JP3184009B2 - 酵素組成物 - Google Patents
酵素組成物Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、安定化された制限酵素
組成物に関する。
組成物に関する。
【０００２】
【従来の技術】制限酵素はＤＮＡ中のある特定の塩基配
列を認識し切断することができるエンド型ヌクレアーゼ
であり、遺伝子工学の分野において不可欠の有用な酵素
である。しかしながら、制限酵素には不安定なものが多
く、その安定化のための手段が検討されている。例え
ば、制限酵素ＳｆｉＩはストレプトミセス フィムブラ
イアタス（Streptomyces fimbriatus)により生産される
制限酵素であり、二本鎖ＤＮＡの５′−ＧＧＣＣＮＮＮ
Ｎ↓ＮＧＧＣＣ−３′（Ｇはグアノシン、Ｃはシチジ
ン、Ｎは任意のヌクレオシドを表す）なる塩基配列（配
列表の配列番号１で表される）を認識し矢印の部位で切
断する数少ない８塩基認識の制限酵素の１つであり〔ヌ
クレイック アシッズ リサーチ（Nucleic Acids Rese
arch) 、第１２巻、第４５０７〜４５１６頁（１９８
４）〕、その製造方法についてはメソッズ イン エン
ザイロモジー（Methods in Enzymology)、第１５５巻、
第１５〜２１頁（１９８７）に記載されている。このＳ
ｆｉＩは大変不安定な酵素でありその濃度に関わらず、
精製操作時、希釈時、−２０℃保存中等にその活性は相
当低下する。したがって、ＳｆｉＩの濃度調整や長時間
の一定品質の維持は大変困難である。特開平４−２３９
８７号公報には、ＳｆｉＩの安定化剤として塩化マグネ
シウムを使用することにより安定化されたＳｆｉＩ組成
物が得られる旨が記載されている。
列を認識し切断することができるエンド型ヌクレアーゼ
であり、遺伝子工学の分野において不可欠の有用な酵素
である。しかしながら、制限酵素には不安定なものが多
く、その安定化のための手段が検討されている。例え
ば、制限酵素ＳｆｉＩはストレプトミセス フィムブラ
イアタス（Streptomyces fimbriatus)により生産される
制限酵素であり、二本鎖ＤＮＡの５′−ＧＧＣＣＮＮＮ
Ｎ↓ＮＧＧＣＣ−３′（Ｇはグアノシン、Ｃはシチジ
ン、Ｎは任意のヌクレオシドを表す）なる塩基配列（配
列表の配列番号１で表される）を認識し矢印の部位で切
断する数少ない８塩基認識の制限酵素の１つであり〔ヌ
クレイック アシッズ リサーチ（Nucleic Acids Rese
arch) 、第１２巻、第４５０７〜４５１６頁（１９８
４）〕、その製造方法についてはメソッズ イン エン
ザイロモジー（Methods in Enzymology)、第１５５巻、
第１５〜２１頁（１９８７）に記載されている。このＳ
ｆｉＩは大変不安定な酵素でありその濃度に関わらず、
精製操作時、希釈時、−２０℃保存中等にその活性は相
当低下する。したがって、ＳｆｉＩの濃度調整や長時間
の一定品質の維持は大変困難である。特開平４−２３９
８７号公報には、ＳｆｉＩの安定化剤として塩化マグネ
シウムを使用することにより安定化されたＳｆｉＩ組成
物が得られる旨が記載されている。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、Ｓｆｉ
Ｉの安定化剤に塩化マグネシウムを加えても長期間のう
ちにはやはり失活は進行する。したがって、強力な制限
酵素の安定化剤の開発が望まれていた。本発明の目的
は、制限酵素ＳｆｉＩの長期安定化に有用な安定化剤を
含有する制限酵素組成物を提供することにある。
Ｉの安定化剤に塩化マグネシウムを加えても長期間のう
ちにはやはり失活は進行する。したがって、強力な制限
酵素の安定化剤の開発が望まれていた。本発明の目的
は、制限酵素ＳｆｉＩの長期安定化に有用な安定化剤を
含有する制限酵素組成物を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明を概説すれば、本
発明は安定化された制限酵素ＳｆｉＩの組成物に関し、
カルシウム塩を含有することを特徴とする。
発明は安定化された制限酵素ＳｆｉＩの組成物に関し、
カルシウム塩を含有することを特徴とする。
【０００５】本発明者らは鋭意研究した結果、安定化剤
としてカルシウム塩を用いることで制限酵素ＳｆｉＩの
長期安定化された組成物が得られることを見いだし、本
発明を完成した。
としてカルシウム塩を用いることで制限酵素ＳｆｉＩの
長期安定化された組成物が得られることを見いだし、本
発明を完成した。
【０００６】以下、本発明を詳細に説明する。ＳｆｉＩ
はＨａｅIII メチラーゼでメチル化された二本鎖ＤＮＡ
を切断する〔ヌクレイック アシッズ リサーチ、第１
９巻、増補、第２０４５〜２０７１頁（１９９１）〕。
言い替えれば、下記式（化２）：
はＨａｅIII メチラーゼでメチル化された二本鎖ＤＮＡ
を切断する〔ヌクレイック アシッズ リサーチ、第１
９巻、増補、第２０４５〜２０７１頁（１９９１）〕。
言い替えれば、下記式（化２）：
【０００７】
【化２】
【０００８】（式中、Ｇはグアノシン、Ｃはシチジン、
5mＣは５−メチルシチジン、Ｎは任意のヌクレオシドを
表す）で表される塩基配列（配列表の配列番号２で表さ
れる）をも認識し、矢印の部位で切断する。
5mＣは５−メチルシチジン、Ｎは任意のヌクレオシドを
表す）で表される塩基配列（配列表の配列番号２で表さ
れる）をも認識し、矢印の部位で切断する。
【０００９】なお、本発明に使用する制限酵素ＳｆｉＩ
は制限酵素生産菌の培養物から採取してもよく、制限酵
素の遺伝子をクローニングして他の生物に導入した形質
転換体によって生産してもよい。本発明の酵素組成物の
形状としては溶液状でもよく凍結乾燥物でもよい。
は制限酵素生産菌の培養物から採取してもよく、制限酵
素の遺伝子をクローニングして他の生物に導入した形質
転換体によって生産してもよい。本発明の酵素組成物の
形状としては溶液状でもよく凍結乾燥物でもよい。
【００１０】本発明に使用するカルシウム塩としては水
溶性のものであればよく、例えば塩化カルシウム、酢酸
カルシウム、硝酸カルシウムが挙げられる。カルシウム
塩の濃度は塩の種類等によって適宜選択すればよい。
溶性のものであればよく、例えば塩化カルシウム、酢酸
カルシウム、硝酸カルシウムが挙げられる。カルシウム
塩の濃度は塩の種類等によって適宜選択すればよい。
【００１１】本発明の酵素組成物には安定化剤として塩
化マグネシウム等のマグネシウム塩が含まれていてもよ
い。マグネシウム塩を加えることにより安定化の相乗効
果を期待できる。本発明の酵素組成物にはグリセロール
が含まれていてもよい。グリセロールの濃度としては、
−２０℃で保存中に凍結しない範囲であればよく、通常
４０〜６０％（ｖ／ｖ）、好ましくは５０％である。本
発明の酵素組成物には緩衝剤が含まれていてもよい。緩
衝剤としては通常の物が使用され、該酵素組成物のｐＨ
を７〜８とするものが好ましい。例えばトリス−塩酸緩
衝液、トリス−リン酸緩衝液等である。本発明の酵素組
成物には必要により他の成分が含まれていてもよい。他
の成分としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、エチレ
ンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジチオスレイトール
（ＤＴＴ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、トリトン
（Triton) Ｘ−１００等が挙げられる。
化マグネシウム等のマグネシウム塩が含まれていてもよ
い。マグネシウム塩を加えることにより安定化の相乗効
果を期待できる。本発明の酵素組成物にはグリセロール
が含まれていてもよい。グリセロールの濃度としては、
−２０℃で保存中に凍結しない範囲であればよく、通常
４０〜６０％（ｖ／ｖ）、好ましくは５０％である。本
発明の酵素組成物には緩衝剤が含まれていてもよい。緩
衝剤としては通常の物が使用され、該酵素組成物のｐＨ
を７〜８とするものが好ましい。例えばトリス−塩酸緩
衝液、トリス−リン酸緩衝液等である。本発明の酵素組
成物には必要により他の成分が含まれていてもよい。他
の成分としては塩化ナトリウム、塩化カリウム、エチレ
ンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジチオスレイトール
（ＤＴＴ）、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、トリトン
（Triton) Ｘ−１００等が挙げられる。
【００１２】
【実施例】以下、実施例をもって本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
【００１３】実施例１ 前述のメソッズ イン エンザイモロジー記載の方法で
ＳｆｉＩの酵素標品を得た。次に、２０ｍＭ トリス−
塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、０．０２５％（ｖ／ｖ） トリトンＸ−１００、及
び２単位／μｌＳｆｉＩからなる酵素組成物を調製し、
該酵素組成物に下記表１に示す各物質を添加し、５℃で
３週間保存した後の活性を比較した。
ＳｆｉＩの酵素標品を得た。次に、２０ｍＭ トリス−
塩酸 ｐＨ７．５、１０ｍＭ ２−メルカプトエタノー
ル、０．０２５％（ｖ／ｖ） トリトンＸ−１００、及
び２単位／μｌＳｆｉＩからなる酵素組成物を調製し、
該酵素組成物に下記表１に示す各物質を添加し、５℃で
３週間保存した後の活性を比較した。
【００１４】
【表１】
【００１５】活性の比較はアデノウイルスＤＮＡのＰｍ
ａＣＩ消化断片（７５６３ｂｐ）をｐＵＣ１８のＨｉｎ
ｃII部位に挿入しＸｂａＩで一箇所切断した基質ＤＮＡ
と酵素組成物を前述の活性測定用緩衝液５０μｌ中で５
０℃で１時間反応させて、基質ＤＮＡの切断の程度をア
ガロースゲル電気泳動にて比較することにより行った。
ａＣＩ消化断片（７５６３ｂｐ）をｐＵＣ１８のＨｉｎ
ｃII部位に挿入しＸｂａＩで一箇所切断した基質ＤＮＡ
と酵素組成物を前述の活性測定用緩衝液５０μｌ中で５
０℃で１時間反応させて、基質ＤＮＡの切断の程度をア
ガロースゲル電気泳動にて比較することにより行った。
【００１６】その結果、ＣａＣｌ2 、Ｃａ（ＮＯ3 ）
2 、Ｃａ（ＣＨ3 ＣＯＯ）2 を添加したサンプル（サン
プル番号３、４、５）は、酵素は安定に活性を保持し、
基質ＤＮＡを完全に切断した。一方、ＥＤＴＡ（サンプ
ル番号２）、各種マグネシウム塩（サンプル番号６、
７、８、９）、他の金属塩（サンプル番号１０、１１、
１２、１３、１４）を添加したサンプル及び未添加（サ
ンプル番号１）のサンプルは酵素が失活し、基質ＤＮＡ
を切断しなかった。
2 、Ｃａ（ＣＨ3 ＣＯＯ）2 を添加したサンプル（サン
プル番号３、４、５）は、酵素は安定に活性を保持し、
基質ＤＮＡを完全に切断した。一方、ＥＤＴＡ（サンプ
ル番号２）、各種マグネシウム塩（サンプル番号６、
７、８、９）、他の金属塩（サンプル番号１０、１１、
１２、１３、１４）を添加したサンプル及び未添加（サ
ンプル番号１）のサンプルは酵素が失活し、基質ＤＮＡ
を切断しなかった。
【００１７】実施例２ 下記表２に示す組成からなる安定化された酵素組成物を
調製した。
調製した。
【００１８】
【表２】 この酵素組成物は−２０℃で少なくとも３ヶ月間安定で
あった。
あった。
【００１９】
【発明の効果】本発明により、遺伝子工学用試薬として
有用な制限酵素の長期安定化に有用な安定化剤を含有す
る制限酵素組成物が提供された。
有用な制限酵素の長期安定化に有用な安定化剤を含有す
る制限酵素組成物が提供された。
【００２０】
【００２１】 配列番号：1 配列の長さ：13 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の特徴：５〜９番目のＮは任意のヌクレオシドであ
る。 配列： GGCCNNNNNG GCC 13
る。 配列： GGCCNNNNNG GCC 13
【００２２】 配列番号：2 配列の長さ：13 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 配列の特徴：３番目のＣは m5cである。 ５〜９番目のＮは任意のヌクレオシドである。 １２番目のＣは m5cである。 配列： GGCCNNNNNG GCC 13
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 君塚 房夫 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (72)発明者 中島 和男 滋賀県大津市瀬田３丁目４番１号 寳酒 造株式会社中央研究所内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/96 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】 制限酵素ＳｆｉＩの組成物であって、カ
ルシウム塩を含有することを特徴とする安定化された酵
素組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15819693A JP3184009B2 (ja) | 1993-06-04 | 1993-06-04 | 酵素組成物 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP15819693A JP3184009B2 (ja) | 1993-06-04 | 1993-06-04 | 酵素組成物 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06343468A JPH06343468A (ja) | 1994-12-20 |
| JP3184009B2 true JP3184009B2 (ja) | 2001-07-09 |
Family
ID=15666377
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP15819693A Expired - Fee Related JP3184009B2 (ja) | 1993-06-04 | 1993-06-04 | 酵素組成物 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3184009B2 (ja) |
-
1993
- 1993-06-04 JP JP15819693A patent/JP3184009B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06343468A (ja) | 1994-12-20 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |