする細胞の解析方法を提供するもの
である。

【００１４】本発明者らは、上記の如く、binding assa
y との比較において、フローサイトメトリーによるＧ−
ＣＳＦレセプター解析の可能性を検討した。エリスロポ
エチン（Erythropoietin）とは異なり、ヒトＧ−ＣＳＦ
における糖鎖の有無は本質的な生物活性には関係ないと
思われるが、ｐＨや温度に対する安定性に関与すると言
われ、糖鎖を有する組換えヒトＧ−ＣＳＦ（rhＧ−ＣＳ
Ｆ）を使用する方がより生理的条件を反映するものと考
えられた。そこで、チャイニーズハムスター卵巣細胞
（ＣＨＯ細胞）で産生させた天然型Ｇ−ＣＳＦと同一の
１７４個のアミノ酸と同一組成比の糖鎖を有するrhＧ−
ＣＳＦを用いてＧ−ＣＳＦレセプターの検出を行った。
また、フローサイトメトリーによるＧ−ＣＳＦレセプタ
ー解析を定量性の方向で検討した。

【００１５】フローサイトメトリーにより定量化を図る
方法の一つとしてはＫ−Ｓ解析（Ｋ−Ｓ statistics ）
がある。ここで示されるＤ値（Ｄ value）は２つのヒス
トグラムの差の程度を表現している。すなわち、ビオチ
ン−アビジンを介して蛍光物質を標識したＧ−ＣＳＦの
Ｇ−ＣＳＦレセプターへの特異的結合による蛍光強度の
シフトを表している。

【００１６】検討の結果、上記標識を採用することによ
り、binding assay から求めたレセプター数とフローサ
イトメトリーにおける蛍光強度の増加の程度（Ｄ値）が
相関することが示された。Ｄ値は、後述するように、Ｋ
−Ｓ解析（Kolmogorov-Smirnov statistics ）で算出さ
れてくる値であって、通常の解析上の数値として表面に
現れてくる値ではないが、本発明者らが蛍光強度の差を
数値化していく上で偶然その相関に注目して追試したと
ころ、レセプター数と良く相関していることが示され
た。

【００１７】この解析法の利点は、操作が簡便かつ測定
時間が短いこと、使用する細胞数が２×１０⁵ 個程度
（血液量として数ml）と少ないことである。そもそも、
白血病細胞は、不均一（heterogeneous ）な細胞の集団
であり、個々の細胞のＧ−ＣＳＦレセプター数も広範囲
に分布していると推定される。ラジオアイソトープによ
るbinding assay の結果は平均化したレセプター数であ
り、細胞の分離操作時に混入する目的以外の細胞の存在
により、上記のレセプター数は広範囲にわたっている。
一方、フローサイトメトリーでは２重染色あるいは３重
染色によってイムノフェノタイプでゲートをかけること
により血液細胞のある系統、分化段階のレセプターの解
析が可能である。

【００１８】本発明者らは、まず、蛍光物質としてフィ
コエリスリン（Phycoerythrin ）を用いてフローサイト
メトリーでの測定を実施した。健常人由来顆粒球（以
下、ヒト顆粒球と言うことがある）の一定量に各濃度の
ビオチン標識Ｇ−ＣＳＦ（ｂ−Ｇ−ＣＳＦ）を添加して
反応後、アビジン標識フィコエリスリン（ＳＡ−ＰＥ）
を加え、フローサイトメトリーでＤ値を求めた。図２
に、ｂ−Ｇ−ＣＳＦ（biotinyl Ｇ−ＣＳＦ）濃度とＤ
値の関係を示す。これから、ｂ−Ｇ−ＣＳＦ濃度が約２
００ng/ml 以下のとき、ｂ−Ｇ−ＣＳＦ濃度とＤ値は直
線的な比例関係を示した（相関係数０．８３）。

【００１９】図２に示されるように、約２００ng/ml 以
上のｂ−Ｇ−ＣＳＦでは、ヒト由来顆粒球のＧ−ＣＳＦ
レセプターの全部がｂ−Ｇ−ＣＳＦで飽和されるため、
Ｄ値は０．７０以上を示さない。２００ng/ml 以下の場
合、レセプターの解離定数に基づき結合し、ｂ−Ｇ−Ｃ
ＳＦ濃度に比例してＤ値が直線的に低下しているので、
ｂ−Ｇ−ＣＳＦ結合数がレセプター数であると見なすこ
とができる。 〔 ¹²⁵Ｉ〕Ｇ−ＣＳＦを用いたbinding
assay によるＧ−ＣＳＦレセプターの数は、組織球性リ
ンパ腫(histiocytic lymphoma)由来ヒト細胞株のU-937
は288-616 sites/cell、ヒト顆粒球は703-1296 sites/c
ell 、遺伝子工学的にＧ−ＣＳＦのレセプターを発現さ
せたFD11-10 は数万 sites/cell とされている。

【００２０】そこで、上記のフローサイトメトリーで実
施したのと同一の試料を使用して〔³ Ｈ〕rhＧ−ＣＳＦ
を用いたbinding assay を行った。表１に、ヒト顆粒
球、ＦＤ11-10 、Ｕ９３７、ＡＬＬ患者の芽球のフロー
サイトメトリーによるＫ−Ｓ解析でのＤ値と、binding
assay のスッキャッチャード（Scatchard ）解析により
求められた１細胞当りのＧ−ＣＳＦレセプター数（site
/cell ）の比較を示す。なお、表中、* は、binding as
say にて特異的結合が見られず計測不能であることを示
す。

【００２１】

【表１】

【００２２】表１及び図２から、ヒト顆粒球においてｂ
−Ｇ−ＣＳＦ２１４ng/ml でＤ値は０．７を示し、この
ときレセプター数は１４８２sites/cellであることが示
される。更に、ｂ−Ｇ−ＣＳＦ１０７ng/ml のときＤ値
は０．６４でレセプター数は７４２sites/cell、ｂ−Ｇ
−ＣＳＦ２１．４ng/ml のときＤ値は０．２６でレセプ
ター数は１４８sites/cell、ｂ−Ｇ−ＣＳＦ１０．７ng
/ml のときＤ値は０．１３でレセプター数は７４sites/
cellと見なすことが可能である。

【００２３】また、binding assay にて特異的結合の見
られなかった急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）患者の芽球
はフローサイトメトリーの解析でもレセプターを検出で
きなかった。なお、一般的にＡＬＬ患者ではＧ−ＣＳＦ
レセプターの発現はないとされているので、この結果を
裏付するものである。

【００２４】従って、当該ｂ−Ｇ−ＣＳＦ濃度とＤ値と
の関係において、ヒト顆粒球を用いて結合させるｂ−Ｇ
−ＣＳＦ濃度を減少させることにより、見かけの検量線
が得られる。ここで、表１に示したFD11-10 はレセプタ
ー数が５１０６sites/cellであるので、Ｄ値は０．７２
となり、ヒト顆粒球の１４８２sites/cell以上であるの
でレセプター数は算出不可能である。しかしながら、Ｕ
−９３７のＤ値は、０．３２であるので、図２からレセ
プター数を求めると約３００sites/cellであり、これは
binding assay により求めたレセプター数（３７３site
s/cell）の実測値と一致する。

【００２５】Ｄ値の性格上、FD11-10 のような大量のＧ
−ＣＳＦレセプターを保有する細胞ではＤ値がプラトー
となってしまうためＤ値の使用は難しい。しかし、ＡＭ
Ｌ患者の芽球細胞上のＧ−ＣＳＦレセプター数は、0-12
00 sites/cell と報告されている。従って、実際のＡＭ
Ｌ患者の芽球のＧ−ＣＳＦレセプター数は、成熟顆粒球
のそれに比べてやや少ないと推測されることから、十分
対応できると考えられる。もし、ヒト顆粒球よりもＧ−
ＣＳＦレセプター数が多い場合、FD11-10 のような多数
のＧ−ＣＳＦレセプターを有する細胞を用いた標準曲線
にて対応可能であると考えられる。binding assay での
測定限界が約５０sites/cellのレセプター数であること
を考慮すると、本発明者らの検討結果よりＡＭＬ患者の
芽球細胞上のＧ−ＣＳＦレセプターの有無の判定はフロ
ーサイトメトリーによる解析で対応できると結論でき
た。

【００２６】以上の事項を前提とすることにより、ヒト
顆粒球を用いて、加えるｂ−rhＧ−ＣＳＦの濃度を種々
に変えてＤ値をプロットすることにより、標準曲線を描
き、目的とする検体に飽和量のｂ−Ｇ−ＣＳＦを加え、
同条件にて操作測定し、Ｄ値を求め、標準曲線に対応さ
せることにより、Ｇ−ＣＳＦレセプターの概数を求める
ことができることが示された。従って、フローサイトメ
トリーでＫ−Ｓ解析を用いてＧ−ＣＳＦレセプター数を
ある程度数値化できることが検証された。

【００２７】前記の如く、本発明者らの知見によれば、
まず、アビジン標識フィコエリスリン（ＳＡ−ＰＥ）を
蛍光物質としてｂ−Ｇ−ＣＳＦを用いることにより、細
胞のＧ−ＣＳＦレセプターが半定量的に測定できること
が分かったが、当該蛍光物質では高感度に定量化する方
法を確立することは困難であったので、更に、この方法
を精度よく高感度に定量化するために必要とされる蛍光
物質を検索した。その結果、ストレプトアビジン標識Ｒ
ＥＤ６１３（ＳＡ−ＲＥＤ６１３）等の励起波長と蛍光
波長が一定レベル以上離れている特定の標識蛍光物質を
使用することが本目的に合うことを見い出した。

【００２８】ＲＥＤ６１３は、Ｒ−フィコエリスリン
（Ｒ−Phycoerythrin ）にテキサスレッド（Texas Red
）を結合させたエネルギー移行型色素で、励起波長488
nm 、蛍光波長613nm であり、励起波長と蛍光波長は100
nm 以上離れている。

【００２９】ここで、ＳＡ−ＰＥ又はＳＡ−ＲＥＤ６１
３でヒト顆粒球を用いてフローサイトメトリーにより解
析した結果を図３に示す（解析の具体的方法は、後述の
実施例に示す。）。図３に示すように、ＳＡ−ＰＥに比
べ明らかにＳＡ−ＲＥＤ６１３の方が蛍光強度が大きく
なり、逆に対照は蛍光強度が小さくなった。これは、Ｓ
Ａ−ＰＥの励起波長と蛍光波長が接近しているため励起
光源の散乱光がＳＡ−ＰＥの蛍光として測定されている
と考えられる。一方、ＳＡ−ＲＥＤ６１３は、前記の如
く、励起波長と蛍光波長が離れているので、このような
散乱光の妨害等がないと言える。

【００３０】そこで、ＳＡ−ＲＥＤ６１３を用いて、ヒ
ト顆粒球におけるｂ−Ｇ−ＣＳＦ濃度とＤ値の関係を調
べた。その結果を図４に示すが、ＳＡ−ＲＥＤ６１３を
用いても定量的に行えることが分かった。

【００３１】健常人７例のヒト顆粒球をbinding assay
でスキャッチヤード解析を行ったところ、１細胞当たり
のＧ−ＣＳＦレセプター数は１５０８±１８６sites/ce
ll（mean± SE ）であり、ＳＡ−ＲＥＤ６１３を用いた
フローサイトメトリーにてＤ値は０．７であった。一
方、ＡＭＬ患者２例とＡＬＬ患者１例の芽球についてbi
nding assay とＳＡ−ＲＥＤ６１３を用いたフローサイ
トメトリーを行った。これらの結果を表２に示した。bi
nding assay により得られたＧ−ＣＳＦレセプター数
は、ＡＭＬ患者１例で８７３sites/cell、他の１例及び
ＡＬＬ患者で検出限界以外であった。これらの芽球のフ
ローサイトメトリーにおけるＤ値はそれぞれ０．５，
０．０６及び０．０３であったので、ヒト顆粒球を用い
て作成した標準曲線から求めたレセプター数は、それぞ
れ７１８，９８sites/cell及び検出限界以下となった。
従って、この結果はbinding assay での実測値とほぼ一
致していた。

【００３２】

【表２】

【００３３】この他３例のＡＭＬ患者の芽球について同
様にフローサイトメトリーによる解析を行ったところ、
各症例でのＤ値は0.155 、 0.126、 0.056であった。ヒ
ト顆粒球を用いた標準曲線から求めれば、これらの症例
のＧ−ＣＳＦのレセプター数はそれぞれヒト顆粒球の 9
/100、 7/100、4/100 であると想定される。bindingass
ay の結果からヒト顆粒球のＧ−ＣＳＦのレセプター数
が1482 sites/cell と仮定すれば、各症例のＧ−ＣＳＦ
レセプターの数は約135 sites/cell、約105 sites/cel
l、約60 sites/cell であると想定される。

【００３４】すなわち、本発明者らの研究によれば、従
来より使用されているストレプトアビジン結合フィコエ
リスリン（ＳＡ−ＰＥ）との比較において、ＳＡ−ＲＥ
Ｄ６１３を標識蛍光物質として使用した方がより高感度
にレセプターを検出できることが分かった。これは、Ｓ
Ａ−ＰＥは、励起波長と蛍光波長が近接しているので、
散乱光、励起波長等も測定されているため、解析が困難
であるのに対して、ＳＡ−ＲＥＤ６１３は、前記の如
く、励起波長と蛍光波長が離れているので、このような
散乱光の妨害等がなく高感度な解析が可能となるもので
あり、このことからも、前記ＳＡ−ＰＥ等の他の蛍光物
質に見られないＳＡ−ＲＥＤ６１３の本発明方法におい
ての有用性が示される。

【００３５】ＳＡ−ＲＥＤ６１３及びＲＥＤ６７０は、
通常フローサイトメトリーで用いられているアルゴン・
レーザーによって励起され、抗原、抗体の標識に頻用さ
れている蛍光物質のフルオレセイン・イソチオシアーネ
ート（Fluorescein Isothiocianate、ＦＩＴＣ）やフィ
コエリスリン（Phycoerythrin ）よりも長波長領域の６
００ナノメートル（ｎｍ）以上に最大蛍光波長が存在す
る。このため、現在広く使用され容易に入手できる他の
表面抗原を解析する蛍光標識モノクローナル抗体を用い
た２重染色あるいは３重染色も可能であり、その感度が
高いことを合わせると、これらは、非常に有用な蛍光色
素と言える。更に、本発明者らの研究によれば、後述の
実施例に示すように、当該蛍光標識モノクローナル抗体
を用いた３重染色法を用いて、イムノフェノタイプの違
いや分化段階を加味したより詳細なレセプター解析が可
能であることが分かった。

【００３６】本発明者らの知見によれば、このような効
果は、励起波長と蛍光波長の差、すなわち、最大励起波
長と最大蛍光波長の差が少なくとも５０ナノメータ（ｎ
ｍ）以上、好ましくは１００ナノメータ（ｎｍ）以上、
のエネルギー移行型蛍光物質をアビジンに結合した蛍光
物質標識アビジンを使用した場合に得られる特有のもの
である。従って、本発明において使用する蛍光物質は、
上記ＲＥＤ６１３、ＲＥＤ６７０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ
社の蛍光色素の商品名）に限らず、前記条件を満たすも
の、すなわち、当該ＲＥＤ６１３、ＲＥＤ６７０と同効
のものであれば、他の蛍光物質を使用することも適宜可
能である。かかる知見は、本発明方法の前記構成との組
み合わせにおいて、各種蛍光物質の有効性を実際に検証
してはじめて知り得るものであり、当該条件を満たさな
い場合は、所期の目的を達成することはできない。

【００３７】

【実施例】以下、実施例を示して本発明を具体的に説明
するが、本発明は当該実施例によって何ら限定されるも
のではない。 実施例１ Ｇ−ＣＳＦに関する実施例 （１）実験材料 binding assay 及びフローサイトメトリーに使用した被
検細胞は、組織球性リンパ腫（histiocytic lymphoma）
由来ヒト細胞株であるU-937 、正常末梢血液、マウス骨
髄細胞系（murine myeloid cell line）ＦＤＣ−Ｐ１に
遺伝子工学的にヒトＧ−ＣＳＦレセプターを発現させた
細胞株FD11-10 〔ＥＭＢＯ Ｊ．，１０，２８５５−２
８６５（１９９１）〕、急性白血病（ＡＬＬ及びＡＭ
Ｌ）患者の骨髄から得られた芽球である。なお、bindin
g assay 及びフローサイトメトリーに用いたＧ−ＣＳＦ
（中外製薬社製) は、既に述べられているようにチャイ
ニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）で産生させ、
Nomuraらの方法により精製されたＯ結合型糖鎖を有する
遺伝子組換え型ヒトＧ−ＣＳＦ（rhＧ−ＣＳＦ）〔ＥＭ
ＢＯ Ｊ．，５，８７１−８７６（１９８６）、及び
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１１４３２−１１
４３５（１９９０）〕を使用した。

【００３８】（２）細胞の調製 ヘパリン採血したヒト末梢血に、溶血液（０．８２６％
ＮＨ₄ Ｃｌ，０．１％ ＫＨＣＯ₃ ，０．００３７％
ＥＤＴＡ・２Ｎａ，ｐＨ７．３）を加え、３７℃で５
から１０分間静置した。溶血を確認後、細胞を、２％ウ
シ胎児血清（ＦＣＳ），０．１％ アジ化ナトリウム
（Ｎａ₃ Ｎ）を含むＰＢＳ（phosphate buffered salin
e；０．８％ ＮａＣｌ，０．２９％ Ｎａ₂ ＨＰＯ₄
・１２Ｈ₂Ｏ，０．０２％ ＫＨ₂ ＰＯ₄ ）にて２回洗
浄した。フローサイトメトリーにおいては、細胞を２％
ＦＣＳ、０．１％ アジ化ナトリウムを含むＰＢＳ（以
下ＰＦＮ）に、顆粒球濃度４×１０⁶ cells/mlとなるよ
うに懸濁した。radioisotopic binding assay において
は、細胞はリンフォプレップ（Ｎｙｃｏｍｅｄ社、ノル
ウェー）に重層し、室温で３０分間１５００ｒｐｍにて
遠心した。pelletから得られた顆粒球は、ＰＢＳにて２
回洗浄後、ＲＰＭＩ−１６４０（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社
製）に、４×１０⁷ cells/mlで懸濁した。

【００３９】患者から得られた骨髄細胞は、ＲＰＭＩ−
１６４０に懸濁した。細胞懸濁液はリンフォプレップに
重層後、室温にて１５００ｒｐｍ３０分間遠心した。芽
球の多く含まれる中間層を採取した。フローサイトメト
リーでは細胞を２回洗浄後、ＰＦＮに４×１０⁶ cells/
mlで懸濁した。binding assay においては、細胞を２回
洗浄後、ＲＰＭＩ−１６４０に４×１０⁷ cells/mlで懸
濁した。

【００４０】（３）Ｇ−ＣＳＦレセプターのbinding as
say 上記の４×１０⁷ cells/mlに調製した細胞懸濁液を用い
た。〔 ³Ｈ〕rhＧ−ＣＳＦは、10％ウシ胎児血清（feta
l calf serum）（ＦＣＳ：Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）を
含むＲＰＭＩ−１６４０で倍々希釈して６濃度を調製
し、それぞれの放射線を計測した（最高濃度は約５×１
０⁶ dpm/ml）。マイクロ遠心チューブに細胞懸濁液50μ
l 、〔 ³Ｈ〕rhＧ−ＣＳＦ100 μl 及び10％ＦＣＳを含
むＲＰＭＩ−１６４０ 50μl を入れ、４℃、２時間反
応させた。

【００４１】反応液の150 μl をあらかじめｎ−ブチル
フタレート（n-butylphtalate) 200μl を入れたマイク
ロ遠心チューブに重層して、12000rpm、５分間、４℃に
て遠心後、上清を吸引除去した。細胞をphosphate buff
ered saline （ＰＢＳ：0.8％ＮａＣｌ，0.29％Ｎａ₂
ＨＰＯ₄ ・12Ｈ₂ Ｏ，0.02％ＫＨ₂ ＰＯ₄ ）で懸濁して
2ml のクリアゾル（ナカライテスク社製）と混合後、液
体シンチレーションカウンターで放射能を測定した。

【００４２】なお、10％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ−１６４
０の代わりに、〔 ³Ｈ〕rhＧ−ＣＳＦの１００倍の濃度
となるように調整したrhＧ−ＣＳＦ溶液50μl を入れ、
同様に操作して測定した放射能を〔 ³Ｈ〕rhＧ−ＣＳＦ
の細胞への非特異的吸着量とし、これを差し引いた値を
特異的結合とした。スキャッチャード(Scatchard) 解析
は、常法〔Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，５１，
６６０−６７２（１９４９）〕により、〔 ³Ｈ〕rhＧ−
ＣＳＦの総添加量から特異的結合量(Bind)を引いた遊離
量(Free)を求め、Bind/Free と、Bindとの関係からスキ
ャッチャードプロット(Scatchard plot)を作成し、〔 ³
Ｈ〕rhＧ−ＣＳＦ比放射能0.295 ×10^-18mol/dpmから細
胞１個当りの結合数を求めた。

【００４３】（４）rhＧ−ＣＳＦのビオチン化 rhＧ−ＣＳＦのビオチン標識は、ビオチン標識キット
（ＡＭＥＲＩＣＡＮ ＱＵＡＬＥＸ社製）を使用した。
まずrhＧ−ＣＳＦ0.55ml(1.6mg/ml)にＰＢＳを0.05ml加
えた。そこへ精製水0.05mlに溶解したビオチン(biothi
n)0.5mgを加え、室温で１時間振とうした。反応液をＰ
ＢＳで平衡化したSephadex Ｇ２５カラム（ＰＤ−１
０）に添加後、ＰＢＳで溶出し、0.5ml ずつ分画分取し
た。

【００４４】得られた各分画 0.01 mlにホウ酸バッファ
ー（ｐＨ8.0 、0.5ml ）を加えて希釈し、この溶液をチ
ューブにコーティング後、ウシ血清アルブミン（bovin
serum albmin、ＢＳＡ）でブロッキング(blocking)し、
ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ho
rseradish peroxydase）を反応させ、horseradish pero
xydase活性を検出して、ビオチン標識rhＧ−ＣＳＦ（ｂ
−Ｇ−ＣＳＦ）を含む分画を確認した。分画No.11-13を
プールし、エンザイムイムノアッセイ(enzymeimmunoass
ay 、ＥＩＡ）でrhＧ−ＣＳＦ濃度を測定した。

【００４５】（５）Ｇ−ＣＳＦレセプターのフローサイ
トメトリーによる解析 細胞４×１０⁶ cells/ml 25 μl にＰＦＮ10μl 及びｂ
−Ｇ−ＣＳＦ10μl を加え、４℃１時間反応させた。ｂ
−Ｇ−ＣＳＦは、種々の濃度で使用した。ＰＦＮで２回
洗浄後、ストレプトアビジン結合phycoerythrin(ＳＡ−
ＰＥ；ＢＩＯＭＥＤ社製）10μg/ml、10μl 、又は、ス
トレプトアビジン結合ＲＥＤ６１３（ＳＡ−ＲＥＤ６１
３；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）250 μg/ml、４μl を加
え、４℃で２０分反応させた。ＰＦＮで２回洗浄後、Ｐ
ＢＳ0.2ml に懸濁した。なお、ｂ−Ｇ−ＣＳＦ濃度の10
0 倍の非標識rhＧ−ＣＳＦをＰＦＮの代わりに加え、同
様に操作したものを対照とした。また、ヒト顆粒球を用
いて一定濃度のｂ−Ｇ−ＣＳＦ(200ng/ml)を加え、ＰＦ
Ｎの代わりに種々の濃度の非標識rhＧ−ＣＳＦ(20ng/ml
-200μg /ml)を加え、同様に操作することによりＧ−Ｃ
ＳＦレセプターへの特異的結合の検討を行った。測定は
主としてＥＰＩＣＳ Profile II (Coulter C.C.) にて
行った。

【００４６】蛍光色素の励起は488nm アルゴンイオンレ
ーザーを使用した。Phycoerythrin（ＰＥ）の蛍光は、6
00nm 未満の蛍光を通過させる600nm のshort pass dich
roic mirrorを通過し、575nm のband pass filterで捕
らえられたものを測定した。ＲＥＤ613 の蛍光は、shor
t pass dichroic mirrorで90°に屈折された600nm 以上
のものを測定した。解析は、ＥＰＩＣＳ cytologic sof
t ware version 2.0 (Coulter C.C.) のＫ−Ｓ解析（Ko
lmogorov-Smirnov statistics 、Ｋ−Ｓ statistics ）
〔Ｊ．Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．ａｎｄ Ｃｙｔｏｃｈｅ
ｍ．，２５，９３５−９４１（１９７７）〕を利用し、
図１に示したように２つのヒストグラムの累積相対度数
分布曲線間の最大差（maximum difference）の値をＤ値
（Ｄ value）として算出した。

【００４７】なお、図１において、細胞総数ｎ１、ｎ２
からなる２つのヒストグラム〔Ｘ軸；蛍光強度（Fluore
scence Intensity）、Ｙ軸；細胞数の相対度数〕を f_n1
(x)、 f_n2(x) で表される関数とする。それぞれの累積
度数分布関数を F_n1(x) 、 F_n2(x) としたとき、Ｄ値は
F_n1(x) と F_n2(x) 間の最大絶対差（maximum absolute
difference ）である。Ｄ値は、非標識Ｇ−ＣＳＦを加
えたサンプル（対照）と、これを加えなかったサンプル
より得られたヒストグラムを比較することにより算出し
た。

【００４８】（６）解析結果 binding assay とフローサイトメトリー解析結果の比
較 スキャッチャード プロット（Scatcard plot ）の結果
を図６のＡに示した。すなわち、図６のＡに、〔 ³Ｈ〕
rhＧ−ＣＳＦを用いたbinding assay によるスキャッチ
ャード（Scatchard ）解析を示した。U-937 では373 si
tes/cell、ヒト顆粒球では1482 sites/cell 、FD11-10
では5106 sites/cell であった。また、同時にＳＡ−Ｐ
Ｅを用いて行ったフローサイトメトリーの結果を図６の
Ｂに示した。すなわち、図６のＢは、ｂ−Ｇ−ＣＳＦを
用いたフローサイトメトリーであり、グラフは、非特異
的結合のコントロールとしてｂ−Ｇ−ＣＳＦの100 倍濃
度の未標識rhＧ−ＣＳＦを加えたもの（−）と加えなか
ったもの（─）を示す。これらのＤ値はそれぞれ0.32、
0.70、 0.72 であった（表１）。これらの結果から、細
胞のレセプターが多いとフローサイトメトリーにおける
蛍光強度のシフトが増加すること、つまりはＤ値が増加
することが示唆された。

【００４９】ｂ−Ｇ−ＣＳＦを用いたフローサイトメ
トリーによるＧ−ＣＳＦレセプターの検出

【００５０】蛍光色素の種類による蛍光強度の差の検討
をヒト顆粒球を用いて行った。すなわち、ヒト顆粒球
（４×１０⁶ cells/ml)25 μl にＰＦＮ10μl とｂ−Ｇ
−ＣＳＦ(200ng/ml)10μl を加えてインキュベート（in
cubate）し、ＳＡ−ＲＥＤ６１３あるいはＳＡ−ＰＥで
染色し、フローサイトメトリーにより解析した。その結
果を図３に示すが、明らかにＳＡ−ＲＥＤ６１３の方が
対照に対して強い蛍光強度を示した（図３）。なお、図
中、ＡはＳＡ−ＲＥＤ６１３、ＢはＳＡ−ＰＥを使用し
た結果である。グラフは、ｂ−Ｇ−ＣＳＦとともにＰＦ
Ｎの代わりにｂ−Ｇ−ＣＳＦの100 倍濃度の未標識rhＧ
−ＣＳＦ各10μl を加えたもの（−）と加えなかったも
の（─）を示す。グラフの右下に示してあるＤ値は、Ｋ
−Ｓ解析によりＡ、Ｂ各（−）と（─）のヒストグラム
を比較して算出した値である。

【００５１】ｂ−Ｇ−ＣＳＦ及びＳＡ−ＲＥＤ６１３
を用いたフローサイトメトリーによるＧ−ＣＳＦレセプ
ターの検出 次に、各レベルに調製したｂ−Ｇ−ＣＳＦの使用濃度と
Ｄ値との関係をヒト顆粒球を用いて検討した。図４に各
ｂ−Ｇ−ＣＳＦ濃度とフローサイトメトリーの解析結果
から得られたＤ値との関係を示した。すなわち、図４に
おいて示された各濃度のｂ−Ｇ−ＣＳＦとＰＦＮ10μl
をヒト顆粒球（４×１０⁶ cells/ml)25μl に加えてイ
ンキュベート（incubate）し、ＳＡ−ＲＥＤ６１３で染
色後、フローサイトメトリーにより解析した。各ｂ−Ｇ
−ＣＳＦの100 倍濃度の未標識rhＧ−ＣＳＦ10μl をＰ
ＦＮの代わりに加え、同様に操作したものを非特異的蛍
光の対照とし、特異的蛍光によるヒストグラムのシフト
をＫ−Ｓ解析によるＤ値で表した。

【００５２】この結果、一定濃度以上のｂ−Ｇ−ＣＳＦ
を用いれば、一定のＤ値が得られることが分った。すな
わち、図４において、ｂ−Ｇ−ＣＳＦ濃度120ng/ml以上
ではＤ値は0.70となりプラトーとなっている。また、飽
和量以下のｂ−Ｇ−ＣＳＦを使用した場合、加えたｂ−
Ｇ−ＣＳＦ濃度とＤ値の間には正の相関があることが示
された。

【００５３】次に、一定量のｂ−Ｇ−ＣＳＦ（200ng/m
l、10μl ) に対し非標識rhＧ−ＣＳＦの添加濃度とＤ
値との関係をフローサイトメトリーにより解析した（図
５）。すなわち、ｂ−Ｇ−ＣＳＦ（200ng/ml) と非標識
rhＧ−ＣＳＦ各10μl をヒト顆粒球（４×１０⁶ cells/
ml)25 μl に加えてインキュベート（incubate）し、Ｓ
Ａ−ＲＥＤ６１３で染色し、フローサイトメトリーによ
り解析した。図５に示すように、非標識ｂ−Ｇ−ＣＳＦ
の濃度を高めることによりこの濃度の対数に対し直線的
にＤ値の減少を認めた。これによりｂ−Ｇ−ＣＳＦと非
標識rhＧ−ＣＳＦは、Ｇ−ＣＳＦレセプターに競合的に
結合することが確認された。従って、ｂ−Ｇ−ＣＳＦと
ＳＡ−ＲＥＤ６１３を用いる本測定法はＧ−ＣＳＦレセ
プターに特異的であることが示唆された。

【００５４】以上の解析結果から明らかなように、フロ
ーサイトメトリーの結果はスキャッチャード（Scatchar
d ）解析の結果を反映していることが示唆された。ま
た、フローサイトメトリーで得られたヒストグラムをそ
れぞれの対照ヒストグラムとＫ−Ｓ解析により比較する
ことによって算出されたＤ値は、ｂ−Ｇ−ＣＳＦのレセ
プターへの特異的結合を介して結合させた蛍光物質によ
る蛍光強度の増加を反映していることが示された。

【００５５】（７）３重染色によるレセプターの解析 蛍光標識モノクローナル抗体ＣＤ３３及びＣＤ３４と上
記ＳＡ−ＲＥＤ６７０を使用し、３重染色による被検細
胞のＧ−ＣＳＦレセプターの解析を行った。表２に示し
たヒト顆粒球、リンパ球、正常骨髄細胞、ＡＭＬ患者由
来末梢血（ＡＭＬ）の各被検細胞（４×１０⁶ cells/m
l, ２５μl ）をＰＦＮバッファー１０μl とｂ−Ｇ−
ＣＳＦ（２００ng/ml ）１０μl 中で４℃にて１時間イ
ンキュベートした。非特異的蛍光の対照として、ＰＦＮ
バッファーの代わりに、非標識rhＧ−ＣＳＦの１００倍
過剰量の存在下にｂ−Ｇ−ＣＳＦとインキュベートし
た。この場合、全サンプルにおいて全量を４５μl とし
た。各細胞は、まず、ＳＡ−ＲＥＤ６７０とインキュベ
ートした後、各蛍光標識モノクローナル抗体と同時にイ
ンキュベートした。すなわち、各細胞をＰＦＮバッファ
ーで２回洗浄後、細胞をストレプトアビジンＲＥＤ６７
０（ＳＡ−ＲＥＤ６７０；Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ社製）１
μg と４℃にて２０分間インキュベートし、次いで、２
０μl のＦＩＴＣ標識抗−Ｌｅｕ−Ｍ９（ＣＤ３３）及
び２０μl のＰＥ標識ＨＰＣＡ−２（ＣＤ３４）（Ｂｅ
ｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製）を加え、４℃にて
４０分間インキュベートした。その後、各細胞をＰＦＮ
バッファーで２回洗浄し、フローサイトメトリーで解析
した。

【００５６】蛍光強度の測定はＥＰＩＣＳ Profile II
(Coulter C. C.) にて行った。蛍光は４８８nm波長によ
って励起した。フィルターは５５０nm dichroic long p
ass,６００nm dichroic short pass，６３０nm long pa
ssを使用した。

【００５７】解析結果を表３に示す。表３のＣＤ３３
（ＨＰＣＡ−２）、ＣＤ３４（Ｌｅｕ−Ｍ９）及びＤ値
の欄に示されるように、従来、各被検細胞の表面抗原を
認識する蛍光標識モノクローナル抗体として使用されて
いるＣＤ３３、ＣＤ３４による表面抗原の定性的解析結
果（表面抗原の有無）に加え、Ｄ値を測定し、本発明の
レセプター定量方法を併用することにより、当該Ｄ値か
ら各細胞表面のＧ−ＣＳＦレセプターの数を定量するこ
とが可能である。この場合、表３に示される如く、例え
ば、正常な骨髄細胞の場合について言えば、ＣＤ３４⁺
・ＣＤ３４^- 、ＣＤ３４⁺ ・ＣＤ３３⁺ 、ＣＤ３４^- ・
ＣＤ３３⁺ の各イムノフェノタイプでゲートをかけて、
各細胞の系統、分化段階のレセプターの解析が可能にな
ることから、不均一な細胞の集団を含む被検細胞であっ
ても少量の細胞数（血液量として数ml程度）でレセプタ
ー解析が可能である。なお、本発明によれば、上記ＣＤ
３３、ＣＤ３４に限らず、他の蛍光標識モノクローナル
抗体を利用した２重染色法、３重染色法によるレセプタ
ー解析が可能であることは言うまでもない。

【００５８】

【表３】

【００５９】実施例２ ＥＰＯに関する実施例 （１）実験材料 binding assay 及びフローサイトメトリーに使用した被
検細胞は、巨核芽球性白血病由来ヒト細胞株であるUT-7
〔Ｂｌｏｏｄ，８０，３０６０−３０６９（１９９
２）〕よりエリスロポエチン（ＥＰＯ）依存性細胞株と
して樹立された亜株UT-7/EPO〔Ｂｌｏｏｄ， ８２，
４５６−４６４（１９９３）、及びＪ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈ
ｅｍ．，２６９，１９６３３−１９６３８（１９９
４）〕である。なお、binding assay に用いた¹²⁵I-EPO
はアマシャム社より入手し、それ以外は中外製薬社製re
combinant human EPO (rh-EPO)を使用した。

【００６０】（２）EPO レセプターのbinding assay UT-7/EPO細胞をEPO を含まないIMDM培地（１０％ FCS含
有）で２４時間培養し、２％ BSA, ０．２％ NaN₃ 含有
IMDM培地よりなるbinding assay 用培地（BM)で２回洗
浄後、５×１０⁷ cells/mlに調製した細胞懸濁液を用い
た。マイクロ遠心チューブに細胞懸濁液を２０μl 加
え、濃度の異なる¹²⁵I-EPOと共に１５℃、３時間反応さ
せた。反応液の全量をあらかじめ１０％ショ糖溶液２０
０μl を入れたマイクロ遠心チューブに重層して５００
０Ｇ、２分間、４℃にて遠心後、チューブを−８０℃で
凍結した。凍結後、沈降した細胞部分を切断し、ガンマ
カウンターで放射能を測定した。なお、添加した¹²⁵I-E
POの４００倍の濃度になるように非標識EPO を入れ、同
様に操作して測定した放射能を¹²⁵I-EPOの細胞への非特
異的吸着量として、これを差し引いた値を特異的結合と
した。Scatchard 解析により細胞１個当りの結合部位数
を求めた。

【００６１】（３）rh-EPOのビオチン化 脱塩・凍結乾燥したEPO を０．１M 酢酸緩衝液（ｐＨ
５．５）で１mg/ml になるように溶解し、Sodium meta-
periodate 溶液（シグマ社製）を最終濃度１mMで加え、
暗所・０℃で３０分間反応させた。Fast Desalting col
umn （ファルマシア社製）でSodium meta-periodate を
除き、得られたEPO 画分に対して１／１０量の５mM Bio
tin-LC-Hydrazide溶液（ピアス社製）（０．１M 酢酸緩
衝液に溶解）を加えた。室温で１時間反応した後、０．
１M Tris-HCl緩衝液（ｐＨ７．５）で中和し、未反応の
Biotin-LC-Hydrazide をセントリプレップ１０（アミコ
ン社製）で除去した。セントリプレップ１０で０．０２
％ Tween２０を含むPBS に溶媒置換し、同溶媒で平衡化
したSuperdex 75 column（ファルマシア社製）でビオチ
ン標識EPO （b-EPO ）を精製した。得られたb-EPO をSD
S-PAGE後、PVDF膜に転写し、ストレプトアビジン- 西洋
ワサビペルオキシダーゼを用いて、ビオチン標識を確認
した。また、定量はEIA で行い、EPO 依存性細胞株によ
り、b-EPO は非標識EPO と同等の比活性を有することを
確認した。

【００６２】（４）EPO レセプターのフローサイトメト
リーによる解析 UT-7/EPO細胞をEPO 非存在下に２４時間培養し、Ficoll
-hypaque density gradient 法にて細胞を分離、PBS で
２回洗浄した後、PFN にて５×１０⁶ cells/mlに調製し
た。細胞懸濁液５０μl にPFN ５μl を加え、３７℃で
１時間反応させた。次いで、種々の濃度のb-EPO を５μ
l 加え、更に３７℃で１時間反応させた。PFN にて細胞
を２回洗浄後、SA-RED 670 4μl を加え、４℃で３０分
反応させた。PFN で細胞を２回洗浄後、500 μl のPFN
に懸濁し、フローサイトメトリーにより解析した。な
お、過剰量の非標識EPO を加え、同様に操作したものを
対照として用いた。また、UT-7/EPO細胞に一定濃度のb-
EPO を加え、種々の濃度の非標識EPO を添加することに
よりEPO レセプターへの特異的結合の検討を行った。

【００６３】（５）解析結果 １）binding assay とフローサイトメトリーによるEPO
レセプターの検出スキャッチャード プロットの結果を
図７のＡに示した。すなわち、¹²⁵I-EPOにより検出され
たUT-7/EPOのEPO 結合部位数は約４００００sites/cell
であった。また、SA-RED 670を用いて行ったフローサイ
トメトリーの結果を図７のＢに示した。すなわち、図７
のＢは、b-EPO を用いたフローサイトメトリーであり、
グラフは、染色していないコントロール（──）に対し
て、非特異的結合のコントロールとしてb-EPO の過剰量
の非標識EPO を加えたもの（───）と加えなかったも
の（━━━）を示す。この結果から、b-EPO の添加によ
る蛍光強度の増加が明らかであり、フローサイトメトリ
ーによってもEPO レセプターが検出できることが示唆さ
れた。

【００６４】２）b-EPO 及びSA-RED 670を用いたフロー
サイトメトリーによるEPO レセプターの検出 b-EPO の使用濃度とＤ値の関係を検討した。図８に各b-
EPO 濃度とフローサイトメトリーの解析結果から得られ
たＤ値との関係を示した。すなわち、図８において示さ
れた各濃度のb-EPO とUT-7/EPO細胞をインキュベート
し、SA-RED 670で染色後、フローサイトメトリーにより
解析した。過剰量の非標識EPO を加え、同様に操作した
ものを非特異的蛍光の対象とし、特異的蛍光によるヒス
トグラムのシフトをK-S 解析によるＤ値で表した。この
結果、一定濃度以上のb-EPO を用いれば、一定のＤ値が
得られることが分かった。また、飽和量以下のb-EPO を
使用した場合、加えたb-EPO 濃度とＤ値の間には正の相
関があることが示された。

【００６５】次に、一定量のb-EPO に対し、非標識EPO
の添加濃度とＤ値との関係をフローサイトメトリーによ
り解析した（図９）。すなわち、b-EPO （２．５ng/ml
）と図９に示した各濃度の非標識EPO 各１０μl をUT-
7/EPO細胞（５×１０⁶ cells/ml）５０μl に加えてイ
ンキュベートし、SA-RED 670で染色し、フローサイトメ
トリーにより解析した。図９に示すように、非標識EPO
の濃度を高めることによりこの濃度の対数に対し直線的
にＤ値の減少を認めた。これによりb-EPO と非標識EPO
はEPO レセプターに競合的に結合することが確認され
た。従って、b-EPOとSA-RED 670を用いる本測定法はEPO
レセプターに特異的であることが示唆された。

【００６６】なお、上記方法と同様にして、インターロ
イキン−１、インターロイキン−２、インターロイキン
−３、インターロイキン−６、ＧＭ−ＣＳＦ（granuloc
yte/macrophage colony-stimulating factor )を対象と
して、試験した結果、これらのサイトカインについても
同様に実施し得ることが分かった。

【００６７】

【発明の効果】以上詳述したとおり、本発明は、従来、
定性的な解析にとどまっていたサイトカインレセプター
の解析方法を改善し、その定量的解析を可能とするフロ
ーサイトメトリーによるＧ−ＣＳＦレセプターを含む各
種サイトカインレセプターの定量方法に関するものであ
り、本発明によれば、２×１０⁵ 個レベルの少量の細胞
数（血液量として数ml程度）で、患者側への負担をかけ
ることなく、迅速、簡便に被検細胞表面上のサイトカイ
ンレセプターの数を定量することができる。

【００６８】また、比較的レセプター数が少ない急性骨
髄性白血病（ＡＭＬ）患者等の芽球についてもフローサ
イトメトリーにより高感度に検出することができること
から、ＡＭＬの診断における使用、白血病患者にサイト
カインを投与する際の事前検査等に利用することができ
る。

【００６９】更に、本発明方法は、他の蛍光標識モノク
ローナル抗体と組み合わせた２重染色法、３重染色法等
の多重蛍光染色法によるフローサイトメトリーの解析に
より、被検細胞の定性的解析と当該細胞のサイトカイン
レセプター数の定量とを同時的に行うことが可能であ
り、かかる方法によってイムノフェノタイプでゲートを
かけた形で血液細胞のある系統、分化段階のレセプター
の解析を高精度、高効率に行うことができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】Ｋ−Ｓ解析によるＤ値の算出方法を示す。

【図２】ＳＡ−ＰＥを用いたときのヒト顆粒球における
ｂ−Ｇ−ＣＳＦ（biotin-labeled Ｇ−ＣＳＦ) 濃度と
Ｄ値（Ｄ value）の関係を示す。

【図３】ＳＡ−ＲＥＤ６１３とＳＡ−ＰＥを用いたとき
のヒト顆粒球に結合したｂ−Ｇ−ＣＳＦのフローサイト
メトリーによる検出感度の比較を示す。

【図４】ＳＡ−ＲＥＤ６１３を用いたときのヒト顆粒球
におけるｂ−Ｇ−ＣＳＦ（biotin-labeled Ｇ−ＣＳ
Ｆ) 濃度とＤ値（Ｄ value）の関係を示す。

【図５】非標識rhＧ−ＣＳＦによるｂ−Ｇ−ＣＳＦのヒ
ト顆粒球への特異的結合抑制を示す。

【図６】Ｕ９３７、ヒト顆粒球、ＦＤ11-10 のＧ−ＣＳ
Ｆレセプターの検出を示す。図中、Ａは、〔 ³Ｈ〕rhＧ
−ＣＳＦを用いたbinding assay による特異的結合のス
キャッチャード（Scatchard ）解析を示す。また、図
中、Ｂは、ｂ−Ｇ−ＣＳＦとＳＡ−ＰＥを用いたフロー
サイトメトリーを示す。

【図７】図中、Ａは、¹²⁵I-EPOを用いたbinding assay
によるスキャッチャード（Scatchard ）プロットを示
す。また、Ｂは、ＳＡ−ＲＥＤ６７０及びｂ−ＥＰＯを
用いたときのフローサイトメトリーを示す。

【図８】ＳＡ−ＲＥＤ６７０を用いたときのｂ−ＥＰＯ
濃度とＤ値（Ｄ value）の関係を示す。

【図９】非標識ＥＰＯによるｂ−ＥＰＯの結合阻害を、
添加した非標識ＥＰＯ濃度とＤ値（Ｄ value）の関係で
示す。

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/53 G01N 33/536 G01N 33/58 ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の工程、 被検細胞を含む検体に被検対象のレセプターに対応す
   るビオチン標識サイトカインを加えて反応させる、 励起波長と蛍光波長の差が少なくとも５０ナノメータ
   ー（ｎｍ）以上の蛍光物質をアビジンに結合した蛍光物
   質標識アビジンを添加して反応させ、未反応物質を除去
   した後、フローサイトメトリーにより蛍光強度（蛍光強
   度Ａ）を測定する、 一方、被検対照として、被検細胞を含む検体に上記ビ
   オチン標識サイトカインと大過剰量の非標識サイトカイ
   ン及び上記蛍光物質標識アビジンを添加し反応させ、未
   反応蛍光物質を除去した後、フローサイトメトリーによ
   り蛍光強度（蛍光強度Ｂ）を測定する、 対照との蛍光強度差〔蛍光強度Ａ−蛍光強度Ｂ〕（Ｄ
   値）を求め、予めレセプター数とＤ値の関係に基づき作
   成した検量線から細胞表面上の該当サイトカインレセプ
   ター数を求める、を含むことを特徴とする細胞表面上の
   サイトカインレセプター数の定量方法。
2. 【請求項２】 サイトカインが、顆粒球コロニー刺激因
   子（Ｇ−ＣＳＦ）又はエリスロポエチン（ＥＰＯ）であ
   る請求項１記載のサイトカインレセプター数の定量方
   法。
3. 【請求項３】 蛍光物質が、エネルギー移行型蛍光色素
   である請求項１記載のサイトカインレセプター数の定量
   方法。
4. 【請求項４】 蛍光物質が、ＲＥＤ６１３、ＲＥＤ６７
   ０である請求項１記載のサイトカインレセプター数の定
   量方法。
5. 【請求項５】 請求項１の方法における蛍光物質と励起
   波長がほぼ同じで蛍光波長が異なる蛍光物質で標識した
   細胞表面抗原に対するモノクローナル抗体を組み合わせ
   た多重蛍光染色により、被検細胞の定性的解析と請求項
   １記載の方法に基づく当該細胞のサイトカインレセプタ
   ー数の定量とを同時的に行うことを特徴とする細胞の解
   析方法。