JP3178723B2 - 動物細胞由来２’，５’オリゴアデニル酸合成酵素及びリボヌクレアーゼｌを発現するウイルス抵抗性植物及びその作製法 - Google Patents
動物細胞由来２’，５’オリゴアデニル酸合成酵素及びリボヌクレアーゼｌを発現するウイルス抵抗性植物及びその作製法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、遺伝子組換え技術を用いて動物細胞由来
２′,5′オリゴアデニル酸合成酵素及びリボヌクレアー
ゼＬを発現するウイルス抵抗性植物を作出する技術に関
する。更に具体的には、本発明は、動物細胞由来２′,
5′オリゴアデニル酸合成酵素及びリボヌクレアーゼＬ
をコードするDNA配列を植物染色体に組み込んで発現さ
せることにより、ウイルスに対して抵抗性を持つ植物を
作出する方法、及びそのような方法で得られたウイルス
抵抗性植物に関するものである。
２′,5′オリゴアデニル酸合成酵素及びリボヌクレアー
ゼＬを発現するウイルス抵抗性植物を作出する技術に関
する。更に具体的には、本発明は、動物細胞由来２′,
5′オリゴアデニル酸合成酵素及びリボヌクレアーゼＬ
をコードするDNA配列を植物染色体に組み込んで発現さ
せることにより、ウイルスに対して抵抗性を持つ植物を
作出する方法、及びそのような方法で得られたウイルス
抵抗性植物に関するものである。
背景技術 ウイルスは植物にとって大きなストレス源の一つであ
り、ウイルス病害によって作物の産地が移動したり、品
種が更新されたりすることも稀ではない。現在のとこ
ろ、ウイルスに直接作用する有効な薬剤はなく、ウイル
ス感染した植物は焼却処分されている。ウイルス抵抗性
は育種の重要な目標であるが、野生種・近縁種の中に抵
抗性遺伝子源見つからない場合、従来の交配等による育
種技術ではウイルス抵抗性品種の育成は不可能であっ
た。
り、ウイルス病害によって作物の産地が移動したり、品
種が更新されたりすることも稀ではない。現在のとこ
ろ、ウイルスに直接作用する有効な薬剤はなく、ウイル
ス感染した植物は焼却処分されている。ウイルス抵抗性
は育種の重要な目標であるが、野生種・近縁種の中に抵
抗性遺伝子源見つからない場合、従来の交配等による育
種技術ではウイルス抵抗性品種の育成は不可能であっ
た。
このような従来の育成技術の欠点を補う方法として、
近年遺伝子組換え技術を用いて植物にウイルス抵抗性を
与える方法が開発された。遺伝子組換え技術は、前記の
ような交配の壁を超えた遺伝子導入を可能にした。ま
た、既存品種にウイルス抵抗性遺伝子のみを導入するこ
とができ、育種にかかる時間を大幅に短縮できるように
なった。
近年遺伝子組換え技術を用いて植物にウイルス抵抗性を
与える方法が開発された。遺伝子組換え技術は、前記の
ような交配の壁を超えた遺伝子導入を可能にした。ま
た、既存品種にウイルス抵抗性遺伝子のみを導入するこ
とができ、育種にかかる時間を大幅に短縮できるように
なった。
遺伝子組換え技術を用いたウイルス抵抗性植物の作出
方法としては、ウイルス外被蛋白質、ウイルス複製蛋白
質をコードする遺伝子、アンチセンス遺伝子、サテライ
トRNAをコードする遺伝子を植物で発現させる方法等が
報告されている（例えば、Arch.Virol.,115,1,1990）。
これらの方法は、一種のウイルスあるいは近縁のウイル
スに対してのみ抵抗性を与えるものであり、多種類のウ
イルスに対して抵抗性を与える方法については未だ開発
途上にある。
方法としては、ウイルス外被蛋白質、ウイルス複製蛋白
質をコードする遺伝子、アンチセンス遺伝子、サテライ
トRNAをコードする遺伝子を植物で発現させる方法等が
報告されている（例えば、Arch.Virol.,115,1,1990）。
これらの方法は、一種のウイルスあるいは近縁のウイル
スに対してのみ抵抗性を与えるものであり、多種類のウ
イルスに対して抵抗性を与える方法については未だ開発
途上にある。
多種類のウイルスに対して同時に抵抗性を与える方法
として、二本鎖RNA特異的リボヌクレアーゼを用いた方
法（国際公開WO 93/20686）、２′,5′オリゴアデニル
酸合成酵素を用いた方法（Bio/Technology,11,1048,199
3）が報告されている。
として、二本鎖RNA特異的リボヌクレアーゼを用いた方
法（国際公開WO 93/20686）、２′,5′オリゴアデニル
酸合成酵素を用いた方法（Bio/Technology,11,1048,199
3）が報告されている。
２′,5′オリゴアデニル酸合成酵素遺伝子を用いた方
法については、得られる形質転換植物体のウイルス抵抗
性が非常に弱いという報告もされている（The proceedi
ngs of XVIIIth Eucarpia Symposium,Section Ornament
als,1995）。即ち、２′,5′オリゴアデニル酸合成酵素
をタバコ植物（Samsun株）に導入し、２′,5′オリゴア
デニル酸合成酵素活性を発現する植物にタバコモザイク
ウイルス（以下「TMV」という。）OM株を接種したとこ
ろ、対照と比較して病徴の発現の遅れは全く認められな
かった。また、植物細胞ではリボヌクレアーゼＬ類似分
子の存在が認められないという報告も多い（Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.,108,1243,1982;J.Biol.Chem.,259,3
482,1984;The proceedings of XVIIIth Eucarpia Sympo
sium,Section Ornamentals,1995）。
法については、得られる形質転換植物体のウイルス抵抗
性が非常に弱いという報告もされている（The proceedi
ngs of XVIIIth Eucarpia Symposium,Section Ornament
als,1995）。即ち、２′,5′オリゴアデニル酸合成酵素
をタバコ植物（Samsun株）に導入し、２′,5′オリゴア
デニル酸合成酵素活性を発現する植物にタバコモザイク
ウイルス（以下「TMV」という。）OM株を接種したとこ
ろ、対照と比較して病徴の発現の遅れは全く認められな
かった。また、植物細胞ではリボヌクレアーゼＬ類似分
子の存在が認められないという報告も多い（Biochem.Bi
ophys.Res.Commun.,108,1243,1982;J.Biol.Chem.,259,3
482,1984;The proceedings of XVIIIth Eucarpia Sympo
sium,Section Ornamentals,1995）。
発明の開示 本発明者らは、動物細胞由来の２′,5′オリゴアデニ
ル酸合成酵素遺伝子とリボヌクレアーゼＬ遺伝子を同時
に植物体で発現させることにより２′,5′オリゴアデニ
ル酸合成酵素のみによるウイルス抵抗性よりも顕著に抵
抗性が増すことを期待して鋭意研究を重ねた結果、本発
明を完成した。
ル酸合成酵素遺伝子とリボヌクレアーゼＬ遺伝子を同時
に植物体で発現させることにより２′,5′オリゴアデニ
ル酸合成酵素のみによるウイルス抵抗性よりも顕著に抵
抗性が増すことを期待して鋭意研究を重ねた結果、本発
明を完成した。
本発明は、動物細胞由来２′,5′オリゴアデニル酸合
成酵素（以下「２−5Aase」という。）をコードするDNA
配列及び動物細胞由来リボヌクレアーゼＬ（以下「RNas
eL」という。）をコードするDNA配列を植物染色体中に
組み込んで発現させることにより、RNAウイルスに抵抗
性を持つ植物を作出する方法、及びそのような方法で作
出されたウイルス抵抗性植物に関するものである。
成酵素（以下「２−5Aase」という。）をコードするDNA
配列及び動物細胞由来リボヌクレアーゼＬ（以下「RNas
eL」という。）をコードするDNA配列を植物染色体中に
組み込んで発現させることにより、RNAウイルスに抵抗
性を持つ植物を作出する方法、及びそのような方法で作
出されたウイルス抵抗性植物に関するものである。
以下、本発明を詳細に説明する。
（１）２−5Aase及びRNaseLをコードするDNA配列 動物細胞において、インターフェロンによって誘導さ
れる抗ウイルス状態の一部を担っているものとして、２
−5Aase/RNaseLシステムの存在が知られている（Annu.R
ev.Biochem.,51,251,1982）。２−5Aase蛋白質は二本鎖
RNAを認識して活性化され、基質であるアデノシン３リ
ン酸（以下「ATP」という。）より２′,5′オリゴアデ
ニル酸（通常トライマー又はテトラマーで、以下「２−
5A」という。）を合成する酵素活性を持つ蛋白質をい
う。２−5AaseをコードするcDNAは、ヒト（EMBO J.,４,
2249,1985）、マウス（J.Biol.Chem.,266,15293,1991;N
uc.Acids.Res.,19,1919,1991）、ラット（EMBL Acc.No.
Z18877）からクローニングされている。また、本発明者
らは、今回ウシから２−5AaseをコードするcDNAをクロ
ーニングすることに成功した。２−5AaseをコードするD
NA配列としては、これらのものに限らず、前記活性を有
している限り本発明に用いることができる。つまり、他
の動物種からクローニングしたものの、更にこれらにア
ミノ酸の置換、欠失、付加、挿入が加わったものであっ
ても、前記２−5Aase活性を持つものであれば本発明に
用いることができる。RNaseL蛋白質は２−5Aと結合する
活性を持ち、２−5Aが結合することによりRNA分解活性
を示すものをいう。RNaseLをコードするcDNAは、ヒト
（Cell,72,753,1993）からクローニングされている。ま
た、本発明者らは、今回ウシからRNaseLをコードするcD
NAをクローニングすることに成功した。RNaseLをコード
するDNA配列としては、これらのものに限らず、他の動
物種からクローニングしたもの、これらにアミノ酸の置
換、欠失、付加、挿入が加わったものであっても、前記
RNaseL活性を持つものであれば本発明に用いることがで
きる。
れる抗ウイルス状態の一部を担っているものとして、２
−5Aase/RNaseLシステムの存在が知られている（Annu.R
ev.Biochem.,51,251,1982）。２−5Aase蛋白質は二本鎖
RNAを認識して活性化され、基質であるアデノシン３リ
ン酸（以下「ATP」という。）より２′,5′オリゴアデ
ニル酸（通常トライマー又はテトラマーで、以下「２−
5A」という。）を合成する酵素活性を持つ蛋白質をい
う。２−5AaseをコードするcDNAは、ヒト（EMBO J.,４,
2249,1985）、マウス（J.Biol.Chem.,266,15293,1991;N
uc.Acids.Res.,19,1919,1991）、ラット（EMBL Acc.No.
Z18877）からクローニングされている。また、本発明者
らは、今回ウシから２−5AaseをコードするcDNAをクロ
ーニングすることに成功した。２−5AaseをコードするD
NA配列としては、これらのものに限らず、前記活性を有
している限り本発明に用いることができる。つまり、他
の動物種からクローニングしたものの、更にこれらにア
ミノ酸の置換、欠失、付加、挿入が加わったものであっ
ても、前記２−5Aase活性を持つものであれば本発明に
用いることができる。RNaseL蛋白質は２−5Aと結合する
活性を持ち、２−5Aが結合することによりRNA分解活性
を示すものをいう。RNaseLをコードするcDNAは、ヒト
（Cell,72,753,1993）からクローニングされている。ま
た、本発明者らは、今回ウシからRNaseLをコードするcD
NAをクローニングすることに成功した。RNaseLをコード
するDNA配列としては、これらのものに限らず、他の動
物種からクローニングしたもの、これらにアミノ酸の置
換、欠失、付加、挿入が加わったものであっても、前記
RNaseL活性を持つものであれば本発明に用いることがで
きる。
以下に示す実施例においては、２−5Aase及びRNaseL
をコードするDNA配列として、ヒト又はウシ由来のcDNA
クローンを使用したが、本発明に使用し得る２−5Aas
e、RNaseLをコードするDNA配列は、このヒト又はウシ由
来２−5Ase、RNaseLに限定されるものではないことはい
うまでもない。
をコードするDNA配列として、ヒト又はウシ由来のcDNA
クローンを使用したが、本発明に使用し得る２−5Aas
e、RNaseLをコードするDNA配列は、このヒト又はウシ由
来２−5Ase、RNaseLに限定されるものではないことはい
うまでもない。
また、一般にあるDNA配列があるアミノ酸配列を持つ
ポリペプチドをコードする場合、一つのアミノ酸配列に
対応する遺伝コード（コドン）が複数存在するために、
一つのアミノ酸配列に対応するDNA配列が複数個存在す
る（縮重異性体）。本発明に用いる２−5Aase、RNaseL
をコードするDNA配列においても、それがコードするポ
リペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲におい
て、任意の遺伝コードを用いることができることはいう
までもない。
ポリペプチドをコードする場合、一つのアミノ酸配列に
対応する遺伝コード（コドン）が複数存在するために、
一つのアミノ酸配列に対応するDNA配列が複数個存在す
る（縮重異性体）。本発明に用いる２−5Aase、RNaseL
をコードするDNA配列においても、それがコードするポ
リペプチドのアミノ酸配列を変化させない範囲におい
て、任意の遺伝コードを用いることができることはいう
までもない。
（２）２−5Aase及びRNaseLをコードするDNA配列の発現 ２−5Aase及びRNaseLをコードするDNA配列が遺伝子組
換え植物中で発現するためには、少なくともDNA配列がR
NAに転写されることが必要である。植物染色体中に外来
遺伝子を組み込む場合、ある確率によって染色体上の被
転写領域に組み込まれることが知られている（EMBO J.,
６,3891,1987）ので、２−5Aase又はRNaseLをコードす
るDNA配列を単独に組み込んで発現させることも可能で
ある。しかし、好ましくはあらかじめ適当なプロモータ
ー及びターミネーター配列を連結してから組み込むこと
が好ましい。
換え植物中で発現するためには、少なくともDNA配列がR
NAに転写されることが必要である。植物染色体中に外来
遺伝子を組み込む場合、ある確率によって染色体上の被
転写領域に組み込まれることが知られている（EMBO J.,
６,3891,1987）ので、２−5Aase又はRNaseLをコードす
るDNA配列を単独に組み込んで発現させることも可能で
ある。しかし、好ましくはあらかじめ適当なプロモータ
ー及びターミネーター配列を連結してから組み込むこと
が好ましい。
この場合、プロモーターとしては、これまでに植物細
胞中で機能することが知られているあらゆるプロモータ
ー、具体的にはリブロース−1,5−２リン酸カルボキシ
ラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモータ
ー、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、カリフラ
ワーモザイクウイルス35S−RNAを生じるプロモーター
（CaMV 35Sプロモーター）（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
3,2358,1986;Plant Cell Rep.,４,355,1985;Cell,30,76
3,1982;Nature,313,810,1985）等を用いることができ
る。ターミネーターとしても、これまでに植物細胞中で
機能することが知られているあらゆるターミネーターを
使用することができる。具体的には、ノパリン合成酵素
遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素遺伝子の
ターミネーター（J.Mol.Appl.Gen.,１,561,1992;EMBO
J.,３,835,1984）等を利用することができる。
胞中で機能することが知られているあらゆるプロモータ
ー、具体的にはリブロース−1,5−２リン酸カルボキシ
ラーゼ小サブユニットをコードする遺伝子のプロモータ
ー、ノパリン合成酵素遺伝子のプロモーター、カリフラ
ワーモザイクウイルス35S−RNAを生じるプロモーター
（CaMV 35Sプロモーター）（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
3,2358,1986;Plant Cell Rep.,４,355,1985;Cell,30,76
3,1982;Nature,313,810,1985）等を用いることができ
る。ターミネーターとしても、これまでに植物細胞中で
機能することが知られているあらゆるターミネーターを
使用することができる。具体的には、ノパリン合成酵素
遺伝子のターミネーター、オクトピン合成酵素遺伝子の
ターミネーター（J.Mol.Appl.Gen.,１,561,1992;EMBO
J.,３,835,1984）等を利用することができる。
（３）２−5Aase及びRNaseLをコードするDNA配列の植物
への組み込み 植物細胞に２−5Aase又はRNaseLをコードするDNA配列
を導入するには、すでに報告され確立された種々の方
法、例えばAgrobacterium tumefaciensのTiプラスミド
をベクターとして用いる方法や、植物片や植物プロトプ
ラストに直接DNAを導入する方法等を、目的とする植物
種に応じて適宜用いることができる（例えば、“Plant
genetic transformation and gene expression;a labor
atory manual",Draper,J.et al.,Blackwell Scientific
Publications,1988）。形質転換した植物組織又は細胞
を植物種に応じた適当な条件下で組織培養することによ
り、形質転換植物体を再生することができる。２−5Aas
eとRNaseLを同時に発現する形質転換植物体を得る方法
としては、２−5Aase又はRNaseLを導入した植物体での
それぞれ目的遺伝子の発現を調べ、それぞれの遺伝子を
発現している植物体を交配する方法が考えられる。ま
た、２−5Aase又はRNaseLを導入した形質転換体を再
度、他の遺伝子を用いて形質転換する方法、あるいは２
−5AaseとRNaseLを同時に形質転換する方法も可能であ
る。
への組み込み 植物細胞に２−5Aase又はRNaseLをコードするDNA配列
を導入するには、すでに報告され確立された種々の方
法、例えばAgrobacterium tumefaciensのTiプラスミド
をベクターとして用いる方法や、植物片や植物プロトプ
ラストに直接DNAを導入する方法等を、目的とする植物
種に応じて適宜用いることができる（例えば、“Plant
genetic transformation and gene expression;a labor
atory manual",Draper,J.et al.,Blackwell Scientific
Publications,1988）。形質転換した植物組織又は細胞
を植物種に応じた適当な条件下で組織培養することによ
り、形質転換植物体を再生することができる。２−5Aas
eとRNaseLを同時に発現する形質転換植物体を得る方法
としては、２−5Aase又はRNaseLを導入した植物体での
それぞれ目的遺伝子の発現を調べ、それぞれの遺伝子を
発現している植物体を交配する方法が考えられる。ま
た、２−5Aase又はRNaseLを導入した形質転換体を再
度、他の遺伝子を用いて形質転換する方法、あるいは２
−5AaseとRNaseLを同時に形質転換する方法も可能であ
る。
図面の簡単な説明 図１は、ヒト由来２−5Aase、RNaseL cDNAを含む植物
形質転換ベクターを示す図である。
形質転換ベクターを示す図である。
NOSpro ノパリン合成酵素遺伝子プロモーター NOSterm ノパリン合成酵素遺伝子ターミネーター CaMV35S カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモー
ター NPTII ネオマイシン耐性遺伝子 HYG ハイグロマイシン耐性遺伝子 ２−5Aase ２−5Aase cDNA RNaseL（Ｔ） 部分長RNaseL cDNA RNaseL（Ｆ） 全長RNaseL cDNA RB 右ボーダー LB 左ボーダー 図２は、２−5Aase導入形質転換タバコ（キサンチnc
株）の葉中の２−5Aaseの活性を示す図である。
ター NPTII ネオマイシン耐性遺伝子 HYG ハイグロマイシン耐性遺伝子 ２−5Aase ２−5Aase cDNA RNaseL（Ｔ） 部分長RNaseL cDNA RNaseL（Ｆ） 全長RNaseL cDNA RB 右ボーダー LB 左ボーダー 図２は、２−5Aase導入形質転換タバコ（キサンチnc
株）の葉中の２−5Aaseの活性を示す図である。
control 非形質転換体 ２−5Aase＃11b 形質転換体 ２−5Aase＃12a 形質転換体 ２−5Aase＃13b 形質転換体 図３は、部分長RNaseL導入形質転換タバコ（キサンチ
nc株）の葉中のRNaseLの活性を示す図である。
nc株）の葉中のRNaseLの活性を示す図である。
control 非形質転換体 RNaseL＃H1 形質転換体 RNaseL＃H2 形質転換体 RNaseL＃H3 形質転換体 RNaseL＃H4 形質転換体 Spleen マウス脾臓粗抽出液 図４は、全長RNaseL導入形質転換体タバコ（キサンチ
nc株）の葉中のRNaseLの活性を示す図である。
nc株）の葉中のRNaseLの活性を示す図である。
control 非形質転換体 RNaseL（Ｆ）＃23a 形質転換体 RNaseL（Ｆ）＃14a 形質転換体 RNaseL（Ｆ）＃27a 形質転換体 RNaseL（Ｆ）＃12b 形質転換体 RNaseL（Ｆ）＃30b 形質転換体 Spleen マウス脾臓粗抽出液 図５は、CMV（Ｙ株）接種後の２−5Aase導入タバコ
（２−5Aase＃11b）と２−5Aase＋部分長RNaseL導入タ
バコ（２−5Aase＃11b＋RNaseL＃H1,2−5Aase＃11b＋RN
aseL＃H4）の非接種上葉に病徴が見られた植物体の割合
（％）を示す図である。
（２−5Aase＃11b）と２−5Aase＋部分長RNaseL導入タ
バコ（２−5Aase＃11b＋RNaseL＃H1,2−5Aase＃11b＋RN
aseL＃H4）の非接種上葉に病徴が見られた植物体の割合
（％）を示す図である。
図６は、CMV（Ｙ株）接種タバコ葉中のCMV外被蛋白質
の検出のための電気泳動の結果を示す写真である。
の検出のための電気泳動の結果を示す写真である。
２−5Aase＃11b ２−5Aase導入タバコ ２−5Aase＃11b＋RNaseL＃H4 ２−5Aase＋部分長RNa
seL導入タバコ 図７は、CMV Y株感染３日後における２−5Aase＋RNas
eL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タバコ及びRNaseL
（Ｆ）導入タバコの壊死斑の有無を表す生物の形態を示
す写真である。
seL導入タバコ 図７は、CMV Y株感染３日後における２−5Aase＋RNas
eL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タバコ及びRNaseL
（Ｆ）導入タバコの壊死斑の有無を表す生物の形態を示
す写真である。
Ａ ２−5Aase＃13b Ｂ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a Ｃ RNaseL（Ｆ）＃23a Ｄ ２−5Aase＃13b Ｅ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃27a Ｆ RNaseL（Ｆ）＃27a Ｇ ２−5Aase＃13b Ｈ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b Ｉ RNaseL（Ｆ）＃30b ↑ 接種葉 図８は、CMV Y株感染12日後における２−5Aase＋RNas
eL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タバコ及びRNaseL
（Ｆ）導入タバコの全身病徴の有無を表す生物の形態を
示す写真である。
eL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タバコ及びRNaseL
（Ｆ）導入タバコの全身病徴の有無を表す生物の形態を
示す写真である。
Ａ ２−5Aase＃13b Ｂ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a Ｃ RNaseL（Ｆ）＃23a Ｄ ２−5Aase＃13b Ｅ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃27a Ｆ RNaseL（Ｆ）＃27a Ｇ ２−5Aase＃13b Ｈ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b Ｉ RNaseL（Ｆ）＃30b 図９は、各形質転換タバコの感染５日後の接種葉の壊
死斑部分と同一の葉で壊死斑を形成していない部分にお
けるCMVの検出のための電気泳動の結果を示す写真であ
る。
死斑部分と同一の葉で壊死斑を形成していない部分にお
けるCMVの検出のための電気泳動の結果を示す写真であ
る。
１ ２−5Aase＃13b ２ RNaseL（Ｆ）＃23b ３ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a壊死斑形成部
分 ４ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a壊死斑のない
部分 ５ RNaseL（Ｆ）＃30b ６ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b壊死斑形成部
分 ７ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b壊死斑のない
部分 ８ RNaseL（Ｆ）＃27a ９ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃27a壊死斑形成部
分 10 ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃27a壊死斑のない
部分 図10は、各形質転換タバコの感染12日後の非接種上葉
におけるCMVの検出のための電気泳動の結果を示す写真
である。
分 ４ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a壊死斑のない
部分 ５ RNaseL（Ｆ）＃30b ６ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b壊死斑形成部
分 ７ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b壊死斑のない
部分 ８ RNaseL（Ｆ）＃27a ９ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃27a壊死斑形成部
分 10 ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃27a壊死斑のない
部分 図10は、各形質転換タバコの感染12日後の非接種上葉
におけるCMVの検出のための電気泳動の結果を示す写真
である。
1 非形質転換体 2 ２−5Aase＃13b 3 RNaseL（Ｆ）＃23a 4,5 ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a 6 RNaseL（Ｆ）＃27a 7,8 ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃27a 9 RNaseL（Ｆ）＃30b 10,11 ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b 図11は、CMV Y株感染葉粗汁液の接種５日後における
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの壊死斑の有無を表す
生物の形態を示す写真である。
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの壊死斑の有無を表す
生物の形態を示す写真である。
Ａ ２−5Aase＃13b Ｂ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a Ｃ RNaseL（Ｆ）＃23a Ｄ ２−5Aase＃13b Ｅ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b Ｆ RNaseL（Ｆ）＃30b ↑ 接種葉 図12は、CMV Y株感染葉粗汁液の接種16日後における
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの全身病徴の有無を表
す生物の形態を示す写真である。
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの全身病徴の有無を表
す生物の形態を示す写真である。
Ａ ２−5Aase＃13b Ｂ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a Ｃ RNaseL（Ｆ）＃23a Ｄ ２−5Aase＃13b Ｅ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b Ｆ RNaseL（Ｆ）＃30b 図13は、PVY T株感染葉粗汁液の接種５日後における
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの壊死斑の有無を表す
生物の形態を示す写真である。
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの壊死斑の有無を表す
生物の形態を示す写真である。
Ａ ２−5Aase＃13b Ｂ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a Ｃ RNaseL（Ｆ）＃23a Ｄ ２−5Aase＃13b Ｅ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b Ｆ RNaseL（Ｆ）＃30b ↑ 接種葉 図14は、PVY T株感染葉粗汁液の接種14日後における
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの全身病徴の有無を表
す生物の形態を示す写真である。
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの全身病徴の有無を表
す生物の形態を示す写真である。
Ａ ２−5Aase＃13b Ｂ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a Ｃ RNaseL（Ｆ）＃23a Ｄ ２−5Aase＃13b Ｅ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃27a Ｆ RNaseL（Ｆ）＃27a Ｇ ２−5Aase＃13b Ｈ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b Ｉ RNaseL（Ｆ）＃30b 図15は、各形質転換タバコの感染５日後の非接種上葉
（Ａ）及び感染10日後の非接種上葉（Ｂ）におけるPVY
T株の検出のための電気泳動の結果を示す写真である。
（Ａ）及び感染10日後の非接種上葉（Ｂ）におけるPVY
T株の検出のための電気泳動の結果を示す写真である。
1 非形質転換体 2,3 ２−5Aase＃13b 4,5 RNaseL（Ｆ）＃23a 6,7 ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a 8,9 RNaseL（Ｆ）＃30b 10,11 ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b 図16は、PVY O株感染葉粗汁液の接種３日後における
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの壊死斑の有無を表す
生物の形態を示す写真である。
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの壊死斑の有無を表す
生物の形態を示す写真である。
Ａ ２−5Aase＃13b Ｂ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a Ｃ RNaseL（Ｆ）＃23a Ｄ ２−5Aase＃13b Ｅ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃27a Ｆ RNaseL（Ｆ）＃27a Ｇ ２−5Aase＃13b Ｈ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b Ｉ RNaseL（Ｆ）＃30b ↑ 接種葉 図17は、PVY O株感染葉粗汁液の接種15日後における
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの全身病徴の有無を表
す生物の形態を示す写真である。
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの全身病徴の有無を表
す生物の形態を示す写真である。
Ａ ２−5Aase＃13b Ｂ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a Ｃ RNaseL（Ｆ）＃23a Ｄ ２−5Aase＃13b Ｅ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃27a Ｆ RNaseL（Ｆ）＃27a Ｇ ２−5Aase＃13b Ｈ ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b Ｉ RNaseL（Ｆ）＃30b 図18は、各形質転換タバコの感染５日後の接種葉
（Ａ）及び感染６日後の非接種上葉（Ｂ）におけるPVY
O株の検出のための電気泳動の結果を示す写真である。
（Ａ）及び感染６日後の非接種上葉（Ｂ）におけるPVY
O株の検出のための電気泳動の結果を示す写真である。
1 非形質転換体 2 ２−5Aase＃13b 3 RNaseL（Ｆ）＃23a 4,5 ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a 6 RNaseL（Ｆ）＃27a 7,8 ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃27a 9 RNaseL（Ｆ）＃30b 10,11 ２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30b 図19は、ウシ２−5Aase cDNAの塩基配列とそれから予
測されるアミノ酸配列を示す図である。
測されるアミノ酸配列を示す図である。
図20は、ウシRNaseL cDNAの塩基配列とそれから予測
されるアミノ酸配列を示す図である。
されるアミノ酸配列を示す図である。
図21は、２−5Aase導入形質転換タバコ（サムソン）
の葉中の２−5Aaseの活性を示す図である。
の葉中の２−5Aaseの活性を示す図である。
control 非形質転換体 ＃13−４ ２−5Aase導入形質転換体 ＃13−５ ２−5Aase導入形質転換体 ＃13−７ ２−5Aase導入形質転換体 ＃13−９ ２−5Aase導入形質転換体 ＃13−10 ２−5Aase導入形質転換体 ＃13−11 ２−5Aase導入形質転換体 図22は、RNaseL（Ｆ）導入形質転換タバコ（サムソ
ン）の葉中のRNaseL活性を示す図である。
ン）の葉中のRNaseL活性を示す図である。
control 非形質転換体 ＃57−4a RNaseL（Ｆ）導入形質転換体 ＃57−6b RNaseL（Ｆ）導入形質転換体 ＃57−11 RNaseL（Ｆ）導入形質転換体 ＃58−７ RNaseL（Ｆ）導入形質転換体 ＃58−11 RNaseL（Ｆ）導入形質転換体 ＃58−18 RNaseL（Ｆ）導入形質転換体 図23は、CMV Y株感染葉粗汁液の接種３日後における
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの壊死斑の有無を表す
生物の形態を示す写真である。
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの壊死斑の有無を表す
生物の形態を示す写真である。
Ａ ２−5Aase（Ｓ）＃13−10 Ｂ ２−5Aase（Ｓ）＃13−10＋RNaseL（Ｓ）＃57−6b Ｃ RNaseL（Ｓ）＃57−6b ↑ 接種葉 図24は、CMV Y株感染葉粗汁液の接種10日後における
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの全身病徴の有無を表
す生物の形態を示す写真である。
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２−5Aase導入タ
バコ及びRNaseL（Ｆ）導入タバコの全身病徴の有無を表
す生物の形態を示す写真である。
Ａ ２−5Aase（Ｓ）＃13−10 Ｂ ２−5Aase（Ｓ）＃13−10＋RNaseL（Ｓ）＃57−6b Ｃ RNaseL（Ｓ）＃57−6b 発明を実施するための最良の形態 以下に実施例を挙げて更に具体的に本発明を説明する
が、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものでは
ない。
が、本発明の範囲は以下の実施例に限定されるものでは
ない。
以下の実施例では、２−5Aase及びRNaseLのDNA配列と
してヒト由来のcDNAを使用し、植物でこの遺伝子を発現
させるためのプロモーターとしてはCaMV 35Sプロモータ
ーを使用した。２−5Aase cDNAの発現には、pBI121ベク
ター（EMBO J.,６,3901,1987）上のβグルクロニダーゼ
遺伝子（βGUS）と２−5Aase cDNAを入れ替えて使用し
た。RNaseL cDNAの発現には、pBIB−HYGベクター（ケル
ン大学遺伝研究所、Dr.Detlef Backerより入手）へ、Ca
MV 35SプロモーターをRNaseL cDNAの５′上流につなげ
たDNA配列を導入したものを使用した。
してヒト由来のcDNAを使用し、植物でこの遺伝子を発現
させるためのプロモーターとしてはCaMV 35Sプロモータ
ーを使用した。２−5Aase cDNAの発現には、pBI121ベク
ター（EMBO J.,６,3901,1987）上のβグルクロニダーゼ
遺伝子（βGUS）と２−5Aase cDNAを入れ替えて使用し
た。RNaseL cDNAの発現には、pBIB−HYGベクター（ケル
ン大学遺伝研究所、Dr.Detlef Backerより入手）へ、Ca
MV 35SプロモーターをRNaseL cDNAの５′上流につなげ
たDNA配列を導入したものを使用した。
本発明の効果を確認するための宿主植物としてタバコ
（キサンチnc株）を使用し、アグロバクテリウムを介し
てリーフディスク法によるか、又はタバコプロトプラス
トを用いてエレクトロポレーション法によってタバコ形
質転換体を得た（Plant genetic transformation and g
ene expression;a laboratory manual,Draper,J.et a
l.,Blackwell Scientific Publications,1988）。
（キサンチnc株）を使用し、アグロバクテリウムを介し
てリーフディスク法によるか、又はタバコプロトプラス
トを用いてエレクトロポレーション法によってタバコ形
質転換体を得た（Plant genetic transformation and g
ene expression;a laboratory manual,Draper,J.et a
l.,Blackwell Scientific Publications,1988）。
形質転換体中の２−5Aase cDNA及びRNaseL cDNA発現
の有無は、形質転換体植物の葉から粗抽出液を調製し、
それぞれ２−5Aase活性（J.Biol.Chem.,259,1363,198
4）、RNaseL活性（Anal.Biochem.,144,450,1985）を測
定することによって調べた。
の有無は、形質転換体植物の葉から粗抽出液を調製し、
それぞれ２−5Aase活性（J.Biol.Chem.,259,1363,198
4）、RNaseL活性（Anal.Biochem.,144,450,1985）を測
定することによって調べた。
２−5Aase cDNAとRNaseL cDNAを同時に発現している
形質転換体タバコは、２−5Aase活性を発現しているタ
バコ植物とRNaseL活性を発現しているタバコ植物を交配
することによって得た。２−5Aaseのみを発現している
タバコ植物、２−5AaseとRNaseLの両方を発現している
タバコ植物にキュウリモザイクウイルス（CMV Y株）を
感染させたところ、２−5Aaseのみを発現しているタバ
コ植物に比較して有無に高いウイルス抵抗性を示した。
形質転換体タバコは、２−5Aase活性を発現しているタ
バコ植物とRNaseL活性を発現しているタバコ植物を交配
することによって得た。２−5Aaseのみを発現している
タバコ植物、２−5AaseとRNaseLの両方を発現している
タバコ植物にキュウリモザイクウイルス（CMV Y株）を
感染させたところ、２−5Aaseのみを発現しているタバ
コ植物に比較して有無に高いウイルス抵抗性を示した。
（実施例１）形質転換植物作製に用いるプラスミドの作
製（図１） 報文（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,4904,1983）に記
載されているヒト由来２−5AaseのDNA配列（配列番号
１）を基に、cDNAクローニングのためのプローブ（配列
番号２）を作製した。cDNAクローニングのためのライブ
ラリーは、HeLa細胞（東京大学薬学部生理化学教室、榎
本助教授より入手）を200units/mlのヒトβインターフ
ェロン（Paesel Lorei GMBH ＆ CO,Frankfurt）で12時
間処理した後、mRNAを抽出し、ファルマシアcDNA合成キ
ットを用いてcDNAを作製し、Lambda gt10ベクターにつ
なげて作製した。２−5Aase mRNAは２種（1.6kbと1.8k
b）あることが報告されているが、植物発現用には1.6kb
mRNAに対するcDNAを用いた。２−5Aase cDNA（EcoR I
断片）をpBI121のβGUSと入れ替え、植物発現用プラス
ミドpBI2−5Aaseを作製した。
製（図１） 報文（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,80,4904,1983）に記
載されているヒト由来２−5AaseのDNA配列（配列番号
１）を基に、cDNAクローニングのためのプローブ（配列
番号２）を作製した。cDNAクローニングのためのライブ
ラリーは、HeLa細胞（東京大学薬学部生理化学教室、榎
本助教授より入手）を200units/mlのヒトβインターフ
ェロン（Paesel Lorei GMBH ＆ CO,Frankfurt）で12時
間処理した後、mRNAを抽出し、ファルマシアcDNA合成キ
ットを用いてcDNAを作製し、Lambda gt10ベクターにつ
なげて作製した。２−5Aase mRNAは２種（1.6kbと1.8k
b）あることが報告されているが、植物発現用には1.6kb
mRNAに対するcDNAを用いた。２−5Aase cDNA（EcoR I
断片）をpBI121のβGUSと入れ替え、植物発現用プラス
ミドpBI2−5Aaseを作製した。
ヒト由来RNaseL cDNAについては、報文（Cell,72,75
3,1993）に記載されているDNA配列（配列番号３）を基
にプローブ（配列番号４）を作製し、ヒト脾臓cDNAライ
ブラリー（Clontech社）をスクリーニングすることによ
って取得した。ヒト脾臓cDNAライブラリーから２種、部
分長（Ｃ末アミノ酸61残基欠いているもの）と全長のcD
NAクローンを得た。２種のRNaseL cDNA（Hind III−Eco
R I断片）のＮ末側にCaMV 35Sプロモーターをつなげ、
これをpBIB−HYGベクターのHind III−Sac I断片と入れ
替え、植物発現用プラスミドを作製した。部分長RNaseL
を含むもの、全長RNaseLを含むものを、それぞれpBIBRN
aseL（Ｔ）、pBIBRNaseL（Ｆ）という。
3,1993）に記載されているDNA配列（配列番号３）を基
にプローブ（配列番号４）を作製し、ヒト脾臓cDNAライ
ブラリー（Clontech社）をスクリーニングすることによ
って取得した。ヒト脾臓cDNAライブラリーから２種、部
分長（Ｃ末アミノ酸61残基欠いているもの）と全長のcD
NAクローンを得た。２種のRNaseL cDNA（Hind III−Eco
R I断片）のＮ末側にCaMV 35Sプロモーターをつなげ、
これをpBIB−HYGベクターのHind III−Sac I断片と入れ
替え、植物発現用プラスミドを作製した。部分長RNaseL
を含むもの、全長RNaseLを含むものを、それぞれpBIBRN
aseL（Ｔ）、pBIBRNaseL（Ｆ）という。
（実施例２）タバコ植物の形質転換 形質転換には、タバコ（Nicotiana tabacum）キサン
チnc株（Xanthi nc）を用いた。図１に示したプラスミ
ドpBI2−5Aase又はpBIBRNaseL（Ｆ）をそれぞれ、エレ
クトロポレーション法によりアグロバクテリウム（Agro
bacterium tumefaciens）LBA4404株に導入した。リーフ
ディスク法によりタバコ葉片にアグロバクテリウムを感
染させ、250μg/mlクラフォラン、100μg/mlカナマイシ
ン又は20μg/mlハイグロマイシン入りMS−B5培地［Mura
shige ＆ Skoog基本培地（Physiol.Plant.,15,473,196
2）にB5ビタミンを添加したもの］上に置床して形質転
換体を選択した。シュートが出てきたら、ホルモンフリ
ーのMS培地に移し発現させた。得られた形質転換植物体
は、プラントボックスにて無菌インビトロカルチャーし
た後、鉢上げして自家受粉又は交配（２−5Aase＋RNase
L）してR1種子を得た。
チnc株（Xanthi nc）を用いた。図１に示したプラスミ
ドpBI2−5Aase又はpBIBRNaseL（Ｆ）をそれぞれ、エレ
クトロポレーション法によりアグロバクテリウム（Agro
bacterium tumefaciens）LBA4404株に導入した。リーフ
ディスク法によりタバコ葉片にアグロバクテリウムを感
染させ、250μg/mlクラフォラン、100μg/mlカナマイシ
ン又は20μg/mlハイグロマイシン入りMS−B5培地［Mura
shige ＆ Skoog基本培地（Physiol.Plant.,15,473,196
2）にB5ビタミンを添加したもの］上に置床して形質転
換体を選択した。シュートが出てきたら、ホルモンフリ
ーのMS培地に移し発現させた。得られた形質転換植物体
は、プラントボックスにて無菌インビトロカルチャーし
た後、鉢上げして自家受粉又は交配（２−5Aase＋RNase
L）してR1種子を得た。
プラスミドpBIBRNaseL（Ｔ）は、タバコ葉より調製し
たプロトプラスト細胞へエレクトロポレーションによっ
て導入された。プロトプラストは、タバコ（キサンチnc
株）葉肉細胞から酵素液［１％Cellulase Onozuka RS
（ヤクルト社）,1％Driselase（協和発酵工業社）,0.1
％Pectolyase（Seihshin Pharmaceutical社）,0.4M D−
マンニトール（pH5.7）］により室温で一晩処理して調
製した。冷0.4MD−マンニトールでプロトプラストを３
回洗浄して、１×108個の細胞を約10μｇのDNAプラスミ
ドを含む0.8mlのエレクトロポレーションバッファー
（0.3MD−マンニトール,5mM 2−（Ｎ−モルホリノ）エ
タンスルホン酸pH5.8,70mM KCl）に懸濁し、エレクトロ
ポレーションキュベット（Bio−rad社、0.4cm幅）に移
して、125μF,300Vで加電した。エレクトロポレーショ
ンしたプロトプラストは、１％アガロースを含むスフェ
ロプラスト培地（１％スクロース,0.4MD−マンニトー
ル,0.2μg/ml2,4−ジクロロフェノキシ酢酸を含むMuras
hige ＆ Skoog培地）中で１週間、28℃、暗黒下で培養
し、次にハイグロマイシン（20μg/ml）による形質転換
体の選択を行った。得られたコロニーからシュートが形
成された後、ホルモンフリー培地に移して形質転換植物
体を得た。得られた形質転換植物体は、プラントボック
スにて無菌インビトロカルチャーした後、鉢上げし、２
−5Aase植物と交配してF1種子を得た。
たプロトプラスト細胞へエレクトロポレーションによっ
て導入された。プロトプラストは、タバコ（キサンチnc
株）葉肉細胞から酵素液［１％Cellulase Onozuka RS
（ヤクルト社）,1％Driselase（協和発酵工業社）,0.1
％Pectolyase（Seihshin Pharmaceutical社）,0.4M D−
マンニトール（pH5.7）］により室温で一晩処理して調
製した。冷0.4MD−マンニトールでプロトプラストを３
回洗浄して、１×108個の細胞を約10μｇのDNAプラスミ
ドを含む0.8mlのエレクトロポレーションバッファー
（0.3MD−マンニトール,5mM 2−（Ｎ−モルホリノ）エ
タンスルホン酸pH5.8,70mM KCl）に懸濁し、エレクトロ
ポレーションキュベット（Bio−rad社、0.4cm幅）に移
して、125μF,300Vで加電した。エレクトロポレーショ
ンしたプロトプラストは、１％アガロースを含むスフェ
ロプラスト培地（１％スクロース,0.4MD−マンニトー
ル,0.2μg/ml2,4−ジクロロフェノキシ酢酸を含むMuras
hige ＆ Skoog培地）中で１週間、28℃、暗黒下で培養
し、次にハイグロマイシン（20μg/ml）による形質転換
体の選択を行った。得られたコロニーからシュートが形
成された後、ホルモンフリー培地に移して形質転換植物
体を得た。得られた形質転換植物体は、プラントボック
スにて無菌インビトロカルチャーした後、鉢上げし、２
−5Aase植物と交配してF1種子を得た。
（実施例３）２−5Aase導入形質転換タバコ中の２−5Aa
se活性の検出（図２） インビトロカルチャーしたタバコ葉、インターフェロ
ン処理したHeLa細胞からの粗抽出液をWellsらの方法
（J.Biol.Chem.,259,1363,1984）によって調製した。葉
の湿重量を測定し、液体窒素中で粉砕し、等量の溶解バ
ッファー（0.5％ Nonidet P−40,90mM KCl,1mM酢酸マグ
ネシウム,10mM Hepes pH7.6,2mM 2−メルカプトエタノ
ール、20μg/mlロイペプチン、50μg/mlウシ肺アプロチ
ニン（bovine lung aprotinin）,50μＭフェニルメチル
スルホニルフルオリド（PMSF）,50μg/mlトリプシン阻
害剤）を加え、テフロンペッスルホモジナイザーによっ
てホモジナイズし、15,000rpm,4℃,20minで２回遠心し
て上清を取った。葉粗抽出液1ml（HeLa細胞粗抽出液の
場合は、粗抽出液を溶解バッファーで10倍に希釈したも
の）に40μｌのpolyI:polyCセルロース懸濁液を加え
て、４℃で２時間反応させた後、洗浄バッファー（20mM
Hepes pH7.0,10mM酢酸マグネシウム,5mM KCl）で３回
遠心洗浄して0.2μl32P−rATP（10mCi/ml,3000Ci/mmol,
NEN社）を含む反応混合物（20mM Hepes pH7.0,20％グリ
セリン,7mM 2−メルカプトエタノール,2mM TAP,5mM KC
l,10mM酢酸マグネシウム）50μｌに懸濁し、30℃で一晩
（16〜20時間）反応させた。反応液中に生成された32P
標識オリゴアデニル酸は、Wellsらの方法（J.Biol.Che
m.,259,1363,1984）に従ってDEAEセルロースを用いて精
製して液体シンチレーションカウンターにて放射活性を
測定した。polyI:polyCセルロースは、Wellsらの方法
（J.Biol.Chem.,259,1363,1984）によって作製した。粗
抽出液中の蛋白質はBio−rad社のプロテインアッセイキ
ットによって測定した。
se活性の検出（図２） インビトロカルチャーしたタバコ葉、インターフェロ
ン処理したHeLa細胞からの粗抽出液をWellsらの方法
（J.Biol.Chem.,259,1363,1984）によって調製した。葉
の湿重量を測定し、液体窒素中で粉砕し、等量の溶解バ
ッファー（0.5％ Nonidet P−40,90mM KCl,1mM酢酸マグ
ネシウム,10mM Hepes pH7.6,2mM 2−メルカプトエタノ
ール、20μg/mlロイペプチン、50μg/mlウシ肺アプロチ
ニン（bovine lung aprotinin）,50μＭフェニルメチル
スルホニルフルオリド（PMSF）,50μg/mlトリプシン阻
害剤）を加え、テフロンペッスルホモジナイザーによっ
てホモジナイズし、15,000rpm,4℃,20minで２回遠心し
て上清を取った。葉粗抽出液1ml（HeLa細胞粗抽出液の
場合は、粗抽出液を溶解バッファーで10倍に希釈したも
の）に40μｌのpolyI:polyCセルロース懸濁液を加え
て、４℃で２時間反応させた後、洗浄バッファー（20mM
Hepes pH7.0,10mM酢酸マグネシウム,5mM KCl）で３回
遠心洗浄して0.2μl32P−rATP（10mCi/ml,3000Ci/mmol,
NEN社）を含む反応混合物（20mM Hepes pH7.0,20％グリ
セリン,7mM 2−メルカプトエタノール,2mM TAP,5mM KC
l,10mM酢酸マグネシウム）50μｌに懸濁し、30℃で一晩
（16〜20時間）反応させた。反応液中に生成された32P
標識オリゴアデニル酸は、Wellsらの方法（J.Biol.Che
m.,259,1363,1984）に従ってDEAEセルロースを用いて精
製して液体シンチレーションカウンターにて放射活性を
測定した。polyI:polyCセルロースは、Wellsらの方法
（J.Biol.Chem.,259,1363,1984）によって作製した。粗
抽出液中の蛋白質はBio−rad社のプロテインアッセイキ
ットによって測定した。
非形質転換体の値に対して、２−5Aase形質転換タバ
コは有意に高い活性を示した。また、HeLa細胞粗抽出液
は、219nmol/mg蛋白質/4hであり、２−5Aaseタバコに比
べ非常に高い活性であった。
コは有意に高い活性を示した。また、HeLa細胞粗抽出液
は、219nmol/mg蛋白質/4hであり、２−5Aaseタバコに比
べ非常に高い活性であった。
（実施例４）RNaseL導入形質転換タバコ中のRNaseL活性
の検出（図３、図４） インビトロカルチャーしたタバコ葉、マウス脾臓から
の抽出液をSilvermanらの方法（J.Biol.Chem.,263,733
6,1988）によって調製した。葉の湿重量を測定し、液体
窒素中で粉砕した後、等量のハイポバッファー（0.5％
Nonidet P−40,20mM Hepes pH7.6,10mM酢酸カリウム,15
mM酢酸マグネシウム,1mMジチオトレイトール（DTT）,10
0μM PMSF,20μg/mlロイペプチン）を加えてポリトロン
によってホモジナイズした。ホモジネートを15,000rpm,
4℃,20minで２回遠心して上清を取り粗抽出液とした。
２−5A（５′−３リン酸テトラマー、生化学工業社）及
びコントロール（ATP）セルロースは、polyI:polyCセル
ロースと同様な方法（実施例３参照）で調製した。1.0m
lタバコ葉（全長RNaseLタバコの場合は0.5ml）、マウス
脾臓抽出液（マウス脾臓抽出液はハイポバッファーで４
倍に希釈されたもの）に2.5μｌの0.1MATP、7.5μｌの3
M KClを加え、25μl ATPセルロース懸濁液と混ぜ、４℃
で１時間反応させた後、遠心し上清を取り25μl 2−5Aa
seセルロース懸濁液を加え、４℃で２時間反応させ上清
を捨てた。反応させた後、遠心して沈殿させたATPセル
ロース、２−5Aaseセルロースは、バッファーＡ（11.5m
M Hepes pH7.6,104mM KCl,5.8mM酢酸マグネシウム,8.8m
M 2−メルカプトエタノール,10μM PMSF,20μg/mlロイ
ペプチン）で３回遠心洗浄した後、50μｌバッファーＡ
で懸濁した。32Pラベル化polyU基質をSilvermanの方法
（Anal.Biochem.,144,450,1985）に従って調製した。20
μｌの懸濁液と20μｌの反応液（４μｌの100μM 2−5
A,2μｌの５×バッファーA,0.25μｌの32P−polyUpCp,
0.05μｌの10μM cold polyU,13.7μｌの水）を混ぜ、3
7℃で一晩（16時間）反応させた後、50μｌの10mg/ml酵
母RNA、1mlトリクロロ酢酸（TCA）を加え反応を停止さ
せた。氷上で15min以上放置した後、Whatman GF/Cフィ
ルター上にTCA−不溶性画分をトラップして、液体シン
チレーションカウンターにて放射活性を測定した。２−
5A依存的RNase活性（RNaseL活性）は、ATPセルロース画
分の放出活性から２−5Aセルロース画分の放射活性を引
いたものとして表した。粗抽出液中の蛋白量はBio−rad
社のプロテインアッセイキットによって測定した。非形
質転換タバコの値は０以下の値を示したのに対して、部
分長RNaseL形質転換タバコでは＋の値を示した（図
３）。全長RNaseL形質転換タバコでは、部分長RNaseLよ
りも更に高い活性を示した（図４）。
の検出（図３、図４） インビトロカルチャーしたタバコ葉、マウス脾臓から
の抽出液をSilvermanらの方法（J.Biol.Chem.,263,733
6,1988）によって調製した。葉の湿重量を測定し、液体
窒素中で粉砕した後、等量のハイポバッファー（0.5％
Nonidet P−40,20mM Hepes pH7.6,10mM酢酸カリウム,15
mM酢酸マグネシウム,1mMジチオトレイトール（DTT）,10
0μM PMSF,20μg/mlロイペプチン）を加えてポリトロン
によってホモジナイズした。ホモジネートを15,000rpm,
4℃,20minで２回遠心して上清を取り粗抽出液とした。
２−5A（５′−３リン酸テトラマー、生化学工業社）及
びコントロール（ATP）セルロースは、polyI:polyCセル
ロースと同様な方法（実施例３参照）で調製した。1.0m
lタバコ葉（全長RNaseLタバコの場合は0.5ml）、マウス
脾臓抽出液（マウス脾臓抽出液はハイポバッファーで４
倍に希釈されたもの）に2.5μｌの0.1MATP、7.5μｌの3
M KClを加え、25μl ATPセルロース懸濁液と混ぜ、４℃
で１時間反応させた後、遠心し上清を取り25μl 2−5Aa
seセルロース懸濁液を加え、４℃で２時間反応させ上清
を捨てた。反応させた後、遠心して沈殿させたATPセル
ロース、２−5Aaseセルロースは、バッファーＡ（11.5m
M Hepes pH7.6,104mM KCl,5.8mM酢酸マグネシウム,8.8m
M 2−メルカプトエタノール,10μM PMSF,20μg/mlロイ
ペプチン）で３回遠心洗浄した後、50μｌバッファーＡ
で懸濁した。32Pラベル化polyU基質をSilvermanの方法
（Anal.Biochem.,144,450,1985）に従って調製した。20
μｌの懸濁液と20μｌの反応液（４μｌの100μM 2−5
A,2μｌの５×バッファーA,0.25μｌの32P−polyUpCp,
0.05μｌの10μM cold polyU,13.7μｌの水）を混ぜ、3
7℃で一晩（16時間）反応させた後、50μｌの10mg/ml酵
母RNA、1mlトリクロロ酢酸（TCA）を加え反応を停止さ
せた。氷上で15min以上放置した後、Whatman GF/Cフィ
ルター上にTCA−不溶性画分をトラップして、液体シン
チレーションカウンターにて放射活性を測定した。２−
5A依存的RNase活性（RNaseL活性）は、ATPセルロース画
分の放出活性から２−5Aセルロース画分の放射活性を引
いたものとして表した。粗抽出液中の蛋白量はBio−rad
社のプロテインアッセイキットによって測定した。非形
質転換タバコの値は０以下の値を示したのに対して、部
分長RNaseL形質転換タバコでは＋の値を示した（図
３）。全長RNaseL形質転換タバコでは、部分長RNaseLよ
りも更に高い活性を示した（図４）。
（実施例５）キュウリモザイクウイルス（CMV Y株）感
染実験（図５、図６） R1種子（２−5Aase導入タバコ、２−5Aase＋RNaseL
（Ｔ）導入タバコ）を800μg/mlカナマイシン又は800μ
g/mlカナマイシン＋100μg/mlハイグロマイシンを含むM
S寒天培地上に播種し、２−5Aase導入タバコ植物体、２
−5Aase＋RNaseL導入植物体を選択した。幼植物は鉢上
げした後、葉の一部からDNAを抽出（Nuc.Acids Res.,2
1,4153,1993）してPCRによって２−5Aase又はRNaseL cD
NAの存在を確認した。鉢上げした後、約２週間経過した
植物体にCMV Y株３μg/mlを接種し、ウイルス感染後の
病徴の出現を観察した。各形質転換体について、５個体
を用いた。感染後、非接種上葉に病徴が現われた植物の
割合を％で示した。活性を確認した部分長RNaseLタバコ
（実施例３、図３参照）と２−5Aaseタバコを交配して
得た２−5Aase＋RNaseL（Ｔ）導入タバコは、２−5Aase
のみを導入した形質転換タバコに対して、有意に強いウ
イルス抵抗性を示した（図５）。感染８日後の形質転換
タバコ（２−5Aase＃11b,2−5Aase＃11b＋RNaseL＃H4）
の非接種上葉を各形質転換体、５個体ずつから切り取
り、５倍量のSDSバッファー（２％SDS,80mM Tris−HCl
pH6.8,2％２−メルカプトエタノール,10％グリセリン）
で全蛋白質を抽出し、各サンプルをSDS電気泳動用サン
プルバッファーで100倍に希釈して、10μｌをSDSポリア
クリルアミド電気泳動で分画した。ポリビニリデンジフ
ルオリド（PVDF）膜（ミリポア社）へ蛋白質を転写し
て、抗CMVウサギ血清（約2000倍希釈）とプロテインＡ
−アルカリホスファターゼ発色により感染植物葉中のCM
Vを検出した。２−5Aase＃11bタバコの非接種上葉で
は、強いCMV蓄積がサンプリングした５個体全てに見ら
れたのに対して、２−5Aase＃11b＋RNaseL＃H4タバコで
は、５個体中で２個体にのみしか見られなかった（図
６）。
染実験（図５、図６） R1種子（２−5Aase導入タバコ、２−5Aase＋RNaseL
（Ｔ）導入タバコ）を800μg/mlカナマイシン又は800μ
g/mlカナマイシン＋100μg/mlハイグロマイシンを含むM
S寒天培地上に播種し、２−5Aase導入タバコ植物体、２
−5Aase＋RNaseL導入植物体を選択した。幼植物は鉢上
げした後、葉の一部からDNAを抽出（Nuc.Acids Res.,2
1,4153,1993）してPCRによって２−5Aase又はRNaseL cD
NAの存在を確認した。鉢上げした後、約２週間経過した
植物体にCMV Y株３μg/mlを接種し、ウイルス感染後の
病徴の出現を観察した。各形質転換体について、５個体
を用いた。感染後、非接種上葉に病徴が現われた植物の
割合を％で示した。活性を確認した部分長RNaseLタバコ
（実施例３、図３参照）と２−5Aaseタバコを交配して
得た２−5Aase＋RNaseL（Ｔ）導入タバコは、２−5Aase
のみを導入した形質転換タバコに対して、有意に強いウ
イルス抵抗性を示した（図５）。感染８日後の形質転換
タバコ（２−5Aase＃11b,2−5Aase＃11b＋RNaseL＃H4）
の非接種上葉を各形質転換体、５個体ずつから切り取
り、５倍量のSDSバッファー（２％SDS,80mM Tris−HCl
pH6.8,2％２−メルカプトエタノール,10％グリセリン）
で全蛋白質を抽出し、各サンプルをSDS電気泳動用サン
プルバッファーで100倍に希釈して、10μｌをSDSポリア
クリルアミド電気泳動で分画した。ポリビニリデンジフ
ルオリド（PVDF）膜（ミリポア社）へ蛋白質を転写し
て、抗CMVウサギ血清（約2000倍希釈）とプロテインＡ
−アルカリホスファターゼ発色により感染植物葉中のCM
Vを検出した。２−5Aase＃11bタバコの非接種上葉で
は、強いCMV蓄積がサンプリングした５個体全てに見ら
れたのに対して、２−5Aase＃11b＋RNaseL＃H4タバコで
は、５個体中で２個体にのみしか見られなかった（図
６）。
（実施例６）キュウリモザイクウイルス（CMV Y株）感
染実験 R1種子（２−5Aase導入タバコ、１系統（２−5Aase＃
13b）;RNaseL（Ｆ）導入タバコ、３系統（RNaseL（Ｆ）
＃23a、RNaseL（Ｆ）＃27a、RNaseL（Ｆ）＃30b））、F
1種子（２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、３系統
（２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a、２−5Aase＃13
b＋RNaseL（Ｆ）＃27a、２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）
＃30b））を100μg/mlハイグロマイシンを含むMS寒天培
地上に播種し、RNaseL（Ｆ）導入植物体を選抜した。幼
植物は鉢上げした後、葉の一部からDNAを抽出してPCRに
よって２−5Aase又はRNaseL（Ｆ）cDNAの存在を確認し
た（実施例５参照）。鉢上げした後、約４週間経過した
植物体にCMV Y株15μg/mlを接種し、ウイルス感染後の
経過、病徴の出現を観察した。各形質転換体の系統につ
いて５個体を接種実験に供した。その結果、感染３日後
に、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコの、すべての
系統、すべての個体の接種葉に壊死斑が観察された。一
方、２−5Aase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコで
は壊死斑は観察されなかった（図７）。更に、感染後12
日目では、２−5Aase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タ
バコでは、すべての系統、すべての個体で非接種上葉で
病徴が観察されたが、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タ
バコにおいては、すべての系統、すべての個体の非接種
上葉で病徴は観察されなかった（図８）。各形質転換タ
バコの感染５日後の接種葉の壊死斑部分と同一の葉で壊
死斑を形成していない部分、及び感染12日後の非接種上
葉より、実施例５で示した方法で全蛋白質を抽出し、感
染植物葉中のCMVを検出した。その結果、感染５日後の
接種葉では、２−5Aase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入
タバコでは大量のCMVが蓄積されている一方、２−5Aase
＋RNaseL（Ｆ）導入タバコにおいては、壊死斑部分にお
いて少量のCMVが検出されたものの、壊死斑を形成して
いない部分ではCMVは検出されなかった（図９）。ま
た、感染12日後の非接種上葉においても、２−5Aase導
入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコでは大量のCMVが蓄
積されている一方、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバ
コにおいては、CMVは全く検出されなかった（図10）。
これらのことから、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバ
コにおいては、接種葉においてCMV感染によって壊死斑
を形成し、感染された細胞が壊死し、それによってウイ
ルスが広がるのを防ぎ、結果として全く病徴が現われな
かったと考えられる。
染実験 R1種子（２−5Aase導入タバコ、１系統（２−5Aase＃
13b）;RNaseL（Ｆ）導入タバコ、３系統（RNaseL（Ｆ）
＃23a、RNaseL（Ｆ）＃27a、RNaseL（Ｆ）＃30b））、F
1種子（２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、３系統
（２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a、２−5Aase＃13
b＋RNaseL（Ｆ）＃27a、２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）
＃30b））を100μg/mlハイグロマイシンを含むMS寒天培
地上に播種し、RNaseL（Ｆ）導入植物体を選抜した。幼
植物は鉢上げした後、葉の一部からDNAを抽出してPCRに
よって２−5Aase又はRNaseL（Ｆ）cDNAの存在を確認し
た（実施例５参照）。鉢上げした後、約４週間経過した
植物体にCMV Y株15μg/mlを接種し、ウイルス感染後の
経過、病徴の出現を観察した。各形質転換体の系統につ
いて５個体を接種実験に供した。その結果、感染３日後
に、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコの、すべての
系統、すべての個体の接種葉に壊死斑が観察された。一
方、２−5Aase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコで
は壊死斑は観察されなかった（図７）。更に、感染後12
日目では、２−5Aase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タ
バコでは、すべての系統、すべての個体で非接種上葉で
病徴が観察されたが、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タ
バコにおいては、すべての系統、すべての個体の非接種
上葉で病徴は観察されなかった（図８）。各形質転換タ
バコの感染５日後の接種葉の壊死斑部分と同一の葉で壊
死斑を形成していない部分、及び感染12日後の非接種上
葉より、実施例５で示した方法で全蛋白質を抽出し、感
染植物葉中のCMVを検出した。その結果、感染５日後の
接種葉では、２−5Aase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入
タバコでは大量のCMVが蓄積されている一方、２−5Aase
＋RNaseL（Ｆ）導入タバコにおいては、壊死斑部分にお
いて少量のCMVが検出されたものの、壊死斑を形成して
いない部分ではCMVは検出されなかった（図９）。ま
た、感染12日後の非接種上葉においても、２−5Aase導
入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコでは大量のCMVが蓄
積されている一方、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバ
コにおいては、CMVは全く検出されなかった（図10）。
これらのことから、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバ
コにおいては、接種葉においてCMV感染によって壊死斑
を形成し、感染された細胞が壊死し、それによってウイ
ルスが広がるのを防ぎ、結果として全く病徴が現われな
かったと考えられる。
（実施例７）接種源としてウイルス感染植物葉粗汁液を
用いたキュウリモザイクウイルス（CMV Y株）感染実験 R1種子（２−5Aase導入タバコ、１系統（２−5Aase＃
13b）;RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２系統（RNaseL（Ｆ）
＃23a、RNaseL（Ｆ）＃30b））、F1種子（２−5Aase＋R
NaseL（Ｆ）導入タバコ、２系統（２−5Aase＃13b＋RNa
seL（Ｆ）＃23a、２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30
b））を用いて、実施例６で示した方法で植物体を育成
した。鉢上げした後、約２週間経過した植物体にCMV Y
株を感染させ病徴を呈したタバコ葉（Xanthi nc株）
を、葉の重量あたり10倍量の抽出緩衝液（10mMリン酸緩
衝液（pH7.0）、20mM2−メルカプトエタノール）で摩砕
し、その粗汁液を鉢上げした後約２週間経過した植物体
に接種し、接種後の経過、病徴の出現を観察した。各形
質転換体の系統について２個体を接種実験に供した。そ
の結果、実施例６で示した、15μg/mlの純化ウイルスを
接種した際と同様の経過が観察された。つまり、接種３
日後に、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコの、すべ
ての系統、すべての個体の接種葉に壊死斑が観察され
た。一方、２−5Aase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タ
バコでは壊死斑は観察されなかった。接種５日後の接種
葉を図11に示した。更に、感染12日後では、２−5Aase
導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコでは、すべての系
統、すべての個体で非接種上葉で病徴が観察されたが、
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコにおいては、すべ
ての系統、すべての個体の非接種上葉で病徴は観察され
なかった。接種16日後の植物体を図12に示した。このこ
とは、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコのCMV Y株に
対する抵抗性反応は、接種源の形状（純化ウイルス、感
染葉粗汁液）によって相違しないことを示す。
用いたキュウリモザイクウイルス（CMV Y株）感染実験 R1種子（２−5Aase導入タバコ、１系統（２−5Aase＃
13b）;RNaseL（Ｆ）導入タバコ、２系統（RNaseL（Ｆ）
＃23a、RNaseL（Ｆ）＃30b））、F1種子（２−5Aase＋R
NaseL（Ｆ）導入タバコ、２系統（２−5Aase＃13b＋RNa
seL（Ｆ）＃23a、２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃30
b））を用いて、実施例６で示した方法で植物体を育成
した。鉢上げした後、約２週間経過した植物体にCMV Y
株を感染させ病徴を呈したタバコ葉（Xanthi nc株）
を、葉の重量あたり10倍量の抽出緩衝液（10mMリン酸緩
衝液（pH7.0）、20mM2−メルカプトエタノール）で摩砕
し、その粗汁液を鉢上げした後約２週間経過した植物体
に接種し、接種後の経過、病徴の出現を観察した。各形
質転換体の系統について２個体を接種実験に供した。そ
の結果、実施例６で示した、15μg/mlの純化ウイルスを
接種した際と同様の経過が観察された。つまり、接種３
日後に、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコの、すべ
ての系統、すべての個体の接種葉に壊死斑が観察され
た。一方、２−5Aase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タ
バコでは壊死斑は観察されなかった。接種５日後の接種
葉を図11に示した。更に、感染12日後では、２−5Aase
導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコでは、すべての系
統、すべての個体で非接種上葉で病徴が観察されたが、
２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコにおいては、すべ
ての系統、すべての個体の非接種上葉で病徴は観察され
なかった。接種16日後の植物体を図12に示した。このこ
とは、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコのCMV Y株に
対する抵抗性反応は、接種源の形状（純化ウイルス、感
染葉粗汁液）によって相違しないことを示す。
（実施例８）ポテトウイルスY T株（PVY T株）感染実験 R1種子（２−5Aase導入タバコ、１系統（２−5Aase＃
13b）;RNaseL（Ｆ）導入タバコ、３系統（RNaseL（Ｆ）
＃23a、RNaseL（Ｆ）＃27a、RNaseL（Ｆ）＃30b））、F
1種子（２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、３系統
（２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a、２−5Aase＃13
b＋RNaseL（Ｆ）＃27a、２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）
＃30b））を用いて、実施例６で示した方法で植物体を
育成した。鉢上げした後、約２週間経過した植物体にPV
Y T株を感染させ病徴を呈したタバコ葉（Samsun株）
を、葉の重量あたり10倍量の抽出緩衝液（10mMリン酸緩
衝液（pH7.0）、20mM2−メルカプトエタノール）で摩砕
し、その粗汁液を鉢上げした後約２週間経過した植物体
に接種し、接種後の経過、病徴の出現を観察した。各形
質転換体の系統について５から７個体を接種実験に供し
た。その結果、CMV Y株を接種した際と同様に、接種３
日後に、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコの、すべ
ての系統、すべての個体の接種葉に壊死斑が観察され
た。一方、２−5Aase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タ
バコでは壊死斑は観察されなかった。接種５日後の接種
葉を図13に示した。更に、接種５日後に、２−5Aase＋R
NaseL（Ｆ）導入タバコの、すべての系統、すべての個
体の非接種上葉に壊疽が形成され始めた。その壊疽は徐
々に広がり、接種20日後には、ほぼ完全に枯死した。接
種14日後における植物体を図14に示した。一方、２−5A
ase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコでは枯死する
ことはなく、PVY T株特有の病徴を呈した。
13b）;RNaseL（Ｆ）導入タバコ、３系統（RNaseL（Ｆ）
＃23a、RNaseL（Ｆ）＃27a、RNaseL（Ｆ）＃30b））、F
1種子（２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、３系統
（２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a、２−5Aase＃13
b＋RNaseL（Ｆ）＃27a、２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）
＃30b））を用いて、実施例６で示した方法で植物体を
育成した。鉢上げした後、約２週間経過した植物体にPV
Y T株を感染させ病徴を呈したタバコ葉（Samsun株）
を、葉の重量あたり10倍量の抽出緩衝液（10mMリン酸緩
衝液（pH7.0）、20mM2−メルカプトエタノール）で摩砕
し、その粗汁液を鉢上げした後約２週間経過した植物体
に接種し、接種後の経過、病徴の出現を観察した。各形
質転換体の系統について５から７個体を接種実験に供し
た。その結果、CMV Y株を接種した際と同様に、接種３
日後に、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコの、すべ
ての系統、すべての個体の接種葉に壊死斑が観察され
た。一方、２−5Aase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タ
バコでは壊死斑は観察されなかった。接種５日後の接種
葉を図13に示した。更に、接種５日後に、２−5Aase＋R
NaseL（Ｆ）導入タバコの、すべての系統、すべての個
体の非接種上葉に壊疽が形成され始めた。その壊疽は徐
々に広がり、接種20日後には、ほぼ完全に枯死した。接
種14日後における植物体を図14に示した。一方、２−5A
ase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコでは枯死する
ことはなく、PVY T株特有の病徴を呈した。
各形質転換タバコの接種５日後及び接種10日後の非接
種上葉より、実施例５で示した方法で全蛋白質を抽出
し、PVY T株の蓄積を検出した。その結果、接種５日後
及び接種10日後の非接種上葉のいずれの場合も２−5Aas
e導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコではPVY T株が蓄
積されている一方、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバ
コにおいては、PVY T株の蓄積は検出されなかった（図1
5）。これらのことから、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入
タバコにおいては、接種葉においてPVY T株感染によっ
て壊死斑を形成し、感染された細胞が壊死するものの、
何らかの原因で非接種上葉でもRNaseLが活性化され、全
身枯死が引き起こされたと考えられる。しかし、壊疽が
出現しはじめた接種５日後と壊疽が進行してきた接種10
日後の非接種上葉においてもPVY T株の蓄積が検出され
なかったことは、全身枯死の直接の原因がPVY T株の過
剰蓄積によるものではないことを示している。実際の現
場では、ウイルス感染植物は周囲の植物にウイルスを広
げる（二次感染）ことを避けるために早期に処分するこ
とが行われている。２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバ
コが、PVY T株感染によってウイルスを蓄積する過程を
経ずに枯死することは、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入
植物は、たとえPVY T株が感染しても二次感染源にはな
らず、自然に枯死することによって実栽培の際の省力が
期待できる。
種上葉より、実施例５で示した方法で全蛋白質を抽出
し、PVY T株の蓄積を検出した。その結果、接種５日後
及び接種10日後の非接種上葉のいずれの場合も２−5Aas
e導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコではPVY T株が蓄
積されている一方、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバ
コにおいては、PVY T株の蓄積は検出されなかった（図1
5）。これらのことから、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入
タバコにおいては、接種葉においてPVY T株感染によっ
て壊死斑を形成し、感染された細胞が壊死するものの、
何らかの原因で非接種上葉でもRNaseLが活性化され、全
身枯死が引き起こされたと考えられる。しかし、壊疽が
出現しはじめた接種５日後と壊疽が進行してきた接種10
日後の非接種上葉においてもPVY T株の蓄積が検出され
なかったことは、全身枯死の直接の原因がPVY T株の過
剰蓄積によるものではないことを示している。実際の現
場では、ウイルス感染植物は周囲の植物にウイルスを広
げる（二次感染）ことを避けるために早期に処分するこ
とが行われている。２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバ
コが、PVY T株感染によってウイルスを蓄積する過程を
経ずに枯死することは、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入
植物は、たとえPVY T株が感染しても二次感染源にはな
らず、自然に枯死することによって実栽培の際の省力が
期待できる。
（実施例９）ポテトウイルスY O株（PVY O株）感染実験 R1種子（２−5Aase導入タバコ、１系統（２−5Aase＃
13b）;RNaseL（Ｆ）導入タバコ、３系統（RNaseL（Ｆ）
＃23a、RNaseL（Ｆ）＃27a、RNaseL（Ｆ）＃30b））、F
1種子（２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、３系統
（２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a、２−5Aase＃13
b＋RNaseL（Ｆ）＃27a、２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）
＃30b））を用いて、実施例６で示した方法で植物体を
育成した。鉢上げした後、約２週間経過した植物体にPV
Y O株を感染させ病徴を呈したタバコ葉（Samsun株）
を、葉の重量あたり10倍量の抽出緩衝液（10mMリン酸緩
衝液（pH7.0）、20mM2−メルカプトエタノール）で摩砕
し、その粗汁液を鉢上げした後約２週間経過した植物体
に接種し、接種後の経過、病徴の出現を観察した。各形
質転換体の系統について５個体を接種実験に供した。そ
の結果、PVY T株を接種した際とほぼ同様な結果が観察
された。つまり、接種３日後に、２−5Aase＋RNaseL
（Ｆ）導入タバコの、すべての系統、すべての個体の接
種葉に壊死斑が観察された。一方、２−5Aase導入タバ
コ、RNaseL（Ｆ）導入タバコでは壊死斑は観察されなか
った（図16）。更に、接種５日後に２−5Aase＋RNaseL
（Ｆ）導入タバコの、すべての系統、すべての個体の非
接種上葉に壊疽が形成され始めた。その壊疽は徐々に広
がり、接種20日後には、ほぼ完全に枯死した。接種15日
後の植物体を図17に示した。一方、２−5Aase導入タバ
コ、RNaseL（Ｆ）導入タバコでは枯死することはなく、
PVY O株特有の病徴を呈した。
13b）;RNaseL（Ｆ）導入タバコ、３系統（RNaseL（Ｆ）
＃23a、RNaseL（Ｆ）＃27a、RNaseL（Ｆ）＃30b））、F
1種子（２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、３系統
（２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a、２−5Aase＃13
b＋RNaseL（Ｆ）＃27a、２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）
＃30b））を用いて、実施例６で示した方法で植物体を
育成した。鉢上げした後、約２週間経過した植物体にPV
Y O株を感染させ病徴を呈したタバコ葉（Samsun株）
を、葉の重量あたり10倍量の抽出緩衝液（10mMリン酸緩
衝液（pH7.0）、20mM2−メルカプトエタノール）で摩砕
し、その粗汁液を鉢上げした後約２週間経過した植物体
に接種し、接種後の経過、病徴の出現を観察した。各形
質転換体の系統について５個体を接種実験に供した。そ
の結果、PVY T株を接種した際とほぼ同様な結果が観察
された。つまり、接種３日後に、２−5Aase＋RNaseL
（Ｆ）導入タバコの、すべての系統、すべての個体の接
種葉に壊死斑が観察された。一方、２−5Aase導入タバ
コ、RNaseL（Ｆ）導入タバコでは壊死斑は観察されなか
った（図16）。更に、接種５日後に２−5Aase＋RNaseL
（Ｆ）導入タバコの、すべての系統、すべての個体の非
接種上葉に壊疽が形成され始めた。その壊疽は徐々に広
がり、接種20日後には、ほぼ完全に枯死した。接種15日
後の植物体を図17に示した。一方、２−5Aase導入タバ
コ、RNaseL（Ｆ）導入タバコでは枯死することはなく、
PVY O株特有の病徴を呈した。
各形質転換タバコの接種５日後の接種葉と６日後の非
接種上葉より、実施例５で示した方法で全蛋白質を抽出
し、感染植物葉中のPVY O株を検出した。その結果、接
種５日後の接種葉と６日後の非接種上葉ともに、２−5A
ase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコではPVY O株が
蓄積されている一方、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タ
バコにおいては、PVY O株の蓄積は検出されなかった
（図18）。これらのことから、PVY O株接種に対して
も、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコは、接種葉に
おいてPVY感染によって壊死斑を形成し、感染された細
胞が壊死するものの、ウイルスを蓄積する過程を経ずに
枯死することが解かった。このことは、２−5Aase＋RNa
seL（Ｆ）導入タバコがウイルス感染によって枯死する
性質は、PVYの株によって相違するものではなく、PVYそ
のものに対する反応であると考えられる。２−5Aase＋R
NaseL（Ｆ）導入タバコは、PVY O株の感染に対してもPV
Y T株感染に対するのと同様に栽培の際の省力が期待で
き、かつ二次感染源にはならないと考えられる。
接種上葉より、実施例５で示した方法で全蛋白質を抽出
し、感染植物葉中のPVY O株を検出した。その結果、接
種５日後の接種葉と６日後の非接種上葉ともに、２−5A
ase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコではPVY O株が
蓄積されている一方、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タ
バコにおいては、PVY O株の蓄積は検出されなかった
（図18）。これらのことから、PVY O株接種に対して
も、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコは、接種葉に
おいてPVY感染によって壊死斑を形成し、感染された細
胞が壊死するものの、ウイルスを蓄積する過程を経ずに
枯死することが解かった。このことは、２−5Aase＋RNa
seL（Ｆ）導入タバコがウイルス感染によって枯死する
性質は、PVYの株によって相違するものではなく、PVYそ
のものに対する反応であると考えられる。２−5Aase＋R
NaseL（Ｆ）導入タバコは、PVY O株の感染に対してもPV
Y T株感染に対するのと同様に栽培の際の省力が期待で
き、かつ二次感染源にはならないと考えられる。
（実施例10）緩衝液 接種F1種子（２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ、
３系統（２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a、２−5Aa
se＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃27a、２−5Aase＃13b＋RNaseL
（Ｆ）＃30b））を用いて、実施例６で示した方法で植
物体を育成した。鉢上げした後、約２週間経過した植物
体に抽出緩衝液（10mMリン酸緩衝液（pH7.0）、20mM2−
メルカプトエタノール）を接種し、接種後の経過、病徴
の出現を観察した。各形質転換体の系統について２個体
を接種実験に供した。その結果、接種10日後においても
接種葉、非接種葉ともに変化は観察されなかった。
３系統（２−5Aase＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃23a、２−5Aa
se＃13b＋RNaseL（Ｆ）＃27a、２−5Aase＃13b＋RNaseL
（Ｆ）＃30b））を用いて、実施例６で示した方法で植
物体を育成した。鉢上げした後、約２週間経過した植物
体に抽出緩衝液（10mMリン酸緩衝液（pH7.0）、20mM2−
メルカプトエタノール）を接種し、接種後の経過、病徴
の出現を観察した。各形質転換体の系統について２個体
を接種実験に供した。その結果、接種10日後においても
接種葉、非接種葉ともに変化は観察されなかった。
このことは、前記した一連の２−5Aase＋RNaseL
（Ｆ）導入タバコのウイルス接種後の反応は、まさにウ
イルスによって引き起こされており、緩衝液成分や接種
そのものの行為によって引き起こされたのではないこと
を示す。
（Ｆ）導入タバコのウイルス接種後の反応は、まさにウ
イルスによって引き起こされており、緩衝液成分や接種
そのものの行為によって引き起こされたのではないこと
を示す。
（実施例11）ウシ由来２−5Aase、ウシ由来RNaseL cDNA
のクローニングとその塩基配列の決定 ウシ脾臓由来ファージlambda gt10 cDNAライブラリー
（Clontech社）より、石田らの方法（遺伝子発現実験マ
ニュアル第２章、1994年講談社刊）によりファージDNA
を抽出してPCRのDNAテンプレートとして用いた。ウシ２
−5Aase、RNaseL cDNA断片のPCRクローニングのプライ
マーは、ヒト２−5Aase cDNA（EMBO J.,４,2249,198
5）、ヒトRNaseL cDNA（Cell,72,753,1993）の塩基配列
を参考にして以下のようにデザインした。
のクローニングとその塩基配列の決定 ウシ脾臓由来ファージlambda gt10 cDNAライブラリー
（Clontech社）より、石田らの方法（遺伝子発現実験マ
ニュアル第２章、1994年講談社刊）によりファージDNA
を抽出してPCRのDNAテンプレートとして用いた。ウシ２
−5Aase、RNaseL cDNA断片のPCRクローニングのプライ
マーは、ヒト２−5Aase cDNA（EMBO J.,４,2249,198
5）、ヒトRNaseL cDNA（Cell,72,753,1993）の塩基配列
を参考にして以下のようにデザインした。
石田らの方法によってPCR反応を行い、増幅されたDNA
断片をpBluescript SKII+プラスミド（Stratagene社）
へサブクローニングした（遺伝子発現実験マニュアル第
２章、1994年講談社刊）。これらのPCR増幅DNA断片（２
−5Aase:455bp、RNaseL:292bp）の塩基配列を決定し、
それらとヒト２−5Aase、RNaseLの塩基配列をそれぞれ
比較したところ、相同性［２−5Aase:80％、RNaseL:73
％（プライマーの配列部分は計算から除いた）］が認め
られた。よって、これらのPCR増幅DNA断片はそれぞれ、
ウシ由来２−5Aase、RNaseL cDNAの一部であることが確
認された。
断片をpBluescript SKII+プラスミド（Stratagene社）
へサブクローニングした（遺伝子発現実験マニュアル第
２章、1994年講談社刊）。これらのPCR増幅DNA断片（２
−5Aase:455bp、RNaseL:292bp）の塩基配列を決定し、
それらとヒト２−5Aase、RNaseLの塩基配列をそれぞれ
比較したところ、相同性［２−5Aase:80％、RNaseL:73
％（プライマーの配列部分は計算から除いた）］が認め
られた。よって、これらのPCR増幅DNA断片はそれぞれ、
ウシ由来２−5Aase、RNaseL cDNAの一部であることが確
認された。
ここで得られたPCR増幅DNA断片をプローブに用いて、
ウシ脾臓由来cDNAファージライブラリーをスクリーニン
グして２−5Aase、RNaseL cDNA全長をコードするファー
ジクローンを単離した。単離されたファージクローンか
らDNAを抽出して、cDNAインサートをpBluescript SKII+
プラスミドへサブクローニングし、アプライドバイオシ
ステムズ社DNAシークエンサー373Aを使用し、蛍光ダイ
ターミネーター法によりDNA塩基配列を決定し、それか
ら予測されるアミノ酸配列を明らかにした（図19:ウシ
２−5Aase cDNA、図20:ウシRNaseL cDNA）。その結果、
ウシ２−5Aaseは、ヒト２−5AaseE18（EMBO J.,４,224
9,1985）、マウス２−5AaseL3（Virology,179,228,199
0）と相同性を持つことがわかった。
ウシ脾臓由来cDNAファージライブラリーをスクリーニン
グして２−5Aase、RNaseL cDNA全長をコードするファー
ジクローンを単離した。単離されたファージクローンか
らDNAを抽出して、cDNAインサートをpBluescript SKII+
プラスミドへサブクローニングし、アプライドバイオシ
ステムズ社DNAシークエンサー373Aを使用し、蛍光ダイ
ターミネーター法によりDNA塩基配列を決定し、それか
ら予測されるアミノ酸配列を明らかにした（図19:ウシ
２−5Aase cDNA、図20:ウシRNaseL cDNA）。その結果、
ウシ２−5Aaseは、ヒト２−5AaseE18（EMBO J.,４,224
9,1985）、マウス２−5AaseL3（Virology,179,228,199
0）と相同性を持つことがわかった。
ここに得られたウシ２−5Aase、ウシRNaseL cDNAを植
物で発現させることによって、ウイルス抵抗性植物の育
種が可能となる。
物で発現させることによって、ウイルス抵抗性植物の育
種が可能となる。
（実施例12）タバコ植物サムソン（Nicotiana tabacum
cv Samsun）の形質転換 形質転換には、タバコ植物サムソン（Ｎ遺伝子の表現
系としてnn）を用いた。実施例２で示した方法、つまり
pBI2−5Aase又はpBIBRNaseL（Ｆ）をそれぞれ導入した
アグロバクテリウムLBA4404によって形質転換体を作出
した（２−5Aase（Ｓ）タバコ、RNaseL（Ｓ）タバ
コ）。得られた形質転換体を鉢上げし、自家受粉によっ
てR1種子を、また交配によってF1種子（２−5Aase
（Ｓ）＋RNaseL（Ｓ）タバコ）を得た。
cv Samsun）の形質転換 形質転換には、タバコ植物サムソン（Ｎ遺伝子の表現
系としてnn）を用いた。実施例２で示した方法、つまり
pBI2−5Aase又はpBIBRNaseL（Ｆ）をそれぞれ導入した
アグロバクテリウムLBA4404によって形質転換体を作出
した（２−5Aase（Ｓ）タバコ、RNaseL（Ｓ）タバ
コ）。得られた形質転換体を鉢上げし、自家受粉によっ
てR1種子を、また交配によってF1種子（２−5Aase
（Ｓ）＋RNaseL（Ｓ）タバコ）を得た。
（実施例13）２−5Aase導入形質転換タバコ（サムソ
ン）及びRNaseL（Ｆ）導入形質転換タバコ（サムソン）
中の２−5Aase及びRNaseL活性の検出 ２−5Aase活性の検出は実施例３で示した方法で、ま
た、RNaseL活性の検出は実施例４で示した方法によって
行った。その結果を図21及び22に示した。その結果、２
−5Aase（Ｓ）タバコ中の２−5Aase活性、及びRNaseL
（Ｓ）タバコ中のRNaseL活性はともに非形質転換体に比
べて有意に高い値を示した。
ン）及びRNaseL（Ｆ）導入形質転換タバコ（サムソン）
中の２−5Aase及びRNaseL活性の検出 ２−5Aase活性の検出は実施例３で示した方法で、ま
た、RNaseL活性の検出は実施例４で示した方法によって
行った。その結果を図21及び22に示した。その結果、２
−5Aase（Ｓ）タバコ中の２−5Aase活性、及びRNaseL
（Ｓ）タバコ中のRNaseL活性はともに非形質転換体に比
べて有意に高い値を示した。
（実施例14）サムソン形質転換体への、接種源としてウ
イルス感染植物葉粗汁液を用いたキュウリモザイクウイ
ルス（CMV Y株）感染実験 R1種子（２−5Aase導入タバコ（２−5Aase（Ｓ）＃13
−10）、RNaseL（Ｆ）導入タバコ（RNaseL（Ｓ）＃57−
6b））、F1種子（２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ
（２−5Aase（Ｓ）＃13−10＋RNaseL（Ｓ）＋＃57−6
b））を用いて、実施例６で示した方法で植物体を育成
した。鉢上げした後、約２週間経過した植物体に、実施
例７で示した方法でCMV Y株の感染植物粗汁液を接種
し、接種後の経過、病徴の出現を観察した。各形質転換
体の系統について３個体を接種実験に供した。その結
果、実施例６、７で示した、キサンチ（Ｎ遺伝子の表現
系としてNN）形質転換体にCMV Y株を接種した際と同様
な経過が観察された。つまり、接種３日後に、２−5Aas
e＋RNaseL（Ｆ）導入タバコの、すべての系統、すべて
の個体の接種葉に壊死斑が観察された。一方、２−5Aas
e導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコでは壊死斑は観
察されなかった（図23）。更に、感染10日後では、２−
5Aase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコでは、すべ
ての系統、すべての個体で非接種上葉で病徴が観察され
たが、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコにおいて
は、すべての系統、すべての個体の非接種上葉で病徴は
観察されなかった（図24）。このことは、２−5Aase＋R
NaseL（Ｆ）導入タバコのCMV Y株に対する抵抗性反応
は、宿主に用いたタバコのＮ遺伝子の表現系によらない
ことを示す。
イルス感染植物葉粗汁液を用いたキュウリモザイクウイ
ルス（CMV Y株）感染実験 R1種子（２−5Aase導入タバコ（２−5Aase（Ｓ）＃13
−10）、RNaseL（Ｆ）導入タバコ（RNaseL（Ｓ）＃57−
6b））、F1種子（２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコ
（２−5Aase（Ｓ）＃13−10＋RNaseL（Ｓ）＋＃57−6
b））を用いて、実施例６で示した方法で植物体を育成
した。鉢上げした後、約２週間経過した植物体に、実施
例７で示した方法でCMV Y株の感染植物粗汁液を接種
し、接種後の経過、病徴の出現を観察した。各形質転換
体の系統について３個体を接種実験に供した。その結
果、実施例６、７で示した、キサンチ（Ｎ遺伝子の表現
系としてNN）形質転換体にCMV Y株を接種した際と同様
な経過が観察された。つまり、接種３日後に、２−5Aas
e＋RNaseL（Ｆ）導入タバコの、すべての系統、すべて
の個体の接種葉に壊死斑が観察された。一方、２−5Aas
e導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコでは壊死斑は観
察されなかった（図23）。更に、感染10日後では、２−
5Aase導入タバコ、RNaseL（Ｆ）導入タバコでは、すべ
ての系統、すべての個体で非接種上葉で病徴が観察され
たが、２−5Aase＋RNaseL（Ｆ）導入タバコにおいて
は、すべての系統、すべての個体の非接種上葉で病徴は
観察されなかった（図24）。このことは、２−5Aase＋R
NaseL（Ｆ）導入タバコのCMV Y株に対する抵抗性反応
は、宿主に用いたタバコのＮ遺伝子の表現系によらない
ことを示す。
産業上の利用の可能性 ２−5Aase/RNaseLシステムは、ウイルスが細胞に感染
したときに産生される二本鎖RNAを認識して細胞質でリ
ボヌクレアーゼ活性を発現し、ウイルス増殖を抑制す
る。一般にRNAウイルスは、複製の段階で二本鎖RNAを形
成するため、本システムは全てのRNAウイルスに対して
有効である。
したときに産生される二本鎖RNAを認識して細胞質でリ
ボヌクレアーゼ活性を発現し、ウイルス増殖を抑制す
る。一般にRNAウイルスは、複製の段階で二本鎖RNAを形
成するため、本システムは全てのRNAウイルスに対して
有効である。
よって、本発明で示した遺伝子組換えにより２−5Aas
eとRNaseLを導入するウイルス抵抗性植物の作出技術
は、ウイルス抵抗性植物品種の育成に広く応用できる。
eとRNaseLを導入するウイルス抵抗性植物の作出技術
は、ウイルス抵抗性植物品種の育成に広く応用できる。
配列表 配列番号:1 配列の長さ:1322 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 起源 生物名：ヒト 配列 配列番号:2 配列の長さ:50 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 配列番号:3 配列の長さ:2378 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 起源 生物名：ヒト 配列 配列番号:4 配列の長さ:51 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 配列番号:5 配列の長さ:32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 配列番号:6 配列の長さ:32 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 配列番号:7 配列の長さ:35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 配列番号:8 配列の長さ:35 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列 配列番号:9 配列の長さ:1170 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 起源 生物名：ウシ 配列 配列番号:10 配列の長さ:2157 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類:cDNA 起源 生物名：ウシ 配列
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (31)優先権主張番号 特願平8−52010 (32)優先日 平成８年３月８日(1996．3．8) (33)優先権主張国 日本（ＪＰ） (72)発明者 石田 功 神奈川県横浜市金沢区福浦１−13−５ 麒麟麦酒株式会社 基盤技術研究所内 (56)参考文献 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏ ｌ．11（1993）ｐｐ．1048−1052 Ｃｅｌｌ，Ｖｏｌ．72，Ｎｏ．５ （1993）ｐｐ．753−765 「生化学辞典（第２版）」東京化学同 人（1990）ｐｐ．236
Claims (9)
- 【請求項１】動物細胞由来２′,5′オリゴアデニル酸合
成酵素をコードするDNA配列及び動物細胞由来リボヌク
レアーゼＬをコードするDNA配列を植物染色体中に組み
込んで同時に発現させることにより、植物に壊死斑の出
現又は全身枯死を起こさせてRNAウイルスの二次感染を
防止できる植物を作出する方法。 - 【請求項２】動物細胞由来２′,5′オリゴアデニル酸合
成酵素をコードするDNA配列がヒト、マウス、ラット又
はウシのいずれか由来である請求の範囲第１項記載の方
法。 - 【請求項３】動物細胞由来２′,5′オリゴアデニル酸合
成酵素をコードするDNA配列がヒト、マウス、ラット又
はウシのいずれか由来のcDNAである請求の範囲第２項記
載の方法。 - 【請求項４】動物細胞由来リボヌクレアーゼＬをコード
するDNA配列がヒト又はウシ由来である請求の範囲第１
項記載の方法。 - 【請求項５】動物細胞由来リボヌクレアーゼＬをコード
するDNA配列がヒト又はウシ由来のcDNAである請求の範
囲第４項記載の方法。 - 【請求項６】動物細胞由来２′,5′オリゴアデニル酸合
成酵素をコードするDNA配列がヒト、マウス、ラット又
はウシのいずれか由来であり、かつ動物細胞由来リボヌ
クレアーゼＬをコードするDNA配列がヒト又はウシ由来
である請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項７】動物細胞由来２′,5′オリゴアデニル酸合
成酵素をコードするDNA配列がヒト、マウス、ラット又
はウシのいずれか由来のcDNAであり、かつ動物細胞由来
リボヌクレアーゼＬをコードするDNA配列がヒト又はウ
シ由来のcDNAである請求の範囲第６項記載の方法。 - 【請求項８】請求の範囲第１項記載の方法によって作出
された植物。 - 【請求項９】動物細胞由来２′,5′オリゴアデニル酸合
成酵素をコードするDNA配列及び動物細胞由来リボヌク
レアーゼＬをコードするDNA配列を植物染色体中に組み
込んで同時に発現させることにより、植物に壊死斑の出
現又は全身枯死を起こさせてRNAウイルスの二次感染を
防止できる植物。
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