JP3130313B2 - Method for producing human bFGF mutein - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、創傷の治癒促進剤などとして用いることの
できる成熟型ヒト塩基性線維芽細胞成長因子（以下、本
明細書においては、hbFGFと略称することもある。）の
少なくとも１個の構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換さ
れているムテインを製造する技術に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a mature human basic fibroblast growth factor (hereinafter sometimes abbreviated as hbFGF in the present specification) which can be used as a wound healing promoter or the like. ), Wherein at least one constituent amino acid is replaced with another amino acid.
従来技術 塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）は主として下垂体
より分泌される分子量約17000の塩基性ポリペプチドホ
ルモンであり、当初BALB/c3T3細胞などの線維芽細胞に
強い増殖促進作用を示す因子として分離された［D.Gosp
odarowicz;ネイチャー（Nature）：249:123（197
4）］。しかし、その後中胚葉由来の殆んど全ての細胞
に対して増殖促進作用を示すことが判明した［D.Gospod
arowiczら：ナショナル・キャンサー・インスティテュ
ート・モノグラフ（National Cancer Institute Mono
graph）48;109（1978）］。中でもbFGFの血管新生作用
は細胞増殖促進作用と相まって損傷の治療薬および血栓
症，動脈硬化症などの予防治療薬としての可能性を示す
ものである。Prior art Basic fibroblast growth factor (bFGF) is a basic polypeptide hormone with a molecular weight of about 17,000, which is mainly secreted by the pituitary gland, and initially has a strong growth promoting effect on fibroblasts such as BALB / c3T3 cells. [D.Gosp
odarowicz; Nature: 249 : 123 (197
Four)]. However, it was later found that it exhibited a growth-promoting effect on almost all cells derived from mesoderm [D. Gospod
arowicz et al .: National Cancer Institute Monograph
graph) 48 ; 109 (1978)]. Above all, the angiogenesis effect of bFGF, combined with the cell growth promoting effect, indicates its potential as a therapeutic agent for damage and a preventive therapeutic agent for thrombosis, arteriosclerosis and the like.
hbFGFをコードする遺伝子は、アブラハムら［ザ・EMB
Oジャーナル，５;2523−2528（1986）］、黒川ら［FEBS
レターズ，213;189−194,（1987）］によってクローン
化され、動物細胞［FEBSレターズ，213;189−194,（198
7）］，酵母［ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー，263;16471−16478,（1988）］，大腸
菌［ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー，263;16297−16302（1988）］で発現されている
が、その生産量は必ずしも十分ではなく、また得られる
標品は非常に不安定で、医薬品として用いるには必ずし
も満足すべきものではない。この安定性を解決するため
に種々検討された結果、hbFGF分子中に存在するシステ
イン残基をセリン残基に置換した化合物は安定性が高く
しかも同じ生物活性を示すことが明らかにされた［ビオ
ケミカル・アンド・ビオフィジカル・リサーチ・コミュ
ニケーション，151;701−708,（1988）］。The gene encoding hbFGF was obtained from Abraham et al. [The EMB
O Journal, 5 ; 2523-2528 (1986)], Kurokawa et al. [FEBS
Letters, 213 ; 189-194, (1987)] and animal cells [FEBS Letters, 213 ; 189-194, (198).
7)], Yeast [The Journal of Biological Chemistry, 263 ; 16471-16478, (1988)], Escherichia coli [The Journal of Biological Chemistry, 263 ; 16297-16302 (1988)] However, its production is not always sufficient, and the obtained sample is very unstable, and is not always satisfactory for use as a pharmaceutical. As a result of various studies to solve this stability, it was revealed that a compound in which a cysteine residue present in the hbFGF molecule was substituted with a serine residue had high stability and the same biological activity [Biol. Chemical and Biophysical Research Communication, 151 ; 701-708, (1988)].
また、hbFGFの少なくとも１個の構成アミノ酸が別の
アミノ酸で置換されているムテインを遺伝子工学的手法
で製造する方法が開発された（ヨーロッパ特許出願公開
第281,822号）。In addition, a method for producing a mutein in which at least one constituent amino acid of hbFGF has been substituted with another amino acid by a genetic engineering technique has been developed (EP-A-281,822).
大腸菌を用いて遺伝子組換え蛋白質を生産させる場
合、しばしば水不溶性の封入体（inclusion body）を形
成して蓄積される。この様な封入体から目的物質を単離
精製する場合には通常蛋白変性剤を添加して可溶化する
方法が採用される。しかしhbFGFムテインではこの様に
して可溶化した蛋白質は不活性であり、これを再活性化
する技術はまだ確立されていない。When a recombinant protein is produced using Escherichia coli, it is often accumulated in the form of a water-insoluble inclusion body. In the case of isolating and purifying the target substance from such an inclusion body, a method of adding a protein denaturant and solubilizing it is usually employed. However, in the case of the hbFGF mutein, the protein solubilized in this manner is inactive, and a technique for reactivating the protein has not yet been established.
従って、hbFGFムテインを遺伝子工学的手法を用いて
大量にしかも活性状態で蓄積させ、さらに高収率で単離
精製することができれば、医薬などとして使用の際に特
に有利であり、効率良い生産方法の確立は重要な課題で
ある。Therefore, if the hbFGF mutein can be accumulated in a large amount and in an active state using a genetic engineering technique, and can be isolated and purified in a high yield, it is particularly advantageous when used as a medicine, etc., and an efficient production method. Is an important issue.
一般に、遺伝子工学的手法を用いて遺伝子産物を大量
生産する場合、宿主−ベクター系およびプロモーターの
選択は、重要な課題であり、遺伝子ごとに異なる。hbFG
Fムテインの効率良い発現系について種々検討を重ねた
結果、hbFGFムテイン遺伝子の発現にはT7プロモーター
を用いた大腸菌遺伝子発現系［F.W.Studierら，ジャー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー 189巻,113
−130（1986）］が最も優れていることを見出した。T7
プロモーターとhbFGFムテイン遺伝子との組合せは新規
なものである。このT7プロモーターは強力なプロモータ
ーであることが知られているが、ヒト・インターロイキ
ン−２、プロラクチン等の蓄積される蛋白質は封入体等
を形成して、その大部分が不活性の状態で蓄積されるこ
とがあった。これらの内、ヒト・インターロイキン−２
については本発明者らが見出したものであり、プロラク
チンについてはParis,N.らが見出したものである〔Pari
s,N.et al.,バイオテクノロジー・アンド・アプライド
・バイオケミストリー（Biotechnology and Applied Bi
ochemistry），12,436−449（1990）〕。Generally, when gene products are produced in large quantities using genetic engineering techniques, the selection of a host-vector system and a promoter is an important issue, and differs from gene to gene. hbFG
As a result of various studies on an efficient expression system of F mutein, the expression of the hbFGF mutein gene was carried out using an E. coli gene expression system using the T7 promoter [FWStudier et al., Journal of Molecular Biology 189, 113
−130 (1986)] was found to be the best. T7
The combination of the promoter and the hbFGF mutein gene is novel. Although this T7 promoter is known to be a strong promoter, the accumulated proteins such as human interleukin-2 and prolactin form inclusion bodies and the like, and most of them are accumulated in an inactive state. Had to be done. Of these, human interleukin-2
Were found by the present inventors, and prolactin was found by Paris, N. et al. [Pari
s, N. et al., Biotechnology and Applied Bichemistry
ochemistry), 12 , 436-449 (1990)].
発明の開示 本発明者らは多量のhbFGFムテインを活性な状態で蓄
積させるべく鋭意研究を重ねた結果、イソプロピルチオ
ガラクテピラノシドを低濃度で加えるのが効果的である
ことを見出した。更にその効率良い単離精製法を確立
し、本発明を完成するに至った。DISCLOSURE OF THE INVENTION As a result of intensive studies to accumulate a large amount of hbFGF mutein in an active state, the present inventors have found that it is effective to add isopropylthiogalactepyranoside at a low concentration. Furthermore, the efficient isolation and purification method was established, and the present invention was completed.
本発明は、 （１） 成熟型ヒト塩基性線維芽細胞成長因子（hbFG
F）の少なくとも１個の構成アミノ酸が別のアミノ酸で
置換されているムテインをコードする塩基配列およびそ
の上流にT7プロモーターを含有するベクター， （２） 上記（１）記載のベクターを保持する形質転換
体， （３） 宿主がｌacプロモーターの下流にT7RNAポリメ
ラーゼ遺伝子を有する大腸菌である上記（２）記載の形
質転換体， （４） 上記（２）記載の形質転換体を培地に培養する
ことを特徴とする成熟型hbFGFの少なくとも１個の構成
アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているムテインの製
造法， （５） 上記（３）記載の形質転換体の対数増殖期に約
３〜500μＭのイソプロピルチオガラクトピラノシド（I
PTG）を一括または分割して培地に添加して培養するこ
とを特徴とする上記（４）記載の製造法，および （６） 得られるムテイン含有液を架橋ポリサッカライ
ド硫酸エステル，交換基としてスルホン酸基を有する合
成ポリマーまたはゲルろ過用合成ポリマーを担体とする
クロマトグラフィーで精製する上記（５）記載の製造法
である。The present invention relates to (1) mature human basic fibroblast growth factor (hbFG)
A vector containing a base sequence encoding mutein in which at least one of the constituent amino acids of F) is substituted with another amino acid and a T7 promoter upstream thereof, (2) transformation carrying the vector according to (1) above (3) the transformant according to (2), wherein the host is Escherichia coli having a T7 RNA polymerase gene downstream of the lac promoter; (4) the transformant according to (2) is cultured in a medium. A method for producing a mutein wherein at least one constituent amino acid of the mature hbFGF is replaced with another amino acid, (5) about 3 to 500 μM isopropylthio in the logarithmic growth phase of the transformant according to the above (3). Galactopyranoside (I
(PTG) is added to the medium in a lump or divided manner and cultured. (6) The mutein-containing solution obtained is cross-linked to a polysaccharide sulfate, and a sulfonic acid as an exchange group. The production method according to the above (5), wherein the purification is carried out by chromatography using a synthetic polymer having a group or a synthetic polymer for gel filtration as a carrier.
本発明方法により、成熟型hbFGFの置換型ムテインを
効率良く製造することができるので、本発明方法は該ム
テインの工業生産に有利に用いることができる。According to the method of the present invention, a substituted mutein of mature hbFGF can be efficiently produced, and thus the method of the present invention can be advantageously used for industrial production of the mutein.
図面の簡単な説明 第１図は、実施例１で用いられた、rhbFGFムテインCS
23のDNA塩基配列およびそれがコードする蛋白質のアミ
ノ酸配列を示す。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows the rhbFGF mutein CS used in Example 1.
The following shows the 23 DNA base sequences and the amino acid sequences of the proteins encoded by them.
第２図は、実施例１で得られた、プラスミドpTB960の
構築図を示す。FIG. 2 shows a construction diagram of plasmid pTB960 obtained in Example 1.
第３図は、実施例５で得られた精製標品およびマーカ
ーのSDS−PAGEパターンを示す。FIG. 3 shows the SDS-PAGE patterns of the purified sample and the marker obtained in Example 5.
第４〜６図は、実施例５で得られた精製標品の高速液
体クロマトグラフィーのパターンを示す。4 to 6 show the high performance liquid chromatography patterns of the purified sample obtained in Example 5.
第７〜９図は、実施例８で得られたプラスミドpHP90
1,pME901およびpCM901の構築図である。7 to 9 show the plasmid pHP90 obtained in Example 8.
1, Construction diagrams of pME901 and pCM901.
発明の詳細な説明 本発明でいう成熟型hbFGFは、第１図においてＮ末端
のMetの次のProを第１番目とし、Ｃ末端のSerを146番目
とする146個のアミノ酸からなるペプチドである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The mature hbFGF referred to in the present invention is a peptide consisting of 146 amino acids having Pro at 1st position next to Met at N-terminal and Ser at 146th position at C-terminal in FIG. .
本発明のhbFGFムテインとしては、たとえばヨーロッ
パ特許出願公開第281,822号公報，バイオケミカル・ア
ンド・バイオフイジカル・リサーチ・コミュニケーショ
ンズ（Biochemical and Biophysical Research Com
munication）151;701〜708（1988）に記載の成熟型hbFG
Fの少なくとも１個の構成アミノ酸が別のアミノ酸で置
換されているムテインが挙げられる。The hbFGF mutein of the present invention includes, for example, European Patent Application Publication No. 281,822, Biochemical and Biophysical Research Communications.
munication) 151 ; 701-708 (1988)
Muteins in which at least one constituent amino acid of F has been replaced by another amino acid.
hbFGFの少なくとも１個の構成アミノ酸が別のアミノ
酸で置換されているムテインにおける置換される前の少
なくとも１個のhbFGF構成アミノ酸の数としては、血管
新生、細胞成長刺激活性および細胞分化活性というよう
なhbFGFの特徴を失わない限り何個でもよい。The number of at least one hbFGF constituent amino acid before replacement in a mutein in which at least one constituent amino acid of hbFGF is replaced by another amino acid may include angiogenesis, cell growth stimulating activity and cell differentiation activity. Any number may be used as long as the characteristics of hbFGF are not lost.
置換される前の構成アミノ酸の例としては、システイ
ン，システイン以外のものが挙げられるが、システイン
が特に好ましい。置換される前の構成アミノ酸としてシ
ステイン以外のものとしては、アスパラギン酸，アルギ
ニン，グリシン，バリンなどが挙げられる。Examples of the constituent amino acids before substitution include cysteine and those other than cysteine, and cysteine is particularly preferred. Examples of constituent amino acids other than cysteine before substitution include aspartic acid, arginine, glycine, valine and the like.
置換される前の構成アミノ酸がシステインである場合
には、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミ
ノ酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、た
とえば、グリシン，バリン，アラニン，ロイシン，イソ
ロイシン，チロシン，フェニルアラニン，ヒスチジン，
トリプトファン，セリン，スレオニン，メチオニンなど
が挙げられる。特に、セリン，スレオニンが好ましい。When the constituent amino acid before substitution is cysteine, the substituted amino acid is preferably, for example, a neutral amino acid. Specific examples of the neutral amino acid include glycine, valine, alanine, leucine, isoleucine, tyrosine, phenylalanine, histidine,
Tryptophan, serine, threonine, methionine and the like. Particularly, serine and threonine are preferred.
置換される前の構成アミノ酸がシステイン以外のもの
である場合には、置換された別のアミノ酸としては、た
とえば、アミノ酸の親水性，疎水性あるいは電荷の点
で、置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつもの
を選ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラ
ギン酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてア
スパラギン，スレオニン，バリン，フェニルアラニン，
アルギニンなどが挙げられるが、特にアスパラギン，ア
ルギニンが好ましい。When the constituent amino acid before substitution is other than cysteine, another substituted amino acid is, for example, an amino acid before substitution in terms of hydrophilicity, hydrophobicity or charge of the amino acid. Choose one with different properties. Specifically, when the amino acid before substitution is aspartic acid, the amino acids after substitution are asparagine, threonine, valine, phenylalanine,
Although arginine etc. are mentioned, especially asparagine and arginine are preferable.
置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換
されたあとのアミノ酸としてグルタミン，スレオニン，
ロイシン，フェニルアラニン，アスパラギン酸が挙げら
れるが、特にグルタミンが好ましい。When the amino acid before substitution is arginine, the amino acids after substitution are glutamine, threonine,
Leucine, phenylalanine and aspartic acid are exemplified, and glutamine is particularly preferred.
置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合に
は、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン，
ロイシン，フェニルアラニン，セリン，グルタミン酸，
アルギニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好まし
い。When the constituent amino acid before substitution is glycine, the amino acid after substitution is threonine,
Leucine, phenylalanine, serine, glutamic acid,
Arginine and the like can be mentioned, and threonine is particularly preferable.
置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合に
は、置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン，
アラニン，ロイシン，システイン，グルタミン，アルギ
ニン，アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニン
が好ましい。When the constituent amino acid before substitution is serine, the amino acid after substitution is methionine,
Examples thereof include alanine, leucine, cysteine, glutamine, arginine, and aspartic acid, and methionine is particularly preferable.
置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合に
は、置換されたあとのアミノ酸としては、セリン，ロイ
シン，プロリン，グリシン，リジン，アスパラギン酸な
どが挙げられ、特にセリンが好ましい。When the constituent amino acid before substitution is valine, examples of the amino acid after substitution include serine, leucine, proline, glycine, lysine, and aspartic acid, with serine being particularly preferred.
置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスパラ
ギン酸，アルギニン，グリシン，セリン，バリンが好ま
しい。As the original constituent amino acids before substitution, aspartic acid, arginine, glycine, serine, and valine are preferable.
置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン，
グルタミン，アルギニン，スレオニン，メチオニン，セ
リン，ロイシンが好ましい。Amino acids after substitution include asparagine,
Glutamine, arginine, threonine, methionine, serine, leucine are preferred.
置換されたムテインの最も好ましいものとしては、構
成アミノ酸であるシステインがセリンに置換されたもの
が挙げられる。The most preferred substituted muteins include those in which the constituent amino acid cysteine is replaced by serine.
上記の置換においては、２個以上の置換を同時に行な
ってもよい。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換
されるのが好ましい。In the above substitution, two or more substitutions may be made simultaneously. In particular, it is preferred that two or three constituent amino acids are substituted.
本発明のhbFGFムテインとしては、たとえば成熟型hbF
GFの少なくとも１個のシステインがセリンで置換されて
いるムテインが好ましい。The hbFGF muteins of the present invention include, for example, mature hbF
Muteins in which at least one cysteine of the GF is replaced by serine are preferred.
該ムテインとしては、特に成熟型hbFGFの69位および8
7位のシステインがそれぞれセリンに置換された組換え
型hbFGFムテインCS23（以下、rhbFGFムテインCS23と略
称することがある。）が好ましい。なお、上記hbFGFの
アミノ酸の位置は、第１図のアミノ酸配列においてＮ末
端のMetの次のProを第１番目として数えるものとする。The muteins include, particularly, positions 69 and 8 of mature hbFGF.
Recombinant hbFGF mutein CS23 in which the cysteine at position 7 is substituted with serine (hereinafter sometimes abbreviated as rhbFGF mutein CS23) is preferred. In addition, the position of the amino acid of the above hbFGF shall be counted as the first Pro next to the N-terminal Met in the amino acid sequence of FIG.
該ムテインを製造するためには、特定部位指向性変異
誘発技術（Site−directed mutagenesis）が採用され
る。該技術は周知であり、アール・エフ・レイサー（la
ther,R.F.）及びジェイ・ピー・レコック（Lecoq,J.
P.），ジェネティック・エンジニアリング（Genetic E
ngineering）、アカデミックプレス社（1983年）第31−
50頁、に示されている。オリゴヌクレオチドに指示され
た変異誘発はエム・スミス（Smith,M.）及びエス・ギラ
ム（Gillam,S.）、ジェネティック・エンジニアリン
グ：原理と方法、プレナムプレス社（1981年）３巻 １
−32頁に示されている。In order to produce the mutein, a site-directed mutagenesis technique is employed. The technology is well known and is available from R.F.
ther, RF) and J. Lecoq, J.
P.), Genetic E
ngineering), Academic Press (1983) 31st
On page 50. Oligonucleotide-directed mutagenesis is described in M. Smith and M. Gillam, S., Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press (1981), vol. 3, 1
-See page 32.
該ムテインをコードする構造遺伝子を製造するために
は、たとえば、（ａ）hbFGFの構造遺伝子の１本鎖から
なる１本鎖DNAを突然変異株オリゴヌクレオチドプライ
マーと雑種形成させる（この１本鎖で代替えすべきシス
テイン用コドン、又は場合によりこのコドンと対合をつ
くるアンチセンス・トリプレットを包含する領域に対し
て上記プライマーは相補的なものである。但し、当該コ
ドンの他のアミノ酸暗号化用コドン、又は場合によりア
ンチセンス・トリプレットとの不一致はこの限りでな
い。）、（ｂ）DNAポリメラーゼによりプライマーを伸
長させ、突然変異性ヘテロ二量体（heteroduplex）を形
成させる、及び （ｃ）この突然変異性ヘテロ二量体を複製する、 次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージDN
Aを単離し、プラスミドへ組み込む、 などがあげられる。In order to produce the structural gene encoding the mutein, for example, (a) a single-stranded DNA consisting of a single strand of the hbFGF structural gene is hybridized with a mutant oligonucleotide primer (with this single-stranded DNA). The primer is complementary to the cysteine codon to be replaced or, optionally, to the region encompassing the antisense triplet that forms a pair with this codon, provided that the codon is another codon for amino acid encoding. Or, optionally, inconsistencies with the antisense triplet), (b) extending the primer with a DNA polymerase to form a mutable heteroduplex, and (c) Phage DN that replicates the sex heterodimer, then carries the mutated gene
Isolating A and incorporating it into a plasmid.
本発明で用いられるT7プロモーターとしては、T7DNA
上で見い出されている17種のプロモーター［J.L.Oakley
ら,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.74:4266−4270（1977）,
M.D.Rosa,Cell 16:815−825（1979）,N.Panayotatosら,
Nature 280:35（1979）,J.J.Dunnら,J.Mol.Biol.166:47
7−535（1983）］のいずれでもよいがφ10プロモーター
［A.H.Rosenbergら,Gene 56:125−135（1987）］が好ま
しい。As the T7 promoter used in the present invention, T7 DNA
17 promoters found above [JLOakley
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 : 4266-4270 (1977),
MDRosa, Cell 16 : 815-825 (1979), N. Panayotatos et al.,
Nature 280 : 35 (1979), JJ Dunn et al., J. Mol. Biol. 166: 47.
7-535 (1983)], but the φ10 promoter [AHRosenberg et al., Gene 56 : 125-135 (1987)] is preferred.
本発明で用いられる転写ターミネーターとしては、大
腸菌の系で作動するターミネーターならいずれでもよい
が、好ましくはＴφターミネーター［F.W.Studierら,J.
Mol.Biol.189:113−130（1986）］が用いられる。The transcription terminator used in the present invention may be any terminator that operates in an E. coli system, but is preferably a Tφ terminator [FWStudier et al., J. Am.
Mol. Biol. 189 : 113-130 (1986)].
本発明で用いられるT7RNAポリメラーゼ遺伝子として
はT7遺伝子１［F.W.Studierら,J.Mol.Biol.189:113−13
0（1986）］をあげることが出来る。The T7 RNA polymerase gene used in the present invention includes T7 gene 1 [FW Studier et al., J. Mol. Biol. 189: 113-13].
0 (1986)].
本発明のベクターに用いる基となるベクターとしては
たとえばpBR322,pUC8,pUC9,pMB9,pKC7,pACYC177,pKN410
などを挙げることができる。Examples of the base vector used in the vector of the present invention include pBR322, pUC8, pUC9, pMB9, pKC7, pACYC177, and pKN410.
And the like.
本発明に用いられるベクターは上記ベクターにT7プロ
モーター,T7ターミネーターを組み込んで構築される。
このようなベクターとしては、pET−1,pET−2,pET−3,p
ET−4,pET−５［A.H.Rosenberg,Gene 56:125−135（198
7）］をあげることができるが、好ましくはpET−3C［同
上］が用いられる。The vector used in the present invention is constructed by incorporating a T7 promoter and a T7 terminator into the above vector.
Such vectors include pET-1, pET-2, pET-3, pET
ET-4, pET-5 [AHRosenberg, Gene 56 : 125-135 (198
7)], but pET-3C [ditto] is preferably used.
本発明で用いられる形質転換体の宿主としては、T7RN
Aポリメラーゼ遺伝子（T7遺伝子１）［F.W.Studierら,
J.Mol.Biol.189:113−130（1986）］を組み込んだ大腸
菌株、例えばMM294,DH−1,C600,BL21など、ならいずれ
でもよい。好ましくはT7遺伝子１を組み込んだλファー
ジが溶原化したMM294株およびBL21株が用いられる。T7R
NAポリメラーゼ遺伝子は発現ベクターとは異なる系統の
プラスミドに保持させることができる。この場合T7遺伝
子１のプロモーターとしては、イソプロピル−１−チオ
−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（IPTGと略することがあ
る。）で発現が誘導されるｌacプロモーターが用いられ
る。As a host of the transformant used in the present invention, T7RN
A polymerase gene (T7 gene 1) [FWStudier et al.
J. Mol. Biol. 189 : 113-130 (1986)], for example, any of E. coli strains such as MM294, DH-1, C600, and BL21. Preferably, MM294 strain and BL21 strain in which λ phage into which T7 gene 1 has been incorporated are lysogenized are used. T7R
The NA polymerase gene can be carried on a plasmid of a different strain from the expression vector. In this case, as a promoter of the T7 gene 1, a lac promoter whose expression is induced by isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (may be abbreviated as IPTG) is used.
本発明で用いられる形質転換体は、上記T7遺伝子１
（RNAポリメラーゼ遺伝子）を組み込んだ大腸菌株を、T
7プロモーター・発現させる遺伝子・転写ターミネータ
ーを保持するプラスミドで通常の方法たとえばProc.Nat
l.Acad.Sci.U.S.A. 69:2110（1972）,Gene 17:107（198
2）などに記載の方法、により形質転換して得られる。
この場合、使用する宿主をあらかじめT7リゾチーム遺伝
子を有するプラスミドで形質転換しておき、得られた形
質転換体が２種の異なるプラスミドを同時に保持してい
てもよい。The transformant used in the present invention is the above T7 gene 1
(RNA polymerase gene) into E. coli strain
(7) Plasmid holding promoter, gene to be expressed, transcription terminator and plasmid
l.Acad.Sci.USA 69 : 2110 (1972), Gene 17 : 107 (198
It is obtained by transformation according to the method described in 2) or the like.
In this case, the host to be used may be previously transformed with a plasmid having the T7 lysozyme gene, and the resulting transformant may simultaneously hold two different plasmids.
形質転換体を培養する際、培養に使用される培地とし
ては液体培地が適当であり、その中には該形質転換体の
生育に必要な炭素源，窒素源，無機物その他が含有せし
められる。炭素源としては、たとえばグルコース，デキ
ストリン，可溶性澱粉，ショ糖など、窒素源としては、
たとえばアンモニウム塩類，硝酸塩類，コーンスチープ
・リカー，ペプトン，カゼイン，カザミノ酸，肉エキ
ス，大豆粕，バレイショ抽出液などの無機または有機物
質，無機物としてはたとえば塩化カルシウム，リン酸二
水素ナトリウム，塩化マグネシウムなどがあげられる。
また、酵母エキス，ビタミン類，生長促進因子などを添
加してもよい。When culturing the transformant, a liquid medium is suitable as a medium to be used for culturing, which contains a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance and the like necessary for growth of the transformant. Examples of carbon sources include glucose, dextrin, soluble starch, and sucrose. Examples of nitrogen sources include:
For example, inorganic or organic substances such as ammonium salts, nitrates, corn steep liquor, peptone, casein, casamino acid, meat extract, soybean meal, potato extract, and inorganic substances such as calcium chloride, sodium dihydrogen phosphate, and magnesium chloride And so on.
In addition, yeast extract, vitamins, growth promoting factors and the like may be added.
培地のpHは約６〜８が望ましい。 The pH of the medium is preferably about 6-8.
大腸菌形質転換体を培養する際の培地としては、例え
ばグルコース、カザミノ酸を含むM9培地［Miller,ジャ
ーナル・オブ・エクスペリメンツ・イン・モレキュラー
・ジェネティックス（Journal of Experiments in
MolecularGenetics）,431−433,Cold Spring Harbor
Laboratory,New York 1972）］が好ましい。さら
に、この培地に鉄イオン源を添加した培地を用いてもよ
い。鉄イオン源としては、溶液にしたときに鉄イオンと
なる物質あるいは鉄イオンの形で利用される物質をい
い、例えば鉄の塩が挙げられる。好ましくは２価もしく
は３価の鉄の無機塩（例、塩化第１鉄，塩化第２鉄，硫
酸第１鉄，硫酸第２鉄，リン酸第２鉄，硝酸第２鉄）な
どが好ましい。鉄イオン源は約10-6〜10-4M、より好ま
しくは約５×10-6〜５×10-5M添加される。培養は通常
約15〜43℃で約３〜72時間より好ましくは約12〜48時間
行い、必要により、通気や撹拌を加えることもできる。As a medium for culturing E. coli transformants, for example, M9 medium containing glucose and casamino acid [Miller, Journal of Experiments in Molecular Genetics (Journal of Experiments in
Molecular Genetics), 431-433, Cold Spring Harbor
Laboratory, New York 1972)]. Further, a medium obtained by adding an iron ion source to this medium may be used. The iron ion source refers to a substance that becomes an iron ion when it is made into a solution or a substance that is used in the form of an iron ion, such as an iron salt. Preferred are inorganic salts of divalent or trivalent iron (eg, ferrous chloride, ferric chloride, ferrous sulfate, ferric sulfate, ferric phosphate, ferric nitrate). The iron ion source is added at about 10 -6 to 10 -4 M, more preferably about 5 × 10 -6 to 5 × 10 -5 M. The cultivation is usually performed at about 15 to 43 ° C. for about 3 to 72 hours, more preferably for about 12 to 48 hours, and if necessary, aeration and stirring may be added.
遺伝子の発現には、培養途中でIPTGを添加するのが好
ましい。これにより、ｌacプロモーターの下流に連結さ
れているT7遺伝子１（RNAポリメラーゼ遺伝子）が発現
し、生成されるT7ファージRNAポリメラーゼ１が特異的
にT7プロモーターを作動させることによって行われる。
ｌacプロモーターの発現には従来技術においては0.1〜2
0mM好ましくは１〜2mMのIPTGが添加されるが、この濃度
のIPTGを添加して発現を誘導した際に蓄積される蛋白質
は、封入体等を形成して不活性体として蓄積されること
があることが判明した。そこで溶解状態で蓄積させる方
法について種々検討した結果、培養途中に約３〜500μ
Ｍ、さらに好ましくは約６〜200μＭ、最も好ましくは
６〜80μＭのIPTGを一括または分割して添加することに
よりはじめて目的が達せられることを見出した。なお、
大スケールでの培養たとえばタンク培養の場合には、IP
TGの添加量を約10〜500μＭ、好ましくは10〜200μＭ、
より好ましくは10〜100μＭ、更に好ましくは10〜80μ
Ｍとするのが好ましく、小スケールでの培養たとえばフ
ラスコ培養の場合には、IPTGの添加量を約３〜100μ
Ｍ、好ましくは６〜80μＭとするものである。IPTGの初
添加時期は、培養開始後約１〜24時間、より好ましくは
約３〜12時間であり、対数増殖期が好ましい。以降必要
に応じて間歇的にまたは連続的に添加される。For gene expression, it is preferable to add IPTG during the culture. As a result, T7 gene 1 (RNA polymerase gene) linked downstream of the lac promoter is expressed, and the generated T7 phage RNA polymerase 1 specifically activates the T7 promoter.
In the prior art, the expression of the lac promoter is 0.1-2.
0 mM, preferably 1 to 2 mM IPTG is added, but the protein accumulated when the expression is induced by adding this concentration of IPTG may form an inclusion body or the like and be accumulated as an inactive form. It turned out to be. Therefore, as a result of various studies on a method of accumulating in a dissolved state, about 3 to 500 μm
M, more preferably about 6 to 200 μM, most preferably 6 to 80 μM, IPTG was found to be achieved only by adding it in batches or in portions. In addition,
For large-scale cultivation, such as tank cultivation, IP
The amount of TG to be added is about 10 to 500 μM, preferably 10 to 200 μM,
More preferably 10-100 μM, more preferably 10-80 μM
M, and in the case of small-scale culture, for example, flask culture, the amount of IPTG to be added is about 3 to 100 μM.
M, preferably 6 to 80 μM. The initial addition time of IPTG is about 1 to 24 hours, more preferably about 3 to 12 hours after the start of culture, and the logarithmic growth phase is preferable. Thereafter, they are added intermittently or continuously as necessary.
IPTGを培地に添加して培養する際の温度としては、約
20〜42℃，より好ましくは約20〜30℃が挙げられる。The temperature for adding IPTG to the culture medium and culturing is as follows.
20 to 42 ° C, more preferably about 20 to 30 ° C.
イソプロピルチオガラクトピラノシドの代わりに、た
とえばプロピルチオガラクトピラノシド，メチルチオガ
ラクトピラノシド，ブチルチオガラクトピラノシド，シ
クロヘキシルチオガラクトピラノシドなども使用できる
ことがある。Instead of isopropylthiogalactopyranoside, for example, propylthiogalactopyranoside, methylthiogalactopyranoside, butylthiogalactopyranoside, cyclohexylthiogalactopyranoside and the like may be sometimes used.
上記培養物から本発明のhbFGFムテインを分離精製す
るには、例えば下記の方法により行うことができる。本
発明のhbFGFムテインを培養菌体あるいは細胞から抽出
するに際しては、培養後、公知の方法で菌体あるいは細
胞を集め、グラスビーズによる破砕、フレンチプレス、
超音波処理、リゾチームおよび（または）凍結融解処理
などが用いられる。とりわけ、グラスビーズで破砕する
方法が好ましい。The hbFGF mutein of the present invention can be separated and purified from the above culture by, for example, the following method. When extracting the hbFGF mutein of the present invention from cultured cells or cells, after culture, the cells or cells are collected by a known method, crushed with glass beads, French press,
Ultrasonic treatment, lysozyme and / or freeze-thaw treatment and the like are used. In particular, a method of crushing with glass beads is preferable.
上記上澄液から本発明のhbFGFムテインを精製する方
法について種々検討した結果、架橋ポリサッカライド硫
酸エステルを担体とするアフィニティクロマトグラフィ
ー，交換基としてスルホン酸基を有する合成ポリマーを
担体とするイオン交換クロマトグラフィー，ゲルろ過用
合成ポリマーを担体とするクロマトグラフィーをそれぞ
れ１回以上組合せることにより、高純度の標品を極めて
高収率で得ることができる。As a result of various studies on a method for purifying the hbFGF mutein of the present invention from the above supernatant, affinity chromatography using a crosslinked polysaccharide sulfate as a carrier, ion exchange chromatography using a synthetic polymer having a sulfonic acid group as an exchange group as a carrier. By combining chromatography using a synthetic polymer for chromatography and gel filtration at least once each, a highly pure sample can be obtained in an extremely high yield.
本発明で用いられる架橋ポリサッカライド硫酸エステ
ルとしては、架橋セルロース硫酸エステル，架橋アガロ
ース硫酸エステルまたは架橋デキストラン硫酸エステル
が挙げられる。The crosslinked polysaccharide sulfate used in the present invention includes crosslinked cellulose sulfate, crosslinked agarose sulfate or crosslinked dextran sulfate.
上記セルロースとしては、グルコースがβ−1,4−結
合をした多糖であり、分子量が約５万〜200万のものが
好ましい。その具体例としては、たとえばアビセル（旭
化成工業株式会社製結晶セルロース），セルロファイン
（チッソ株式会社製）などが挙げられる。The cellulose is preferably a polysaccharide having β-1,4-linked glucose and a molecular weight of about 50,000 to 2,000,000. Specific examples thereof include Avicel (crystalline cellulose manufactured by Asahi Kasei Corporation) and Cellulofine (manufactured by Chisso Corporation).
上記アガロースとしては、寒天の主成分をなす多糖で
あり、［Ｄ−ガラクトシル−（β１→４）−3,6−アン
ヒドロ−Ｌ−ガラクトシル−（α１→３）］の繰り返し
構造をもつ。分子量約１万〜500万のものが好ましい。
その具体例としては、たとえばセファロース2B,セファ
ロース4B,セファロース6B（ファルマシア社製（スウェ
ーデン））などが挙げられる。The agarose is a polysaccharide which is a main component of agar, and has a repeating structure of [D-galactosyl- (β1 → 4) -3,6-anhydro-L-galactosyl- (α1 → 3)]. Those having a molecular weight of about 10,000 to 5,000,000 are preferred.
Specific examples thereof include Sepharose 2B, Sepharose 4B, and Sepharose 6B (Pharmacia (Sweden)).
上記デキストランとしては、たとえばシュークロース
からロイコノストック・メセンテロイデス（leuconosto
c mesenteroides）などの微生物の作用によって生成す
るα（１→６）結合を主体とするＤ−グルコース重合体
であり、平均分子量は、約1000〜4000万のものが好まし
い。Examples of the dextran include sucrose and leuconostoc mesenteroides.
C-mesenteroides) are D-glucose polymers mainly composed of α (1 → 6) bonds generated by the action of microorganisms, and preferably have an average molecular weight of about 10 to 40 million.
本発明で用いられる架橋ポリサッカライド硫酸エステ
ルは、上記のデキストラン，アガロース，セルロースな
どのポリサッカライドを、自体公知の架橋剤、たとえば
エピクロルヒドリンや2,3−ジブロモプロパノールなど
の架橋剤を用いて自体公知の方法で架橋して得られる架
橋ポリサッカライドを硫酸エステル化して得られるもの
である。The crosslinked polysaccharide sulfate used in the present invention can be obtained by converting the above-mentioned polysaccharides such as dextran, agarose and cellulose with a known crosslinking agent such as epichlorohydrin or 2,3-dibromopropanol. It is obtained by subjecting a crosslinked polysaccharide obtained by crosslinking by a method to sulfate esterification.
架橋ポリサッカライドは、市販されており、たとえば
セファデックスＧ−10,G−15,G−25,G−50,G−100（架
橋デキストラン），セファロースCL−2B,CL−4B,CL−6B
（架橋アガロース）などの商品名でファルマシア社（ス
エーデン）から購入できる。また、セルロファイン（架
橋セルロース）の商品名でチッソ株式会社から購入でき
る。これらの架橋ポリサッカライドに自体公知の硫酸エ
ステル化剤、たとえばクロルスルホン酸や無水硫酸エス
テルなどを作用させて目的の架橋ポリサッカライド硫酸
エステルを合成することができる。架橋セルロース硫酸
エステルとしては、たとえば硫酸化セルロファイン（架
橋セルロース硫酸エステル）の商品名で生化学工業株式
会社から発売されている。Crosslinked polysaccharides are commercially available, such as Sephadex G-10, G-15, G-25, G-50, G-100 (crosslinked dextran), Sepharose CL-2B, CL-4B, CL-6B
(Cross-linked agarose) and can be purchased from Pharmacia (Sweden). It can be purchased from Chisso Corporation under the trade name of Cellulofine (crosslinked cellulose). The desired crosslinked polysaccharide sulfate can be synthesized by reacting these crosslinked polysaccharides with a known sulfuric esterifying agent such as chlorosulfonic acid or sulfuric anhydride. The crosslinked cellulose sulfate is marketed, for example, by Seikagaku Corporation under the trade name of sulfated cellulofine (crosslinked cellulose sulfate).
架橋デキストラン硫酸エステルとしては、たとえば硫
酸化セファデックスが挙げられる。Examples of the cross-linked dextran sulfate include sulfated Sephadex.
架橋アガロース硫酸エステルとしては、たとえば硫酸
化セファロースが挙げられる。Examples of the cross-linked agarose sulfate include sulfated sepharose.
本発明において用いられる架橋ポリサッカライド硫酸
エステルは、塩の形となっていてもよい。該塩として
は、たとえばナトリウム，カリウム，アンモニウム，ト
リメチルアンモニウムなどが挙げられる。特にナトリウ
ム塩が好ましい。The crosslinked polysaccharide sulfate used in the present invention may be in the form of a salt. Examples of the salt include sodium, potassium, ammonium, trimethylammonium and the like. Particularly, a sodium salt is preferable.
本発明で用いられる架橋ポリサッカライド硫酸エステ
ルは、水不溶性であり、水和状態でゲル状となったもの
を用いるのが好ましい。The crosslinked polysaccharide sulfate used in the present invention is preferably a water-insoluble, hydrated gelled material.
本発明において、架橋ポリサッカライド硫酸エステル
を使用してhbFGFムテインを精製取得する方法としては
以下に記載するアフイニティに付す方法が挙げられる。In the present invention, as a method for purifying and obtaining hbFGF mutein using a crosslinked polysaccharide sulfate, the following affinity method can be mentioned.
hbFGFムテイン含有液としては、水性媒体にhbFGFムテ
インを含有せしめたものである。水性媒体としては、
水，水を主体としたものが挙げられ、hbFGFムテインの
失活を招かないようにするため緩衝液，たとえばリン酸
緩衝液，クエン酸緩衝液，トリス−塩酸緩衝液などでpH
を約３〜10に調整したものが好ましい。The hbFGF mutein-containing liquid is an aqueous medium containing hbFGF mutein. As an aqueous medium,
Water, mainly water, and a buffer such as a phosphate buffer, a citrate buffer, a Tris-HCl buffer to prevent inactivation of hbFGF mutein.
Is preferably adjusted to about 3 to 10.
次に、hbFGFムテイン含有液のpHを約5.0から9.0の範
囲に修正し、その電導度を約15m以下になるように必
要に応じて蒸留水で希釈する。得られたhbFGFムテイン
含有液と架橋ポリサッカライド硫酸エステルゲルとを接
触させる。このためには、バッチ法あるいはカラム法の
いずれを用いても良いが、カラム法の方が操作の簡便性
からより適当である。カラム法の場合は、予め架橋ポリ
サッカライド硫酸エステルゲルをカラムに充てんしたあ
と、たとえば0.4MのNaClを含む50mMクエン酸緩衝液（pH
7.0）などの適当な緩衝液を用いてカラムを十分に洗浄
し平衡化する。使用するゲルの量は負荷するhbFGFムテ
イン含有液の種類によって異なるが、hbFGFムテイン1mg
あたりおおよそ１〜50mlの範囲が望ましい。Next, the pH of the hbFGF mutein-containing solution is adjusted to a range of about 5.0 to 9.0, and the conductivity is diluted with distilled water as needed so that the conductivity is about 15 m or less. The resulting hbFGF mutein-containing solution is brought into contact with a crosslinked polysaccharide sulfate gel. For this purpose, either the batch method or the column method may be used, but the column method is more suitable because of the simplicity of the operation. In the case of the column method, a cross-linked polysaccharide sulfate ester gel is previously filled in a column, and then, for example, a 50 mM citrate buffer (pH: 0.4 M) containing 0.4 M NaCl is added.
Wash and equilibrate the column thoroughly with an appropriate buffer such as 7.0). The amount of gel used depends on the type of hbFGF mutein-containing solution to be loaded, but hbFGF mutein 1 mg
A range of approximately 1 to 50 ml per unit is desirable.
次いで上述のhbFGFムテイン含有液をカラムに負荷す
る。負荷速度はSV＝約0.1〜5.0の範囲内で選択できる。
負荷後、カラムを十分に洗浄し、常法に従って緩衝液の
イオン強度を高めてhbFGFを溶出，回収する。イオン強
度を高めるためには、電導度を約15m以上、より好ま
しくは30m以上になるように、NaClなどの塩類を添加
するか高濃度の緩衝液を用いる。溶出の方法としてはバ
ッチ法もしくは濃度勾配溶出法のいずれでも良い。濃度
勾配溶出法の場合は、たとえばNaClを約０から2.0Mまで
徐々に上昇させて溶出、回収する。このようにして、き
わめて高純度のhbFGFムテインを収率よく取得すること
ができる。Next, the above-mentioned hbFGF mutein-containing solution is loaded on the column. The load speed can be selected within a range of SV = about 0.1 to 5.0.
After loading, the column is sufficiently washed, and the ionic strength of the buffer is increased according to a conventional method to elute and collect hbFGF. In order to increase the ionic strength, salts such as NaCl are added or a high-concentration buffer is used so that the electric conductivity is about 15 m or more, more preferably 30 m or more. The elution method may be either a batch method or a concentration gradient elution method. In the case of the concentration gradient elution method, for example, NaCl is gradually eluted from about 0 to 2.0 M to elute and recover. In this way, hbFGF mutein of extremely high purity can be obtained with high yield.
本発明で用いられる、交換基としてスルホン酸基を有
する合成ポリマーとしては、たとえば、親水性ビニルポ
リマー，スチレンジビニルベンゼンポリマー，アクリル
アミドポリマー等に直接または間接にスルフォン酸基を
導入したポリマーを挙げることができる。なかでも、回
収率，操作性等の点で親水性ビニルポリマーにスルフォ
ン酸基を導入したSP（スルフォプロピル）−トヨパール
（東ソー（株））が好ましい。Examples of the synthetic polymer having a sulfonic acid group as an exchange group used in the present invention include a polymer obtained by directly or indirectly introducing a sulfonic acid group into a hydrophilic vinyl polymer, a styrene divinylbenzene polymer, an acrylamide polymer, or the like. it can. Among them, SP (sulfopropyl) -toyopearl (Tosoh Corporation) in which a sulfonic acid group is introduced into a hydrophilic vinyl polymer is preferable in terms of recovery rate, operability, and the like.
クロマトグラフィーを行なう際には、部分精製したhb
FGFムテイン含有液の塩濃度を例えばリン酸緩衝液の場
合には約50mM以下に調製し、pH約５〜７の範囲で上記樹
脂に吸着させる。吸着はバッチ式，カラム式いずれでも
よいが、操作性の点でカラム式が好ましい。樹脂からの
溶出は塩濃度を高めることにより行う。溶出の方法とし
てはバッチ式，濃度勾配を利用する方式いずれでもよ
い。バッチ式を用いる場合には、例えば上記リン酸緩衝
液に約500mM〜1MになるようにNaClを加えた緩衝液を用
いて行うことができる。またリン酸緩衝液の代りにクエ
ン酸緩衝液を用いることもできる。温度は約１〜25℃、
好ましくは約１〜10℃で行なうのが良く、なかでも４℃
前後が特に好ましい。When performing chromatography, partially purified hb
For example, in the case of a phosphate buffer solution, the salt concentration of the FGF mutein-containing solution is adjusted to about 50 mM or less, and the FGF mutein-containing solution is adsorbed to the above resin at a pH of about 5 to 7. Adsorption may be of a batch type or a column type, but a column type is preferred in terms of operability. Elution from the resin is performed by increasing the salt concentration. The elution method may be either a batch method or a method using a concentration gradient. When the batch method is used, for example, it can be carried out using a buffer obtained by adding NaCl to the above-mentioned phosphate buffer to about 500 mM to 1 M. Also, a citrate buffer can be used in place of the phosphate buffer. The temperature is about 1-25 ° C,
Preferably, it is carried out at about 1 to 10 ° C, especially at 4 ° C.
Before and after is particularly preferred.
本発明で用いられるゲルろ過用合成ポリマーとして
は、たとえば親水性ビニルポリマー，ポリアクリルアミ
ドポリマー等を挙げることが出来る。なかでも、ゲルの
耐久性，操作性の点で親水性ビニルポリマーであるトヨ
パールHW（東ソー（株））が好ましい。Examples of the synthetic polymer for gel filtration used in the present invention include a hydrophilic vinyl polymer and a polyacrylamide polymer. Above all, Toyopearl HW (Tosoh Corporation), which is a hydrophilic vinyl polymer, is preferable in terms of gel durability and operability.
部分精製したhbFGFムテイン含有液を例えば、トヨパ
ールHW−50Fのカラムで処理する場合には、展開溶媒と
しては、リン酸緩衝液，クエン酸緩衝液などを用いるこ
とができるが、50mMクエン酸緩衝液（pH7.0）を用いる
のが、有利である。温度は約１〜25℃、好ましくは約１
〜10℃であるが、特に４℃前後が好ましい。When a partially purified hbFGF mutein-containing solution is treated with, for example, a column of Toyopearl HW-50F, a phosphate buffer, a citrate buffer, or the like can be used as a developing solvent. It is advantageous to use (pH 7.0). The temperature is about 1 to 25 ° C, preferably about 1
To 10 ° C, preferably around 4 ° C.
上記の方法以外の方法を用いて精製工程の一つとして
もよい。該方法においては、たとえば、イオン交換用ク
ロマトグラフィー用担体として、セルロース，アガロー
ス，デキストラン等の天然物を担体とするもの、ガラス
ビーズなどの無機物を担体とするものも使用できる。A method other than the above method may be used as one of the purification steps. In this method, for example, as a carrier for ion exchange chromatography, a carrier using a natural substance such as cellulose, agarose, or dextran as a carrier, or a carrier using an inorganic substance such as glass beads as a carrier can be used.
また、ゲル濾過用担体として、セルロース，アガロー
ス，デキストラン等の天然物を主成分とするゲル，ガラ
スビーズなどの無機物をベースとするものなども、同様
に使用可能である。Further, as a carrier for gel filtration, a gel mainly composed of natural substances such as cellulose, agarose and dextran, and a substance based on an inorganic substance such as glass beads can also be used.
この様にして得られた標品は透析、凍結乾燥を行い、
乾燥粉末とすることもできる。さらに、担体として血清
アルブミンなどを添加して保存することは、標品の容器
への吸着を防ぐことができ好適である。The sample thus obtained is dialyzed and freeze-dried,
It can also be a dry powder. Further, it is preferable to add serum albumin or the like as a carrier and preserve it, since the adsorption of the sample to the container can be prevented.
また、精製過程、あるいは保存過程での微量の還元剤
の共存は、該標品の酸化を防ぐのに好適である。還元剤
としてはβ−メルカプトエタノール，ジチオスレイトー
ル，グルタチオンなどが挙げられる。The coexistence of a trace amount of a reducing agent in the purification step or the storage step is suitable for preventing oxidation of the sample. Examples of the reducing agent include β-mercaptoethanol, dithiothreitol, and glutathione.
このようにして、実質的にパイロジエンもエンドトキ
シンも含まない、実質的に純粋な本発明のhbFGFムテイ
ンが得られる。本発明の実質的に純粋な本発明のhbFGF
ムテインとしては、蛋白質含量として本発明のhbFGFム
テインを95％（w/w）以上であるもの、さらに好ましく
は本発明のhbFGFムテインを98％（w/w）以上であるもの
が挙げられる。In this way, a substantially pure hbFGF mutein of the invention is obtained which is substantially free of pyrodiene and endotoxin. The substantially pure hbFGF of the invention of the invention
Examples of the mutein include those having a protein content of 95% (w / w) or more of the hbFGF mutein of the present invention, and more preferably 98% (w / w) or more of the hbFGF mutein of the present invention.
上記の方法により得られる本発明のhbFGFムテインは
線維芽細胞の増殖を促進させる作用，血管内皮細胞の増
殖を促進させる作用，血管を新生させる作用を有し、安
定性が高く、毒性は低いので火傷，創傷，術後組織など
の治癒促進剤，あるいは血管新生作用による血栓症や動
脈硬化症などの治療薬として用いることができる。ま
た、細胞培養を促進させるための試薬として用いること
ができる。特に、構成システインのうち少なくとも一つ
がセリンに置換されたものは、安定性が高いので好まし
い。The hbFGF mutein of the present invention obtained by the above method has an action of promoting the growth of fibroblasts, an action of promoting the growth of vascular endothelial cells, and an action of generating blood vessels, and has high stability and low toxicity. It can be used as a healing promoter for burns, wounds, postoperative tissues, etc., or as a therapeutic agent for thrombosis or arteriosclerosis due to angiogenic action. Further, it can be used as a reagent for promoting cell culture. In particular, those in which at least one of the constituent cysteines is substituted with serine are preferable because of high stability.
本発明のhbFGFムテインを医薬として用いるには、そ
のまま粉末として、または他の薬理学的に許容されうる
担体，賦形剤，希釈剤とともに医薬組成物（例、注射
剤，錠剤，カプセル剤，液剤，軟膏）として、温血動物
（例、ヒト，マウス，ラット，ハムスター，ウサギ，
犬，ネコ）に対して非経口的または経口的に安全に投与
することができる。To use the hbFGF mutein of the present invention as a medicament, a pharmaceutical composition (eg, injection, tablet, capsule, liquid) may be used as it is as a powder or together with other pharmacologically acceptable carriers, excipients, and diluents. Ointments) as warm-blooded animals (eg, humans, mice, rats, hamsters, rabbits,
(Dogs, cats) can be safely administered parenterally or orally.
注射剤の製剤化はたとえば生理食塩水またはブドウ糖
やその他の補助薬を含む水溶液を用い、常法に従って行
なわれる。錠剤，カプセル剤等の医薬組成物も常法に従
って調製しうる。Formulation of an injection is carried out, for example, using physiological saline or an aqueous solution containing glucose and other adjuvants according to a conventional method. Pharmaceutical compositions such as tablets and capsules can also be prepared according to conventional methods.
本発明のhbFGFムテインを上記した医薬として用いる
場合には、たとえば上記した温血動物に、投与ルート，
症状などを考慮して、１日量約1ngないし100μg/kgの中
から適当量を選んで投与される。When the hbFGF mutein of the present invention is used as the above-mentioned medicine, for example, the administration route,
Considering the symptoms and the like, an appropriate amount is selected and administered from a daily dose of about 1 ng to 100 μg / kg.
また、本発明のhbFGFムテインを細胞培養を促進させ
るための試薬として用いる場合、培地１あたり約0.01
〜10μｇ、さらに好ましくは約0.1〜10μｇとなるよう
に培地に加えることが好ましい。When the hbFGF mutein of the present invention is used as a reagent for promoting cell culture, about 0.01
It is preferable to add to the medium so that the amount is about 10 to 10 μg, more preferably about 0.1 to 10 μg.
本発明明細書および図面において、塩基やアミノ酸な
どを略号で表示する場合、IUPAC−IUB Commison on
Biochemical Nomenclatureによる略号あるいは当該分
野における慣用略号に基づくものであり、その例を下記
する。また、アミノ酸に関し光学異性体がありうる場合
は、特に明示しなければＬ−体を示すものとする。In the specification and drawings of the present invention, when bases and amino acids are indicated by abbreviations, IUPAC-IUB Commison on
This is based on the abbreviation by Biochemical Nomenclature or the abbreviation commonly used in this field, examples of which are described below. In addition, when an amino acid can have an optical isomer, the L-isomer is indicated unless otherwise specified.
DNA :デオキシリボ核酸 cDNA:相補的デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン RNA :リボ核酸 dATP:デオキシアデノシン三リン酸 dTTP:デオキシチミジン三リン酸 dGTP:デオキシグアノシン三リン酸 dCTP:デオキシシチジン三リン酸 ATP :アデノシン三リン酸 Tdr :チミジン EDTA:エチレンジアミン四酢酸 SDS :ドデシル硫酸ナトリウム Gly :グリシン Ala :アラニン Val :バリン Leu :ロイシン Ile :イソロイシン Ser :セリン Thr :スレオニン Cys :システイン Met :メチオニン Glu :グルタミン酸 Asp :アスパラギン酸 Lys :リジン Arg :アルギニン His :ヒスチジン Phe :フェニールアラニン Tyr :チロシン Trp :トリプトファン Pro :プロリン Asn :アスパラギン Gln :グルタミン 第１図においては、hbFGFの構成アミノ酸の番号は、
Ｎ末端にMetが付加したアミノ酸配列において、該Metを
第１番目として数えているが、本明細書においては該Me
tの次のProを第１番目として数えるものとする。DNA: deoxyribonucleic acid cDNA: complementary deoxyribonucleic acid A: adenine T: thymine G: guanine C: cytosine RNA: ribonucleic acid dATP: deoxyadenosine triphosphate dTTP: deoxythymidine triphosphate dGTP: deoxyguanosine triphosphate dCTP: deoxy Cytidine triphosphate ATP: Adenosine triphosphate Tdr: Thymidine EDTA: Ethylenediaminetetraacetic acid SDS: Sodium dodecyl sulfate Gly: Glycine Ala: Alanine Val: Valine Leu: Leucine Ile: Isoleucine Ser: Serine Thr: Threonine Cys: Cysteine Met: Methionine Glu: glutamic acid Asp: aspartic acid Lys: lysine Arg: arginine His: histidine Phe: phenylalanine Tyr: tyrosine Trp: tryptophan Pro: proline Asn: asparagine Gln: glutamine In FIG. 1, the numbers of the constituent amino acids of hbFGF are:
In the amino acid sequence in which Met is added to the N-terminus, the Met is counted as the first position.
The Pro next to t is counted as the first Pro.
後述の実施例１で用いられたプラスミドpTB762を保持
する形質転換体エシェリヒア コリ（H.coli）MM294/pT
B762、実施例１で製造された形質転換体エシェリヒア
コリ（E.coli）MM294（DE3）/pTB960、実施例８で製造
された形質転換体エシェリヒア コリ（E.coli）MM294
（DE3）/pCM901およびプラスミドpTB1004を保持するエ
シェリヒア コリ（E.coli）DH1/pTB1004は、財団法人
発酵研究所（IFO）および通商産業省工業技術院微生物
工業技術研究所（FRI）に寄託されている。それらの受
託番号および受託日を次の表１に示す。なお、エシェリ
ヒア コリ（E.coli）MM294/pTB762のFRIへの寄託につ
いては、当初国内寄託がなされFERM Ｐ番号で示される
受託番号が付され、該寄託はブダペスト条約に基づく寄
託に切換えられて、FERM BP番号で示される受託番号が
付され、同研究所（FRI）に保管されている。A transformant Escherichia coli (H. coli) MM294 / pT carrying the plasmid pTB762 used in Example 1 described later.
B762, the transformant Escherichia produced in Example 1
E. coli MM294 (DE3) / pTB960, the transformant E. coli MM294 produced in Example 8
Escherichia coli (E. coli) DH1 / pTB1004 carrying (DE3) / pCM901 and plasmid pTB1004 have been deposited with the Fermentation Research Institute (IFO) and the Microbial Technology Research Institute (FRI) of the Ministry of International Trade and Industry of Japan. I have. Table 1 below shows their accession numbers and accession dates. The deposit of E. coli MM294 / pTB762 with FRI was initially made in Japan and a deposit number indicated by the FERMP number was assigned. The deposit was switched to a deposit based on the Budapest Treaty. It has a deposit number indicated by the FERM BP number and is kept at the Research Institute (FRI).
実施例 以下に実施例をもって本発明をさらに詳しく説明する
が、本発明は、これらによってなんら限定されるもので
はない。 EXAMPLES Hereinafter, the present invention will be described in more detail by way of examples, but the present invention is not limited thereto.
発明の実施における最良モード 実施例１ rhbFGFムテインCS23産生組換え体の調製 hbFGFに存在する４つのシステイン残基のうち第69位
および第87位のシステインをセリン残基に置換したrhbF
GFムテインCS23をコードする遺伝子が組込まれたプラス
ミドpTB762［妹尾等、ビオケミカル・アンド・ビオフィ
ジカル・リサーチ・コミュニケーション 151;701−708
（1988），ヨーロッパ特許出願公開第281,822号公報］
をEcoR IおよびPst Iで処理し、rhbFGFムテインCS23を
コードするDNA断片を切出した。次にプラスミドpTB1004
（ヨーロッパ特許出願公開第336,383号公報）をEcoR I
およびPst Iで完全消化したのち、得られた最も大きいD
NAにこの断片をT4DNAリガーゼで接続し、プラスミドpTB
921を構築した。次にプラスミドpTB921を、制限酵素Eco
R Iで切断し、ムングビーン（ヤエナリ）ヌクレアーゼ
を作用させてその部位を平滑末端とした後、制限酵素Bg
l IIで切断し、rhbFGFムテインCS23をコードする遺伝子
を含むDNA断片を調製した。一方、T7ファージのφ10プ
ロモーターを保持するベクターpET3C［F.W.Studier等、
ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー 189;
113−130（1986）］を、制限酵素Nde Iで切断し、ムン
グビーン・ヌクレアーゼで処理して平滑末端とした後、
制限酵素BamH Iを作用させた。得られたDNA断片にrhbFG
FムテインCS23を含むDNA断片をT4リガーゼを作用させて
連結し、発現プラスミドpTB960を得た（第２図）。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Example 1 Preparation of rhbFGF Mutein CS23 Producing Recombinant rhbF wherein the cysteines at positions 69 and 87 of the four cysteine residues present in hbFGF were replaced with serine residues
Plasmid pTB762 in which the gene encoding GF mutein CS23 has been integrated [Seno et al., Biochemical and Biophysical Research Communication 151 ; 701-708]
(1988), European Patent Application Publication No. 281,822]
Was treated with EcoR I and Pst I to cut out a DNA fragment encoding rhbFGF mutein CS23. Next, plasmid pTB1004
(European Patent Application Publication No. 336,383) to EcoR I
And the largest D obtained after complete digestion with Pst I
This fragment was ligated to NA with T4 DNA ligase and plasmid pTB
Built 921. Next, the plasmid pTB921 was replaced with the restriction enzyme Eco.
After digestion with RI, the site is blunt-ended by the action of Mungbean (Yaenari) nuclease, and the restriction enzyme Bg
After digestion with lII, a DNA fragment containing the gene encoding rhbFGF mutein CS23 was prepared. On the other hand, a vector pET3C carrying the φ10 promoter of T7 phage [FWStudier et al.
Journal of Molecular Biology189 ;
113-130 (1986)] was cleaved with the restriction enzyme NdeI and treated with Mungbean nuclease to make blunt ends.
The restriction enzyme BamHI was acted on. RhbFG is added to the obtained DNA fragment.
The DNA fragment containing F mutein CS23 was ligated by the action of T4 ligase to obtain an expression plasmid pTB960 (FIG. 2).
大腸菌MM294株にT7ファージのRNAポリメラーゼ遺伝子
を組込んだλファージDE3［F.W.Studierら，ジャーナル
・オブ・モレキュラー・バイオロジー，189;113−130
（1986）］を溶原化させ、大腸菌MM294（DE3）株を作製
した。発現プラスミドpTB960を用いてこの大腸菌を形質
転換させることにより、第１図に示すrhbFGFムテインCS
23をコードする遺伝子を保持する組換え体エシェリヒア
コリ（Escherichia coli）MM294（DE3）/pTB960（IFO
14979,FERM BP−2690）を得た。Lambda phage DE3 in which the T7 phage RNA polymerase gene has been incorporated into E. coli MM294 [FWStudier et al., Journal of Molecular Biology, 189 ; 113-130
(1986)], and E. coli MM294 (DE3) strain was prepared. By transforming this E. coli with the expression plasmid pTB960, the rhbFGF mutein CS shown in FIG.
Recombinant Escherichia coli MM294 (DE3) / pTB960 (IFO
14979, FERM BP-2690).
実施例２ LB培地（バクトトリプトン10g/，バクトイーストエ
キス5g/，食塩5g/）にアンピシリンナトリウム50mg
/を添加した培地30mlに、組換え大腸菌MM294（DE3）/
pTB960株（IFO 14979,FERM BP−2690）を１白金耳接
種し、37℃にて一夜振盪培養した。この培養液をM/−９
培地（Na2HPO4・12H2O 16.8g/,KH2PO4 3g/,NH4Cl
1g/，食塩0.5g/,MgSO4・7H2O 0.246g/）にグ
ルコース15g/，カザミノ酸15g/，塩酸チアミン1mg/
，アンピシリンナトリウム50mg/を添加した培地30m
lへ、1.5ml宛移植し、37℃にて振盪培養を行った。濁度
が100〜120クレット単位まで生育した時点でIPTGを各種
濃度になるように添加し、さらに４時間培養を続けた。
遠心分離により菌体を集め、−20℃にて保存した。同じ
試料を２本用意し、一方には7M塩酸グアニジンを添加
し、菌体をよくほぐしたのち１時間放置し、遠心分離で
上清を得た（全bFGFムテイン量）。もう一方には、50μ
g/mlリゾチーム溶液（10％ショ糖,10mM EDTA,100mM N
aC,1mM APMSF,10Mm Tris−HCl,pH7.6）を添加し、４℃
で１時間放置したのち、超音波処理（クボタインソネー
ター200M）で菌体を破砕したのち遠心分離を行い上清を
得た（可溶性hbFGFムテイン量）。両抽出液を希釈した
のちELISA法によりrhbFGFムテインCS23量を算出した。
その結果を第２表に示す。Example 2 50 mg of ampicillin sodium was added to an LB medium (Bactotryptone 10 g /, Bacto yeast extract 5 g /, NaCl 5 g /).
/ Recombinant E. coli MM294 (DE3) /
One loopful of pTB960 strain (IFO 14979, FERM BP-2690) was inoculated and cultured with shaking at 37 ° C overnight. This culture was added to M / -9.
Medium (Na 2 HPO 4・ 12H 2 O 16.8g /, KH 2 PO 4 3g /, NH 4 Cl
1 g /, salt 0.5g /, MgSO 4 · 7H 2 O 0.246g /) glucose 15 g /, casamino acids 15 g /, thiamine hydrochloride 1mg /
, Medium 30m containing 50mg / ampicillin sodium
Then, 1.5 ml was transplanted to each l, and cultured with shaking at 37 ° C. When the turbidity grew to 100-120 klet units, IPTG was added to various concentrations, and the culture was continued for another 4 hours.
The cells were collected by centrifugation and stored at -20 ° C. Two identical samples were prepared, and 7M guanidine hydrochloride was added to one of them, the cells were loosened well, allowed to stand for 1 hour, and centrifuged to obtain a supernatant (total bFGF mutein amount). On the other side, 50μ
g / ml lysozyme solution (10% sucrose, 10 mM EDTA, 100 mM N
aC, 1 mM APMSF, 10 mM Tris-HCl, pH 7.6)
For 1 hour, the cells were disrupted by sonication (Kubotain Sonator 200M), and then centrifuged to obtain a supernatant (soluble hbFGF mutein amount). After dilution of both extracts, the amount of rhbFGF mutein CS23 was calculated by ELISA.
Table 2 shows the results.
上記のように、小スケールでの培養たとえばフラスコ
培養の場合には、IPTGの添加量は少ない方の範囲で本発
明の効果を奏することが判明した。すなわち、ｌacプロ
モーターの誘導には1mM程度のIPTGが添加された。しか
しIPTGを100μＭ以上添加した場合は生産性が低くかつ
目的物の大部分が不溶性の状態で蓄積された。これに対
し、本発明方法においては、IPTGの添加量を３μＭ以上
100μＭまで、殊に６μＭ〜８μＭの範囲にすると、著
しい生産性の向上と同時に、可溶性蛋白として蓄積され
る比率も著しく向上すると云う全く予期しない結果が得
られた。 As described above, in the case of small-scale culture, for example, flask culture, it was found that the effects of the present invention can be obtained in a range where the amount of IPTG added is smaller. That is, about 1 mM of IPTG was added to induce the lac promoter. However, when IPTG was added at 100 μM or more, the productivity was low and most of the target product was accumulated in an insoluble state. On the other hand, in the method of the present invention, the amount of IPTG added was 3 μM or more.
At up to 100 μM, especially in the range of 6 μM to 8 μM, quite unexpected results were obtained, with a marked increase in the productivity and at the same time a significant increase in the proportion accumulated as soluble protein.
実施例３ ５ジャーファーメンターにＭ−９培地にグルコース
15g/，カザミノ酸15g/，塩酸チアミン5mg/を添加
した培地2.5（pH6.8）を仕込んで滅菌したのち、実施
例２と同様に調製した種培養液125mlを接種し、37℃，
通気2.5／分，撹拌1000rpmでpH6.8にコントロールし
つつ培養した。培養途中濁度120クレット単位になった
時点（培養３時間後）でIPTGを10μＭになる様に添加
し、さらに培養８時間目にグルコース10g/，カザミノ
酸10g/となるよう添加して培養を続け、全体で15時間
培養を続けたところ、440mg/のrhbFGFムテインCS23が
可溶性の状態で蓄積された。これに対し、400μＭのIPT
Gを同じ条件で添加した場合の生産量は17.5mg/であっ
た。Example 3 Glucose in M-9 medium in 5-jar fermenter
After adding and sterilizing a medium 2.5 (pH 6.8) supplemented with 15 g /, casamino acid 15 g /, and thiamine hydrochloride 5 mg /, 125 ml of a seed culture solution prepared in the same manner as in Example 2 was inoculated at 37 ° C.
The culture was performed while controlling the pH at 6.8 with aeration of 2.5 / min and stirring at 1000 rpm. At the time when the turbidity reaches 120 klet units during the culture (after 3 hours of culture), IPTG is added to 10 μM, and further 8 hours after the culture, glucose is added to 10 g / and casamino acid is added to 10 g /. When culturing was continued for a total of 15 hours, 440 mg / h of rhbFGF mutein CS23 was accumulated in a soluble state. On the other hand, 400μM IPT
The production amount when G was added under the same conditions was 17.5 mg /.
実施例４ 実施例３と同じ培地を仕込んだ５ジャーファーメン
ターに実施例２と同様に調製した種培養液を移植し、撹
拌1000rpm,通気2.5／分,30℃,pH6.8で培養を開始し
た。培養開始後７時間目に濁度が約700クレット単位に
なった時点でIPTG42μＭを添加し、pH6.8で8.5時間目に
グルコース20g/，カザミノ酸20g/を添加して36時間
培養した。培養液中には860mg/のrhbFGFムテインCS23
が可溶性の状態で蓄積された。Example 4 A seed culture solution prepared in the same manner as in Example 2 was transplanted to a 5-jar fermenter charged with the same medium as in Example 3, and the culture was started with stirring at 1000 rpm, aeration at 2.5 / min, 30 ° C. and pH 6.8. did. Seven hours after the start of the culture, when the turbidity reached about 700 Klet units, 42 μM of IPTG was added. At 8.5 hours at pH 6.8, glucose 20 g / and casamino acid 20 g / were added, and the cells were cultured for 36 hours. 860mg / rhbFGF mutein CS23 in culture
Accumulated in a soluble state.
実施例５ ５ジャーファーメンターにＭ−９培地にグルコース
15g/，カザミノ酸15g/，塩酸チアミン5mg/を添加
した培地2.5（pH6.8）を仕込んで滅菌したのち、第３
表に示す濃度の鉄イオンを除菌濾過して添加した。これ
に実施例２と同様に調製した種培養液125ml宛を接種
し、30℃，通気量2.5／分，撹拌1000rpmでpHを6.8に
コントロールしつつ培養した。生育が約300クレット単
位（約5.5〜６時間後）になった時点でIPTGを42μＭに
なるように添加すると同時に培養温度を25℃に下げ23.5
時間培養した。なお培養７〜7.5時間後にグルコースお
よびカザミノ酸をそれぞれ15g/の割合で添加し、pHは
培養中6.8に保持した。結果を第３表に示す。Example 5 Glucose in M-9 medium in 5-jar fermenter
A medium 2.5 (pH 6.8) supplemented with 15 g /, casamino acid 15 g /, and thiamine hydrochloride 5 mg / was charged and sterilized.
Iron ions at the concentrations shown in the table were sterilized and added. 125 ml of the seed culture prepared in the same manner as in Example 2 was inoculated thereto, and the cells were cultured at 30 ° C, aeration of 2.5 / min, and stirring at 1000 rpm while controlling the pH to 6.8. When the growth reached about 300 klet units (after about 5.5 to 6 hours), IPTG was added to 42 μM, and at the same time the culture temperature was lowered to 25 ° C. and 23.5
Cultured for hours. After 7 to 7.5 hours of culture, glucose and casamino acid were added at a rate of 15 g / each, and the pH was maintained at 6.8 during the culture. The results are shown in Table 3.
実施例６ LB培地にアンピシリンナトリウム50mg/を添加した
培地１に、組換え大腸菌MM294（DE3）/pTB960（IFO
14979,FERM BP−2690）のマスターセル1mlを接種し、3
0℃,8時間振盪培養した。その全量を50培養槽に仕込
んだ20のLB培地（アンピシリンナトリウム50mg/添
加）に移植し、通気量10／分，撹拌300rpm,内圧1.0kg
/cm2G,温度30℃で７時間培養した。この培養液18を採
取し、500培養槽に仕込んだ360の発酵培地（Ｍ−９
培地にグルコース15g/，カザミノ酸15g/，ビタミン
B1 5mg/,FeSO4・7H2O 5mg/添加）へ移植し、pH6.
8,通気量240／分，撹拌250rpm,内圧1.0kg/cm2G,温度3
0℃で培養を開始した。生育が約1000クレット単位にな
った時点で100μＭ相当量のIPTGを添加し、培養温度を2
5℃に下げると同時に18kgグルコースと5.4kgカザミノ酸
を50の溶液としたのち滅菌した液を毎時約２の割合
で添加し、36時間培養を続けたところ1.2g/のrhbFGF
ムテインCS23が可溶性の状態で蓄積された。このように
して得られた培養物をシャープレス遠心分離器にかけ、
湿菌体を集め、−80℃に凍結保存した。 Example 6 Recombinant E. coli MM294 (DE3) / pTB960 (IFO) was added to medium 1 in which 50 mg / ampicillin sodium was added to LB medium.
14979, FERM BP-2690), and inoculate 1 ml of the master cell.
Shaking culture was performed at 0 ° C for 8 hours. Transfer the entire amount to 20 LB medium (ampicillin sodium 50 mg / addition) charged in a 50 culture tank, aeration 10 / min, stirring 300 rpm, internal pressure 1.0 kg
The cells were cultured at 30 ° C./cm 2 G for 7 hours. This culture solution 18 was collected and charged in a fermentation medium (M-9) of 360 charged in a 500 culture tank.
Glucose 15g /, casamino acid 15g /, vitamin in medium
B 1 5 mg /, were transplanted to FeSO 4 · 7H 2 O 5mg / additives), pH 6.
8, Aeration rate 240 / min, stirring 250rpm, internal pressure 1.0kg / cm 2 G, temperature 3
Culture was started at 0 ° C. When the growth reached about 1000 klet units, 100 μM equivalent of IPTG was added and the culture temperature was increased to 2
At the same time, the temperature was lowered to 5 ° C, and 18 kg of glucose and 5.4 kg of casamino acid were made into a 50 solution. A sterilized solution was added at a rate of about 2 per hour, and the culture was continued for 36 hours.
Mutein CS23 accumulated in a soluble state. The culture thus obtained is placed in a Sharpless centrifuge,
The wet cells were collected and stored frozen at -80 ° C.
実施例７ 組換え型ヒト塩基性線維芽細胞成長因子ムテ
イン（rhbFGFムテインCS23）の精製 実施例６で得られた−80℃に凍結保存した菌体（大腸
菌MM294（DE3）/pTB960）1kgを25mMリン酸緩衝液（pH6.
0）＋0.1mM APMSF（ｐ−アミジノフェニルメタンスルフ
ォニルフルオロライド塩酸塩）＋2mM DTT（ジチオスレ
イトール）抽出用緩衝液４中に懸濁した。４のガラ
スビーズを用いて５容量のダイノミル（KD−５型，ウ
ィリーバッフォフェン社，スイス）で、氷冷下５サイク
ル破砕した。約５の抽出用緩衝液を用いてガラスビー
ズを洗浄し、洗液は抽出液と合せた。この合せた抽出液
約10を10,000rpm,60分間遠心分離（21型，ベックマン
社，米国）し、得られた上澄液を硫酸化セルロファイン
Ｃ（生化学工業）のカラム（25.2cmID×50cm）に注ぎ込
んだ。吸着後、カラムは25mMリン酸緩衝液（pH7.0）＋
0.5M塩化ナトリウム25で洗浄した。次いで25mMリン酸
緩衝液（pH7.0）＋1M塩化ナトリウム30を用いて溶出
を行った。溶出液は限外濾過装置（ペリコンカセットシ
ステム，ミリポア社，米国）を用いて280nmにおける吸
光度が３〜４になるまで濃縮を行った。この濃縮液25mM
リン酸緩衝液（pH6.0）約60に対して一晩透析した。
透析内液は4,200rpm,30分間遠心分離（ベックマン社，
米国）した後、上澄液をSP−トヨパール650M（東ソー）
のカラム（17.0cmID×33.0cm）に注ぎ込んだ。カラムは
25mMリン酸緩衝液（pH6.0）＋200mM塩化ナトリウム７
で洗浄し、25mMリン酸緩衝液（pH6.0）＋500mM塩化ナト
リウム10を用いて溶出を行った。溶出液を高速液体ク
ロマトグラフィー装置（ギルソン社，フランス）を用い
て、硫酸化セルロファイン（生化学工業）のカラム（1
5.0cmID×50.0cm）に注ぎ込んだ。次いで、50mMクエン
酸緩衝液（pH7.0）20と50mMクエン酸緩衝液（pH7.0）
＋2M塩化ナトリウム30との間で、直線濃度勾配をかけ
て溶出を行った。主要溶出画分を集め、伝導度が20m
以下になるように、10mMクエン酸緩衝液（pH6.0）で希
釈した。この液をSP−トヨパール650M（東ソー）のカラ
ム（14.0cmID×39.0cm）に注ぎ込んだ。カラムは25mMク
エン酸緩衝液（pH6.0）10で洗浄後、25mMクエン酸緩
衝液（pH6.0）＋0.5M塩化ナトリウム10で溶出を行っ
た。溶出液はトヨパールンHW−50F（東ソー）のカラム
（14.0cmID×90.0cm）に注ぎ込み、50mMクエン酸緩衝液
（pH7.0）を用いて展開した。主要溶出画分を集め、ミ
リパック−20（ミリポア社，米国）を用いて除菌濾過
し、rhbFGFムテインCS23精製原液とした。収量17.0g
（収率70％） 第４表にＮ末端アミノ酸配列分析の、第５表にＣ末端
アミノ酸分析の、第６表にアミノ酸組成分析の結果をそ
れぞれ示す。Example 7 Purification of Recombinant Human Basic Fibroblast Growth Factor Mutein (rhbFGF Mutein CS23) 1 kg of the cells (Escherichia coli MM294 (DE3) / pTB960) cryopreserved at −80 ° C. obtained in Example 6 was 25 mM. Phosphate buffer (pH 6.
0) +0.1 mM APMSF (p-amidinophenylmethanesulfonylfluoride hydrochloride) + 2 mM DTT (dithiothreitol) suspended in extraction buffer 4. Using the glass beads of No. 4 and 5 volumes of Dynomill (KD-5, Willy Baffen, Switzerland), the mixture was crushed for 5 cycles under ice cooling. The glass beads were washed with about 5 extraction buffers, and the washings were combined with the extract. About 10 of the combined extracts were centrifuged at 10,000 rpm for 60 minutes (Type 21, Beckman, USA), and the resulting supernatant was subjected to a sulfated Cellulofine C (Seikagaku Corporation) column (25.2 cm ID × 50 cm). ). After adsorption, the column is 25 mM phosphate buffer (pH 7.0) +
Washed with 0.5 M sodium chloride 25. Next, elution was performed using 25 mM phosphate buffer (pH 7.0) + 1 M sodium chloride 30. The eluate was concentrated using an ultrafiltration apparatus (Pellicon Cassette System, Millipore, USA) until the absorbance at 280 nm became 3 to 4. 25 mM of this concentrate
Dialysis was performed overnight against about 60 phosphate buffer (pH 6.0).
The dialysis solution is centrifuged at 4,200 rpm for 30 minutes (Beckman,
(USA), and the supernatant was SP-Toyopearl 650M (Tosoh)
Column (17.0 cm ID x 33.0 cm). The column is
25 mM phosphate buffer (pH 6.0) + 200 mM sodium chloride 7
And elution was performed using 25 mM phosphate buffer (pH 6.0) +500 mM sodium chloride 10. The eluate was subjected to a sulfated Cellulofine (Seikagaku) column (1) using a high performance liquid chromatography system (Gilson, France).
5.0cmID × 50.0cm). Then, 50 mM citrate buffer (pH 7.0) 20 and 50 mM citrate buffer (pH 7.0)
Elution was carried out with a linear concentration gradient between + 2M sodium chloride 30. Collect major elution fraction, conductivity 20m
It was diluted with 10 mM citrate buffer (pH 6.0) as follows. This solution was poured into a column (14.0 cm ID × 39.0 cm) of SP-Toyopearl 650M (Tosoh). The column was washed with 25 mM citrate buffer (pH 6.0) 10 and eluted with 25 mM citrate buffer (pH 6.0) +0.5 M sodium chloride 10. The eluate was poured into a column (14.0 cm ID × 90.0 cm) of Toyopearlun HW-50F (Tosoh) and developed using a 50 mM citrate buffer (pH 7.0). The major eluted fractions were collected, sterilized and filtered using Millipak-20 (Millipore, USA) to obtain a purified stock solution of rhbFGF mutein CS23. Yield 17.0g
Table 4 shows the results of N-terminal amino acid sequence analysis, Table 5 shows the results of C-terminal amino acid analysis, and Table 6 shows the results of amino acid composition analysis.
さらに、第３図に還元条件（100mMDTT,50℃,15分）で
行なったSDS−PAGEの結果を示す。第３図において、
（１）はマーカーの、（２）はrhbFGFムテインCS23の結
果をそれぞれ示す。 FIG. 3 shows the results of SDS-PAGE performed under reducing conditions (100 mM DTT, 50 ° C., 15 minutes). In FIG.
(1) shows the result of the marker, and (2) shows the result of the rhbFGF mutein CS23.
第４図に、ヘパリン−5PW［東ソー（株）製］を担体
としたカラム（7.5mmID×7.5cm）の高速液体クロマトグ
ラフィー 溶離液A:50mMリン酸緩衝液（pH7） B:50mMリン酸緩衝液（pH7）＋2M塩化ナトリウム 流速:0.8ml/min 検出:280nm の結果を示す。FIG. 4 shows high performance liquid chromatography of a column (7.5 mm ID × 7.5 cm) using heparin-5PW (manufactured by Tosoh Corporation) as a carrier. Eluent A: 50 mM phosphate buffer (pH 7) B: 50 mM phosphate buffer Solution (pH 7) + 2M sodium chloride Flow rate: 0.8 ml / min Detection: 280 nm The results are shown.
第５図に、ODP−50［旭化成工業（株）製］を担体と
したカラム（4.6mmID×150cm）の高速液体クロマトグラ
フィー 溶離液A:0.1％トリフルオロ酢酸 B:80％アセトニトリル＋0.1％トリフルオロ酢
酸 流速:1.0ml/min 検出:280nm の結果を示す。FIG. 5 shows high performance liquid chromatography of a column (4.6 mm ID × 150 cm) using ODP-50 [manufactured by Asahi Kasei Corporation] as eluent A: 0.1% trifluoroacetic acid B: 80% acetonitrile + 0.1% The results of trifluoroacetic acid flow rate: 1.0 ml / min detection: 280 nm are shown.
第６図に、G2000SW［東ソー（株）製］を担体とした
カラム（7.5mmID×7.5cm）の高速液体クロマトグラフィ
ー 展開液:0.1Mリン酸緩衝液（pH7）＋0.1M硫酸ナトリウ
ム 流速:0.5ml/min 検出:280nm の結果を示す。FIG. 6 shows a high-performance liquid chromatography column (7.5 mm ID × 7.5 cm) using G2000SW [manufactured by Tosoh Corporation] as a carrier. Developing solution: 0.1 M phosphate buffer (pH 7) +0.1 M sodium sulfate Flow rate: 0.5 ml / min detection: the result at 280 nm is shown.
生物活性については、ウシ胎児心臓内皮細胞の増殖促
進活性を指標とする方法で測定したところ、標品と同等
の活性を示した。The biological activity was measured by a method using the activity of promoting the growth of fetal bovine heart endothelial cells as an indicator, and showed the same activity as the standard.
実施例８ テトラサイクリン耐性マーカーを持つrhbFGF
ムテインCS23産生組換え体の調製 hbFGFに存在する４つのシステイン残基のうち第69位
および第87位のシステイン残基をセリン残基に置換した
rhbFGFムテインCS23をコードする遺伝子が組込まれたプ
ラスミドpTB762［妹尾等、ビオケミカル・アンド・ビオ
フィジカル・リサーチ・コミュニケーション（Biochemi
cal and Biophysical Research communication）151;70
1−708（1988）、ヨーロッパ特許出願公開第281,822号
公報］を、Ava IおよびPst Iで完全消化し、rhbFGFムテ
インCS23の大部分を含む約0.45キロ塩基対の断片を得
た。この断片と合成DNA （ GATCTGC ACGTCTAGACG） をT4DNAリガーゼで接続後、Ava IおよびPst Iで消化
し、Pst I切断部位をBgl II切断部位に改変したフラグ
メントＡを得た。次にhbFGFのＣ末端の欠失したrhbFGF
ムテインC128をコードする遺伝子が組込まれたプラスミ
ドpTB955［妹尾等、ヨーロピアン・シャーナル・オブ・
バイオケミストリー 188;239−245（1990）］を、Sal
I、BamH Iで完全消化し、約4.1キロ塩基対のフラグメン
トＢを得た。また、pTB955を、Ava I,Sal Iで完全消化
し、約390塩基対のフラグメントＣを得た。３つのフラ
グメントA,B,Cを、T4DNAリガーゼで接続し、アンピシリ
ン耐性をマーカーに持つ、発現プラスミドpHP901を得
た。（第７図） pHP901を、EcoR I,Bgl IIで完全消化し、rhbFGFムテ
インCS23をコードする遺伝子とT7プロモーターとT7ター
ミネーターを含む約1.1キロ塩基対のフラグメントを得
た。EcoR I,BamH Iで完全消化したpUC18に、このフラグ
メントを、T4DNAリガーゼで接続し、プラスミドpME901
を得た（第８図）。Example 8 rhbFGF with a tetracycline resistance marker
Preparation of Recombinant Producing Mutein CS23 Of the four cysteine residues present in hbFGF, the cysteine residues at positions 69 and 87 were replaced with serine residues.
Plasmid pTB762 in which the gene encoding rhbFGF mutein CS23 has been integrated [Seno et al., Biochemical and Biophysical Research Communication (Biochemi
cal and Biophysical Research communication) 151; 70
1-708 (1988), EP-A-281,822] was completely digested with Ava I and Pst I to obtain a fragment of about 0.45 kilobase pairs containing most of the rhbFGF mutein CS23. This fragment and a synthetic DNA (GATCTGC ACGTCTAGACG) were ligated with T4 DNA ligase and digested with Ava I and Pst I to obtain a fragment A in which the Pst I cleavage site was changed to a Bgl II cleavage site. Next, rhbFGF lacking the C-terminal of hbFGF
Plasmid pTB955 in which the gene encoding mutein C128 has been incorporated [Seno, et al., European Shanal of
Biochemistry 188; 239-245 (1990)]
Complete digestion with I and BamHI resulted in a fragment B of approximately 4.1 kilobase pairs. Further, pTB955 was completely digested with AvaI and SalI to obtain a fragment C of about 390 base pairs. The three fragments A, B, and C were ligated with T4 DNA ligase to obtain an expression plasmid pHP901 having ampicillin resistance as a marker. (FIG. 7) pHP901 was completely digested with EcoR I and Bgl II to obtain a fragment of about 1.1 kilobase pairs containing a gene encoding rhbFGF mutein CS23, a T7 promoter and a T7 terminator. This fragment was ligated to pUC18 completely digested with EcoR I and BamHI using T4 DNA ligase, and plasmid pME901
Was obtained (FIG. 8).
pME901を、EcoR V,Hind IIIで完全消化し、rhbFGFム
テインCS23をコードする遺伝子とT7プロモーターとT7タ
ーミネーターを含む約0.77キロ塩基対のフラグメントを
得、T4DNAポリメラーゼで、末端を平滑化した。このフ
ラグメントを、Sca Iで消化したpBR322に、T4DNAリガー
ゼで接続し、テトラサイクリン耐性をマーカーに持つ、
発現プラスミドpCM901を得た（第９図）。pME901 was completely digested with EcoR V and Hind III to obtain a fragment of about 0.77 kb containing the gene encoding rhbFGF mutein CS23, the T7 promoter and the T7 terminator, and the ends were blunt-ended with T4 DNA polymerase. This fragment is ligated to pBR322 digested with ScaI with T4 DNA ligase, and has tetracycline resistance as a marker.
The expression plasmid pCM901 was obtained (FIG. 9).
大腸菌μM294株に、T7ファージのRNAポリメラーゼ遺
伝子を組込んだλファージDE3［F.W.Studierら、ジヤー
ナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー 189;113〜1
30（1986）］を溶原化させ、大腸菌MM294（DE3）株を作
製した。発現プラスミドpCM901を用いてこの大腸菌を形
質転換させ、rhbFGFムテインCS23をコードする遺伝子を
保持する組換え体エシェリヒア コリ（Escherichia c
oli）MM294（DE3）/pCM901（IFO15104,FERM BP−316
8）を得た。Escherichia coli μM294 strain, λ phage DE3 in which the RNA polymerase gene of T7 phage was integrated [FWStudier et al., Journal of Molecular Biology 189; 113-1
30 (1986)] was lysogenized to prepare E. coli MM294 (DE3) strain. This Escherichia coli was transformed with the expression plasmid pCM901, and a recombinant Escherichia coli carrying a gene encoding rhbFGF mutein CS23 was used.
oli) MM294 (DE3) / pCM901 (IFO15104, FERM BP-316
8) Got it.
実施例９ LB培地にテトラサイクリン塩酸5mg/を添加した培地
１に、組替え大腸菌MM294（DE3）/pCM901（IFO15104,
FERM BP−3168）のマスターセル1mlを接続し、30℃８
時間振盪した。その全量を50培養膜に仕込んだ20の
LB培地（テトラサイクリン塩酸5mg/を添加）に移植
し、通気量10／分、撹拌300rpm、内圧1.0kg/cm2G、温
度30℃で生育が700クレット単位になるまで撹拌した。
その全量を500培養槽に仕込んだ360の発酵培地（グ
ルコース15/，カザミノ酸15/,Na2HPO4・12H2O 16.
8g/,KH2PO43g/,NH4Cl 1g/，食塩0.5g/,MgSO4
・7H2O,0.5g/，塩酸チアミン5mg/,FeSO4・7H2O 2.
5mg/，消泡剤0.2g/）へ移植し、pH6.9,通気量240
／分、撹拌250rpm、内圧1.0kg/cm2G,28℃で培養した。
生育が約450クレット単位になった時点で10mg/（42μ
Ｍ）のIPTGを添加した。また残糖が約１％になった時点
より、グルコース（60g/相当）をカゼイン水解物（15
g/相当）の混液を連続的に供給しつつ、40時間培養を
続けたところ、1.6g/のrhbFGFムテインCS23が可溶性
の状態で蓄積された。このようにして得られた培養物を
シヤープレス遠心分離器にかけて湿菌体を集め、−80℃
に凍結保存した。この菌体1kgを実施例７と同様に処理
し、rhbFGFムテインCS23精製原液（収量25.0g）を得
た。その品質は生物活性、理化学的分析結果とも実施例
７で得られた標品と同等であることが確認された。Example 9 Recombinant E. coli MM294 (DE3) / pCM901 (IFO15104,
Connect 1 ml of the master cell of FERM BP-3168),
Shake for hours. The total amount of the 20
The cells were transplanted into an LB medium (tetracycline hydrochloride 5 mg / added), and stirred at an aeration rate of 10 / min, stirring at 300 rpm, an internal pressure of 1.0 kg / cm 2 G and a temperature of 30 ° C. until the growth reached 700 klet units.
As fermentation medium 360 were charged the total amount to 500 culture tank (glucose 15 /, casamino acid 15 /, Na 2 HPO 4 · 12H 2 O 16.
8 g /, KH 2 PO 4 3 g /, NH 4 Cl 1 g /, salt 0.5 g /, MgSO 4
· 7H 2 O, 0.5g /, thiamine hydrochloride 5mg /, FeSO 4 · 7H 2 O 2.
Transplanted to 5mg /, defoamer 0.2g /), pH 6.9, aeration volume 240
Per minute, stirring at 250 rpm, and an internal pressure of 1.0 kg / cm 2 G at 28 ° C.
When the growth reaches about 450 klet units, 10mg / (42μ
M) of IPTG was added. From the point when the residual sugars became about 1%, glucose (60 g / equivalent) was converted to casein hydrolyzate (15
(g / equivalent), the culture was continued for 40 hours while continuously supplying a mixed solution of 1.6 g / rh, and 1.6 g / rhbFGF mutein CS23 was accumulated in a soluble state. The culture thus obtained was subjected to a shear press centrifugal separator to collect wet cells, and the cells were collected at -80 ° C.
And stored frozen. 1 kg of the cells was treated in the same manner as in Example 7 to obtain a purified stock solution of rhbFGF mutein CS23 (yield: 25.0 g). It was confirmed that the quality was the same as that of the sample obtained in Example 7 in both biological activity and physicochemical analysis results.
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188;239−245（1990）References included: Nature: 249 ; 123 (1974) National Cancer Institute Monograph, 48 ; 109 (1978) The EMBO Journal, 5 ; 2523-2528 (1986) FEBS Letters, 213 ; 189-194 (1987) The Journal of Biological Chemistry, 263 ; 16471-16478 (1988) The Journal of Biological Chemistry, 263 ; 16297-16302 (1988) Biochemical and Biophysical Research Communication, 151 ; 701-708 (1988) European Patent Application Publication No. 281,822 Journal of Molecular Biology 189 ;
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477-535 (1983) Gene 56 : 125-135 (1987) Proceedings of National Academy of Sciences, USA 69 : 2110 (1972) Gene 17 : 107 (1982) Journal of Experiments・ In Molecular Genetics, 431-433, Cold Spring Harb
or Laboratory, New York 1972 Cell 57 : 881-889 (1989) Gene 68 : 345-355 (1988) DNA, 5 ; 21-28 (1986) European Shanar of Biochemistry
188 ; 239-245 (1990)
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 五十嵐 貢一 京都府京都市左京区下鴨宮崎町66番地― ３ (56)参考文献 Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．189［１ ］（1986）ｐ．113−130 Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒ ｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．151［２］（1988) ｐ．701−708 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification code FI C12R 1:19) (72) Inventor Koichi Igarashi 66, Shimogamo Miyazaki-cho, Sakyo-ku, Kyoto-shi, Kyoto (3) Reference 56 J . Mol. Biol. 189 [1] (1986) p. 113-130 Biochem. Biophys. Res. Commun. 151 [2] (1988) p. 701-708 (58) Fields surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) BIOSIS (DIALOG) EPAT (QUESTEL) JICST file (JOIS) WPI (DIALOG)
Claims (2)
FGF）の少なくとも１個の構成アミノ酸が別のアミノ酸
で置換されているムテインをコードする塩基配列および
その上流にT7プロモーターを含有するベクターで形質転
換された形質転換体であって、ｌacプロモーターの下流
にT7RNAポリメラーゼ遺伝子を有する大腸菌である形質
転換体の対数増殖期に約６〜80μＭのイソプロピルチオ
ガラクトピラノシド（IPTG）を培地に添加して培養する
ことを特徴とする成熟型hbFGFの少なくとも１個の構成
アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているムテインの製
造法。1. A mature human basic fibroblast growth factor (hb
A transformant transformed by a vector containing a mutein in which at least one constituent amino acid of FGF) is substituted by another amino acid and a vector containing a T7 promoter upstream thereof, wherein the transformant is downstream of the lac promoter. At least one of mature hbFGF, characterized in that about 6-80 μM isopropylthiogalactopyranoside (IPTG) is added to a medium during the logarithmic growth phase of a transformant which is Escherichia coli having a T7 RNA polymerase gene and cultured. A method for producing mutein in which two constituent amino acids are substituted with another amino acid.
ライド硫酸エステル，交換基としてスルホン酸基を有す
る合成ポリマーおよび／またはゲルろ過用合成ポリマー
を担体とするクロマトグラフィーで精製する請求項１記
載の製造法。2. The process according to claim 1, wherein the obtained mutein-containing solution is purified by chromatography using a crosslinked polysaccharide sulfate, a synthetic polymer having a sulfonic acid group as an exchange group and / or a synthetic polymer for gel filtration as a carrier. Law.
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