JP3135301B2 - 胚芽系列形質転換事象の早期同定を伴う植物形質転換法 - Google Patents
胚芽系列形質転換事象の早期同定を伴う植物形質転換法Info
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Description
【産業上の利用分野】本発明は、一般に植物の遺伝子形
質転換に関し、特には植物形質転換のための粒子媒介法
を用いるダイズ植物の効率的な胚芽系列形質転換に関す
る。
質転換に関し、特には植物形質転換のための粒子媒介法
を用いるダイズ植物の効率的な胚芽系列形質転換に関す
る。
【従来の技術】いくつかの主要作物植物に、これらに可
能性ある興味の外来遺伝子を導入することが今や可能に
なってきている。遺伝子工学のこの方法は、或るモデル
種たとえばタバコ、アサガオ、ニンジンにおいて達成さ
れており、ダイズおよび綿のような主要作物種において
今や達成された。植物の遺伝子工学の手順において、植
物組織の遺伝子形質転換が、その植物組織の胚芽系列の
ものであることが望ましい。胚芽系列とは、植物が通常
の遺伝的形質遺伝により、挿入された外来遺伝子をその
子孫に伝える様式で形質転換プロセスにより永久的に変
えられた植物の遺伝可能な遺伝子物質を云う。体性の、
即ち非胚芽の系列細胞の形質転換がいくつかの場合には
望ましいが、作物植物の遺伝子工学においては一般に植
物系列の胚芽系列形質転換が出来るだけ迅速かつ効率的
に達成されることが望ましい。植物の遺伝子工学のため
に従来最も普通の技法は、土壌生育植物病原バクテリア
アグロバクテリウム チュメファシエンス（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の使用を
含む。Ａ．チュメファシエンスは、Ｔ−ＤＮＡと呼ばれ
るそのＤＮＡの一部を、感受性植物細胞のゲノム中に移
す天然の能力を有する。アグロバクテリウム株中の天然
Ｔ−ＤＮＡを変えることにより、単一の植物の細胞中に
望む遺伝子を移すためにアグロバクテリウムのこのユニ
ークな特性を用いることが可能である。もし導入された
遺伝子が、選択可能なマーカーたとえば除草剤または抗
生特性を有するなら、想定される形質転換細胞を適当な
抗性物質又は除草剤の選択力に付すことによって、組織
培養物中の形質転換された細胞を選択することが可能で
ある。不幸なことに、ダイズにおける殆んど総ての栽培
変種はアグロバクテリウム感染に抵抗し、従ってアグロ
バクテリウムでの形質転換に極めて抵抗する。加えて、
他の植物種でのアグロバクテリウム植物形質転換手順で
広く用いられている抗生耐性マーカーたとえばカナマイ
シン耐性は、ダイズ形質転換実験において限られた有用
性しか持たないことが見い出された。従って、アグロバ
クテリウム媒介形質転換技法をダイズで用いることは可
能であるが、効果的な選択マーカーの欠如の故に困難な
努力である。しかし、植物を形質転換する他の方法が存
在する。特に、標的植物組織中に物理的に射出される小
さな不活性担体粒子上にＤＮＡをコーティングすること
によって植物細胞中に形質転換性ＤＮＡを運ぶことに基
づく植物細胞の形質転換への一般的アプローチが存在す
る。粒子媒介植物細胞形質転換の技術は、タマネギの表
皮組織のような組織における体質細胞で初めて示され
た。クレイン（Ｋｌｅｉｎ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、３２７：７０：７３（１９８７）。後には、選
択可能なマーカーを用いて組織培養においてタバコの形
質転換により、遺伝子的に手を加えたタバコ植物を、粒
子媒介形質転換技術が達成でき、これは次に植物全体へ
と再生された。クレインら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８５０２−８５０５（１
９８８）。培養において植物細胞に粒子媒介形質転換技
術を用いることを試みるのではなくて、植物の生長する
未分化胚組織を粒子媒介形質転換事象に付す別のアプロ
ーチが開発された。そのような技術から、ダイズ植物の
胚芽系列の安定な形質転換が達成された。マッカベ（Ｍ
ｃＣａｂｅ）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ），６：９２３−９２６（１９８
８）。この技術は、この植物種のための選択可能マーカ
ーの入手可能性と独立ではない。未分化胚組織形質転換
に基づく粒子媒介技術を用いるダイズ植物の胚芽系列形
質転換のための技術を開発するにおいて、形質転換事象
はしばしばキメラ植物をもたらすことが発見された。こ
の植物は、その組織のいくつか（総てではなく）が導入
されたＤＮＡにより遺伝子的に形質転換された植物であ
る。マッカベら（上述）。該技術はこのように遺伝子的
に手を加えた植物を作るために有用であったが、多数の
組織を形質転換事象に付さなければならない点、及び導
入されたＤＮＡを適当に発現した特定の芽及び植物を発
見するために多数の植物を推定される形質転換組織から
培養しなければならない点でいくぶん面倒である。従っ
て、遺伝可能な胚芽系列形質転換を生じるプロセスにお
いて早期に形質転換を同定する能力は、植物の実用的か
つ費用効果的な遺伝子形質転換において劇的な節約をも
たらす能力を創成し、これは形質転換事象に付されたが
形質転換していない組織を培養するのに費やされる労
力、時間及びエネルギーの低減をもたらす。ダイズのよ
うな植物種の胚芽系列形質転換を求めるにおいて、植物
の胚芽細胞の先祖組織が成長未分化胚組織つまり芽にお
いて同定されるなら、それは有用であろう。不幸にも、
植物細胞の発育形態学は、ダイズ胚芽細胞の先祖細胞が
判る点まではまだ発展していない。従って、形質転換さ
れるべきものが植物未分化胚組織または胚であるなら
ば、胚芽系列形質転換を達成するためにその未分化胚組
織または胚における正確にどの細胞が形質転換されるべ
きなのかについて知識は存在しない。従って、成長する
ダイズ植物における形質転換された細胞のカテゴリーと
胚芽系列形質転換事象の間の何らかの相関関係が経験的
に見い出されなければならないであろう。
能性ある興味の外来遺伝子を導入することが今や可能に
なってきている。遺伝子工学のこの方法は、或るモデル
種たとえばタバコ、アサガオ、ニンジンにおいて達成さ
れており、ダイズおよび綿のような主要作物種において
今や達成された。植物の遺伝子工学の手順において、植
物組織の遺伝子形質転換が、その植物組織の胚芽系列の
ものであることが望ましい。胚芽系列とは、植物が通常
の遺伝的形質遺伝により、挿入された外来遺伝子をその
子孫に伝える様式で形質転換プロセスにより永久的に変
えられた植物の遺伝可能な遺伝子物質を云う。体性の、
即ち非胚芽の系列細胞の形質転換がいくつかの場合には
望ましいが、作物植物の遺伝子工学においては一般に植
物系列の胚芽系列形質転換が出来るだけ迅速かつ効率的
に達成されることが望ましい。植物の遺伝子工学のため
に従来最も普通の技法は、土壌生育植物病原バクテリア
アグロバクテリウム チュメファシエンス（Ａｇｒｏ
ｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の使用を
含む。Ａ．チュメファシエンスは、Ｔ−ＤＮＡと呼ばれ
るそのＤＮＡの一部を、感受性植物細胞のゲノム中に移
す天然の能力を有する。アグロバクテリウム株中の天然
Ｔ−ＤＮＡを変えることにより、単一の植物の細胞中に
望む遺伝子を移すためにアグロバクテリウムのこのユニ
ークな特性を用いることが可能である。もし導入された
遺伝子が、選択可能なマーカーたとえば除草剤または抗
生特性を有するなら、想定される形質転換細胞を適当な
抗性物質又は除草剤の選択力に付すことによって、組織
培養物中の形質転換された細胞を選択することが可能で
ある。不幸なことに、ダイズにおける殆んど総ての栽培
変種はアグロバクテリウム感染に抵抗し、従ってアグロ
バクテリウムでの形質転換に極めて抵抗する。加えて、
他の植物種でのアグロバクテリウム植物形質転換手順で
広く用いられている抗生耐性マーカーたとえばカナマイ
シン耐性は、ダイズ形質転換実験において限られた有用
性しか持たないことが見い出された。従って、アグロバ
クテリウム媒介形質転換技法をダイズで用いることは可
能であるが、効果的な選択マーカーの欠如の故に困難な
努力である。しかし、植物を形質転換する他の方法が存
在する。特に、標的植物組織中に物理的に射出される小
さな不活性担体粒子上にＤＮＡをコーティングすること
によって植物細胞中に形質転換性ＤＮＡを運ぶことに基
づく植物細胞の形質転換への一般的アプローチが存在す
る。粒子媒介植物細胞形質転換の技術は、タマネギの表
皮組織のような組織における体質細胞で初めて示され
た。クレイン（Ｋｌｅｉｎ）ら、ネイチャー（Ｎａｔｕ
ｒｅ）、３２７：７０：７３（１９８７）。後には、選
択可能なマーカーを用いて組織培養においてタバコの形
質転換により、遺伝子的に手を加えたタバコ植物を、粒
子媒介形質転換技術が達成でき、これは次に植物全体へ
と再生された。クレインら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：８５０２−８５０５（１
９８８）。培養において植物細胞に粒子媒介形質転換技
術を用いることを試みるのではなくて、植物の生長する
未分化胚組織を粒子媒介形質転換事象に付す別のアプロ
ーチが開発された。そのような技術から、ダイズ植物の
胚芽系列の安定な形質転換が達成された。マッカベ（Ｍ
ｃＣａｂｅ）ら、バイオ／テクノロジー（Ｂｉｏ／Ｔｅ
ｃｈｎｏｌｏｇｙ），６：９２３−９２６（１９８
８）。この技術は、この植物種のための選択可能マーカ
ーの入手可能性と独立ではない。未分化胚組織形質転換
に基づく粒子媒介技術を用いるダイズ植物の胚芽系列形
質転換のための技術を開発するにおいて、形質転換事象
はしばしばキメラ植物をもたらすことが発見された。こ
の植物は、その組織のいくつか（総てではなく）が導入
されたＤＮＡにより遺伝子的に形質転換された植物であ
る。マッカベら（上述）。該技術はこのように遺伝子的
に手を加えた植物を作るために有用であったが、多数の
組織を形質転換事象に付さなければならない点、及び導
入されたＤＮＡを適当に発現した特定の芽及び植物を発
見するために多数の植物を推定される形質転換組織から
培養しなければならない点でいくぶん面倒である。従っ
て、遺伝可能な胚芽系列形質転換を生じるプロセスにお
いて早期に形質転換を同定する能力は、植物の実用的か
つ費用効果的な遺伝子形質転換において劇的な節約をも
たらす能力を創成し、これは形質転換事象に付されたが
形質転換していない組織を培養するのに費やされる労
力、時間及びエネルギーの低減をもたらす。ダイズのよ
うな植物種の胚芽系列形質転換を求めるにおいて、植物
の胚芽細胞の先祖組織が成長未分化胚組織つまり芽にお
いて同定されるなら、それは有用であろう。不幸にも、
植物細胞の発育形態学は、ダイズ胚芽細胞の先祖細胞が
判る点まではまだ発展していない。従って、形質転換さ
れるべきものが植物未分化胚組織または胚であるなら
ば、胚芽系列形質転換を達成するためにその未分化胚組
織または胚における正確にどの細胞が形質転換されるべ
きなのかについて知識は存在しない。従って、成長する
ダイズ植物における形質転換された細胞のカテゴリーと
胚芽系列形質転換事象の間の何らかの相関関係が経験的
に見い出されなければならないであろう。
【発明の目的及び構成】本発明をまとめて云うと、ダイ
ズ植物の多数の生長未分化胚組織を粒子媒介形質転換手
順に付すところの、胚芽系列形質転換ダイズ植物を作り
かつ同定する方法が提供され、また胚芽系列形質転換事
象と高い相関を持つ表現型マーカーを捜すために、得ら
れた組織が主な形質転換体組織において表現型マーカー
に一連の初期段階テストに付され、従ってマークされた
組織のみが、それから植物全体を再生する努力に付され
るであろう。本発明の目的は、従来の方法よりも本質的
により効率的でありかつ費用効果的な、植物の粒子媒介
形質転換法を提供することである。本発明の目的は、胚
芽系列形質転換体を与える可能性が最も高い植物を、プ
ロセスの出来るだけ早期に同定することにより、植物特
にダイズ植物の遺伝子工学をより費用効果的に成し、従
ってこれら植物のみを成長した植物へと培養すればよく
することである。本発明の別の目的は、選択可能マーカ
ーの不存在においてでも植物形質転換実験においてレポ
ーターまたはマーカー遺伝子の使用を最適にして、信頼
できる優性な選択可能マーカーが利用できない植物にお
いて植物の遺伝子工学を可能にすることである。本発明
の他の目的、利点及び特徴は、添付図面を参照すると下
記の説明から明らかとなろう。本発明の方法に従い、粒
子媒介植物形質転換プロセスにおいて高い可能性の胚芽
系列形質転換事象を同定するために用いられる一連の指
標を説明する。これら指標は、或る定義された段階にお
ける再生している植物の組織においてマーカー遺伝子の
発現の或る表現型の分類に基づく。本方法の利点を十分
に理解するために、植物の加速された粒子媒介形質転換
の性質について或る考慮を評価することは有用である。
形質転換ＤＮＡは粒子上で植物組織中に運ばれる故に、
及び形質転換された植物組織の破壊を避けるために粒子
の数は限定されねばならない故に、処理された植物組織
中の細胞の僅か１％が形質転換ＤＮＡを受け、これら細
胞の僅か１％が形質転換されるであろう。従って、形質
転換されなかった細胞を優先的に殺す選択物質の不存在
下において、そのような処理された組織からの再生植物
の結果は、その組織の殆んどが形質転換されていない組
織の植物であろう。少くとも部分的に形質転換される植
物においてさえ、形質転換の多くは胚芽系列形質転換を
結果しないことが見い出された。従って本発明は、非胚
芽系列植物の再生を最小にしうるように初期の段階で所
望の胚芽系列形質転換事象を同定することに向けられ
る。すなわち、ダイズの胚芽系列形質転換を達成するた
めに、ここで記述する初期胚芽系列同定法を用いること
は必要でない。処理された組織から回収された総ての植
物を再生し、総ての植物を性的に繁殖し、そして総ての
子孫を評価することが可能である。このアプローチの欠
点は、再生及び繁殖における努力の多くが非胚芽系列形
質転換事象に浪費されるであろうことである。本発明
は、この浪費を避けることを助け、それによって遺伝子
的に形質転換されたダイズの系列の効率的創作を助け
る。すなわち、本発明は、植物細胞の粒子媒介形質転換
を含む技術に基づく。従って、本発明の流れをより良く
理解するために、植物細胞の粒子媒介形質転換の一般的
技術および従って用いられる装置を理解する必要があ
る。植物細胞の粒子媒介形質転換のプロセスにおいて、
小さな不活性な比較的密な粒子より成る担体粒子は、Ｄ
ＮＡの形質転換遺伝子構造体をコーティングされ、そし
て形質転換されるべき成長未分化胚組織つまり胚の細胞
の内部に運ばれるように物理的に加速される。形質転換
ＤＮＡはこのようにして個々の細胞内に運ばれるが、担
体粒子は、個々の細胞が破壊される又は重大に無力化さ
れないように十分に小さい。植物たとえばダイズ中にそ
のような様式でそのような担体粒子上のＤＮＡを運ぶこ
とによって、総て形質転換された胚芽系列植物が得ら
れ、植物系列における突然変異植物をもたらすことがで
きることが見い出された。この様式での胚芽系列植物形
質転換の創作において考慮されるいくつかの因子があ
る。遺伝子構造体は、植物組織において発現されるべく
適当に構造されたものでなければならない。用いられる
装置は、ＤＮＡをコーティングされた担体粒子を植物細
胞中に、適当な数の細胞が形質転換される様式で運ぶこ
とができるタイプのものでなければならない。生物学的
に不活性な小さな担体粒子を加速すると考えられるいく
つかのタイプの機械的システムがある。可能性ある機構
は、粒子の弾道爆発加速、粒子の遠心加速、粒子の静電
加速又は小さな不活性粒子に運動量及び速度を与えうる
何らかの他の類似のシステムを包含する。粒子媒介植物
形質転換を達成するために本発明で用いられる機構は、
調節可能な電圧スパーク放電装置に基づく。該装置を図
１に図式的に示す。図１において粒子加速装置は一般に
数字１０で示されている。装置は、スパーク放電室１２
より成り、その中に約１〜２ｍｍの間隔で離された二つ
の電極１４が挿入される。スパーク放電室１２は、水平
に延びる矩形であり、その上方端に延びる二つの開口１
６及び１８を有する。開口１６は、入口プレート２０に
より被われる。電極１４とは反対側のスパーク放電室１
２の矩形の側に位置する開口１８は、担体シート２２に
よって被われるよう意図される。電極１４は、放電電圧
の適当な調節しうる電圧源に接続される。そのような放
電電圧源は好ましくは、１〜２マイクロファラッドのサ
イズの範囲のコンデンサーに接続された適当な電気スイ
ッチを含み、コンデンサーに導入される電圧は、たとえ
ばオートトランスの使用により、たぶん１〜５０，００
０ボルトの範囲で調節可能である。適当な高電圧電気ス
イッチ（図示せず）は、装置が使用者により便利に使用
できるようにコンデンサーが安全に電極１４を通して放
電されうるように備えられる。スパーク放電室１２の開
口１８の上に置かれることを意図される担体シート２２
は、比較的硬い物質の平坦なシート、たとえばアルミナ
化したサランをコーティングした積層物のシートであ
る。放電室１２内の開口１８の約１５ｍｍ上に、保持ス
クリーン２４が置かれる。保持スクリーンの上の約５〜
２５ｍｍの距離に標的表面２６が置かれる。標的表面２
６は、形質転換されるべき物質をその上に容易に置くこ
とができるところの任意の適当な培養物表面であること
ができ、たとえば最も便宜には、植物組織が培養のため
に入れられたところの逆さにしたペトリ皿である。植物
組織中に形質転換されるべく意図される外来の遺伝子構
造体のコピーは、当業者に周知の適当なＤＮＡ調製技術
により調製でき、遺伝子構造体の複数コピーが作られ
る。水性溶液中の外来遺伝子構造体のコピーは次に、耐
久性の密な生物学的に不活性な担体物質たとえば金の小
さな粒子上にコーティングされる。担体粒子は典型的に
は１〜３ミクロンのサイズ範囲である。その上に外来遺
伝子構造体を持つ担体粒子は次に、担体シート２２上に
置かれ、これはスパーク放電室１２の上の適当な開口に
挿入される。生きた植物物質をその上に含む標的表面２
６が次に、保持スクリーン２４の上の位置に置かれる。
好ましくは約１０マイクロリットルの大きさの、水の小
滴を電極１４の両端を橋架けして置かれる。入口カバー
２０をスパーク放電室１２の上の位置に置く。この時点
で、装置全体を真室室に封じ、約５００ｍｍＨｇの範囲
まで減圧する。この減圧に引きながら、ヘリウムを真室
室中に入れて、真空室内の残る雰囲気をヘリウムで置換
する。低減された圧力と相まって、ヘリウムの低い相対
密度は、金粒子への障害を減らすように助ける。この時
点で、電極１４間のスパーク放電を使用者が開始でき
る。これは、電極１４の端子にかかるコンデンサー内に
貯められた電圧を適用する適当な電気スイッチによって
行なわれる。この放電の力は電極１４の間のスパーク放
電ギャップを橋架けし、この間に予め置かれた水の小滴
を瞬間的に気化させる。この水の気化の力はスパーク放
電室１２内で衝撃波を作り、これは外側に総ての方向に
放射する。担体シート２２上への放射する衝撃波のイン
パクトは、担体シート２２を上方へ大きな速度で推進す
る。上方に進む担体シート２２は、それが保持スクリー
ン２４と接触するまで加速する。装置のための真室容器
内のヘリウムの使用は、担体シート２２ならびに担体粒
子の飛しょうへの障害を小さくする。保持スクリーン２
４において担体シートが保持され、予め外来遺伝子構造
体をコーティングされた担体粒子が担体シートから飛び
出し、標的組織の方向へ自由に動く。そして小さな担体
粒子は、標的表面２６上に置かれた標的組織の細胞中に
進み、その上に置かれた細胞の細胞ゾル中へ自由に入
る。担体粒子が標的組織の表面に衝突するときの担体粒
子の実際の運動量は、電極１４に適用される当初の放電
の電圧に基づいて調節できる。すなわち、電極１４間に
かけられる放電の量を変えることによって、粒子が標的
に衝突する速度を調節でき、従って標的組織の組織中へ
の担体粒子の侵入の深さは、電極１４間にかけられる電
圧の調節の全範囲にわたって連続的に調節できる。粒子
媒介形質転換技術において有用であるために、形質転換
外来遺伝子構造体は、標的植物組織の細胞において何ら
かの有用な機能を行えなければならない。そのＤＮＡが
一より多い生物に起源する意味において通常はキメラ構
造であろう形質転換遺伝子構造体は、標的組織遺伝子産
生物たとえば興味の外来蛋白質又は抗感作（ａｎｔｉｓ
ｅｎｓｅ）ＲＮＡストランドにおいて発現できなければ
ならない。植物細胞において用いる発現カセットベクタ
ー内に有用に埋め込まれるそのような外来遺伝子構造体
は、当業者に知られている。典型的にはそのような植物
発現カセットベクターは、所望の外来遺伝子のコーディ
ング配列の外に、植物細胞内の外来遺伝子の発現に適す
る適当なフランキング規制配列たとえばもし蛋白合成が
望まれるなら転写を開始できるプロモーター配列及びメ
ッセージの翻訳を停止する翻訳ターミネーターを包含す
る。他の植物組織において有効であると判っている典型
的なプロモーター及び転写ターミネーターががタイズで
も有効であることが以前に示されている。形質転換遺伝
子構造体はまた、マーカー遺伝子を包含しうる。そのよ
うなマーカー遺伝子は、選択可能なマーカーである必要
はない。その存在が、最小量の植物組織を用いて、突然
変異植物組織において観察されうる適当な生物化学的又
は表現型特質によりアッセイされうるマーカーであれば
よい。そのようなマーカー遺伝子は、もし形質転換ＤＮ
Ａの存在のための完全に生物化学的なアッセイ、たとえ
ばＤＮＡ自体のためのポリメラーゼ鎖反応タイプのアッ
セイが用いられるのなら、形質転換するＤＮＡそれ自体
でありうる。表現型アッセイにより検出できるマーカー
遺伝子の一つの便宜なタイプは、ジェファーソン（Ｊｅ
ｆｆｅｒｓｏｎ）ら、Ｅｍｂｏ Ｊ．，６：３９０１−
３９０７に記載されるＧＵＳ遺伝子である。ＧＵＳ遺伝
子は、植物細胞中で発現されることができそしてその発
現が組織破壊的アッセイにおいて、便宜な準直線（ｓｕ
ｂｓｔｒａｉｇｈｔ）インジゴ・グルクロニド又は５−
ブロム−４−クロル−３−インドイルグルクロニドブル
ーを植物組織中のインサイツアッセイにおいて着色する
ところの酵素ベータ・グルクロニダーゼをコードする。
従ってＧＵＳ遺伝子の使用は、形質転換体植物組織にお
ける表現型分析により、導入されたＤＮＡの発現につい
ての便宜な測色アッセイを提供する。即ち、典型的形質
転換手順において、興味の所望の遺伝子は、単一の遺伝
子構造体ＤＮＡストランド中にＧＵＳ遺伝子と縦列に連
結され、そして植物組織中の形質転換ＤＮＡの検出は標
的植物組織中のＧＵＳ酵素の発現についての表現型分析
により行われる。ダイスのいくつかの植物組織は、図１
の装置を用いて、そのような粒子媒介形質転換技術によ
り遺伝子的に形質転換されうる。未成熟の又は成熟した
ダイズ種子からの切った胚軸がこの手順を用いて容易に
形質転換されることが最も便宜に見い出された。胚軸は
ダイズ種子から切り取られ、一次葉（ｐｒｉｍａｒｙ
ｌｅａｖｅｓ）を取除いて胚の未分化組織を露出させ
る。次に軸を、１％水・寒天を含む標的プレート上にプ
レートする。プレートを次に、粒子媒介形質転換事象の
ために図１の装置において標的表面として用いる。次に
軸は、接合子の胚を再生するために、バーウェール（Ｂ
ａｒｗａｌｅ）ら、プランタ（Ｐｌａｎｔａ）、１６
７：４７３−４８１（１９８６）により変性されたよう
なＭＳ基礎培地上で暗所でプレートされてもよい。この
特別の培地は、プレートされた胚組織において多数の芽
形成を誘発するベンジルアミノプリンを高濃度で含む。
暗所での１〜２週間のインキュベーションに続いて、組
織を、より低濃度のベンジルアミノプリンを含む同じ基
礎培地に移し、次に光中で育てて芽伸長を促進する。こ
の技術を用いて、胚組織上の一次及び葉脈の未分化胚組
織から多数の芽が導かれるであろう。次にこれらの芽
は、ダイズ根に接木され、又は根を形成するよう誘発さ
れて、安全な性的に成熟したダイズ植物全体を再生す
る。多数の胚芽系列形質転換体植物をもたらすべく本明
細書記載のスクリーニング技術に付されるのは、この芽
またはそれから再生されたダイズ植物である。上記のよ
うに形質転換プロセスに付された組織から得られたダイ
ズ芽又は苗木が全体の成熟した植物へと再生されると
き、得られたダイズ植物の一部のみが、外来ＤＮＡで遺
伝子的に形質転換されたことを証明するであろうことが
見い出された。この組織から得た芽から再生された植物
は、Ｒ０植物と呼ばれ、一方、後の世代のその子孫はＲ
１及びＲ２と呼ばれる。何らかの遺伝子形質転換を示す
Ｒ０植物がＲ０植物世代内での遺伝子形質転換の低い頻
度を有することに加えて、植物の多くはキメラである。
ここでキメラという言葉は、植物が遺伝子的に同一でな
い組織から成る、即ち植物が形質転換されたその組織の
一部又は断片のみを有し、組織の残りは遺伝子的に形質
転換されていないことを意味する。胚芽細胞質中に外来
ＤＮＡを有し、挿入されたＤＮＡをその子孫に伝えうる
安定に形質転換された植物を作ることが、ここで記載す
る植物形質転換プロセスの目的であるから、多数の、そ
してたぶん極多数の推定される形質転換されたＲ０植物
又は植物組織から胚芽系列形質転換事象をどのように回
収するかを確かめるスクリーニング手順を履行すること
が必要である。ここで開示する方法は、その胚芽系列が
形質転換された子孫植物を生じであろう又は少なくとも
最も生じる可能性があるであろう植物を分離すること
を、推定される形質転換された植物培養物からＲ０芽と
植物のスクリーニングで可能にすることを意図される。
これに関して、Ｒ０植物から育てられた子孫すなわちＲ
１世代より先については、もし子孫植物が挿入された外
来ＤＮＡを総て含んでいたなら、それらはクローナルで
ある即ち非キメラであり、その胚芽系列細胞が形質転換
されている。挿入されたＤＮＡがＲ０植物中でクローナ
ル様式で存在するように見えるが、しかしＲ１及びＲ２
植物中に全く存在しないという事象が観察される一方、
もし遺伝子がＲ１植物中に存在すると見い出されるな
ら、それは挿入された遺伝子を特質として遺伝するＲ１
植物の子孫の中に以後安定に受け継ぎうることを証明す
るものであろう。本方法は、選択手法というよりは、ス
クリーニング手法である。これが意味するところは、植
物又は植物の一部が或るマーカー特性の存在についてス
クリーンされるのであって、抗生又は除草剤耐性の手順
によって達成されるような選択基準に付されるのではな
いということである。一部には、選択手法と逆にそのよ
うなスクリーニング手法の使用は、ダイズ組織において
有効な信頼しうる選択マーカー遺伝子の不存在により必
要とされる。スクリーニングプロセスの目的である、上
述したような好ましいマーカー遺伝子は、ＧＵＳ遺伝子
である。しかし、ＧＵＳアッセイは、植物組織を破壊
し、従ってインビボでは実施できない。従って、スクリ
ーンされるべき植物から回収した組織の一部についてそ
れは実施されるべきであり、選択された組織の一部は、
求められる事象がアッセイプロセスの間に失われないよ
うに、特定の植物において胚芽系列形質転換の見込みの
正確な反影を得る必要と、当該植物組織の活力を維持す
る必要とをバランスするものでなければならない。本発
明の方法は、再生プロセスの間のＲ０植物から植物組織
の或る戦略的に位置付けた部分の選択に基づく。特に、
Ｒ０植物の形質転換状態の三つの指標が用いられる。第
一の指標は、根が出る前の芽から集められたＲ０芽から
の茎部分（ｓｔｅｍ ｓｅｇｍｅｎｔ）の選択である。
第二の指標は、実生の発育の第一の三葉段階における葉
表現型の選択である。第三の指標は、第三又は第四の三
葉段階における、より成熟した植物の三葉の葉の葉柄／
中肋選択である。これら三つの段階の夫々においてＧＵ
Ｓ遺伝子によりコードされる酵素について組織化学的ア
ッセイを行うことによって、生じた胚芽系列形質転換事
象を高度的初期の段階において、再生するＲ０芽のほと
んどの信頼性をもって予測できる。事実、手順の比較
（９０〜９９％もの多く）を捨て、胚芽系列形質転換事
象を与える高い可能性を持つ残りの芽又は苗に集中する
ことができる。そのような多数の芽又は苗の廃棄は浪費
のように見え、また、たまたまの本当に形質転換された
植物の廃棄をほぼ確実に含むであろうが、多数の形質転
換されていない植物の種を生じさせないことにより節約
される労力と時間の量は、追加の形質転換事象を作るに
要する時間に比べて大きい。従って、プロセスの労力の
いる部分、即ち推定される形質転換された植物の種を生
じさせ、そして育て、子孫をテストすることが、ここに
開示するスクリーニング手法によって最小へと低減でき
る。形質転換された植物の第一の指標分析は、芽の再生
が元々の形質転換された植物移植片から始る時に起る。
再生するダイズ芽が、有限の定義されたサイズ、典型的
には２ｃｍのサイズに達した時、芽を元の移植片から分
離し、接木または根形成を誘発するホルモン処理により
繁殖のために準備する。しかし、芽が元の移植片から分
離される時に、この点で、分離された芽の基礎部分から
茎の比較的小さい部分、即ちたぶん２ｍｍのサイズの部
分を取ることが便宜である。この茎部分は次に固定さ
れ、ＧＵＳ組織化学的アッセイに付されることができ
る。結果は、形質転換された植物の組織のこれら部分に
おいて色、即ち青色を示すであろうダイズ植物の茎の断
面検分である。これら組織の分析に基づいて、いくらか
の酵素活性を示す茎を予測することができ、その植物は
胚芽系列形質転換事象を与える可能性が最も高い。茎部
分アッセイの結果を分類するために、分類法を考案し
た。遺伝子が、アッセイされた茎部分の表皮、皮質及び
髄の総てにおいて発現されたことをＧＵＳ酵素アッセイ
が示した場合、この突然変異の主な再生物はＢと指定さ
れた。ＧＵＳ遺伝子の発現がアッセイされた芽部分の皮
質又は髄のどちらか１００％に限られた場合、再生物は
夫々Ｃ＊又はＰ＊と指定された。皮質の少くとも半分が
酵素を発現した場合、再生性芽はＣと指定され、皮質の
５０％未満が活性を示した場合にはｃと指定された。同
様に、分類Ｐ又はｐは、茎の髄の５０％超又は未満での
ＧＵＳ活性を示す。ＧＵＳ遺伝子の活性が芽の表皮にお
いてのみ見られうる場合、芽はｅと評価された。複数の
エリアにおける局所的活性を示すために上記符号が用い
られた例もまた観察された。たとえば、ｃ／Ｐ＊という
評価は、芽がその髄組織の１００％でＧＵＳマーカー遺
伝子を発現し、しかしその皮質組織の５０％未満で発現
したことを示す。Ｅ＊／ｐという分類は、表皮の１００
％で、しかし髄の５０％未満での酵素の発現、及び形質
転換体植物の皮質での無発現を示す。図３〜８は、茎部
分の分類法を示す。図３は、概念的なダイズ茎断面の極
めて様式化した図であり、３０は茎全体を示し、３２は
表皮を示し（これは幅が大きく誇張されている）、３４
は皮質を示し、３６は髄を示す。図４〜８における斜線
は、ＧＵＳアッセイにおける青色を示すためである。図
４は、表皮のみがＧＵＳ遺伝子を発現する故にＥと分類
される茎３８を示す。図５は、皮質又は髄の５０％未満
が発現しているので、ｃ／ｐと分類される茎４０を示
す。図６の茎４２は、髄の総てと、しかし皮質の５０％
未満が形質転換されたので、ｃ／Ｐ＊と分類される。図
７の茎４４は、Ｃ＊である。図８の茎４６は、明らかに
Ｂ茎部分を示す。図４〜８の結果の総ては実際の事象を
示している。図１及び２の装置を用いる植物形質転換プ
ロセスのために回収された芽の多くについて、茎部分に
おけるＧＵＳ遺伝子の発現は見られなかった。茎部分で
の発現が見られ、上記の分類の一つに分類された芽のう
ち、各分類の多数の芽が発根へと誘発され、又は健康な
根に接木され、苗へと更に育てられた。苗が二又は三つ
の三葉の葉を発達した時、第一の三葉の葉の一つ以上の
葉を各植物から採取し、三葉の小葉自体をＧＵＳ酵素の
活性についてアッセイした。従って、初めの再生芽の元
の茎における分類からの表現型と関連づけうる新しい表
現型が同定された。多数の植物が、小葉全体で又は小葉
内の或るエリアでのみ表皮トリコーム及び／又は毛にお
いてＧＵＳ酵素を発現するのみであると見い出された。
他の植物は、葉肉細胞又は気孔においてのみＧＵＳ活性
を発現すると見い出され、これら組織における活性は小
葉全体に及ぶことができ、又は小葉内の特定の一又は二
以上のエリアに限られることができた。別の場合には、
酵素活性は、中肋に局在化され、又は小葉の扇形内の中
肋の一つの側又は両側に種々の程度で及ぶことが見られ
るであろう。葉の半分上でのみ中肋から周辺へとＧＵＳ
活性が及ぶ例さえ見つかった。やはり、青色が一扇形内
に局在化されていないか、又は表皮に限られていないも
のが、観察された最適の表現型であった。更に発展する
と、再生する植物から更に進出三葉の一つの葉における
葉柄及び中肋部分に基づき第三のアッセイが開発され
た。もし、この最後のアッセイが実施されないと、或る
非胚芽系列形質転換事象が種子を生じるのを許されるで
あろう。なぜなら、或る形質転換事象は、形質転換され
た組織が再生する植物の茎までの限られた長さしか及ば
ないところの植物を生じさせるようであるからである。
最初の三葉の葉においてのみＧＵＳ活性を観察し、該植
物から更に進む或る他の三葉においては観察しないこと
が、異例ではない観察となっていた。しかし、第三又は
第四の三葉の葉においてＧＵＳ活性を有した植物の多数
は植物の葉の総て又は殆んどにおいて同じ活性を示すと
いうのが一般的観察であった。これら三つの指標の使用
は、茎部分のアッセイの間にＢ、Ｐ＊としてまたはＰと
ｃ又はＣのどれかの組合せとして特徴づけられた植物の
みが完全に再生され、Ｒ１植物へと繁殖を許されるな
ら、形質転換プロセスが合計の労力について最適化され
得たという観察をもたらした。しかし、Ｂと特徴づけら
れる植物でさえ、もしＧＵＳ遺伝子の発現が第一の三葉
の葉で見られず、また成熟した葉における葉柄及び中肋
アッセイにおいて見られなかったなら、胚芽系列形質転
換事象を持つと判明しない。形質転換事象の第二及び第
三の指標の最良の使用は、負（ネガティブ）として用い
られる。即ち、これら段階でＧＵＳ活性を適当に示さな
かった植物は廃棄されうる。なぜなら、そのような植物
が胚芽系列形質転換事象を与える確率は比較的に最小で
あると見い出されたからである。茎部分のアッセイの間
にＢと分類され、第三又は第四の三葉段階の葉柄及び中
肋部分のアッセイの間に髄又は髄と皮質において大きな
ＧＵＳ活性を示した植物のうち、クローンであり、ＧＵ
Ｓ遺伝子を発現した子孫植物の回収により証明されるよ
うに胚芽系列形質転換事象を含むと後に決定された総て
の植物は活性を有した。上述した分類の外のどれかに分
類された植物は総て、胚芽系列形質転換事象の劇的に低
い頻度を示し、しかしそのような事象は組織の別のクラ
スでも起った。たとえば、茎部分段階においてその表皮
でのみ活性を示した３６８個のうち二つの植物が、形質
転換された子孫を与えた。しかし、他のどれかの分類の
植物からの何らかの形質転換事象の可能性は、茎部分の
間で上記で指定した植物以外を総て捨て、そして第一の
三葉段階でＧＵＳ活性を示しかつ植物の成熟した葉の葉
柄及び中肋のアッセイの間で大きな髄及び皮質のかかわ
り合いを示した胚芽系列形質転換をもたらすであろうと
分類された植物を性的にさらに繁殖させることを実用的
理由で正当化する程に低かった。Ｂと分類された植物の
三分の一より多くは、胚芽系列形質転換事象を生じるで
あろう。対照的に、茎部分の間に他の分類に分類された
植物は、胚芽系列形質転換事象の劇的に低い可能性を持
つと判った。たとえば、ｃ／Ｐ＊と分類された植物で
は、胚芽系列形質転換事象の可能性は１０％未満であ
り、一方、皮質の半分より多くで活性を示し、Ｃと分類
される植物では、形質転換事象の比は２％のオーダーで
あった。大きな皮質及び髄活性を有し、Ｃ／Ｐと指定さ
れ、そのうち僅か八つの植物がテストされた植物のう
ち、二つが胚芽系列形質転換事象を与えた。髄の５０％
未満で活性を示した六つの植物のうち一つの胚芽系列形
質事象が回収された。従って、再生される正確な分類
は、より推定的に形質転換された芽を再生するコストに
比べて、芽を植物及び種子へと再生するコストのコスト
分析に依存するであろう。
ズ植物の多数の生長未分化胚組織を粒子媒介形質転換手
順に付すところの、胚芽系列形質転換ダイズ植物を作り
かつ同定する方法が提供され、また胚芽系列形質転換事
象と高い相関を持つ表現型マーカーを捜すために、得ら
れた組織が主な形質転換体組織において表現型マーカー
に一連の初期段階テストに付され、従ってマークされた
組織のみが、それから植物全体を再生する努力に付され
るであろう。本発明の目的は、従来の方法よりも本質的
により効率的でありかつ費用効果的な、植物の粒子媒介
形質転換法を提供することである。本発明の目的は、胚
芽系列形質転換体を与える可能性が最も高い植物を、プ
ロセスの出来るだけ早期に同定することにより、植物特
にダイズ植物の遺伝子工学をより費用効果的に成し、従
ってこれら植物のみを成長した植物へと培養すればよく
することである。本発明の別の目的は、選択可能マーカ
ーの不存在においてでも植物形質転換実験においてレポ
ーターまたはマーカー遺伝子の使用を最適にして、信頼
できる優性な選択可能マーカーが利用できない植物にお
いて植物の遺伝子工学を可能にすることである。本発明
の他の目的、利点及び特徴は、添付図面を参照すると下
記の説明から明らかとなろう。本発明の方法に従い、粒
子媒介植物形質転換プロセスにおいて高い可能性の胚芽
系列形質転換事象を同定するために用いられる一連の指
標を説明する。これら指標は、或る定義された段階にお
ける再生している植物の組織においてマーカー遺伝子の
発現の或る表現型の分類に基づく。本方法の利点を十分
に理解するために、植物の加速された粒子媒介形質転換
の性質について或る考慮を評価することは有用である。
形質転換ＤＮＡは粒子上で植物組織中に運ばれる故に、
及び形質転換された植物組織の破壊を避けるために粒子
の数は限定されねばならない故に、処理された植物組織
中の細胞の僅か１％が形質転換ＤＮＡを受け、これら細
胞の僅か１％が形質転換されるであろう。従って、形質
転換されなかった細胞を優先的に殺す選択物質の不存在
下において、そのような処理された組織からの再生植物
の結果は、その組織の殆んどが形質転換されていない組
織の植物であろう。少くとも部分的に形質転換される植
物においてさえ、形質転換の多くは胚芽系列形質転換を
結果しないことが見い出された。従って本発明は、非胚
芽系列植物の再生を最小にしうるように初期の段階で所
望の胚芽系列形質転換事象を同定することに向けられ
る。すなわち、ダイズの胚芽系列形質転換を達成するた
めに、ここで記述する初期胚芽系列同定法を用いること
は必要でない。処理された組織から回収された総ての植
物を再生し、総ての植物を性的に繁殖し、そして総ての
子孫を評価することが可能である。このアプローチの欠
点は、再生及び繁殖における努力の多くが非胚芽系列形
質転換事象に浪費されるであろうことである。本発明
は、この浪費を避けることを助け、それによって遺伝子
的に形質転換されたダイズの系列の効率的創作を助け
る。すなわち、本発明は、植物細胞の粒子媒介形質転換
を含む技術に基づく。従って、本発明の流れをより良く
理解するために、植物細胞の粒子媒介形質転換の一般的
技術および従って用いられる装置を理解する必要があ
る。植物細胞の粒子媒介形質転換のプロセスにおいて、
小さな不活性な比較的密な粒子より成る担体粒子は、Ｄ
ＮＡの形質転換遺伝子構造体をコーティングされ、そし
て形質転換されるべき成長未分化胚組織つまり胚の細胞
の内部に運ばれるように物理的に加速される。形質転換
ＤＮＡはこのようにして個々の細胞内に運ばれるが、担
体粒子は、個々の細胞が破壊される又は重大に無力化さ
れないように十分に小さい。植物たとえばダイズ中にそ
のような様式でそのような担体粒子上のＤＮＡを運ぶこ
とによって、総て形質転換された胚芽系列植物が得ら
れ、植物系列における突然変異植物をもたらすことがで
きることが見い出された。この様式での胚芽系列植物形
質転換の創作において考慮されるいくつかの因子があ
る。遺伝子構造体は、植物組織において発現されるべく
適当に構造されたものでなければならない。用いられる
装置は、ＤＮＡをコーティングされた担体粒子を植物細
胞中に、適当な数の細胞が形質転換される様式で運ぶこ
とができるタイプのものでなければならない。生物学的
に不活性な小さな担体粒子を加速すると考えられるいく
つかのタイプの機械的システムがある。可能性ある機構
は、粒子の弾道爆発加速、粒子の遠心加速、粒子の静電
加速又は小さな不活性粒子に運動量及び速度を与えうる
何らかの他の類似のシステムを包含する。粒子媒介植物
形質転換を達成するために本発明で用いられる機構は、
調節可能な電圧スパーク放電装置に基づく。該装置を図
１に図式的に示す。図１において粒子加速装置は一般に
数字１０で示されている。装置は、スパーク放電室１２
より成り、その中に約１〜２ｍｍの間隔で離された二つ
の電極１４が挿入される。スパーク放電室１２は、水平
に延びる矩形であり、その上方端に延びる二つの開口１
６及び１８を有する。開口１６は、入口プレート２０に
より被われる。電極１４とは反対側のスパーク放電室１
２の矩形の側に位置する開口１８は、担体シート２２に
よって被われるよう意図される。電極１４は、放電電圧
の適当な調節しうる電圧源に接続される。そのような放
電電圧源は好ましくは、１〜２マイクロファラッドのサ
イズの範囲のコンデンサーに接続された適当な電気スイ
ッチを含み、コンデンサーに導入される電圧は、たとえ
ばオートトランスの使用により、たぶん１〜５０，００
０ボルトの範囲で調節可能である。適当な高電圧電気ス
イッチ（図示せず）は、装置が使用者により便利に使用
できるようにコンデンサーが安全に電極１４を通して放
電されうるように備えられる。スパーク放電室１２の開
口１８の上に置かれることを意図される担体シート２２
は、比較的硬い物質の平坦なシート、たとえばアルミナ
化したサランをコーティングした積層物のシートであ
る。放電室１２内の開口１８の約１５ｍｍ上に、保持ス
クリーン２４が置かれる。保持スクリーンの上の約５〜
２５ｍｍの距離に標的表面２６が置かれる。標的表面２
６は、形質転換されるべき物質をその上に容易に置くこ
とができるところの任意の適当な培養物表面であること
ができ、たとえば最も便宜には、植物組織が培養のため
に入れられたところの逆さにしたペトリ皿である。植物
組織中に形質転換されるべく意図される外来の遺伝子構
造体のコピーは、当業者に周知の適当なＤＮＡ調製技術
により調製でき、遺伝子構造体の複数コピーが作られ
る。水性溶液中の外来遺伝子構造体のコピーは次に、耐
久性の密な生物学的に不活性な担体物質たとえば金の小
さな粒子上にコーティングされる。担体粒子は典型的に
は１〜３ミクロンのサイズ範囲である。その上に外来遺
伝子構造体を持つ担体粒子は次に、担体シート２２上に
置かれ、これはスパーク放電室１２の上の適当な開口に
挿入される。生きた植物物質をその上に含む標的表面２
６が次に、保持スクリーン２４の上の位置に置かれる。
好ましくは約１０マイクロリットルの大きさの、水の小
滴を電極１４の両端を橋架けして置かれる。入口カバー
２０をスパーク放電室１２の上の位置に置く。この時点
で、装置全体を真室室に封じ、約５００ｍｍＨｇの範囲
まで減圧する。この減圧に引きながら、ヘリウムを真室
室中に入れて、真空室内の残る雰囲気をヘリウムで置換
する。低減された圧力と相まって、ヘリウムの低い相対
密度は、金粒子への障害を減らすように助ける。この時
点で、電極１４間のスパーク放電を使用者が開始でき
る。これは、電極１４の端子にかかるコンデンサー内に
貯められた電圧を適用する適当な電気スイッチによって
行なわれる。この放電の力は電極１４の間のスパーク放
電ギャップを橋架けし、この間に予め置かれた水の小滴
を瞬間的に気化させる。この水の気化の力はスパーク放
電室１２内で衝撃波を作り、これは外側に総ての方向に
放射する。担体シート２２上への放射する衝撃波のイン
パクトは、担体シート２２を上方へ大きな速度で推進す
る。上方に進む担体シート２２は、それが保持スクリー
ン２４と接触するまで加速する。装置のための真室容器
内のヘリウムの使用は、担体シート２２ならびに担体粒
子の飛しょうへの障害を小さくする。保持スクリーン２
４において担体シートが保持され、予め外来遺伝子構造
体をコーティングされた担体粒子が担体シートから飛び
出し、標的組織の方向へ自由に動く。そして小さな担体
粒子は、標的表面２６上に置かれた標的組織の細胞中に
進み、その上に置かれた細胞の細胞ゾル中へ自由に入
る。担体粒子が標的組織の表面に衝突するときの担体粒
子の実際の運動量は、電極１４に適用される当初の放電
の電圧に基づいて調節できる。すなわち、電極１４間に
かけられる放電の量を変えることによって、粒子が標的
に衝突する速度を調節でき、従って標的組織の組織中へ
の担体粒子の侵入の深さは、電極１４間にかけられる電
圧の調節の全範囲にわたって連続的に調節できる。粒子
媒介形質転換技術において有用であるために、形質転換
外来遺伝子構造体は、標的植物組織の細胞において何ら
かの有用な機能を行えなければならない。そのＤＮＡが
一より多い生物に起源する意味において通常はキメラ構
造であろう形質転換遺伝子構造体は、標的組織遺伝子産
生物たとえば興味の外来蛋白質又は抗感作（ａｎｔｉｓ
ｅｎｓｅ）ＲＮＡストランドにおいて発現できなければ
ならない。植物細胞において用いる発現カセットベクタ
ー内に有用に埋め込まれるそのような外来遺伝子構造体
は、当業者に知られている。典型的にはそのような植物
発現カセットベクターは、所望の外来遺伝子のコーディ
ング配列の外に、植物細胞内の外来遺伝子の発現に適す
る適当なフランキング規制配列たとえばもし蛋白合成が
望まれるなら転写を開始できるプロモーター配列及びメ
ッセージの翻訳を停止する翻訳ターミネーターを包含す
る。他の植物組織において有効であると判っている典型
的なプロモーター及び転写ターミネーターががタイズで
も有効であることが以前に示されている。形質転換遺伝
子構造体はまた、マーカー遺伝子を包含しうる。そのよ
うなマーカー遺伝子は、選択可能なマーカーである必要
はない。その存在が、最小量の植物組織を用いて、突然
変異植物組織において観察されうる適当な生物化学的又
は表現型特質によりアッセイされうるマーカーであれば
よい。そのようなマーカー遺伝子は、もし形質転換ＤＮ
Ａの存在のための完全に生物化学的なアッセイ、たとえ
ばＤＮＡ自体のためのポリメラーゼ鎖反応タイプのアッ
セイが用いられるのなら、形質転換するＤＮＡそれ自体
でありうる。表現型アッセイにより検出できるマーカー
遺伝子の一つの便宜なタイプは、ジェファーソン（Ｊｅ
ｆｆｅｒｓｏｎ）ら、Ｅｍｂｏ Ｊ．，６：３９０１−
３９０７に記載されるＧＵＳ遺伝子である。ＧＵＳ遺伝
子は、植物細胞中で発現されることができそしてその発
現が組織破壊的アッセイにおいて、便宜な準直線（ｓｕ
ｂｓｔｒａｉｇｈｔ）インジゴ・グルクロニド又は５−
ブロム−４−クロル−３−インドイルグルクロニドブル
ーを植物組織中のインサイツアッセイにおいて着色する
ところの酵素ベータ・グルクロニダーゼをコードする。
従ってＧＵＳ遺伝子の使用は、形質転換体植物組織にお
ける表現型分析により、導入されたＤＮＡの発現につい
ての便宜な測色アッセイを提供する。即ち、典型的形質
転換手順において、興味の所望の遺伝子は、単一の遺伝
子構造体ＤＮＡストランド中にＧＵＳ遺伝子と縦列に連
結され、そして植物組織中の形質転換ＤＮＡの検出は標
的植物組織中のＧＵＳ酵素の発現についての表現型分析
により行われる。ダイスのいくつかの植物組織は、図１
の装置を用いて、そのような粒子媒介形質転換技術によ
り遺伝子的に形質転換されうる。未成熟の又は成熟した
ダイズ種子からの切った胚軸がこの手順を用いて容易に
形質転換されることが最も便宜に見い出された。胚軸は
ダイズ種子から切り取られ、一次葉（ｐｒｉｍａｒｙ
ｌｅａｖｅｓ）を取除いて胚の未分化組織を露出させ
る。次に軸を、１％水・寒天を含む標的プレート上にプ
レートする。プレートを次に、粒子媒介形質転換事象の
ために図１の装置において標的表面として用いる。次に
軸は、接合子の胚を再生するために、バーウェール（Ｂ
ａｒｗａｌｅ）ら、プランタ（Ｐｌａｎｔａ）、１６
７：４７３−４８１（１９８６）により変性されたよう
なＭＳ基礎培地上で暗所でプレートされてもよい。この
特別の培地は、プレートされた胚組織において多数の芽
形成を誘発するベンジルアミノプリンを高濃度で含む。
暗所での１〜２週間のインキュベーションに続いて、組
織を、より低濃度のベンジルアミノプリンを含む同じ基
礎培地に移し、次に光中で育てて芽伸長を促進する。こ
の技術を用いて、胚組織上の一次及び葉脈の未分化胚組
織から多数の芽が導かれるであろう。次にこれらの芽
は、ダイズ根に接木され、又は根を形成するよう誘発さ
れて、安全な性的に成熟したダイズ植物全体を再生す
る。多数の胚芽系列形質転換体植物をもたらすべく本明
細書記載のスクリーニング技術に付されるのは、この芽
またはそれから再生されたダイズ植物である。上記のよ
うに形質転換プロセスに付された組織から得られたダイ
ズ芽又は苗木が全体の成熟した植物へと再生されると
き、得られたダイズ植物の一部のみが、外来ＤＮＡで遺
伝子的に形質転換されたことを証明するであろうことが
見い出された。この組織から得た芽から再生された植物
は、Ｒ０植物と呼ばれ、一方、後の世代のその子孫はＲ
１及びＲ２と呼ばれる。何らかの遺伝子形質転換を示す
Ｒ０植物がＲ０植物世代内での遺伝子形質転換の低い頻
度を有することに加えて、植物の多くはキメラである。
ここでキメラという言葉は、植物が遺伝子的に同一でな
い組織から成る、即ち植物が形質転換されたその組織の
一部又は断片のみを有し、組織の残りは遺伝子的に形質
転換されていないことを意味する。胚芽細胞質中に外来
ＤＮＡを有し、挿入されたＤＮＡをその子孫に伝えうる
安定に形質転換された植物を作ることが、ここで記載す
る植物形質転換プロセスの目的であるから、多数の、そ
してたぶん極多数の推定される形質転換されたＲ０植物
又は植物組織から胚芽系列形質転換事象をどのように回
収するかを確かめるスクリーニング手順を履行すること
が必要である。ここで開示する方法は、その胚芽系列が
形質転換された子孫植物を生じであろう又は少なくとも
最も生じる可能性があるであろう植物を分離すること
を、推定される形質転換された植物培養物からＲ０芽と
植物のスクリーニングで可能にすることを意図される。
これに関して、Ｒ０植物から育てられた子孫すなわちＲ
１世代より先については、もし子孫植物が挿入された外
来ＤＮＡを総て含んでいたなら、それらはクローナルで
ある即ち非キメラであり、その胚芽系列細胞が形質転換
されている。挿入されたＤＮＡがＲ０植物中でクローナ
ル様式で存在するように見えるが、しかしＲ１及びＲ２
植物中に全く存在しないという事象が観察される一方、
もし遺伝子がＲ１植物中に存在すると見い出されるな
ら、それは挿入された遺伝子を特質として遺伝するＲ１
植物の子孫の中に以後安定に受け継ぎうることを証明す
るものであろう。本方法は、選択手法というよりは、ス
クリーニング手法である。これが意味するところは、植
物又は植物の一部が或るマーカー特性の存在についてス
クリーンされるのであって、抗生又は除草剤耐性の手順
によって達成されるような選択基準に付されるのではな
いということである。一部には、選択手法と逆にそのよ
うなスクリーニング手法の使用は、ダイズ組織において
有効な信頼しうる選択マーカー遺伝子の不存在により必
要とされる。スクリーニングプロセスの目的である、上
述したような好ましいマーカー遺伝子は、ＧＵＳ遺伝子
である。しかし、ＧＵＳアッセイは、植物組織を破壊
し、従ってインビボでは実施できない。従って、スクリ
ーンされるべき植物から回収した組織の一部についてそ
れは実施されるべきであり、選択された組織の一部は、
求められる事象がアッセイプロセスの間に失われないよ
うに、特定の植物において胚芽系列形質転換の見込みの
正確な反影を得る必要と、当該植物組織の活力を維持す
る必要とをバランスするものでなければならない。本発
明の方法は、再生プロセスの間のＲ０植物から植物組織
の或る戦略的に位置付けた部分の選択に基づく。特に、
Ｒ０植物の形質転換状態の三つの指標が用いられる。第
一の指標は、根が出る前の芽から集められたＲ０芽から
の茎部分（ｓｔｅｍ ｓｅｇｍｅｎｔ）の選択である。
第二の指標は、実生の発育の第一の三葉段階における葉
表現型の選択である。第三の指標は、第三又は第四の三
葉段階における、より成熟した植物の三葉の葉の葉柄／
中肋選択である。これら三つの段階の夫々においてＧＵ
Ｓ遺伝子によりコードされる酵素について組織化学的ア
ッセイを行うことによって、生じた胚芽系列形質転換事
象を高度的初期の段階において、再生するＲ０芽のほと
んどの信頼性をもって予測できる。事実、手順の比較
（９０〜９９％もの多く）を捨て、胚芽系列形質転換事
象を与える高い可能性を持つ残りの芽又は苗に集中する
ことができる。そのような多数の芽又は苗の廃棄は浪費
のように見え、また、たまたまの本当に形質転換された
植物の廃棄をほぼ確実に含むであろうが、多数の形質転
換されていない植物の種を生じさせないことにより節約
される労力と時間の量は、追加の形質転換事象を作るに
要する時間に比べて大きい。従って、プロセスの労力の
いる部分、即ち推定される形質転換された植物の種を生
じさせ、そして育て、子孫をテストすることが、ここに
開示するスクリーニング手法によって最小へと低減でき
る。形質転換された植物の第一の指標分析は、芽の再生
が元々の形質転換された植物移植片から始る時に起る。
再生するダイズ芽が、有限の定義されたサイズ、典型的
には２ｃｍのサイズに達した時、芽を元の移植片から分
離し、接木または根形成を誘発するホルモン処理により
繁殖のために準備する。しかし、芽が元の移植片から分
離される時に、この点で、分離された芽の基礎部分から
茎の比較的小さい部分、即ちたぶん２ｍｍのサイズの部
分を取ることが便宜である。この茎部分は次に固定さ
れ、ＧＵＳ組織化学的アッセイに付されることができ
る。結果は、形質転換された植物の組織のこれら部分に
おいて色、即ち青色を示すであろうダイズ植物の茎の断
面検分である。これら組織の分析に基づいて、いくらか
の酵素活性を示す茎を予測することができ、その植物は
胚芽系列形質転換事象を与える可能性が最も高い。茎部
分アッセイの結果を分類するために、分類法を考案し
た。遺伝子が、アッセイされた茎部分の表皮、皮質及び
髄の総てにおいて発現されたことをＧＵＳ酵素アッセイ
が示した場合、この突然変異の主な再生物はＢと指定さ
れた。ＧＵＳ遺伝子の発現がアッセイされた芽部分の皮
質又は髄のどちらか１００％に限られた場合、再生物は
夫々Ｃ＊又はＰ＊と指定された。皮質の少くとも半分が
酵素を発現した場合、再生性芽はＣと指定され、皮質の
５０％未満が活性を示した場合にはｃと指定された。同
様に、分類Ｐ又はｐは、茎の髄の５０％超又は未満での
ＧＵＳ活性を示す。ＧＵＳ遺伝子の活性が芽の表皮にお
いてのみ見られうる場合、芽はｅと評価された。複数の
エリアにおける局所的活性を示すために上記符号が用い
られた例もまた観察された。たとえば、ｃ／Ｐ＊という
評価は、芽がその髄組織の１００％でＧＵＳマーカー遺
伝子を発現し、しかしその皮質組織の５０％未満で発現
したことを示す。Ｅ＊／ｐという分類は、表皮の１００
％で、しかし髄の５０％未満での酵素の発現、及び形質
転換体植物の皮質での無発現を示す。図３〜８は、茎部
分の分類法を示す。図３は、概念的なダイズ茎断面の極
めて様式化した図であり、３０は茎全体を示し、３２は
表皮を示し（これは幅が大きく誇張されている）、３４
は皮質を示し、３６は髄を示す。図４〜８における斜線
は、ＧＵＳアッセイにおける青色を示すためである。図
４は、表皮のみがＧＵＳ遺伝子を発現する故にＥと分類
される茎３８を示す。図５は、皮質又は髄の５０％未満
が発現しているので、ｃ／ｐと分類される茎４０を示
す。図６の茎４２は、髄の総てと、しかし皮質の５０％
未満が形質転換されたので、ｃ／Ｐ＊と分類される。図
７の茎４４は、Ｃ＊である。図８の茎４６は、明らかに
Ｂ茎部分を示す。図４〜８の結果の総ては実際の事象を
示している。図１及び２の装置を用いる植物形質転換プ
ロセスのために回収された芽の多くについて、茎部分に
おけるＧＵＳ遺伝子の発現は見られなかった。茎部分で
の発現が見られ、上記の分類の一つに分類された芽のう
ち、各分類の多数の芽が発根へと誘発され、又は健康な
根に接木され、苗へと更に育てられた。苗が二又は三つ
の三葉の葉を発達した時、第一の三葉の葉の一つ以上の
葉を各植物から採取し、三葉の小葉自体をＧＵＳ酵素の
活性についてアッセイした。従って、初めの再生芽の元
の茎における分類からの表現型と関連づけうる新しい表
現型が同定された。多数の植物が、小葉全体で又は小葉
内の或るエリアでのみ表皮トリコーム及び／又は毛にお
いてＧＵＳ酵素を発現するのみであると見い出された。
他の植物は、葉肉細胞又は気孔においてのみＧＵＳ活性
を発現すると見い出され、これら組織における活性は小
葉全体に及ぶことができ、又は小葉内の特定の一又は二
以上のエリアに限られることができた。別の場合には、
酵素活性は、中肋に局在化され、又は小葉の扇形内の中
肋の一つの側又は両側に種々の程度で及ぶことが見られ
るであろう。葉の半分上でのみ中肋から周辺へとＧＵＳ
活性が及ぶ例さえ見つかった。やはり、青色が一扇形内
に局在化されていないか、又は表皮に限られていないも
のが、観察された最適の表現型であった。更に発展する
と、再生する植物から更に進出三葉の一つの葉における
葉柄及び中肋部分に基づき第三のアッセイが開発され
た。もし、この最後のアッセイが実施されないと、或る
非胚芽系列形質転換事象が種子を生じるのを許されるで
あろう。なぜなら、或る形質転換事象は、形質転換され
た組織が再生する植物の茎までの限られた長さしか及ば
ないところの植物を生じさせるようであるからである。
最初の三葉の葉においてのみＧＵＳ活性を観察し、該植
物から更に進む或る他の三葉においては観察しないこと
が、異例ではない観察となっていた。しかし、第三又は
第四の三葉の葉においてＧＵＳ活性を有した植物の多数
は植物の葉の総て又は殆んどにおいて同じ活性を示すと
いうのが一般的観察であった。これら三つの指標の使用
は、茎部分のアッセイの間にＢ、Ｐ＊としてまたはＰと
ｃ又はＣのどれかの組合せとして特徴づけられた植物の
みが完全に再生され、Ｒ１植物へと繁殖を許されるな
ら、形質転換プロセスが合計の労力について最適化され
得たという観察をもたらした。しかし、Ｂと特徴づけら
れる植物でさえ、もしＧＵＳ遺伝子の発現が第一の三葉
の葉で見られず、また成熟した葉における葉柄及び中肋
アッセイにおいて見られなかったなら、胚芽系列形質転
換事象を持つと判明しない。形質転換事象の第二及び第
三の指標の最良の使用は、負（ネガティブ）として用い
られる。即ち、これら段階でＧＵＳ活性を適当に示さな
かった植物は廃棄されうる。なぜなら、そのような植物
が胚芽系列形質転換事象を与える確率は比較的に最小で
あると見い出されたからである。茎部分のアッセイの間
にＢと分類され、第三又は第四の三葉段階の葉柄及び中
肋部分のアッセイの間に髄又は髄と皮質において大きな
ＧＵＳ活性を示した植物のうち、クローンであり、ＧＵ
Ｓ遺伝子を発現した子孫植物の回収により証明されるよ
うに胚芽系列形質転換事象を含むと後に決定された総て
の植物は活性を有した。上述した分類の外のどれかに分
類された植物は総て、胚芽系列形質転換事象の劇的に低
い頻度を示し、しかしそのような事象は組織の別のクラ
スでも起った。たとえば、茎部分段階においてその表皮
でのみ活性を示した３６８個のうち二つの植物が、形質
転換された子孫を与えた。しかし、他のどれかの分類の
植物からの何らかの形質転換事象の可能性は、茎部分の
間で上記で指定した植物以外を総て捨て、そして第一の
三葉段階でＧＵＳ活性を示しかつ植物の成熟した葉の葉
柄及び中肋のアッセイの間で大きな髄及び皮質のかかわ
り合いを示した胚芽系列形質転換をもたらすであろうと
分類された植物を性的にさらに繁殖させることを実用的
理由で正当化する程に低かった。Ｂと分類された植物の
三分の一より多くは、胚芽系列形質転換事象を生じるで
あろう。対照的に、茎部分の間に他の分類に分類された
植物は、胚芽系列形質転換事象の劇的に低い可能性を持
つと判った。たとえば、ｃ／Ｐ＊と分類された植物で
は、胚芽系列形質転換事象の可能性は１０％未満であ
り、一方、皮質の半分より多くで活性を示し、Ｃと分類
される植物では、形質転換事象の比は２％のオーダーで
あった。大きな皮質及び髄活性を有し、Ｃ／Ｐと指定さ
れ、そのうち僅か八つの植物がテストされた植物のう
ち、二つが胚芽系列形質転換事象を与えた。髄の５０％
未満で活性を示した六つの植物のうち一つの胚芽系列形
質事象が回収された。従って、再生される正確な分類
は、より推定的に形質転換された芽を再生するコストに
比べて、芽を植物及び種子へと再生するコストのコスト
分析に依存するであろう。
【実施例】本明細書で述べるダイズ形質転換手順におい
て用いられる標的組織は、ダイズの優秀な系列の未成熟
の及び成熟した種子から切った胚軸であった。軸は種子
から切取られ、寒天上の標的プレート上にプレートされ
た。種子を切り、形質転換実験を行う方法は、マッカべ
ら、バイオ／テクノロジー、６：９２３−９２６（１９
８８）に詳細に記載されている。形質転換実験で用いら
れた装置は、図１及び２の装置であった。形質転換事象
を行った後に、５，０００を超える芽を回収し、茎部分
アッセイに付した。茎部分アッセイを行うにおいて、芽
は下方の組織から切られる前に約２ｃｍの長さに達する
ことを許された。切断の時に、芽の基部の２〜４ｃｍ部
分を切断し、ＧＵＳ活性についてアッセイした。ＧＵＳ
活性を示したアッセイされた７５７個の茎部分の植物
は、上述した分類系、即ちＢ、Ｃ／Ｐ＊、Ｃ、Ｃ／Ｐ、
ｐ、ｃまたはｅのどれかによって、茎で観察された活性
の種類に基づいて分類された。分類された植物の分布を
表１に示す。
て用いられる標的組織は、ダイズの優秀な系列の未成熟
の及び成熟した種子から切った胚軸であった。軸は種子
から切取られ、寒天上の標的プレート上にプレートされ
た。種子を切り、形質転換実験を行う方法は、マッカべ
ら、バイオ／テクノロジー、６：９２３−９２６（１９
８８）に詳細に記載されている。形質転換実験で用いら
れた装置は、図１及び２の装置であった。形質転換事象
を行った後に、５，０００を超える芽を回収し、茎部分
アッセイに付した。茎部分アッセイを行うにおいて、芽
は下方の組織から切られる前に約２ｃｍの長さに達する
ことを許された。切断の時に、芽の基部の２〜４ｃｍ部
分を切断し、ＧＵＳ活性についてアッセイした。ＧＵＳ
活性を示したアッセイされた７５７個の茎部分の植物
は、上述した分類系、即ちＢ、Ｃ／Ｐ＊、Ｃ、Ｃ／Ｐ、
ｐ、ｃまたはｅのどれかによって、茎で観察された活性
の種類に基づいて分類された。分類された植物の分布を
表１に示す。
【表１】 茎部分アッセイが何らかの程度で正であった植物の総て
を次に、接木するか発根させて、小葉を作った。小葉の
各々からの第一の三葉の葉は、ＧＵＳ活性についてアッ
セイされた。そのアッセイの結果は、表１の第３欄に示
されている。第一の三葉の葉においてＧＵＳ活性を持ち
続けた総ての植物を次に、多数の葉を含む植物へと繁殖
させ、該植物から成熟した第三及び第四の三葉レベルの
葉を採取し、その葉から葉柄及び中肋部分を取り、固定
し、そしてＧＵＡ活性についてアッセイした。これらの
アッセイの結果を表１の第４欄に示す。第４欄に示す総
ての植物は、胚芽系列形質転換事象を経験したことが見
い出された。表１の第４欄は、第三又は第四段階の三葉
の葉の髄または髄と皮質において活性を有した植物を示
す。ＧＵＳ活性を持った植物の総ては、自家受粉し、子
孫を再生産することを許された。次にＧＵＳ活性につい
て子孫の分析を行った。第三又は第四段階の三葉の葉の
髄または髄と皮質に活性を持つと表１の第四欄に示され
た植物の総ては、ＧＵＳ遺伝子を発現した子孫植物の回
収により示されたように、胚芽系列形質転換事象を含む
と判った。第三又は第四段階の三葉の葉において髄また
は髄と皮質の活性を持たなかった植物については、結果
はより複雑であった。茎部分アッセイによりＢと指定さ
れた植物のうち、第三又は第四の三葉の葉のアッセイの
間に植物の八つのみが表皮において活性を示し、一方、
六つがＧＵＳアッセイにおいて完全に負（ネガチブ）で
あると判った。表皮においてのみ活性を示した植物の二
つは、形質転換された子孫を生じた。従って、Ｂの分類
の表示は、胚芽系列形質転換事象の単独のかつそれ自体
で予言者ではない。つまり、Ｂの分類は、胚芽系列形質
転換の回収の高い可能性を示すが、ダイズ植物の第三又
は第四の三葉の葉における髄又は髄と皮質の関与なしで
胚芽系列形質転換事象の高度に信頼しうる予言者と考え
られることはできない。茎部分アッセイが他のカテゴリ
ーの分類をもたらす植物については結果はまたより低い
頻度ではあるが胚芽系列形質転換事象を生じる。Ｃ／Ｐ
＊と特徴づけられた１３個の植物のうち、その組織全体
においてＧＵＳを発現すると見えた５つの植物が回収さ
れ、しかし僅か１つの植物が胚芽系列形質転換事象であ
ると判った。その皮質の５０％超で活性を示し、Ｃと指
定された４５の植物のうち、２０がＧＵＳ発現植物であ
り、うち僅か１つが胚芽系列形質転換事象であると見い
出された。その皮質の５０％超での活性によりＣ／Ｐと
分類された８つの植物のうち、その葉でＧＵＳを発現す
る４つの植物が回収され、うち僅か２つで胚芽系列形質
転換事象が見い出された。その髄の５０％未満で活性を
示した６つの植物のうち、一つの胚芽系列形質転換事象
が見い出された。皮質で小さな活性を示した２９２のＲ
０植物のうち、その葉でＧＵＳを発現した９つの植物が
回収され、１つの胚芽系列形質転換事象が回収された。
表皮でのみ活性を示した３６３のＲ０植物のうち、その
葉でＧＵＳを発現すると見えた７つの植物が回収され、
僅か１つの事象が胚芽系列形質転換に関係する事象であ
ると判った。表１に示したデータ及び関連する実験に基
づいて、ここに述べた粒子媒介形質転換プロセスに付さ
れたダイズ植物の回収された芽の１０〜１５％が茎部分
アッセイの間に何らかの形のＧＵＳ遺伝子発現を示すこ
とが測定された。手順に付された芽の総てのうち、胚芽
系列形質転換されたと見い出されたパーセンテージは、
再生された芽の最終的に０．２〜０．５％範囲にあろ
う。このように茎部分アッセイを行うことにより、再生
プロセスを行われる必要のある植物の数は、８５〜９０
％のファクターで低減されうる。そして、胚芽系列形質
転換事象の最高の濃度は、Ｂ，Ｃ／Ｐ＊，ＣまたはＣ／
Ｐと分類される部分において生じるので、茎部分アッセ
イの間に他の総ての分類に入る他の総ての植物は、胚芽
系列形質転換事象の発見の低い可能性に基づき廃棄され
ることができた。これら植物は少しでもＧＵＳ活性を示
す茎部分合計の約１５％を分類するので、これは、回収
された植物の約８５％の廃棄を可能にし、従って再生の
努力は胚芽系列形質転換事象の高い可能性を示す残り約
１５％に集中されうる。このようにして、形質転換プロ
セスから回収された芽の約２〜２．５％が最終的に繁殖
される必要があり、従って植物繁殖と子孫テストプロセ
スに関係する労力と努力の９７〜９８％が節約される。
形質転換プロセスで再生された２％のうち１０〜２５％
の植物が、子孫のＧＵＳ活性のアッセイにより、安定に
形質転換され、挿入された外来ＤＮＡを遺伝可能に有す
る子孫を与える胚芽系列形質転換を受けたことが見い出
された。
を次に、接木するか発根させて、小葉を作った。小葉の
各々からの第一の三葉の葉は、ＧＵＳ活性についてアッ
セイされた。そのアッセイの結果は、表１の第３欄に示
されている。第一の三葉の葉においてＧＵＳ活性を持ち
続けた総ての植物を次に、多数の葉を含む植物へと繁殖
させ、該植物から成熟した第三及び第四の三葉レベルの
葉を採取し、その葉から葉柄及び中肋部分を取り、固定
し、そしてＧＵＡ活性についてアッセイした。これらの
アッセイの結果を表１の第４欄に示す。第４欄に示す総
ての植物は、胚芽系列形質転換事象を経験したことが見
い出された。表１の第４欄は、第三又は第四段階の三葉
の葉の髄または髄と皮質において活性を有した植物を示
す。ＧＵＳ活性を持った植物の総ては、自家受粉し、子
孫を再生産することを許された。次にＧＵＳ活性につい
て子孫の分析を行った。第三又は第四段階の三葉の葉の
髄または髄と皮質に活性を持つと表１の第四欄に示され
た植物の総ては、ＧＵＳ遺伝子を発現した子孫植物の回
収により示されたように、胚芽系列形質転換事象を含む
と判った。第三又は第四段階の三葉の葉において髄また
は髄と皮質の活性を持たなかった植物については、結果
はより複雑であった。茎部分アッセイによりＢと指定さ
れた植物のうち、第三又は第四の三葉の葉のアッセイの
間に植物の八つのみが表皮において活性を示し、一方、
六つがＧＵＳアッセイにおいて完全に負（ネガチブ）で
あると判った。表皮においてのみ活性を示した植物の二
つは、形質転換された子孫を生じた。従って、Ｂの分類
の表示は、胚芽系列形質転換事象の単独のかつそれ自体
で予言者ではない。つまり、Ｂの分類は、胚芽系列形質
転換の回収の高い可能性を示すが、ダイズ植物の第三又
は第四の三葉の葉における髄又は髄と皮質の関与なしで
胚芽系列形質転換事象の高度に信頼しうる予言者と考え
られることはできない。茎部分アッセイが他のカテゴリ
ーの分類をもたらす植物については結果はまたより低い
頻度ではあるが胚芽系列形質転換事象を生じる。Ｃ／Ｐ
＊と特徴づけられた１３個の植物のうち、その組織全体
においてＧＵＳを発現すると見えた５つの植物が回収さ
れ、しかし僅か１つの植物が胚芽系列形質転換事象であ
ると判った。その皮質の５０％超で活性を示し、Ｃと指
定された４５の植物のうち、２０がＧＵＳ発現植物であ
り、うち僅か１つが胚芽系列形質転換事象であると見い
出された。その皮質の５０％超での活性によりＣ／Ｐと
分類された８つの植物のうち、その葉でＧＵＳを発現す
る４つの植物が回収され、うち僅か２つで胚芽系列形質
転換事象が見い出された。その髄の５０％未満で活性を
示した６つの植物のうち、一つの胚芽系列形質転換事象
が見い出された。皮質で小さな活性を示した２９２のＲ
０植物のうち、その葉でＧＵＳを発現した９つの植物が
回収され、１つの胚芽系列形質転換事象が回収された。
表皮でのみ活性を示した３６３のＲ０植物のうち、その
葉でＧＵＳを発現すると見えた７つの植物が回収され、
僅か１つの事象が胚芽系列形質転換に関係する事象であ
ると判った。表１に示したデータ及び関連する実験に基
づいて、ここに述べた粒子媒介形質転換プロセスに付さ
れたダイズ植物の回収された芽の１０〜１５％が茎部分
アッセイの間に何らかの形のＧＵＳ遺伝子発現を示すこ
とが測定された。手順に付された芽の総てのうち、胚芽
系列形質転換されたと見い出されたパーセンテージは、
再生された芽の最終的に０．２〜０．５％範囲にあろ
う。このように茎部分アッセイを行うことにより、再生
プロセスを行われる必要のある植物の数は、８５〜９０
％のファクターで低減されうる。そして、胚芽系列形質
転換事象の最高の濃度は、Ｂ，Ｃ／Ｐ＊，ＣまたはＣ／
Ｐと分類される部分において生じるので、茎部分アッセ
イの間に他の総ての分類に入る他の総ての植物は、胚芽
系列形質転換事象の発見の低い可能性に基づき廃棄され
ることができた。これら植物は少しでもＧＵＳ活性を示
す茎部分合計の約１５％を分類するので、これは、回収
された植物の約８５％の廃棄を可能にし、従って再生の
努力は胚芽系列形質転換事象の高い可能性を示す残り約
１５％に集中されうる。このようにして、形質転換プロ
セスから回収された芽の約２〜２．５％が最終的に繁殖
される必要があり、従って植物繁殖と子孫テストプロセ
スに関係する労力と努力の９７〜９８％が節約される。
形質転換プロセスで再生された２％のうち１０〜２５％
の植物が、子孫のＧＵＳ活性のアッセイにより、安定に
形質転換され、挿入された外来ＤＮＡを遺伝可能に有す
る子孫を与える胚芽系列形質転換を受けたことが見い出
された。
【図１】図１は、植物組織の粒子媒介形質転換で用いら
れるのに適した装置の見取図である。
れるのに適した装置の見取図である。
【図２】図２は、図１の装置のスパーク放電室の平面図
である。
である。
【図３】図３は、ダイズ茎の断面の極めて判りやすくし
た図示である。
た図示である。
【図４〜８】図４〜８は、マーカー遺伝子発現の種々の
表現型を示す、ダイズ茎の断面の別の判りやすくした図
示である。
表現型を示す、ダイズ茎の断面の別の判りやすくした図
示である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏ ｌ．６，Ｎｏ．８（1988）ｐ．915−922 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．86，Ｎｏ．19 （1989）ｐ．7500−7504 Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，Ｓ ｕｐｐｌ．13ｐａｒｔＤ（1989）ｐ. 313 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) A01H 1/00 C12N 5/10 C12N 15/65 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (22)
- 【請求項１】 胚芽系列形質転換されたダイズ植物を作
る方法において、 (a)ダイズ植物中に挿入される外来遺伝子構造体を用意
すること、但し外来遺伝子構造体はマーカー遺伝子およ
び興味の遺伝子の両者のための発現構成体を含み、マー
カー遺伝子及び興味の遺伝子の発現構成体の両者はダイ
ズ植物の細胞においてコーディング配列によりコードさ
れる遺伝子産生物を作るべくダイズ細胞中で有効なコー
ディング配列およびフランキング制御配列を含むこと、 (b)生物学的に不活性な物質の担体粒子上に外来遺伝子
構造体のコピーをコーティングすること、但し担体粒子
はダイズ細胞のサイズに比べて小さいこと、 (c)それから芽が再生されうるダイズ組織の細胞中に、
上記コーティングされた担体粒子を加速すること、 (d)ダイズ組織から芽を再生すること、 (e)芽の各々から茎の部分を切り出すこと、 (f)茎部分を、マーカー遺伝子の遺伝子産生物の発現に
ついてアッセイすること、 (g)その髄の少くとも大きな割合中でマーカー遺伝子の
遺伝子産生物を発現した茎部分の芽を性的に成熟したダ
イズ植物全体へと再生すること、 (h)該植物全体を性的に繁殖させて子孫植物を作るこ
と、そして (i)子孫植物の胚芽系列中への興味の遺伝子の胚芽系列
挿入を表わす、子孫植物中のマーカー遺伝子の遺伝子産
生物の発現についてアッセイすることの工程を含む方
法。 - 【請求項２】 マーカー遺伝子が酵素べーダーグルクロ
ニダーゼをコードする遺伝子であり、アッセイが該酵素
の活性について行われる請求項１の方法。 - 【請求項３】 担体粒子が金粒子である請求項１の方
法。 - 【請求項４】 加速工程において、運動の力が電圧スパ
ーク放電により与えられる請求項１の方法。 - 【請求項５】 加速工程が、担体粒子を担体シート上に
置くこと、担体シートを一対の間隔を置かれた電極近く
に置くこと、そして電極間で電圧スパーク放電を開始す
ることを含む請求項４の方法。 - 【請求項６】 その中に担体粒子が加速されるダイズ組
織がダイズ種子からの切取られた胚軸である請求項１の
方法。 - 【請求項７】 胚軸が粒子加速工程の後にプレートさ
れ、再生工程が該プレートされた胚軸における芽形成を
誘発することを含む請求項６の方法。 - 【請求項８】 再生する芽がダイズ組織から切られ、か
つ茎部分の切断工程は芽が組織から切取られる時に実施
される請求項１の方法。 - 【請求項９】 髄、皮質及び表皮の総てにおいて発現、
皮質の５０％超及び髄の総てにおいて発現、皮質の５０
％超及び髄の５０％超で発現、及び髄の５０％超で発現
より成るパターン群から選択されたパターンでマーカー
遺伝子を発現する茎部分の植物についてのみ再生工程を
行う請求項1の方法。 - 【請求項１０】 性的に繁殖する工程が自家受粉により
行われる請求項１の方法。 - 【請求項１１】 ダイズ植物の胚芽系列遺伝子形質転換
の方法において、 (a)ダイズ植物の細胞において遺伝子産生物を発現する
のに有効な遺伝子産生物及びフランキング制御配列をコ
ードするコーディング配列を含む外来遺伝子構造体のコ
ピーを用意すること、 (b)生物学的に不活性な小さな担体粒子上に遺伝子構造
体のコピーをコーティングすること、 (c)ダイズ植物の再生性組織中に、コーティングされた
担体粒子を挿入すること (d)再生性組織からダイズ植物を再生すること、 (e)再生手順の間に、再生しているダイズ植物の選択さ
れた部分を遺伝子産生物の発現についてのアッセイであ
って、前記選択された部分が、芽の基部から切り取られ
た茎、第三の三葉の葉柄、第三の三葉の中肋、第四の三
葉の葉柄、第四の三葉の中肋、およびこれらの組合わせ
からなる群より選ばれる部分である、前記アッセイを行
なうこと、 (f)再生しているダイズ植物の該選択された部分のアッ
セイにおいて観察される表現型に基づき遺伝子構造体を
有するその子孫の可能性に関して、再生しているダイズ
植物を分類すること、 (g)胚芽系列形質転換の高い可能性を有する表現型を示
した選択された部分のダイズ植物のみを再生すること、 (h)再生されたダイズ植物を性的に増殖すること、及び (i)胚芽系列形質転換事象を同定するため性増殖の子孫
における遺伝子産生物についてアッセイすることの工程
を含む方法。 - 【請求項１２】 遺伝子構造体が、遺伝子産生物をコー
ドするところの、二つの遺伝子すなわち興味の遺伝子と
マーカー遺伝子の縦列構成体であり、遺伝子産生物が酵
素べーターグルクロニダーゼであり、アッセイが該酵素
の活性について行われる請求項１１の方法。 - 【請求項１３】 コーティングされた担体粒子を組織中
に挿入する工程が、組織中に粒子を加速することにより
行われる請求項１１の方法。 - 【請求項１４】 担体粒子が金粒子である請求項１３の
方法。 - 【請求項１５】 加速工程において、運動の力が電圧ス
パーク放電により与えられる請求項１３の方法。 - 【請求項１６】 加速工程が、担体粒子を担体シート上
に置くこと、担体シートを一対の間隔を置かれた電極近
くに置くこと、そして電極間で電圧スパーク放電を開始
することを含む請求項１５の方法。 - 【請求項１７】 その中に担体粒子が挿入される組織が
ダイズ種子からの切取られた胚軸である請求項１１の方
法。 - 【請求項１８】 胚軸が粒子加速工程の後にプレートさ
れ、再生工程が該プレートされた胚軸における芽形成を
誘発することを含む請求項１７の方法、 - 【請求項１９】 再生手順の間にダイズ組織から再生し
ている芽が切取られ、かつアッセイされる植物の部分が
芽の基部から切取られた茎の部分である請求項１１の方
法。 - 【請求項２０】 茎部分を調べ、そして髄、皮質及び表
皮の総てにおいて発現、皮質の５０％超及び髄の総てに
おいて発現、皮質の５０％超及び髄の５０％超で発現、
髄の５０％超で発現、上記のどれでも発現せずより成る
分類群から選択された分類で遺伝子産生物を発現する部
分を分類することにより分類工程を行う請求項１９の方
法。 - 【請求項２１】 胚芽系列形質転換の高い可能性を持つ
表現型が、上述の無しの分類を除いて請求項２０記載の
総ての分類を含む請求項２０の方法。 - 【請求項２２】 性的に繁殖する工程が自家受粉により
行われる請求項１１の方法。
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