JP3222985B2 - Biosensor - Google Patents

Biosensor

Info

Publication number
JP3222985B2
JP3222985B2 JP12495093A JP12495093A JP3222985B2 JP 3222985 B2 JP3222985 B2 JP 3222985B2 JP 12495093 A JP12495093 A JP 12495093A JP 12495093 A JP12495093 A JP 12495093A JP 3222985 B2 JP3222985 B2 JP 3222985B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
reaction layer
enzyme
layer
biosensor
electron acceptor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP12495093A
Other languages
Japanese (ja)
Other versions
JPH0688805A (en
Inventor
万里子 宮原
里子 藤澤
俊彦 吉岡
史朗 南海
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Panasonic Corp
Panasonic Holdings Corp
Original Assignee
Panasonic Corp
Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Panasonic Corp, Matsushita Electric Industrial Co Ltd filed Critical Panasonic Corp
Priority to JP12495093A priority Critical patent/JP3222985B2/en
Publication of JPH0688805A publication Critical patent/JPH0688805A/en
Application granted granted Critical
Publication of JP3222985B2 publication Critical patent/JP3222985B2/en
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【0001】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、試料中のスクロースを
簡便に定量するためのバイオセンサに関する。
BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a biosensor for easily determining sucrose in a sample.

【0002】[0002]

【従来の技術】酵素を利用したセンシング技術は、その
高選択性と簡便性、迅速性から医療分析や食品分析等に
広く応用されている。糖濃度の分析にも屈折計や液体ク
ロマト法に代わり酵素センサが開発されており、固定化
酵素膜と過酸化水素電極を使用した酵素センサの例があ
る(K.Inoue, New Food Industry Vol. 28, No. 11,45
-48 (1986))。この酵素センサは、固定化する酵素の種
類を選択することにより種々の基質の測定が可能である
が、ここではスクロース測定について述べる。酵素セン
サ部分は、過酸化水素電極とこの電極上に高分子膜で挟
んで設けた固定化酵素膜を主たる構成としている。な
お、酵素にはサッカラーゼ、変旋光酵素およびグルコー
スオキシダーゼを用いている。測定系は、前記酵素セン
サを有するサンプルチャンバーを温度制御ブロック内に
具備し、サンプルの希釈、攪拌、温度制御、酸素補給、
糖検出などは自動的にプログラムにより制御されるシス
テムになっている。前記サンプルチェンバー内にスクロ
ースを含む試料液を注入すると、試料液と固定化された
各酵素が反応し、過酸化水素とグルコノラクトンが生成
するから、過酸化水素電極の白金陽極上で過酸化水素が
電気化学的に酸化される際の電流値からスクロース濃度
を求めることができる。
2. Description of the Related Art Sensing technology using enzymes has been widely applied to medical analysis, food analysis, and the like because of its high selectivity, simplicity, and rapidity. For the analysis of sugar concentration, enzyme sensors have been developed instead of refractometers and liquid chromatography, and there is an example of an enzyme sensor using an immobilized enzyme membrane and a hydrogen peroxide electrode (K. Inoue, New Food Industry Vol. 28, No. 11, 45
-48 (1986)). This enzyme sensor can measure various substrates by selecting the type of enzyme to be immobilized. Here, sucrose measurement will be described. The enzyme sensor part has a hydrogen peroxide electrode and an immobilized enzyme film provided on the electrode with a polymer film interposed therebetween. In addition, a saccharase, a rotatory photoenzyme, and glucose oxidase are used as enzymes. The measurement system includes a sample chamber having the enzyme sensor in a temperature control block, and dilutes the sample, agitates the sample, controls the temperature, supplements oxygen,
Sugar detection is a system that is automatically controlled by a program. When a sample solution containing sucrose is injected into the sample chamber, the sample solution and the immobilized enzymes react to generate hydrogen peroxide and gluconolactone. The sucrose concentration can be determined from the current value when hydrogen is electrochemically oxidized.

【0003】[0003]

【発明が解決しようとする課題】このような従来の酵素
センサでは、サンプルチェンバーに酵素センサが設けら
れているので、酵素センサ上で生成した過酸化水素があ
らゆる方向に拡散する。そこで、測定誤差を防ぐために
バッファー液中にカタラーゼ酵素を含ませることによ
り、逆流する過酸化水素を分解する必要がある。また、
溶液中で反応が行われるため、希釈、攪拌および温度制
御の必要があり、測定系は複雑で簡便性に欠けていた。
本発明は、上記課題を解決するもので、試料中のスクロ
ースを高精度で、迅速かつ簡便に定量することのできる
バイオセンサを提供することを目的とする。本発明は、
また、試料中のスクロ−スを高精度で定量できる信頼性
の高いバイオセンサを提供することを目的とする。
In such a conventional enzyme sensor, since the sample chamber is provided with the enzyme sensor, hydrogen peroxide generated on the enzyme sensor diffuses in all directions. Therefore, in order to prevent a measurement error, it is necessary to decompose the backflowing hydrogen peroxide by including a catalase enzyme in the buffer solution. Also,
Since the reaction is performed in a solution, dilution, stirring, and temperature control are required, and the measurement system is complicated and lacks simplicity.
An object of the present invention is to solve the above-mentioned problems, and to provide a biosensor capable of quantifying sucrose in a sample with high accuracy, quickly and easily. The present invention
Another object of the present invention is to provide a highly reliable biosensor capable of quantifying sucrose in a sample with high accuracy.

【0004】[0004]

【課題を解決するための手段】本発明のバイオセンサ
は、絶縁性の基板上に形成した測定極と対極を含む電極
系、および前記電極系に接触している反応層を具備し、
前記反応層が少なくとも電子受容体、酵素および親水性
高分子を含み、前記酵素としてインベルターゼおよびフ
ルクトースデヒドロゲナーゼからなる組合せを用いるこ
とを特徴とする。本発明のバイオセンサはまた、前記反
応層を、酵素を含む層と電子受容体を含む層との少なく
とも2つの層から構成する。
A biosensor according to the present invention includes an electrode system including a measurement electrode and a counter electrode formed on an insulating substrate, and a reaction layer in contact with the electrode system.
It said reaction layer is at least an electron acceptor, comprising the enzyme and the hydrophilic polymer, which comprises using a combination consisting of b Nberutaze and fructose dehydrogenase and the said enzyme. In the biosensor of the present invention, the reaction layer is composed of at least two layers: a layer containing an enzyme and a layer containing an electron acceptor.

【0005】さらに、本発明は、反応層における電子受
容体および酵素を親水性高分子に包含させ、または親水
性高分子により、電子受容体および酵素の少なくとも一
方と電極系とを分離する構成とする。また、本発明は、
前記反応層を少なくとも2層で構成したバイオセンサに
おいて、反応層を構成する2つの層の間に、酵素を溶解
しない溶媒に可溶な親水性高分子の膜を設けたことを特
徴とする。
Further, the present invention provides a structure in which the electron acceptor and the enzyme in the reaction layer are included in a hydrophilic polymer, or at least one of the electron acceptor and the enzyme is separated from the electrode system by the hydrophilic polymer. I do. Also, the present invention
In a biosensor comprising at least two reaction layers, a film of a hydrophilic polymer soluble in a solvent that does not dissolve the enzyme is provided between the two layers constituting the reaction layer.

【0006】ここにおいて、前記反応層におけるインベ
ルターゼおよびフルクトースデヒドロゲナーゼの担持量
は、それぞれ1U/cm2以上および5U/cm2以上で
あることが好ましい。本発明のバイオセンサは、前記反
応層に含有させて、または反応層とは分離しているが反
応層へ供給する試料液と接触する位置に、緩衝液の成分
となる試薬を保持している。
[0006] In this case, the supported amount of invertase and fructose dehydrogenase in the previous SL reaction layer is preferably each 1U / cm 2 or more and 5U / cm 2 or more. The biosensor of the present invention contains a reagent serving as a component of a buffer solution at a position contained in the reaction layer or separated from the reaction layer but in contact with a sample solution supplied to the reaction layer. .

【0007】[0007]

【作用】本発明のバイオセンサを用いて試料液中のスク
ロ−スを定量するには、試料液をセンサの電極系に接触
している反応層に供給する。この試料液により反応層の
親水性高分子は溶解し、反応層に含まれている酵素およ
び電子受容体と、試料とが接触する。そして、反応層が
酵素としてインベルターゼ、ムタロターゼおよびグルコ
ースオキシダーゼを担持しているセンサにおいては、試
料液中のスクロ−スはインベルターゼによって加水分解
され、フルクト−スとα−グルコ−スが生成する。α−
グルコ−スは、ムタロターゼの触媒作用によって速やか
に光学異性体であるβ−グルコ−スに変換され、このβ
−グルコ−スはグルコースオキシダーゼによる酸化を受
ける。グルコースオキシダーゼによる酸化反応で移動し
た電子によって電子受容体、例えばフェリシアン化カリ
ウムはフェロシアン化カリウムに還元される。
In order to determine the amount of sucrose in a sample solution using the biosensor of the present invention, the sample solution is supplied to a reaction layer in contact with the electrode system of the sensor. The hydrophilic polymer in the reaction layer is dissolved by this sample solution, and the enzyme and the electron acceptor contained in the reaction layer come into contact with the sample. In a sensor in which the reaction layer carries invertase, mutarotase, and glucose oxidase as enzymes, sucrose in the sample solution is hydrolyzed by invertase to produce fructose and α-glucose. α-
Glucose is rapidly converted to the optical isomer β-glucose by the catalytic action of mutarotase.
-Glucose is oxidized by glucose oxidase. An electron acceptor, for example, potassium ferricyanide, is reduced to potassium ferrocyanide by the electrons transferred in the oxidation reaction by glucose oxidase.

【0008】一方、反応層が酵素としてインベルターゼ
およびフルクトースデヒドロゲナーゼを担持しているバ
イオセンサにおいては、試料液中のスクロースはインベ
ルターゼによってフルクトースとα−グルコースに加水
分解され、フルクトースがフルクトースデヒドロゲナー
ゼによって酸化されて5−ケト−フルクトースが生成す
る。そして、フルクトースデヒドロゲナーゼによる酸化
反応で移動した電子によってフェリシアン化カリウムが
フェロシアン化カリウムに還元される。
On the other hand, in a biosensor in which a reaction layer carries invertase and fructose dehydrogenase as enzymes, sucrose in a sample solution is hydrolyzed to fructose and α-glucose by invertase, and fructose is oxidized by fructose dehydrogenase. 5-Keto-fructose is produced. Then, potassium ferricyanide is reduced to potassium ferrocyanide by the electrons transferred in the oxidation reaction by fructose dehydrogenase.

【0009】上記のように、グルコースオキシダーゼま
たはフルクトースデヒドロゲナーゼによる酸化反応によ
って生成した電子受容体の還元体は、次に対極を基準と
して測定極をアノ−ドとする電圧印加によって酸化され
るから、この酸化電流によってスクロ−スを定量するこ
とができる。また、反応層は、親水性高分子を含み、こ
の高分子が試料液に溶解して反応層に含まれる酵素や電
子受容体などと試料との反応の場を提供することにな
る。従って、この高分子は酵素や電子受容体などが電極
系表面に接触するのを実質的に阻止するところから、電
極系表面へのタンパク質の吸着や、電子受容体などの酸
化能力を有する物質の化学作用による電極系の特性変化
が起こり難くなる。その結果、高精度のセンサ応答を得
ることができる。従って、反応層における酵素や電子受
容体を親水性高分子に包含させる構成、あるいは、親水
性高分子により、電子受容体および酵素の少なくとも一
方を電極系から分離する構成にすることが好ましい。
As described above, the reduced form of the electron acceptor generated by the oxidation reaction with glucose oxidase or fructose dehydrogenase is then oxidized by applying a voltage with the measurement electrode as the anode with respect to the counter electrode. The sucrose can be determined by the oxidation current. Further, the reaction layer contains a hydrophilic polymer, and this polymer is dissolved in the sample solution to provide a site for a reaction between the sample and an enzyme or an electron acceptor contained in the reaction layer. Therefore, since this polymer substantially prevents enzymes and electron acceptors from coming into contact with the electrode system surface, it adsorbs proteins to the electrode system surface and removes oxidizing substances such as electron acceptors. It is difficult for the characteristics of the electrode system to change due to the chemical action. As a result, a highly accurate sensor response can be obtained. Accordingly, it is preferable to adopt a configuration in which the enzyme or the electron acceptor in the reaction layer is included in the hydrophilic polymer, or a configuration in which at least one of the electron acceptor and the enzyme is separated from the electrode system by the hydrophilic polymer.

【0010】さらに、反応層を少なくとも2つの層、す
なわち酵素を含む層と電子受容体を含む層とに分ける
と、酵素は電子受容体によって活性を損なわれることが
ないので、保存によっても性能の劣化しない高信頼性の
バイオセンサを得ることができる。また、上記の2つの
層の間に、酵素を溶解しない溶媒に可溶な親水性高分子
膜を設ければ、酵素と電子受容体との分離効果は、さら
に大きくなる。
Further, when the reaction layer is divided into at least two layers, that is, a layer containing an enzyme and a layer containing an electron acceptor, the activity of the enzyme is not impaired by the electron acceptor. A highly reliable biosensor that does not deteriorate can be obtained. If a hydrophilic polymer membrane soluble in a solvent that does not dissolve the enzyme is provided between the two layers, the effect of separating the enzyme and the electron acceptor is further enhanced.

【0011】なお、反応層は、単一層の構成にすると、
多層構造に比べて製造工程を簡素化することがきるとと
もに、試料液への溶解が容易であるため、センサ応答速
度が短縮され、応答値のばらつきを小さくすることがで
きる利点がある。また、試料液のpHの影響を緩和し、
安定したセンサ応答を得るには、反応層があらかじめ緩
衡液またはその成分となる試薬を含んでいることが好ま
しい。
When the reaction layer has a single layer structure,
Compared with the multilayer structure, the manufacturing process can be simplified, and since it can be easily dissolved in a sample solution, there is an advantage that the response speed of the sensor can be reduced and the variation of the response value can be reduced. In addition, the effect of the pH of the sample solution is reduced,
In order to obtain a stable sensor response, it is preferable that the reaction layer contains a buffer solution or a reagent which is a component thereof in advance.

【0012】緩衡液の成分となる試薬を反応層に含ませ
る代わりに、反応層とは分離して、かつ反応層へ供給す
る試料液と接触する位置に前記試薬を保持させることも
できる。この構成にすると、反応層中に緩衝液の成分と
なる試薬を含まないため、反応層表面が平滑に保たれ、
気泡生成による応答の低下や、ばらつきを抑える効果が
ある。また、緩衝液の成分となる試薬は、反応層の酵素
と隔離されるところから、試薬により酵素活性が阻害さ
れ保存信頼性が低下するなどの影響を考慮することなく
試薬の濃度を高めることもできる。試薬濃度を高めるこ
とにより緩衝作用力が強まり、試料液のpHの影響が緩
和され、安定したセンサ応答を得ることができる。緩衝
液の成分となる試薬としては、リン酸塩の他、リン酸塩
−クエン酸あるいは酢酸−酢酸塩などを使用することが
できる。次に、酵素の担持量については、量が少なくな
ると、反応速度が低下し測定に長時間を要するなどの影
響が出る。反応層における各酵素の好ましい担持量は、
インベルターゼおよびムタローゼが各々1U/cm2
上、グルコースオキシダーゼおよびフルクトースデヒド
ロゲナーゼが各々5U/cm2以上である。
Instead of including the reagent as a component of the buffer solution in the reaction layer, the reagent may be separated from the reaction layer and held at a position in contact with the sample solution supplied to the reaction layer. With this configuration, the reaction layer does not contain a reagent that is a component of the buffer solution, so that the surface of the reaction layer is kept smooth,
This has the effect of reducing the response and variation due to the generation of bubbles. In addition, since the reagent, which is a component of the buffer solution, is isolated from the enzyme in the reaction layer, it is possible to increase the concentration of the reagent without considering the influence of the enzyme inhibiting the enzyme activity and reducing the storage reliability. it can. By increasing the concentration of the reagent, the buffering action becomes stronger, the influence of the pH of the sample solution is reduced, and a stable sensor response can be obtained. As a reagent serving as a component of the buffer solution, phosphate-citric acid or acetic acid-acetate can be used in addition to phosphate. Next, as for the amount of the enzyme to be carried, when the amount is small, the reaction speed is reduced and the measurement takes a long time. The preferred loading of each enzyme in the reaction layer is
Invertase and mutarose are each 1 U / cm 2 or more, and glucose oxidase and fructose dehydrogenase are each 5 U / cm 2 or more.

【0013】本発明に用いる親水性高分子としては、実
施例のカルボキシメチルセルロースに限定されることは
なく、他のセルロース系、ビニルアルコール系、ビニル
ピロリドン系、ゼラチン系、アクリル酸塩系、デンプン
系、無水マレイン酸系、アクリルアミド系などを用いて
もよい。電子受容体としては、実施例のフェリシアン化
カリウム以外に、p−ベンゾキノン、フェロセンなども
使用できる。
The hydrophilic polymer used in the present invention is not limited to the carboxymethylcellulose of the examples, but may be other cellulose-based, vinyl alcohol-based, vinylpyrrolidone-based, gelatin-based, acrylate-based, starch-based. , Maleic anhydride, acrylamide, etc. may be used. As the electron acceptor, p-benzoquinone, ferrocene, and the like can be used in addition to the potassium ferricyanide in Examples.

【0014】上記のように、本発明のバイオセンサは、
電極系と接触している反応層に試料液を供給し、反応層
の酵素反応を電極系で測定するという簡易な操作でスク
ロースを定量することができる。また、酵素反応系を利
用しているところから、高い基質選択性を有するととも
に、酵素を含む反応層と電極系の組合せにより、高精度
を得ることができる。さらに、反応層の構成により、応
答速度を速くし、あるいは保存性を向上することができ
る。
As described above, the biosensor of the present invention comprises:
Sucrose can be quantified by a simple operation of supplying a sample solution to the reaction layer in contact with the electrode system and measuring the enzyme reaction of the reaction layer with the electrode system. In addition, since an enzyme reaction system is used, high precision can be obtained by a combination of a reaction layer containing an enzyme and an electrode system while having high substrate selectivity. Furthermore, depending on the configuration of the reaction layer, the response speed can be increased or the storage stability can be improved.

【0015】[0015]

【実施例】以下、本発明を実施例により説明する。 [実施例1]図1および図2は本発明のバイオセンサの
一実施例として作製したスクロースセンサを示す。以
下、このセンサの作製方法について説明する。まず、ポ
リエチレンテレフタレートからなる絶縁性の基板1に、
スクリーン印刷により銀ペ−ストを印刷しリ−ド2、3
を形成する。次に、樹脂バインダーを含む導電性カーボ
ンペーストを用いて電極系のうち測定極4を、続いて絶
縁性ペーストからなる絶縁層6をそれぞれ印刷により形
成する。絶縁層6は、測定極4の露出部分の面積(約1
mm2)を一定とし、かつリ−ド2、3を部分的に覆っ
ている。最後に測定極と同一のカーボンペーストを用い
て対極5を印刷により形成する。
The present invention will be described below with reference to examples. Embodiment 1 FIGS. 1 and 2 show a sucrose sensor manufactured as an embodiment of the biosensor of the present invention. Hereinafter, a method for manufacturing this sensor will be described. First, on an insulating substrate 1 made of polyethylene terephthalate,
Silver paste is printed by screen printing, and leads 2 and 3
To form Next, using a conductive carbon paste containing a resin binder, the measuring electrode 4 of the electrode system is formed by printing, and then the insulating layer 6 made of an insulating paste is formed by printing. The insulating layer 6 has an exposed area of the measuring electrode 4 (about 1 area).
mm 2 ) is constant and the leads 2 and 3 are partially covered. Finally, a counter electrode 5 is formed by printing using the same carbon paste as the measurement electrode.

【0016】次に、前記電極系上に親水性高分子として
カルボキシメチルセルロ−ス(以下CMCと略す)の
0.25wt%水溶液を滴下し、乾燥させてCMC層を
形成する。一方、酵素としてのインベルターゼ(EC
3.2.1.26:以下INVと略す)250U、ムタ
ロターゼ(EC5.1.3.3:以下MUTと略す)2
50Uおよびグルコースオキシダーゼ(EC1.1.
3.4:以下GODと略す)750Uと電子受容体とし
てのフェリシアン化カリウム33mgを、CMC0.2
5wt%を含むリン酸緩衝液(0.2M:K2HPO4
0.2M:KH2PO4;pH=7.4)1mlに溶解さ
せる。この混合溶液を前記CMC層上に4μl滴下し、
50℃の温風乾燥器中で10分間乾燥させて反応層7を
形成する。反応層は直径約3.6mmのほぼ円形であ
り、対極5の外周部に略一致している。
Next, a 0.25 wt% aqueous solution of carboxymethyl cellulose (hereinafter abbreviated as CMC) as a hydrophilic polymer is dropped on the electrode system and dried to form a CMC layer. On the other hand, invertase (EC
3.2.2.126: hereinafter abbreviated as INV) 250 U, mutarotase (EC 5.1.3.3: hereinafter abbreviated as MUT) 2
50U and glucose oxidase (EC 1.1.
3.4: hereinafter abbreviated as GOD) 750 U and 33 mg of potassium ferricyanide as an electron acceptor were added to CMC 0.2
Phosphate buffer containing 5 wt% (0.2 M: K 2 HPO 4
0.2 M: KH 2 PO 4 ; pH = 7.4) Dissolve in 1 ml. 4 μl of this mixed solution was dropped on the CMC layer,
The reaction layer 7 is formed by drying in a 50 ° C. hot air drier for 10 minutes. The reaction layer is substantially circular with a diameter of about 3.6 mm, and substantially coincides with the outer periphery of the counter electrode 5.

【0017】上記の反応層形成工程において、リン酸
塩、酵素および電子受容体の混合溶液をCMC層上に滴
下すると、親水性高分子からなるCMC層は一度溶解
し、その後の乾燥過程で酵素などと混合された形で反応
層7を形成する。しかし、攪拌等をともなわないため完
全な混合状態とはならず、電極系表面はCMCのみによ
って被覆された状態となる。すなわち、酵素および電子
受容体などが電極系表面に接触しないために、電極系表
面へのタンパク質の吸着や、フェリシアン化カリウム、
2PO4 -のような酸化能力を有する物質の化学的作用
による電極系の特性変化が起こり難くなる。その結果、
高精度なセンサ応答を有するバイオセンサを得ることが
できる。前記のようにして反応層7を形成した後、空気
孔11を有するカバー9および試料供給孔10を形成す
る溝を有するスペーサー8を基板1に接着してセンサが
組立てられる。カバーに透明な材料を用いると、反応層
の状態や試料液の導入状況を外部から極めて容易に確認
することができる。
In the above-mentioned reaction layer forming step, when a mixed solution of phosphate, enzyme and electron acceptor is dropped on the CMC layer, the CMC layer composed of the hydrophilic polymer is dissolved once and the enzyme is dried in the subsequent drying process. The reaction layer 7 is formed in a form mixed with the above. However, since no stirring or the like is involved, a completely mixed state is not obtained, and the surface of the electrode system is in a state covered with only CMC. That is, because the enzyme and the electron acceptor do not contact the electrode system surface, protein adsorption on the electrode system surface, potassium ferricyanide,
H 2 PO 4 - electrode system characteristics change due to chemical action of substances with oxidizing capability is less likely to occur, such as. as a result,
A biosensor having a highly accurate sensor response can be obtained. After the reaction layer 7 is formed as described above, the sensor 9 is assembled by bonding the cover 9 having the air holes 11 and the spacer 8 having the grooves forming the sample supply holes 10 to the substrate 1. When a transparent material is used for the cover, the state of the reaction layer and the state of introduction of the sample solution can be checked very easily from outside.

【0018】また、カバーを装着すると、カバーとスペ
ーサーによってできる空間部の毛細管現象によって、試
料液はセンサ先端の試料供給孔10に接触させるだけの
簡易操作で容易に反応層部分へ導入される。なお、試料
液を円滑に供給するためには、さらに必要に応じて、レ
シチンのトルエン溶液を試料供給部から反応層にかけて
の面上へ展開し乾燥するとよい。試料液の供給量は、カ
バーとスペーサーによって生じる空間容積に依存するた
め、あらかじめ定量する必要がない。さらに、測定中の
試料液の蒸発を最小限に抑えることができ、精度の高い
測定が可能となる。上記のように作製したスクロースセ
ンサに、試料液としてスクロース水溶液3μlを試料供
給孔10より供給すると、試料液は毛細管現象によって
速やかに空気孔11部分まで達し、電極系上の反応層が
溶解した。
When the cover is mounted, the sample liquid is easily introduced into the reaction layer by a simple operation of contacting the sample supply hole 10 at the tip of the sensor due to the capillary action in the space formed by the cover and the spacer. In order to smoothly supply the sample solution, it is preferable that a toluene solution of lecithin is spread on the surface from the sample supply section to the reaction layer and dried as needed. Since the supply amount of the sample liquid depends on the space volume generated by the cover and the spacer, it is not necessary to determine the amount in advance. Furthermore, evaporation of the sample liquid during measurement can be minimized, and highly accurate measurement can be performed. When 3 μl of a sucrose aqueous solution was supplied to the sucrose sensor prepared as described above as a sample liquid from the sample supply hole 10, the sample liquid quickly reached the air hole 11 portion by capillary action, and the reaction layer on the electrode system was dissolved.

【0019】試料液を供給してから一定時間後に、電極
系の対極5を基準にして測定極4にアノード方向へ+
0.5Vのパルス電圧を印加し、5秒後の電流値を測定
したところ、試料液中のスクロース濃度に比例した応答
電流値が得られた。反応層7が試料液に溶解すると、試
料液中のスクロースはINVによって加水分解されフル
クトースとα−グルコースが生成する。α−グルコース
は水溶液として放置すると光学異性体であるβ−グルコ
ースとの平衡に達するが、この平衡移動はMUTによっ
て触媒され、INVよって生成したα−グルコースは迅
速にβ−グルコースとなり、GODによる酸化を受け
る。GODによる酸化反応で移動した電子によってフェ
リシアン化カリウムがフェロシアン化カリウムに還元さ
れる。次に、前記のパルス電圧の印加により、生成した
フェロシアン化カリウムの酸化電流が得られ、この電流
値は基質であるスクロースの濃度に対応する。
After a certain time from the supply of the sample liquid, the measuring electrode 4 is moved in the direction of the anode with respect to the measuring electrode 4 with reference to the counter electrode 5 of the electrode system.
When a pulse voltage of 0.5 V was applied and the current value after 5 seconds was measured, a response current value proportional to the sucrose concentration in the sample solution was obtained. When the reaction layer 7 is dissolved in the sample solution, the sucrose in the sample solution is hydrolyzed by INV to produce fructose and α-glucose. α-Glucose reaches equilibrium with the optical isomer β-glucose when left as an aqueous solution, but this equilibrium transfer is catalyzed by MUT, and α-glucose produced by INV quickly becomes β-glucose, and is oxidized by GOD. Receive. Potassium ferricyanide is reduced to potassium ferrocyanide by the electrons transferred in the oxidation reaction by GOD. Next, by the application of the pulse voltage, an oxidation current of the generated potassium ferrocyanide is obtained, and this current value corresponds to the concentration of sucrose as a substrate.

【0020】[実施例2]実施例1と同様に作製した電
極系上に、CMCの0.25wt%水溶液を滴下し、乾
燥させてCMC層を形成する。一方、酵素のINV25
0U、MUT250UおよびGOD750Uを、CMC
0.25wt%を含むリン酸緩衝液(0.2M:K2
PO4−0.2M:KH2PO4;pH=7.4)1ml
に溶解させ、この混合液を前記CMC層上に4μl滴下
し、50℃の温風乾燥器中で10分間乾燥させ酵素層を
形成する。続いてポリビニルピロリドン(以下PVPと
略す)の2wt%エタノール溶液を酵素層上に4μl滴
下し、約20分室温乾燥させてPVP層を形成する。最
後に、フェリシアン化カリウムの粉末190mgを精製
大豆レシチンの0.5wt%エタノール溶液に分散さ
せ、その3μlをPVP膜上に滴下し、室温で2〜3時
間放置して乾燥させ、フェリシアン化カリウム層を形成
する。この後、実施例1と同様にカバー、スペーサーを
用いてセンサを組み立て、スクロース水溶液を測定した
ところ、試料液中のスクロース濃度に比例した応答電流
値が得られた。
[Example 2] A 0.25 wt% aqueous solution of CMC is dropped on an electrode system manufactured in the same manner as in Example 1, and dried to form a CMC layer. On the other hand, the enzyme INV25
0U, MUT250U and GOD750U by CMC
Phosphate buffer containing 0.25 wt% (0.2 M: K 2 H
PO 4 -0.2 M: KH 2 PO 4 ; pH = 7.4) 1 ml
And 4 μl of the mixture is dropped on the CMC layer, and dried in a 50 ° C. hot air drier for 10 minutes to form an enzyme layer. Subsequently, 4 μl of a 2 wt% ethanol solution of polyvinylpyrrolidone (hereinafter abbreviated as PVP) is dropped on the enzyme layer and dried at room temperature for about 20 minutes to form a PVP layer. Finally, 190 mg of potassium ferricyanide powder was dispersed in a 0.5 wt% ethanol solution of purified soybean lecithin, 3 μl of which was dropped on a PVP membrane, and left to dry at room temperature for 2 to 3 hours to form a potassium ferricyanide layer. I do. Thereafter, the sensor was assembled using the cover and the spacer in the same manner as in Example 1, and the sucrose aqueous solution was measured. As a result, a response current value proportional to the sucrose concentration in the sample solution was obtained.

【0021】[実施例3]図2は本実施例のバイオセン
サの断面図である。実施例1と同様に、絶縁性の基板1
上に、リード2、3と電極系および絶縁層6を形成した
後、CMCの0.25wt%水溶液を滴下し、乾燥させ
CMC層を形成する。続いて、INV250U、MUT
250UおよびGOD750UをCMCの0.25wt
%水溶液1mlに溶解させた混合溶液を前記CMC層上
に4μl滴下し、50℃の温風乾燥器中で10分間乾燥
させて反応層7を形成する。反応層の外周部分は直径約
3.6mmであり、対極の直径に略一致している。次
に、CMC0.25wt%を含むリン酸緩衝液(0.5
M:K2HPO4−0.5M:KH2PO4;pH=7.
4)をカバー9の内側、すなわち電極系に対向する面上
に5μl滴下し、50℃の温風乾燥器中で13分間乾燥
させて緩衝液の成分となる試薬を含む層12を形成す
る。
Embodiment 3 FIG. 2 is a sectional view of a biosensor of this embodiment. As in the first embodiment, the insulating substrate 1
After the leads 2, 3 and the electrode system and the insulating layer 6 are formed thereon, a 0.25 wt% aqueous solution of CMC is dropped and dried to form a CMC layer. Then, INV250U, MUT
250U and GOD750U are 0.25wt of CMC
4 μl of a mixed solution dissolved in 1 ml of a 1% aqueous solution is dropped on the CMC layer, and dried in a 50 ° C. hot air drier for 10 minutes to form a reaction layer 7. The outer peripheral portion of the reaction layer has a diameter of about 3.6 mm, which is substantially equal to the diameter of the counter electrode. Next, a phosphate buffer (0.5%) containing 0.25 wt% of CMC was used.
M: K 2 HPO 4 -0.5 M: KH 2 PO 4 ; pH = 7.
4) is dropped on the inside of the cover 9, that is, on the surface facing the electrode system, and dried in a 50 ° C. hot air drier for 13 minutes to form a layer 12 containing a reagent to be a component of a buffer solution.

【0022】前記のようにして反応層7および層12を
形成した後、カバー9およびスペーサー8を組合せてセ
ンサを構成する。実施例3では、反応層中に緩衝液の成
分となる試薬を含まないため、反応層表面が平滑に保た
れ、気泡生成による応答の低下やばらつきを抑える効果
を有する。また、緩衝液の成分となる試薬が反応層以外
の場所に担持されていることから、試薬により酵素活性
が阻害され保存信頼性が低下するなどの影響を考慮する
ことなく試薬の濃度を高めることも可能である。試薬濃
度を高めることにより緩衝作用力が強まり、試料液のp
Hの影響が緩和され、安定したセンサ応答を得ることが
できる。
After the formation of the reaction layer 7 and the layer 12 as described above, the cover 9 and the spacer 8 are combined to form a sensor. In Example 3, since the reaction layer does not contain a reagent serving as a component of the buffer solution, the surface of the reaction layer is kept smooth and has an effect of suppressing a decrease or variation in response due to bubble generation. In addition, since the reagent that is a component of the buffer solution is supported in a place other than the reaction layer, the concentration of the reagent should be increased without considering the effect such that the enzyme activity is inhibited by the reagent and storage reliability is reduced. Is also possible. Increasing the concentration of the reagent enhances the buffering action and increases the p of the sample solution.
The effect of H is reduced, and a stable sensor response can be obtained.

【0023】また、上記実施例においては、緩衝液の成
分となる試薬としてリン酸塩を使用しているが、これに
限定されることなく、リン酸塩−クエン酸あるいは酢酸
−酢酸塩を使用しても同様の効果が得られる。更に、実
施例1および2では緩衝塩の濃度が0.2Mのものを、
実施例3では0.5Mのものを使用しているが、これら
緩衝液の濃度について検討を行なったところ、緩衝液の
濃度が0.01Mより低くなると緩衝能が低下し、試料
液のpHの影響を受けやすくなり、センサの応答性が著
しく低下した。また、緩衝液の濃度が0.8Mより高く
なると、剥離やひび割れが生じるなど層形成に影響を来
したり、試料液による反応層の溶解速度が低下し、セン
サの応答時間が長くなるなどの影響が出た。従って、セ
ンサ反応に適した緩衝液の濃度は0.01M以上0.8
M以下であり、特に0.1M以上0.8M以下が好適で
あった。
In the above embodiment, phosphate is used as a reagent as a component of the buffer solution. However, the present invention is not limited to this, and phosphate-citric acid or acetic acid-acetate may be used. The same effect can be obtained even if the same is performed. Further, in Examples 1 and 2, the concentration of the buffer salt was 0.2 M,
In Example 3, the buffer having a concentration of 0.5 M was used. However, the concentration of these buffers was examined. When the buffer concentration was lower than 0.01 M, the buffer capacity was reduced, and the pH of the sample solution was lowered. It became susceptible and the responsiveness of the sensor was significantly reduced. When the concentration of the buffer solution is higher than 0.8M, the layer formation is affected such as peeling or cracking, and the dissolution rate of the reaction layer by the sample liquid is reduced, and the response time of the sensor is increased. Affected. Therefore, the concentration of the buffer solution suitable for the sensor reaction is 0.01M or more and 0.8M or more.
M or less, and particularly preferably 0.1 M or more and 0.8 M or less.

【0024】[実施例4]反応層7の構成以外は実施例
1と全て同じである。実施例1と同様に作製した電極系
上にCMCの0.5wt%水溶液を滴下し、乾燥させて
CMC層を形成する。つづいて、酵素としてのINV2
50U、フルクトースデヒドロゲナーゼ(EC1.1.
99.11:以下FDHと略す)1000Uおよび電子
受容体のフェリシアン化カリウム33mgを、CMC
0.5wt%を含むリン酸−クエン酸緩衝液(0.2
M:Na2HPO4−0.1M:C34(OH)(COO
H)3;pH=5.0)1mlに溶解させ、この混合溶
液を前記CMC層上に4μl滴下し、50℃の温風乾燥
器中で10分間乾燥させて反応層7を形成する。反応層
の外周部分は直径約3.6mmであり、対極の直径に略
一致している。実施例1と同様、リン酸塩、クエン酸、
INV、FDHおよび電子受容体の混合溶液と、最初に
形成したCMC層は完全な混合状態とはならず、電極系
表面はCMCのみによって被覆された状態となる。すな
わち、酵素および電子受容体などが電極系表面に接触し
ないために、電極系表面へのタンパク質の吸着や、フェ
リシアン化カリウム、H2PO4 -のような酸化能を有す
る物質の化学的作用による電極系の特性変化が起こり難
くなる。その結果、高精度なセンサ応答を有するバイオ
センサを得ることができる。
Example 4 The structure of the present embodiment is the same as that of Example 1 except for the structure of the reaction layer 7. A 0.5 wt% aqueous solution of CMC is dropped on an electrode system manufactured in the same manner as in Example 1, and dried to form a CMC layer. Next, INV2 as an enzyme
50 U, fructose dehydrogenase (EC 1.1.
99.11: hereinafter abbreviated as FDH) 1000 U and 33 mg of potassium ferricyanide as an electron acceptor were added to CMC
Phosphate-citrate buffer containing 0.5 wt% (0.2
M: Na 2 HPO 4 -0.1 M: C 3 H 4 (OH) (COO
H) 3 ; pH = 5.0) dissolved in 1 ml, 4 μl of this mixed solution was dropped on the CMC layer, and dried in a 50 ° C. hot air drier for 10 minutes to form a reaction layer 7. The outer peripheral portion of the reaction layer has a diameter of about 3.6 mm, which is substantially equal to the diameter of the counter electrode. As in Example 1, phosphate, citric acid,
The mixed solution of INV, FDH, and the electron acceptor and the CMC layer formed first do not form a completely mixed state, and the surface of the electrode system is in a state of being covered only by the CMC. That is, to such an enzyme and an electron acceptor is not in contact with the surface of the electrode system, adsorption or the protein to the electrode system surface, potassium ferricyanide, H 2 PO 4 - electrode by a chemical action of a substance having an oxidizing ability, such as Changes in system characteristics are unlikely to occur. As a result, a biosensor having a highly accurate sensor response can be obtained.

【0025】上記のように作製したスクロースセンサに
ついて、実施例1と同様にスクロース水溶液に対する応
答を測定したところ、試料液中のスクロース濃度に比例
した応答電流値が得られた。上記においては反応層7が
試料液に溶解すると、試料液中のスクロースはINVに
よってフルクトースとα−グルコースに加水分解され、
フルクトースがFDHによって酸化され5−ケト−フル
クトースが生成する。FDHによる酸化反応で移動した
電子によってフェリシアン化カリウムがフェロシアン化
カリウムに還元される。次に、前記のパルス電圧の印加
により、生成したフェロシアン化カリウムの酸化電流が
得られ、この電流値は基質であるスクロースの濃度に対
応する。上記実施例1および4では、酵素、電子受容体
および親水性高分子を同一溶液中に混合し、同一層内に
担持させているので、製造行程を簡素化することができ
る。また、反応層は多層構造に比べて試料液の溶解が容
易であるため、センサ応答速度が短縮され、応答値のば
らつきも小さくすることが可能である。
When the response of the sucrose sensor produced as described above to an aqueous sucrose solution was measured in the same manner as in Example 1, a response current value proportional to the sucrose concentration in the sample solution was obtained. In the above, when the reaction layer 7 is dissolved in the sample solution, the sucrose in the sample solution is hydrolyzed by INV to fructose and α-glucose,
Fructose is oxidized by FDH to produce 5-keto-fructose. Potassium ferricyanide is reduced to potassium ferrocyanide by the electrons transferred in the oxidation reaction by FDH. Next, by the application of the pulse voltage, an oxidation current of the generated potassium ferrocyanide is obtained, and this current value corresponds to the concentration of sucrose as a substrate. In Examples 1 and 4, the enzyme, the electron acceptor, and the hydrophilic polymer are mixed in the same solution and supported in the same layer, so that the manufacturing process can be simplified. In addition, since the reaction layer dissolves the sample liquid more easily than the multilayer structure, the response speed of the sensor is reduced, and the variation of the response value can be reduced.

【0026】[実施例5]反応層7の構成以外は実施例
1と全て同じである。実施例1と同様に作製した電極系
上にCMCの0.5wt%水溶液を滴下し、乾燥させて
CMC層を形成する。続いて酵素としてINV250
U、FDH1000UをCMC0.5wt%を含むリン
酸−クエン酸緩衝液(0.2M:Na2HPO4−0.1
M:C34(OH)(COOH)3;pH=5.0)1
mlに溶解させ、この混合液を前記CMC層に4μl滴
下し、50℃の温風乾燥器中で10分間乾燥させ酵素層
を形成する。続いてポリビニルピロリドン(以下PVP
と略す)の2wt%エタノール溶液を酵素層上に4μl
滴下し、約20分室温乾燥させてPVP層を形成する。
最後に、フェリシアン化カリウムの粉末190mgを精
製大豆レシチンの0.5wt%エタノール溶液に分散さ
せ、その3μlをPVP膜上に滴下して室温で2〜3時
間放置して乾燥させ、フェリシアン化カリウム層を形成
する。この後、実施例1と同様にカバー、スペーサーを
組合せてセンサを構成し、スクロースに対する応答を測
定したところ、良好な直線性が得られた。
Example 5 The structure of the reaction layer 7 was the same as that of Example 1 except for the structure of the reaction layer 7. A 0.5 wt% aqueous solution of CMC is dropped on an electrode system manufactured in the same manner as in Example 1, and dried to form a CMC layer. Subsequently, INV250 was used as an enzyme.
U, 1000 U of FDH in a phosphate-citrate buffer containing 0.5 wt% of CMC (0.2 M: Na 2 HPO 4 -0.1
M: C 3 H 4 (OH ) (COOH) 3; pH = 5.0) 1
Then, 4 μl of this mixed solution is dropped on the CMC layer, and dried in a 50 ° C. hot air drier for 10 minutes to form an enzyme layer. Subsequently, polyvinylpyrrolidone (hereinafter PVP)
4 μl of a 2 wt% ethanol solution of
The mixture is dropped and dried at room temperature for about 20 minutes to form a PVP layer.
Finally, 190 mg of potassium ferricyanide powder is dispersed in a 0.5 wt% ethanol solution of purified soybean lecithin, 3 μl of which is dropped on a PVP membrane and left to dry at room temperature for 2 to 3 hours to form a potassium ferricyanide layer. I do. Thereafter, a sensor was configured by combining the cover and the spacer in the same manner as in Example 1, and the response to sucrose was measured. As a result, good linearity was obtained.

【0027】実施例2および5では、酵素を含む層と電
子受容体を含む層との間にPVP層を形成しているが、
これは必ずしも必要ではない。反応層を酵素を主体にす
る層と電子受容体を主体にする層に単に分離するだけで
も、混合した反応層と比較して保存信頼性が大幅に向上
する。しかしながら、PVPからなる分離層を設けたこ
とにより、電子受容体と酵素を十分に分離することがで
きるめ、保存信頼性を更に向上させることができる。こ
こで、分離層としてPVPを用いたのは、PVPは親水
性高分子でアルコールにも溶解するので、PVPのアル
コール溶液を滴下すれば、酵素がアルコールに溶解する
ことなく分離層として酵素を被覆することができ、また
基質溶液は水溶液であるため、基質溶液が供給されると
PVPは速やかに水と親和し、酵素と基質が反応できる
からである。従って、この分離層はPVPに限定される
ことなく、酵素を溶解しない有機溶剤にも可溶な親水性
高分子は同様の効果を得ることができる。また、上記実
施例ではPVPの膜形成用溶液の濃度が2wt%となっ
ているが、PVPの濃度について検討したところ、4w
t%よりも濃度が高くなると、最後に形成するフェリシ
アン化カリウム層の溶媒であるエタノールとPVPが溶
解してしまい、フェリシアン化カリウム層が乾燥しきら
ないか、あるいは長時間を有するなどセンサ作製に支障
を来した。従ってPVPの濃度としては4wt%以下が
好適である。
In Examples 2 and 5, the PVP layer is formed between the layer containing the enzyme and the layer containing the electron acceptor.
This is not necessary. Even if the reaction layer is simply separated into a layer mainly composed of an enzyme and a layer mainly composed of an electron acceptor, the storage reliability is greatly improved as compared with a mixed reaction layer. However, by providing the separation layer made of PVP, the electron acceptor and the enzyme can be sufficiently separated, and the storage reliability can be further improved. Here, the reason why PVP was used as the separation layer is that PVP is a hydrophilic polymer and also dissolved in alcohol, so if a PVP alcohol solution is dropped, the enzyme is coated as a separation layer without being dissolved in alcohol. Further, since the substrate solution is an aqueous solution, when the substrate solution is supplied, the PVP immediately has an affinity for water, and the enzyme and the substrate can react with each other. Therefore, the separation layer is not limited to PVP, and a hydrophilic polymer that is soluble in an organic solvent that does not dissolve the enzyme can achieve the same effect. In the above embodiment, the concentration of the PVP film forming solution is 2 wt%.
If the concentration is higher than t%, ethanol and PVP, which are the solvents for the potassium ferricyanide layer formed last, will be dissolved, and the potassium ferricyanide layer will not be completely dried or will have a long time. I came. Therefore, the concentration of PVP is preferably 4 wt% or less.

【0028】[実施例6]実施例1と同様に、絶縁性の
基板1上に、リード2、3と電極系および絶縁層6を形
成した後、CMCの0.5wt%水溶液を滴下し、乾燥
させCMC層を形成する。続いて、INV250U、F
DH1000UをCMCの0.5wt%水溶液1mlに
溶解させ、この混合溶液を前記CMC層上に4μl滴下
し、50℃の温風乾燥器中で10分間乾燥させて反応層
7を形成する。反応層の外周部分は直径約3.6mmで
あり、対極の直径に略一致している。次に、CMC0.
25wt%を含むリン酸−クエン酸緩衝液(0.5M:
Na2HPO4−0.5M:C 3H4(OH)(COOH)
3;pH=5.0)をカバー9の内側、すなわち電極系
に対向する面上に5μl滴下し、50℃の温風乾燥器中
で13分間乾燥させて層12を形成する。
[Embodiment 6] As in Embodiment 1, the insulating property
The leads 2 and 3, the electrode system, and the insulating layer 6 are formed on the substrate 1.
After completion, a 0.5 wt% aqueous solution of CMC is dropped and dried.
Then, a CMC layer is formed. Then, INV250U, F
DH1000U in 1ml of 0.5wt% aqueous solution of CMC
Dissolve and add 4 μl of this mixed solution onto the CMC layer
And dried in a warm air dryer at 50 ° C for 10 minutes.
7 is formed. The outer circumference of the reaction layer has a diameter of about 3.6 mm.
And almost coincides with the diameter of the counter electrode. Next, CMC0.
Phosphate-citrate buffer containing 25 wt% (0.5 M:
NaTwoHPOFour-0.5M: C 3HFour(OH) (COOH)
ThreePH = 5.0) inside the cover 9, ie, the electrode system
5 μl is dropped on the surface opposite to
For 13 minutes to form layer 12.

【0029】前記のようにして反応層7および層12を
形成した後、カバー9およびスペーサー8を組合せてセ
ンサを構成する。上記実施例おいては、フェリシアン化
カリウムの担持量は、1.3mg/cm 2である。この
フェリシアン化カリウムの担持量について検討したとこ
ろ、担持量が2.7mg/cm2より多くなると、平滑
あるいは十分な強度を持った反応層を形成することが困
難になるなどの影響が見られた。このことより、フェリ
シアン化カリウムの担持量は2.7mg/cm2以下が
好適である。なお、フェリシアン化カリウムと酵素の混
合溶液中に添加する親水性高分子の濃度を高めるなど、
混合溶液の粘性をたかめると、フェリシアン化カリウム
の担持量を6.5mg/cm2まで増やすことが可能で
ある。
As described above, the reaction layers 7 and 12
After formation, the cover 9 and the spacer 8 are combined to secure
Configure the sensor. In the above embodiment, ferricyanization
The loading amount of potassium is 1.3 mg / cm 2 this
The amount of potassium ferricyanide supported was examined.
2.7 mg / cmTwoThe more, the smoother
Or it is difficult to form a reaction layer with sufficient strength.
Some difficulties were seen. From this, ferries
The loading amount of potassium cyanide is 2.7 mg / cmTwoThe following
It is suitable. The mixture of potassium ferricyanide and enzyme
Such as increasing the concentration of hydrophilic polymer added to the combined solution,
When the viscosity of the mixed solution is increased, potassium ferricyanide
6.5mg / cmTwoCan be increased up to
is there.

【0030】なお、使用する酵素の組合せについては、
上記実施例に限定されることはなく、INVとピラノー
スオキシダーゼ(EC1.1.3.10)の組合せから
なる酵素を用いても優れたセンサ応答が得られた。ま
た、上記実施例において、酵素および電子受容体につい
ては試料液に溶解する方式について示したが、これに制
限されることはなく、固定化によって試料液に不溶化さ
せた場合にも適用することができる。さらに、上記実施
例では測定極と対極からなる2電極系について述べた
が、参照電極を加えた3電極方式とすると、より精度の
高い測定が可能である。
The combination of enzymes used is as follows:
Without being limited to the above examples, excellent sensor response was obtained even when an enzyme composed of a combination of INV and pyranose oxidase (EC 1.1.1.3.10) was used. Further, in the above example, the method of dissolving the enzyme and the electron acceptor in the sample solution was described. it can. Further, in the above-described embodiment, a two-electrode system including a measurement electrode and a counter electrode has been described. However, if a three-electrode system including a reference electrode is used, more accurate measurement is possible.

【0031】[0031]

【発明の効果】以上の説明から明かなように、本発明に
よれば、スクロースを高精度で、迅速かつ簡便に定量で
きる高信頼性のバイオセンサを得ることができる。
As is clear from the above description, according to the present invention, a highly reliable biosensor capable of quantifying sucrose with high accuracy, quickly and easily can be obtained.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図1】本発明の一実施例のバイオセンサの縦断面図で
ある。
FIG. 1 is a longitudinal sectional view of a biosensor according to one embodiment of the present invention.

【図2】本発明の一実施例のバイオセンサの反応層を除
いた分解斜視図である。
FIG. 2 is an exploded perspective view of a biosensor according to an embodiment of the present invention, from which a reaction layer is removed.

【図3】本発明の他の実施例のバイオセンサの縦断面図
である。
FIG. 3 is a longitudinal sectional view of a biosensor according to another embodiment of the present invention.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

1 絶縁性の基板 2、3 リード 4 測定極 5 対極 6 絶縁層 7 反応層 8 スペーサー 9 カバー 10 試料供給孔 11 空気孔 12 緩衝液の成分となる試薬を含む層 REFERENCE SIGNS LIST 1 insulating substrate 2, 3 lead 4 measuring electrode 5 counter electrode 6 insulating layer 7 reaction layer 8 spacer 9 cover 10 sample supply hole 11 air hole 12 layer containing reagent to be a component of buffer solution

フロントページの続き (72)発明者 南海 史朗 大阪府門真市大字門真1006番地 松下電 器産業株式会社内 (56)参考文献 特開 昭54−81177(JP,A) 特開 平2−62953(JP,A) 特開 平2−62952(JP,A) 特開 平2−102448(JP,A) 特開 平2−157645(JP,A) 特開 平3−54447(JP,A) 特開 平2−157646(JP,A) 特開 平4−113262(JP,A) 特開 平2−221855(JP,A) 特開 平4−295755(JP,A) 特開 昭57−63097(JP,A) 特公 昭59−35592(JP,B1) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) G01N 27/327 G01N 27/28 331 JICSTファイル(JOIS)Continuing from the front page (72) Inventor Shiro Nankai 1006 Kazuma Kadoma, Kadoma City, Osaka Prefecture Matsushita Electric Industrial Co., Ltd. (56) References JP-A-54-81177 (JP, A) JP-A-2-62953 (JP) JP-A-2-62952 (JP, A) JP-A-2-102448 (JP, A) JP-A-2-157645 (JP, A) JP-A-3-54447 (JP, A) JP-A-2-157646 (JP, A) JP-A-4-113262 (JP, A) JP-A-2-221855 (JP, A) JP-A-4-295755 (JP, A) JP-A-57-63097 (JP, A A) Japanese Patent Publication No. 59-35592 (JP, B1) (58) Fields investigated (Int. Cl. 7 , DB name) G01N 27/327 G01N 27/28 331 JICST file (JOIS)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項1】 絶縁性の基板上に形成した測定極と対極
を含む電極系、および前記電極系に接触している反応層
を具備し、前記反応層が少なくとも電子受容体、酵素お
よび親水性高分子を含み、前記酵素がインベルターゼお
よびフルクトースデヒドロゲナーゼであることを特徴と
するバイオセンサ。
An electrode system including a measurement electrode and a counter electrode formed on an insulating substrate, and a reaction layer in contact with the electrode system, wherein the reaction layer has at least an electron acceptor, an enzyme and a hydrophilic compound. A biosensor comprising a polymer, wherein the enzymes are invertase and fructose dehydrogenase.
【請求項2】 前記反応層が、酵素を含む層と電子受容
体を含む層との少なくとも2層からなる請求項1記載の
バイオセンサ。
Wherein said reaction layer, the biosensor of claim 1 Symbol placing at least two layers of a layer comprising a layer and an electron acceptor containing the enzyme.
【請求項3】 前記反応層における電子受容体および酵
素が前記親水性高分子に包含されている請求項1記載の
バイオセンサ。
3. A biosensor according to claim 1 Symbol placement electron acceptor and enzyme in the reaction layer is included in the hydrophilic polymer.
【請求項4】 前記親水性高分子が、電子受容体および
酵素の少なくとも一方と前記電極系とを分離している請
求項1または2記載のバイオセンサ。
Wherein said hydrophilic polymer, bio-sensor according to claim 1 or 2 wherein separating the at least one said electrode system of the electron acceptor and enzyme.
【請求項5】 前記反応層を構成する2つの層の間に、
前記酵素を溶解しない溶媒に可溶な親水性高分子の膜を
設けた請求項記載のバイオセンサ。
5. The method according to claim 1, wherein the two layers constituting the reaction layer are:
The biosensor according to claim 2, wherein a film of a hydrophilic polymer soluble in a solvent that does not dissolve the enzyme is provided.
【請求項6】 前記反応層のインベルターゼおよびフル
クトースデヒドロゲナーゼの担持量がそれぞれ1U/c
2以上および5U/cm2以上である請求項記載のバ
イオセンサ。
6. The reaction layer has an invertase and fructose dehydrogenase carrying amount of 1 U / c, respectively.
m 2 or more and 5U / cm 2 or more in the biosensor according to claim 1, wherein.
【請求項7】 反応層と分離して、かつ反応層へ供給す
る試料液と接する位置に、緩衝液の成分となる試薬を保
持させた請求項1〜のいずれかに記載のバイオセン
サ。
7. separated from the reaction layer, and a position in contact with the sample liquid supplied to the reaction layer, biosensor according to any one of claims 1 to 6 is holding the reagent comprising a buffer solution components.
【請求項8】 反応層が緩衝液の成分となる試薬を含む
請求項1〜のいずれかに記載のバイオセンサ。
8. The biosensor according to any one of claims 1 to 6 including the reagent reaction layer is a component of the buffer.
JP12495093A 1992-05-06 1993-04-28 Biosensor Expired - Fee Related JP3222985B2 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP12495093A JP3222985B2 (en) 1992-05-06 1993-04-28 Biosensor

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP11342392 1992-05-06
JP4-113423 1992-05-06
JP12495093A JP3222985B2 (en) 1992-05-06 1993-04-28 Biosensor

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2000398828A Division JP3333183B2 (en) 1992-05-06 2000-12-27 Biosensor

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH0688805A JPH0688805A (en) 1994-03-29
JP3222985B2 true JP3222985B2 (en) 2001-10-29

Family

ID=26452407

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP12495093A Expired - Fee Related JP3222985B2 (en) 1992-05-06 1993-04-28 Biosensor

Country Status (1)

Country Link
JP (1) JP3222985B2 (en)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE60141214D1 (en) 2000-09-25 2010-03-18 Asahi Chemical Ind ENZYME ELECTRODE
JP2014153243A (en) 2013-02-12 2014-08-25 Tanita Corp Biosensor and measurement method employing the same

Also Published As

Publication number Publication date
JPH0688805A (en) 1994-03-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3027306B2 (en) Biosensor and manufacturing method thereof
JP3267936B2 (en) Biosensor
JP3297630B2 (en) Biosensor
US5922188A (en) Biosensor and method for quantitating biochemical substrate using the same
US6077408A (en) Biosensor and method of manufacturing the same
JP2760234B2 (en) Substrate concentration measurement method
JP2502635B2 (en) Biosensor
JP2001183330A (en) Biosensor
JPH1142098A (en) Quantitative determination of substrate
JP2960265B2 (en) Biosensor and measurement method using the same
JPH0816664B2 (en) Biosensor and manufacturing method thereof
JP3267933B2 (en) Substrate quantification method
JP3024394B2 (en) Biosensor and measurement method using the same
JP3529081B2 (en) Cholesterol sensor and method for producing the same
JP3333183B2 (en) Biosensor
JP2502665B2 (en) Biosensor
JP3222985B2 (en) Biosensor
JP2001249103A (en) Biosensor
JP3770757B2 (en) Biosensor
JPH0820400B2 (en) Biosensor
JP3214188B2 (en) Biosensor and manufacturing method thereof
JP3070818B2 (en) Biosensor and manufacturing method thereof
JPH07114705B2 (en) Biosensor
JP3158762B2 (en) Fructose sensor
JP2001201480A (en) Biosensor

Legal Events

Date Code Title Description
FPAY Renewal fee payment (prs date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070817

Year of fee payment: 6

FPAY Renewal fee payment (prs date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080817

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (prs date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080817

Year of fee payment: 7

FPAY Renewal fee payment (prs date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090817

Year of fee payment: 8

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees