JP3209338B2 - Polyethylene glycol-modified arginine deiminase and method for producing the same - Google Patents
Polyethylene glycol-modified arginine deiminase and method for producing the sameInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規かつ有用なポリエチレングリコール修
飾アルギニンデイミナーゼ、およびその製造法に関す
る。さらに本発明はこのポリエチレングリコール修飾ア
ルギニンデイミナーゼを有効成分とする血中安定性の高
い制癌剤に関する。The present invention relates to a novel and useful polyethylene glycol-modified arginine deiminase, and a method for producing the same. Further, the present invention relates to an anticancer agent having high blood stability, which comprises the polyethylene glycol-modified arginine deiminase as an active ingredient.
近年、遺伝子工学の進歩やタンパク質を大量精製する
技術の向上により、酵素や生理活性物質などを医療とし
て使用することが可能となった。癌治療の分野において
も、癌細胞の栄養要求性に基づいた酵素療法〔Nature
誌、229 168（1971）,Br.J.Cancer誌、19,379（196
5）〕が注目されている。アルギニンデイミナーゼ（EC
3.5.3.6）は、癌細胞の増殖に必須であるＬ−アルギニ
ンをＬ−シトルリンとアンモニアに加水分解することに
より、in vitroにおいて強い制癌作用を示すことが知ら
れている（Cancer Res誌50,4522（1990））。しかしな
がら、アルギニンデイミナーゼには、酵素療法における
固有な性質としての循環血液中からの急速な消失（クリ
アランス）の問題と、異種タンパク質としての抗原性の
問題が予想されている。In recent years, advances in genetic engineering and improvements in techniques for purifying proteins in large quantities have made it possible to use enzymes, physiologically active substances, and the like as medical treatment. In the field of cancer treatment, enzyme therapy based on the auxotrophy of cancer cells [Nature
229 168 (1971), Br. J. Cancer, 19 , 379 (196
5)] is drawing attention. Arginine deiminase (EC
3.5.3.6) is known to have a strong anticancer effect in vitro by hydrolyzing L-arginine, which is essential for cancer cell growth, to L-citrulline and ammonia (Cancer Res 50). , 4522 (1990)). However, arginine deiminase is expected to have the problem of rapid disappearance (clearance) from the circulating blood and the problem of antigenicity as a heterologous protein, which are inherent properties of enzyme therapy.
本発明はアルギニンデイミナーゼのこのような欠点を
解決するためになされたものであって、アルギニン分解
能を保持し、血中安定性を向上させたアルギニンデイミ
ナーゼの化学修飾体を製造し、これを制癌剤として利用
しようとするものである。The present invention has been made in order to solve such a drawback of arginine deiminase, and it has been proposed to produce a chemically modified arginine deiminase which retains arginine decomposability and has improved blood stability. It is intended to be used as an anticancer drug.
本発明者らは、アルギニンデイミナーゼの化学修飾に
使用する至適な合成高分子の探索研究を行った。The present inventors conducted a search for an optimal synthetic polymer to be used for chemical modification of arginine deiminase.
その結果、ポリエチレングリコールで化学修飾したア
ルギニンデイミナーゼが優れた性質を示すことを見出
し、本発明を完成するに至った。As a result, they found that arginine deiminase chemically modified with polyethylene glycol exhibited excellent properties, and completed the present invention.
ポリエチレングリコールは、それ自体毒性が低く、免
疫原性がなく、また、水溶液中で酵素の立体構造に影響
を与えないので酵素活性を保持しうる修飾試薬である。
とりわけ、平均分子量1,000〜10,000の該修飾試薬は該
酵素の安定化と免疫原性の抑制に優れた効果を発揮する
ことがわかった。Polyethylene glycol is a modifying reagent which itself has low toxicity, has no immunogenicity, and does not affect the three-dimensional structure of the enzyme in an aqueous solution, and thus can retain the enzyme activity.
In particular, it was found that the modifying reagent having an average molecular weight of 1,000 to 10,000 exerts excellent effects on stabilizing the enzyme and suppressing immunogenicity.
また、該修飾体は次の方法によって調製される。アル
ギニンデイミナーゼは、いかなる生物由来のものを使用
してもよい。たとえば、マイコプラズマ、シュードモナ
ス、ストレプトコッカス等の微生物を例に挙げることが
できる。特に好適な菌株は、（財）発酵研究所から入手
することができるマイコプラズマ アルギニイニ（M.ar
ginini）〔IF014476,ATCC23838またはNCTC10129〕であ
る。The modified form is prepared by the following method. Arginine deiminase may be derived from any organism. For example, microorganisms such as Mycoplasma, Pseudomonas, and Streptococcus can be exemplified. A particularly preferred strain is Mycoplasma arginiini (M.ar) available from Fermentation Research Institute.
ginini) [IF014476, ATCC23838 or NCTC10129].
本発明のアルギニンデイミナーゼは上記マイコプラズ
マの菌体抽出液から、ゲル濾過クロマトグラフィー、イ
オン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマト
グラフィー等のカラムクロマトグラフィーによってアル
ギニンデイミナーゼを分離精製することができる。ま
た、遺伝子工学的手法を用いて生産することもできる。The arginine deiminase of the present invention can be separated and purified from the mycoplasma cell extract by column chromatography such as gel filtration chromatography, ion exchange chromatography and affinity chromatography. Moreover, it can also be produced using genetic engineering techniques.
本発明に用いられる特に好ましいアルギニンデイミナ
ーゼの一つは次の理化学的性質を有する。One particularly preferred arginine deiminase used in the present invention has the following physicochemical properties.
（イ）作用 Ｌ−アルギニンのアミジノ基を加水分解してＬ−シト
ルリンとアンモニアを生成する。(A) Action Hydrolyzes the amidino group of L-arginine to produce L-citrulline and ammonia.
（ロ）至適pH:6.0〜7.5 （ハ）安定pH:45〜9.0 （ニ）至適温度：約50℃ （ホ）km値：約0.2mM （ヘ）等電点（pI）：約4.7 （ト）分子量：約45,000（SDS−ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法による） ：約90,000（ゲル濾過HPLC法による） （チ）Ｎ末端からのアミノ酸配列 さらに、このアルギニンデイミナーゼは第１図に示す
アミノ酸配列を含有する。(B) Optimum pH: 6.0 to 7.5 (c) Stable pH: 45 to 9.0 (d) Optimum temperature: about 50 ° C (e) km value: about 0.2 mM (f) Isoelectric point (pI): about 4.7 (G) Molecular weight: about 45,000 (by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis): about 90,000 (by gel filtration HPLC) (h) Amino acid sequence from N-terminal In addition, this arginine deiminase has the amino acid sequence shown in FIG.
また、修飾に使用するポリエチレングリコール（PE
G）は、蛋白質と共有結合しうる活性化ポリエチレング
リコールであれば、いかなるものを用いてもよい。例え
ば、末端にカルボキシル基を有するポリエチレングリコ
ールとＮ−ヒドロキシスクシンイミドとをカルボジイミ
ドを用いて脱水結合して得られる活性化PEGなどが挙げ
られる。特に好適なものは、塩化シアヌル（2,4,6−ト
リクロロ−ｓ−トリアジン）に２つのポリエチレングリ
コール（平均分子量約5000）鎖を結合させた活性型PEG2
〔2,4−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコール）
−６−クロロ−ｓ−トリアジン〕である。該活性型PEG2
は常法に従い、合成・精製される。In addition, polyethylene glycol (PE
As G), any activated polyethylene glycol that can be covalently bonded to a protein may be used. For example, an activated PEG obtained by dehydrating a polyethylene glycol having a carboxyl group at the terminal and N-hydroxysuccinimide using carbodiimide, and the like are mentioned. Particularly preferred is activated PEG 2 in which two polyethylene glycol chains (average molecular weight about 5000) are linked to cyanuric chloride (2,4,6-trichloro-s-triazine).
[2,4-bis (o-methoxypolyethylene glycol)
-6-chloro-s-triazine]. The activated PEG 2
Is synthesized and purified according to a conventional method.
本発明のポリエチレングリコール修飾アルギニンデイ
ミナーゼは上記の活性型PEG2のトリアジン環と、前記の
アルギニンデイミナーゼの分子表面に存在するアミノ基
とを結合させることにより得ることができる。The polyethylene glycol-modified arginine deiminase of the present invention can be obtained by binding the triazine ring of the above-mentioned activated PEG 2 to an amino group present on the molecular surface of the arginine deiminase.
尚、該修飾体の制癌活性は未修飾アルギニンデイミナ
ーゼと同等である。The anticancer activity of the modified product is equivalent to that of unmodified arginine deiminase.
本発明のポリエチレングリコール修飾アルギニンデイ
ミナーゼは、試験例に示すように、優れた血中安定性を
有することから、制癌剤として有用である。As shown in Test Examples, the polyethylene glycol-modified arginine deiminase of the present invention has excellent blood stability and is therefore useful as an anticancer agent.
本発明のポリエチレングリコール修飾アルギニンデイ
ミナーゼは、通常の製剤用担体、賦形剤あるいは希釈剤
等を用いて慣用の方法で製剤とすることができる。この
剤型としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、顆粒剤等とし
て経口投与したり、あるいは静注、筋注、動注等の注射
剤の形として投与したり、また坐剤の形にして投与した
りすることができる。The polyethylene glycol-modified arginine deiminase of the present invention can be made into a preparation by a conventional method using a usual preparation carrier, excipient, diluent or the like. This dosage form may be orally administered as tablets, pills, capsules, granules, etc., or administered as injections such as intravenous, intramuscular, or intraarterial injections, or in the form of suppositories. Can be administered.
投与量は、症状や投与対象者の年令、性別等を考慮し
て個々の場合に応じて適宜決定されるが、通常成人１日
当り10〜500mgであり、これを１日１回または数回に分
けて投与する。The dose is determined as appropriate depending on the individual case in consideration of symptoms, age of the subject, gender, etc., but is usually 10 to 500 mg per day for an adult, and is administered once or several times a day. It is divided and administered.
該修飾体の毒性については、これをマウスに経口的あ
るいは尾静脈内に1g/kg投与しても死亡例がなく、また
投与後解剖した所見によると各臓器には何等の異常が観
察されず、きわめて安全であることが分かった。Regarding the toxicity of the modified product, there was no death even if it was administered to mice orally or intravenously at 1 g / kg in the tail vein, and no abnormalities were observed in each organ according to the findings dissected after administration. Turned out to be extremely secure.
また、抗原性試験の結果、モルモットにおいて抗体生
産性は著しく抑制され、免疫原生を減少していることが
わかった。In addition, as a result of the antigenicity test, it was found that antibody productivity was significantly suppressed in guinea pigs and immunogenicity was reduced.
実施例 次に、本発明を実施例を示して具体的に説明する。EXAMPLES Next, the present invention will be specifically described with reference to examples.
実施例１ ポリエチレングリコール（PEG）−修飾アルギニンデ
イミナーゼの調製 （１） 2,4−ビス（ｏ−メトキシポリエチレングリコ
ール）−６−クロロ−ｓ−トリアジン〔活性型PEG2〕の
合成法 無水炭酸ナトリウム（10g）とモレキュラーシーヴ3A
（5g）を含む乾燥ベンゼン100mlにモノメトキシポリエ
チレングリコール（平均分子量5000）（20g）と塩化シ
アヌル（365mg）を添加し、80℃で48時間還流した。次
に反応液に石油エーテル200mlを添加し、生成した活性
型PEG2を沈澱させた。この沈殿物を、ベンゼン−アセト
ン（1:1）200mlに溶解し、石油エーテル200mlで沈澱さ
せる精製操作を３回繰り返し、さらにゲル濾過カラムク
ロマトグラフィーにより一本鎖の活性型PEG1を除去した
のち、凍結乾燥して活性型PEG2（10.3g）を得た。Example 1 Preparation of polyethylene glycol (PEG) -modified arginine deiminase (1) Synthesis method of 2,4-bis (o-methoxy polyethylene glycol) -6-chloro-s-triazine [active PEG 2 ] Anhydrous sodium carbonate (10g) and molecular sieve 3A
(5 g) in 100 ml of dry benzene were added with monomethoxy polyethylene glycol (average molecular weight 5000) (20 g) and cyanuric chloride (365 mg), and the mixture was refluxed at 80 ° C. for 48 hours. Next, 200 ml of petroleum ether was added to the reaction solution to precipitate the activated PEG 2 formed. This precipitate was dissolved in 200 ml of benzene-acetone (1: 1), and the purification procedure of precipitating with 200 ml of petroleum ether was repeated three times. Further, single-stranded active PEG 1 was removed by gel filtration column chromatography. After freeze-drying, activated PEG 2 (10.3 g) was obtained.
（２） アルギニンデイミナーゼの調製 マイコプラズマ・アルギニイニ（M.arginini）（IFO
14476株）を30培養液〔PPLO broth w/oCV（Difco）21
g、Ｌ−アルギニン10g、馬血清200ml、25％新鮮イース
トエキス100ml、0.4％フェノールレッド液5ml及び蒸留
水700mlの組成よりなり、pH7.0に調整〕に接種し、５％
CO2インキュベーター内で37℃において２日間静置培養
した。次に得られた培養液を7000rpmで20分間遠心する
ことにより菌体30gを集菌し、これをリン酸緩衝液（pH
7.4）を含む生理食塩液（PBS）で２回洗浄後、10mMリン
酸緩衝液（pH7.0）200mlに懸濁した。この懸濁液を超音
波処理してその中に含まれる菌体を破砕し、遠心分離に
よって不溶物を除き、得られた上清をマイコプラズマ・
アルギニイニ（M.arginini）の菌体抽出液とした。(2) Preparation of arginine deiminase Mycoplasma arginini (M. arginini) (IFO
14476 strain) in 30 cultures [PPLO broth w / oCV (Difco) 21
g, 10 g of L-arginine, 200 ml of horse serum, 100 ml of 25% fresh yeast extract, 5 ml of 0.4% phenol red solution and 700 ml of distilled water, adjusted to pH 7.0] and adjusted to pH 7.0.
The cells were cultured at 37 ° C. for 2 days in a CO 2 incubator. Next, the obtained culture solution was centrifuged at 7000 rpm for 20 minutes to collect 30 g of the cells, which were then collected in a phosphate buffer (pH
After washing twice with a physiological saline solution (PBS) containing 7.4), the cells were suspended in 200 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0). The suspension is sonicated to disrupt the cells contained therein, and the insolubles are removed by centrifugation.
A cell extract of M. arginini was used.
上記で得られた菌体抽出液を出発材料として、通常用
いられるカラムクロマトグラフィー（ゲル濾過、陰イオ
ン交換、アルギニン・アフィニティカラム）を行うこと
により、アルギニンデイミナーゼ0.32gを得た。Using the bacterial cell extract obtained above as a starting material, 0.32 g of arginine deiminase was obtained by performing column chromatography (gel filtration, anion exchange, arginine affinity column) which is usually used.
このときの結果を第１表に示す。 Table 1 shows the results at this time.
このアルギニンデイミナーゼは、前記した理比学的性
質を有し、第１図に示したアミノ酸配列を有していた。 This arginine deiminase had the above-mentioned stoichiometric properties and had the amino acid sequence shown in FIG.
（３） PEG−修飾アルギニンデイミナーゼの調製 （２）で調製したアルギニンデイミナーゼ（25mg）に0.
1M炭酸ナトリウム緩衝液（pH9.0）5mlを添加し、37℃で
30分間撹拌した。氷冷した1Mリン酸カリウム緩衝液（pH
7.0）5mlを添加し、反応を停止させた後、MX−50（アミ
コン社、分子量５万カット）を用いた限外濾過により未
反応の活性化PEG2を除去した。得られたPEG修飾アルギ
ニンデイミナーゼについて、リン酸緩衝液（pH7.4）を
含む生理食塩水（PBS）に対して透析した後、収量、比
活性およびアミノ基の修飾率を測定した。(3) Preparation of PEG-modified arginine deiminase Add 0.2mg to the arginine deiminase (25mg) prepared in (2).
Add 5 ml of 1 M sodium carbonate buffer (pH 9.0) and
Stir for 30 minutes. Ice-cooled 1M potassium phosphate buffer (pH
7.0) After adding 5 ml to stop the reaction, unreacted activated PEG 2 was removed by ultrafiltration using MX-50 (Amicon, molecular weight cut-off 50,000). The obtained PEG-modified arginine deiminase was dialyzed against physiological saline (PBS) containing a phosphate buffer (pH 7.4), and then the yield, specific activity, and modification rate of the amino group were measured.
なお、蛋白定量は牛血清アルブミンを標準として通常
のビウレット法により、酵素活性は生成したシトルリン
をArchibaldの方法（J.Biol.Chem.誌、156,121（1944）
により測定した。このとき、１分間に１μmolのシトル
リンを生産するアルギニンデイミナーゼ活性を１単位
（Ｕ）とし、比活性は酵素1mg当たりの単位数（U/mg蛋
白）で表わした。The protein was quantified by the normal biuret method using bovine serum albumin as a standard, and the enzymatic activity was determined using the produced citrulline according to the method of Archibald (J. Biol. Chem., 156 , 121 (1944)).
Was measured by At this time, the arginine deiminase activity producing 1 μmol of citrulline per minute was defined as 1 unit (U), and the specific activity was expressed in units per 1 mg of enzyme (U / mg protein).
また、PEG−修飾アルギニンデイミナーゼのアミノ基
修飾率は未修飾アルギニンデイミナーゼを対照として2,
4,6−トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）を用いたS
atakeらの方法（J.Biochem.誌，47,654（1960））によ
り測定した。The amino group modification rate of PEG-modified arginine deiminase was 2,2 compared to unmodified arginine deiminase.
S using 4,6-trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS)
It was measured by the method of atake et al. (J. Biochem., 47 , 654 (1960)).
このときの結果を第２表に示す。 Table 2 shows the results.
実施例２ 注射用酵素製剤の調製 実施例１−（３）で得られたPEG−修飾アルギニンデ
イミナーゼをPBSを用いて希釈し、濾過滅菌して25U/ml
の注射用酵素製剤を調製した。 Example 2 Preparation of Enzyme Formulation for Injection The PEG-modified arginine deiminase obtained in Example 1- (3) was diluted with PBS, sterilized by filtration, and sterilized at 25 U / ml.
Was prepared.
なお、実施例１−（２）で得られた未修飾アルギニン
デイミナーゼを実施例２と同様にして注射用酵素製剤を
調製し、比較試験の対照として使用した。The unmodified arginine deiminase obtained in Example 1- (2) was prepared as an enzyme preparation for injection in the same manner as in Example 2, and used as a control in a comparative test.
試験例 マウスにおける血中安定性の向上 ７週齢の雄性CDF1マウス６匹を無作為に対照群３匹、
試験群３匹に群分けした。そして、実施例２で調製した
未修飾アルギニンデイミナーゼ製剤を対照群に、PEG−
修飾アルギニンデイミナーゼ製剤を試験群に、それぞれ
0.2ml（5U/マウス）ずつ尾静脈内に投与し、投与１日
後、３日後、８日後および15日後に眼窩静脈叢より採血
を行った。Control group 3 mice randomly male CDF 1 mice Six improved 7-week-old stability in blood in Test Example mice,
The test group was divided into three animals. Then, the unmodified arginine deiminase preparation prepared in Example 2 was added to a control group by PEG-
The modified arginine deiminase preparation was added to the test group
0.2 ml (5 U / mouse) was administered into the tail vein, and blood was collected from the orbital venous plexus 1 day, 3 days, 8 days, and 15 days after the administration.
各製剤の血中安定性は、血中アルギニン濃度とシトル
リン濃度の経時変化を指標とした。なお、血中アミノ酸
濃度の測定は、各アミノ酸をケイ光試薬（NBD−F,4−フ
ルオロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−1,3−ジアゾ
ール）を用いて誘導体化したのち、高速液体クロマトグ
ラフィーにより行った。The blood stability of each preparation was determined by using changes over time in blood arginine concentration and citrulline concentration as an index. The amino acid concentration in blood was measured by derivatizing each amino acid with a fluorescent reagent (NBD-F, 4-fluoro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazole), followed by high-performance liquid chromatography. Performed by graphy.
このときの結果を第３表に示す。 Table 3 shows the results.
この結果、試験群では対照群にくらべて血中のアルギ
ニン濃度が長期間に亘り低減し、シトルリン濃度が増加
しているので、PEG−修飾アルギニンデイミナーゼは血
中で長期間安定にその作用を持続すると判断される。 As a result, in the test group, the arginine concentration in the blood decreased over a long period of time and the citrulline concentration increased in comparison with the control group. It is determined to last.
本発明のポリエチレングリコール修飾アルギニンデイ
ミナーゼは、アルギニンデイミナーゼと同等の制癌活性
を示し、しかも血中安定性が向上し、抗原性が減少し、
しかも低毒性であるので制癌剤として有用に利用するこ
とができる。The polyethylene glycol-modified arginine deiminase of the present invention exhibits an anticancer activity equivalent to that of arginine deiminase, and further has improved blood stability, reduced antigenicity,
Moreover, since it has low toxicity, it can be usefully used as an anticancer agent.
第１図は本発明に好適に用いられるアルギニンデイミナ
ーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列及びその塩
基配列を示す。FIG. 1 shows the amino acid sequence of the polypeptide constituting arginine deiminase suitably used in the present invention and its base sequence.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (56)参考文献 特開 平２−53490（ＪＰ，Ａ) Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，Ｖｏｌ. 50，Ｎｏ．15（Ａｕｇｕｓｔ １, 1990），ｐ．4522−4527 Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅ ｐ．，Ｖｏｌ．63，Ｎｏ．６（1979）, ｐ．1127−1132 Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅ ｓ．，Ｖｏ7750，Ｎｏ．12（1986）, ｐ．1264−1270 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)────────────────────────────────────────────────── (5) Continuation of the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI C12R 1:01) C12N 15/00 A (56) References JP-A-2-53490 (JP, A) Cancer Res. Vol. 15 (August 1, 1990), p. 4522-4527 Cancer Treat Re p. , Vol. 63, No. 6 (1979), p. 1127-1132 Jpn. J. Cancer Res. , Vo7750, No. 12 (1986), p. 1264-1270 (58) Field surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) C12N 9/00-9/99 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG)
Claims (8)
グリコールにより化学修飾されたポリエチレングリコー
ル修飾アルギニンデイミナーゼ。1. An arginine deiminase modified by polyethylene glycol, which is chemically modified by an activated polyethylene glycol which covalently binds to a protein.
修飾アルギニンデイミナーゼ。 （式中、ADはアルギニンデイミナーゼを表し、ｎはポリ
エチレングリコールの平均分量が1,000〜10,000となる
任意の正の整数を表す）2. Formula (I) The polyethylene glycol-modified arginine deiminase according to claim 1, which is represented by the following formula: (Where AD represents arginine deiminase, and n represents any positive integer such that the average amount of polyethylene glycol is 1,000 to 10,000)
質を有する請求項（１）または（２）に記載のポリエチ
レングリコール修飾アルギニンデイミナーゼ。 （イ） Ｌ−アルギニンのアミジノ基を加水分解してＬ
−シトルリンとアンモニアを生成する。 （ロ） 至適pH:6.0〜7.5 （ハ） 安定pH:45〜9.0 （ニ） 至適温度：約50℃ （ホ） km値：約0.2mM （ヘ） 等電点（pI）：約4.7 （ト） 分子量：約45,000（SDS−ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動法による） ：約90,000（ゲル濾過HPLC法による）3. The polyethylene glycol-modified arginine deiminase according to claim 1, wherein the arginine deiminase has the following physicochemical properties. (A) L-arginine is hydrolyzed to amidino group to form L
-Produces citrulline and ammonia. (B) Optimum pH: 6.0 to 7.5 (c) Stable pH: 45 to 9.0 (d) Optimum temperature: about 50 ° C (e) km value: about 0.2 mM (f) Isoelectric point (pI): about 4.7 (G) Molecular weight: about 45,000 (by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis): about 90,000 (by gel filtration HPLC)
・アルギニイニ（Mycopasma arginini）由来のものであ
る請求項（１）〜（３）のいずれかに記載のポリエチレ
ングリコール修飾アルギニンデイミナーゼ。4. The polyethylene glycol-modified arginine deiminase according to any one of (1) to (3), wherein the arginine deiminase is derived from Mycopasma arginini.
酸配列を含有するものである請求項（１）〜（４）のい
ずれかに記載のポリエチレングリコール修飾アルギニン
デイミナーゼ。5. The polyethylene glycol-modified arginine deiminase according to any one of (1) to (4), wherein the arginine deiminase has the amino acid sequence shown in FIG.
結合する活性化ポリエチレングリコールとを反応させて
両者を共有結合させることを特徴とするポリエチレング
リコール修飾アルギニンデイミナーゼの製造法。6. A method for producing a polyethylene glycol-modified arginine deiminase, which comprises reacting arginine deiminase with an activated polyethylene glycol that is covalently bonded to a protein to covalently bond the two.
グリコールとして2,4−ビス（ｏ−メトキシポリエチレ
ングリコール）−６−クロロ−ｓ−トリアジンを用いる
ことを特徴とする請求項（５）に記載のポリエチレング
リコール修飾アルギニンデイミナーゼの製造法。7. The method according to claim 5, wherein 2,4-bis (o-methoxypolyethylene glycol) -6-chloro-s-triazine is used as the activated polyethylene glycol which is covalently bonded to a protein. A method for producing a polyethylene glycol-modified arginine deiminase.
ポリエチレングリコール修飾アルギニンデイミナーゼを
有効成分とする血中安定性の高い制癌剤。8. An anticancer agent having high blood stability, comprising the polyethylene glycol-modified arginine deiminase according to any one of (1) to (4) as an active ingredient.
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