JP3203624B2 - レーザー蛍光検出装置 - Google Patents
レーザー蛍光検出装置Info
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- JP3203624B2 JP3203624B2 JP13975892A JP13975892A JP3203624B2 JP 3203624 B2 JP3203624 B2 JP 3203624B2 JP 13975892 A JP13975892 A JP 13975892A JP 13975892 A JP13975892 A JP 13975892A JP 3203624 B2 JP3203624 B2 JP 3203624B2
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は試料励起光源にレーザー
を用いるレーザー蛍光検出装置に関する。
を用いるレーザー蛍光検出装置に関する。
【０００２】
【従来の技術】液体クロマトグラフやキャピラリ電気泳
動分析装置における高感度検出器として蛍光検出装置が
用いられる。蛍光検出装置では試料励起光源としてキセ
ノンランプを用いたものが一般に用いられている。光源
にキセノンランプを用いる蛍光検出装置では、分光器に
よってキセノンランプの放射光から適当な波長の光を取
出して試料に照射するようになっているが、分光器によ
って取り出された光は通常或る程度の波長幅を持ってお
り、励起光の単色性を上げるためスリット幅をせまくす
ると、励起光の強度が低下して試料の検出感度が低下
し、検出感度を上げるため励起光を強めようとして、ス
リット幅を広くすると、試料溶媒のラマン散乱光のスペ
クトル幅が広くなって試料の蛍光波長に重なることがあ
るため、試料蛍光のバックグラウンドレベルが高くな
り、Ｓ／Ｎ比が低下する。
動分析装置における高感度検出器として蛍光検出装置が
用いられる。蛍光検出装置では試料励起光源としてキセ
ノンランプを用いたものが一般に用いられている。光源
にキセノンランプを用いる蛍光検出装置では、分光器に
よってキセノンランプの放射光から適当な波長の光を取
出して試料に照射するようになっているが、分光器によ
って取り出された光は通常或る程度の波長幅を持ってお
り、励起光の単色性を上げるためスリット幅をせまくす
ると、励起光の強度が低下して試料の検出感度が低下
し、検出感度を上げるため励起光を強めようとして、ス
リット幅を広くすると、試料溶媒のラマン散乱光のスペ
クトル幅が広くなって試料の蛍光波長に重なることがあ
るため、試料蛍光のバックグラウンドレベルが高くな
り、Ｓ／Ｎ比が低下する。
【０００３】試料励起光の光源にレーザーを用いると、
単色光が得られるので、溶媒のラマン散乱光のスペクト
ル幅がせまくなり、試料蛍光と重なる場合が少なくなっ
て多くの場合にバックグラウンドレベルの低い状態での
測定が可能となる。しかしこの場合でも試料の蛍光と溶
媒のラマン散乱光のスペクトルが近接している場合には
バックグラウンドレベルが高い状態での分析を余儀なく
される。溶媒のラマン散乱光によるバックグラウンド強
度は試料励起光の強度に比例しているので、光源の変動
がバックグラウンド強度に現れ、これがラマン散乱光に
よるバックグラウンドが高い場合の主たるノイズ源にな
る。従ってこの場合測定のＳ／Ｎ比を向上させるにはレ
ーザーの発光を安定化させればよく、レーザーの安定化
装置が用いられるが、安定化装置は高価である。レーザ
ー安定化装置を用いない方法として、レーザー光を試料
光と対照光とに分け、光センサーで対照光の強度変化を
モニターし、対照光の検出強度Ｒに対する試料光の検出
強度Ｓの比Ｓ／Ｒを測定出力とすることで光源の変動を
消去する方法が用いられる。しかしこの対照光と試料光
とを用いる方法では、溶媒のラマン散乱光のスペクトル
と試料の蛍光スペクトルとが離れていて、ラマン散乱光
によるバックグラウンドが殆どない場合、対照光検出信
号も試料光検出信号も主たるノイズ源は夫々の光検出系
のノイズであるため対照光信号に対する試料光信号の比
を採ってもノイズを消去することはできず、バックグラ
ウンドの平均レベルに低いため、相対的にノイズの振幅
が大となり、試料光信号Ｓ対照光信号Ｒの比Ｓ／Ｒにお
けるノイズは却って大きくなってしまう。
単色光が得られるので、溶媒のラマン散乱光のスペクト
ル幅がせまくなり、試料蛍光と重なる場合が少なくなっ
て多くの場合にバックグラウンドレベルの低い状態での
測定が可能となる。しかしこの場合でも試料の蛍光と溶
媒のラマン散乱光のスペクトルが近接している場合には
バックグラウンドレベルが高い状態での分析を余儀なく
される。溶媒のラマン散乱光によるバックグラウンド強
度は試料励起光の強度に比例しているので、光源の変動
がバックグラウンド強度に現れ、これがラマン散乱光に
よるバックグラウンドが高い場合の主たるノイズ源にな
る。従ってこの場合測定のＳ／Ｎ比を向上させるにはレ
ーザーの発光を安定化させればよく、レーザーの安定化
装置が用いられるが、安定化装置は高価である。レーザ
ー安定化装置を用いない方法として、レーザー光を試料
光と対照光とに分け、光センサーで対照光の強度変化を
モニターし、対照光の検出強度Ｒに対する試料光の検出
強度Ｓの比Ｓ／Ｒを測定出力とすることで光源の変動を
消去する方法が用いられる。しかしこの対照光と試料光
とを用いる方法では、溶媒のラマン散乱光のスペクトル
と試料の蛍光スペクトルとが離れていて、ラマン散乱光
によるバックグラウンドが殆どない場合、対照光検出信
号も試料光検出信号も主たるノイズ源は夫々の光検出系
のノイズであるため対照光信号に対する試料光信号の比
を採ってもノイズを消去することはできず、バックグラ
ウンドの平均レベルに低いため、相対的にノイズの振幅
が大となり、試料光信号Ｓ対照光信号Ｒの比Ｓ／Ｒにお
けるノイズは却って大きくなってしまう。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明は試料の蛍光測
定に光源としてレーザーを用いる場合に、溶媒のラマン
散乱光波長の分布と試料蛍光の波長との関係如何にかゝ
わりなく何時でも可能な範囲でＳ／Ｎ比の最も良い測定
が可能であるような蛍光検出装置を提供しようとするも
のである。
定に光源としてレーザーを用いる場合に、溶媒のラマン
散乱光波長の分布と試料蛍光の波長との関係如何にかゝ
わりなく何時でも可能な範囲でＳ／Ｎ比の最も良い測定
が可能であるような蛍光検出装置を提供しようとするも
のである。
【０００５】
【課題を解決するための手段】レーザー光を試料用光束
と対照用光束とに分割する手段と、対照光を検出する手
段と試料光が照射される試料からの蛍光を検出する手段
と、試料セルに溶媒のみを満たしたときの上記蛍光を検
出する手段よりの試料光検出信号のバックグラウンドレ
ベルを基準値と比較する手段とを備え、このバックグラ
ウンドレベルが上記基準値より高い場合には、試料光検
出信号Ｓの対照光検出信号Ｒに対する比Ｓ／Ｒを出力
し、上記バックグラウンドレベルが上記基準値より低い
場合は試料光検出信号Ｓのみを出力して、測定出力とす
る切換え手段と上記基準値を任意設定可能とする手段と
を設けた。
と対照用光束とに分割する手段と、対照光を検出する手
段と試料光が照射される試料からの蛍光を検出する手段
と、試料セルに溶媒のみを満たしたときの上記蛍光を検
出する手段よりの試料光検出信号のバックグラウンドレ
ベルを基準値と比較する手段とを備え、このバックグラ
ウンドレベルが上記基準値より高い場合には、試料光検
出信号Ｓの対照光検出信号Ｒに対する比Ｓ／Ｒを出力
し、上記バックグラウンドレベルが上記基準値より低い
場合は試料光検出信号Ｓのみを出力して、測定出力とす
る切換え手段と上記基準値を任意設定可能とする手段と
を設けた。
【０００６】
【作用】蛍光測定において生じるバックグラウンドの原
因としては、 (1) 試料セル壁面における散乱光 (2) 試料等のレーリー散乱 (3) 溶媒等のラマン散乱 (4) セル或いは溶媒中の不純物からの蛍光 等がある。これらのバックグラウンドのうち(1) と(2)
とは試料励起光と波長が同じなので、光源としてレーザ
ーを用いている場合、波長の拡りが殆どなく、従って比
較的容易に除去することができる。また(4) の不純物の
蛍光は溶媒の純度を高める等の注意によって低減するこ
とができる。従って原理的に問題とされるのは(3) の溶
媒のラマン散乱光である。更にこのラマン散乱光が問題
になるのはラマン散乱光のスペクトル波長分布域と検出
しようとする試料の蛍光波長とが重なる場合である。レ
ーザー光を励起光としている場合、溶媒のラマン散乱光
のスペクトルピークの幅はせまくなるので、試料によっ
ては試料の蛍光とラマン散乱光とが重ならない場合もあ
る。本発明はこれら二つの場合の各々に応じて最も良い
測定方式を切換え選択できるようにしたものである。
因としては、 (1) 試料セル壁面における散乱光 (2) 試料等のレーリー散乱 (3) 溶媒等のラマン散乱 (4) セル或いは溶媒中の不純物からの蛍光 等がある。これらのバックグラウンドのうち(1) と(2)
とは試料励起光と波長が同じなので、光源としてレーザ
ーを用いている場合、波長の拡りが殆どなく、従って比
較的容易に除去することができる。また(4) の不純物の
蛍光は溶媒の純度を高める等の注意によって低減するこ
とができる。従って原理的に問題とされるのは(3) の溶
媒のラマン散乱光である。更にこのラマン散乱光が問題
になるのはラマン散乱光のスペクトル波長分布域と検出
しようとする試料の蛍光波長とが重なる場合である。レ
ーザー光を励起光としている場合、溶媒のラマン散乱光
のスペクトルピークの幅はせまくなるので、試料によっ
ては試料の蛍光とラマン散乱光とが重ならない場合もあ
る。本発明はこれら二つの場合の各々に応じて最も良い
測定方式を切換え選択できるようにしたものである。
【０００７】上述した二つの場合は試料光検出信号即ち
試料側の検出信号のバックグラウンドレベルを調べるこ
とで判別できる。試料検出のために設定した蛍光波長が
溶媒のラマン散乱光に重なっている場合図２のＢに示す
ようにラマン散乱光がバックグラウンドになっているの
でバックグラウンドレベルが高くなるが、蛍光波長が溶
媒のラマン散乱光の波長スペクトルに重ならないときの
バックグラウンドは図２のＡに示すように光検出系の暗
電流成分だけであり、そのレベルは低くなっている。そ
してバックグラウンドレベルが高いときのノイズの原因
は溶媒のラマン散乱光のゆらぎが主たるもので、これは
レーザー光源の変動に基づいている。即ち図２Ｂで周期
の長い振幅の大きな変動が光源の変動によるもので、そ
の上に乗っている細い波は光検出系のノイズである。従
ってこの場合は試料検出光Ｓと対照光検出信号Ｒとの比
Ｓ／Ｒを採ることによってバックグラウンド変動の影響
を除去することができる。バックグラウンドレベルが低
いときは、バックグラウンドが光検出系の暗電流による
ものであり、ノイズも光検出系内で発生しているので、
この場合にもＳ／Ｒを採ると、そのゆらぎはＳ単独の場
合よりも却って大きくなるが、本発明ではこの場合試料
光検出信号のみを採取するので、何れの場合でも、各場
合に適した最良のＳ／Ｎ比で測定を行うことができる。
試料側の検出信号のバックグラウンドレベルを調べるこ
とで判別できる。試料検出のために設定した蛍光波長が
溶媒のラマン散乱光に重なっている場合図２のＢに示す
ようにラマン散乱光がバックグラウンドになっているの
でバックグラウンドレベルが高くなるが、蛍光波長が溶
媒のラマン散乱光の波長スペクトルに重ならないときの
バックグラウンドは図２のＡに示すように光検出系の暗
電流成分だけであり、そのレベルは低くなっている。そ
してバックグラウンドレベルが高いときのノイズの原因
は溶媒のラマン散乱光のゆらぎが主たるもので、これは
レーザー光源の変動に基づいている。即ち図２Ｂで周期
の長い振幅の大きな変動が光源の変動によるもので、そ
の上に乗っている細い波は光検出系のノイズである。従
ってこの場合は試料検出光Ｓと対照光検出信号Ｒとの比
Ｓ／Ｒを採ることによってバックグラウンド変動の影響
を除去することができる。バックグラウンドレベルが低
いときは、バックグラウンドが光検出系の暗電流による
ものであり、ノイズも光検出系内で発生しているので、
この場合にもＳ／Ｒを採ると、そのゆらぎはＳ単独の場
合よりも却って大きくなるが、本発明ではこの場合試料
光検出信号のみを採取するので、何れの場合でも、各場
合に適した最良のＳ／Ｎ比で測定を行うことができる。
【０００８】
【実施例】図１に本発明の一実施例を示す。この実施例
は液体クロマトグラフの検出部に本発明装置を用いた例
である。１は光源のレーザー、２はレーザー光を測定部
に導くオプチカルファイバー、３は試料セルで、液体ク
ロマトグラフの流出液が流通せしめられるフローセルで
ある。光源１からの励起光はフローセル３にその軸方向
から入射せしめられ、フローセル内の液体からの散乱光
のうちフローセル３の周側面に放射された光が楕円面鏡
４によって集光され、レンズ５，フィルタ６を通して蛍
光検出用の光検出器７に入射せしめられる。レーザー１
の出射光はビームスプリッタ８によって一部が対照光検
出器９に入射せしめられる。蛍光検出用の光検出器７の
出力と対照光検出器９の出力がデータ処理装置１０に取
込まれる。
は液体クロマトグラフの検出部に本発明装置を用いた例
である。１は光源のレーザー、２はレーザー光を測定部
に導くオプチカルファイバー、３は試料セルで、液体ク
ロマトグラフの流出液が流通せしめられるフローセルで
ある。光源１からの励起光はフローセル３にその軸方向
から入射せしめられ、フローセル内の液体からの散乱光
のうちフローセル３の周側面に放射された光が楕円面鏡
４によって集光され、レンズ５，フィルタ６を通して蛍
光検出用の光検出器７に入射せしめられる。レーザー１
の出射光はビームスプリッタ８によって一部が対照光検
出器９に入射せしめられる。蛍光検出用の光検出器７の
出力と対照光検出器９の出力がデータ処理装置１０に取
込まれる。
【０００９】上述装置において蛍光測定は次のようにし
て行われる。測定しようとする蛍光波長位置におけるバ
ックグラウンドレベルが高い場合、データ処理装置１０
は光検出器７の出力Ｓ（蛍光検出出力）と光検出器９の
出力Ｒ（対照光検出出力）との比Ｓ／Ｒを算出しメモリ
に記録する。バックグラウンドレベルが低い場合は光検
出器７の出力Ｓのみをメモリに記録する。Ｓ／Ｒを記録
させるかＳのみを記録させるかの選択は分析を行う者が
フローセルに溶媒だけが流れている状態のときの光検出
器７の出力によってバックグラウンドを判定して行う。
上述した実施例ではデータ処理装置としてマイクロコン
ピュータを用い、ディジタル方式で行っているが、アナ
ログ方式でも本発明は実施できる。
て行われる。測定しようとする蛍光波長位置におけるバ
ックグラウンドレベルが高い場合、データ処理装置１０
は光検出器７の出力Ｓ（蛍光検出出力）と光検出器９の
出力Ｒ（対照光検出出力）との比Ｓ／Ｒを算出しメモリ
に記録する。バックグラウンドレベルが低い場合は光検
出器７の出力Ｓのみをメモリに記録する。Ｓ／Ｒを記録
させるかＳのみを記録させるかの選択は分析を行う者が
フローセルに溶媒だけが流れている状態のときの光検出
器７の出力によってバックグラウンドを判定して行う。
上述した実施例ではデータ処理装置としてマイクロコン
ピュータを用い、ディジタル方式で行っているが、アナ
ログ方式でも本発明は実施できる。
【発明の効果】図３は幾つかの溶媒をＨｅ−Ｃｄレーザ
ーの４４２ｎｍの光で励起したときのラマン散乱スペク
トルを示す。この図で例えば検出しようとする蛍光の波
長がＢ点にあるとアセトニトリルを溶媒としているとき
は、ラマン散乱光のバックグラウンドが強く現れ、図２
のＢのようなバックグラウンド検出信号となる。また図
３のＡ点では何れの溶媒でもラマン散乱光のピークはな
くて図２のＡはこのＡ点のバックグラウンド検出信号を
示している。図４はこれら２つの場合において、何れで
も試料光Ｓ対対照光Ｒの比Ｓ／Ｒを求めたもので、Ｂの
場合はノイズが小さい（光検出系のノイズだけ）がＡの
場合は却ってノイズが大きくなっていることが分る。本
発明によれば、この場合でもノイズは図２Ａと同じであ
り、良好なＳ／Ｎ比が得られる。
ーの４４２ｎｍの光で励起したときのラマン散乱スペク
トルを示す。この図で例えば検出しようとする蛍光の波
長がＢ点にあるとアセトニトリルを溶媒としているとき
は、ラマン散乱光のバックグラウンドが強く現れ、図２
のＢのようなバックグラウンド検出信号となる。また図
３のＡ点では何れの溶媒でもラマン散乱光のピークはな
くて図２のＡはこのＡ点のバックグラウンド検出信号を
示している。図４はこれら２つの場合において、何れで
も試料光Ｓ対対照光Ｒの比Ｓ／Ｒを求めたもので、Ｂの
場合はノイズが小さい（光検出系のノイズだけ）がＡの
場合は却ってノイズが大きくなっていることが分る。本
発明によれば、この場合でもノイズは図２Ａと同じであ
り、良好なＳ／Ｎ比が得られる。
【図１】本発明の一実施例装置のブロック図
【図２】二つの場合のバックグラウンドの比較グラフ
【図３】各種溶媒のラマン散乱スペクトル
【図４】本発明の効果を例示するグラフ
１ レーザー ２ オプチカルファイバー ３ フローセル ４ 楕円面鏡 ５ レンズ ６ フィルタ ７ 蛍光検出用光検出器 ８ ビームスプリッタ ９ 対照光検出用光検出器 １０ データ処理装置
Claims (1)
- 【請求項１】 レーザー光を対照用光束と試料セルを照
射する試料用光束とに分割する手段と、試料からの蛍光
を検出する蛍光検出用光検出手段と対照用光束からの光
を検出する対照光用光検出手段と、上記試料セルに溶媒
のみが存在するときの上記蛍光用光検出手段よりの試料
光検出信号のバックグラウンドレベルを可変設定可能な
基準値と比較する手段と、このバックグラウンドが上記
基準値より高いときは、試料の蛍光波長位置における試
料光検出信号Ｓと対照光検出信号Ｒとの比Ｓ／Ｒを採取
し、上記バックグラウンドが上記基準より低いときは上
記試料光検出信号Ｓのみを採取して試料の蛍光検出信号
とする制御装置とを備えたことを特徴とするレーザ蛍光
検出装置。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13975892A JP3203624B2 (ja) | 1992-04-30 | 1992-04-30 | レーザー蛍光検出装置 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP13975892A JP3203624B2 (ja) | 1992-04-30 | 1992-04-30 | レーザー蛍光検出装置 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05307003A JPH05307003A (ja) | 1993-11-19 |
| JP3203624B2 true JP3203624B2 (ja) | 2001-08-27 |
Family
ID=15252706
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP13975892A Expired - Fee Related JP3203624B2 (ja) | 1992-04-30 | 1992-04-30 | レーザー蛍光検出装置 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3203624B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP4323571B2 (ja) * | 1997-01-31 | 2009-09-02 | エックスワイ， インコーポレイテッド | 光学装置 |
| JP2008180567A (ja) * | 2007-01-24 | 2008-08-07 | Shimadzu Corp | 蛍光分光光度計 |
-
1992
- 1992-04-30 JP JP13975892A patent/JP3203624B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05307003A (ja) | 1993-11-19 |
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