JP3065099B2 - 電気泳動用媒質 - Google Patents

電気泳動用媒質

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JP3065099B2 JP3507285A JP50728591A JP3065099B2 JP 3065099 B2 JP3065099 B2 JP 3065099B2 JP 3507285 A JP3507285 A JP 3507285A JP 50728591 A JP50728591 A JP 50728591A JP 3065099 B2 JP3065099 B2 JP 3065099B2
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Description

【発明の詳細な説明】 発明の背景 本発明は、新規の電気泳動用媒質に関係する。この媒
質は、好ましくは、DNA等の生成物の、市販のゲルより
も大きい強度、分離及び回収可能性を示すポリマーゲル
を含む。
この十年間に、ペプチド、DNA及びRNAを操作すること
に向けられた分子生物学における相当な進歩があった。
これらの進歩は、生物薬剤の生産、遺伝子工学によるワ
クチン、免疫化学物質、微生物、植物及び新規の診断薬
に合わせた広範な研究及び開発を伴うバイオテクノロジ
ー産業の出現をあおった。電気泳動（蛋白質、ペプチ
ド、DNA及びRNA等の複雑な生物学的物質を大きさ及び／
又は電荷によって分離する技術）は、あらゆる生命科学
分野において広く用いられる強力な分離方法である。こ
の手順は、蛋白質、ペプチド、DNA及びRNA等の複雑な生
物学的物質の分離及び単離のために用いられ、従って、
出現しつつあるバイオテクノロジー産業が大きく依存す
る技術である。この産業上の必要性から電気泳動技術に
おける新たな増大した需要が生じ、改良された分離、取
扱適性及び回収率、及び新たに発見された応用に用い得
る範囲のマトリックス細孔サイズを与え得る電気泳動用
媒質の相当な要求がある。
殆どの分析用電気泳動法は、試料の薄いゾーンを電気
泳動用媒質に加えるゾーン電気泳動に基づいている。試
料の成分をそれらの電荷によって分離すべきときは、電
気泳動用媒質に一定の時間にわたって電圧を加え、それ
により、試料の荷電成分はそれらの化学特性に応じて様
々な距離を移動する。試料の成分をそれらの大きさによ
って分離すべきときは、電気泳動用媒質は変性剤を含
み、それにより、試料の成分はそれらの分子量によって
様々な距離を移動する。試料成分の移動は分画ゾーンを
生じ、次いで、それを固定し、染色しそして洗浄して緩
衝液を除去する等の標準的電気泳動操作を用いることに
よって試験し、研究することが出来る。典型的には、電
気泳動用媒質は、適当な材料（普通、ガラス又はプラス
チック）で支持された薄いゲルスラブである。
澱粉、セルロースアセテート及びアガロース等の様々
な疎水性コロイドが電気泳動用ゲルスラブを形成するた
めに用いられてきたが、ポリアクリルアミドが一般的に
好まれている。ポリアクリルアミドは、種々の量のアク
リルアミドとビスアクリルアミドからなる注型物質とし
て用いられる。N,N′−ビス−アクリリルシスタミン、
N,N′−ジヒドロキシエチレンビス−アクリルアミド、
及びN,N′−ジアリルタルタルジアミンも又用いられて
きた。これらの材料は、重合に際して、篩又は抗対流の
ための高分子繊維のネットワークを作るように慣用的に
調和される。ゲルの粘性は、アクリルアミドとビス−ア
クリルアミドの量を変えることによって調節する。頻繁
に用いられる触媒及び開始剤は、TEMED（テトラエチル
アミンジアミン）及び過硫酸アンモニウム又はリボフラ
ビン／光である。
ヌクレオチド配列の決定にポリアクリルアミドゲルを
利用するためのこの分野で公知の方法は、約0.3mmの厚
さのガラス板の間等での薄いゲルの製造を含む。幾つか
の応用においては、ゲルを支持フィルム上にて重合させ
得る。32P、35S又は蛍光染料等で標識したDNA試料を試
料スロットに置き、電気泳動する。電気泳動（１〜24時
間）後、ゲルをガラス板からはずしてオートラジオグラ
フィーを行なう。自動化システムにおいては、蛍光標識
したヌクレオチドを分離の間中監視する。オートラジオ
グラフィーは、10〜20時間を必要とし、その時間の後に
フィルムを調べてヌクレオチド配列を決定する。35Sヌ
クレオチドのオートラジオグラフィーのためのゲルの製
造は、尿素を除去するために10％酢酸への浸漬を必要と
し且つ非常に脆いのでゲルの扱いに注意を必要とする。
蛋白質をそれらの大きさに基づいて電気泳動法によっ
て分離するときは、一般に、ドデシル硫酸ナトリウム
（SDS）を単独で又は他の変性剤と共にポリアクリルア
ミドゲルに加えて蛋白質を展開させ且つ正味の負電荷を
与える。分子の大きさは既知の標準との比較によって移
動度から見積もることが出来る。分離を電荷によって行
なうときは、ポリアクリルアミドゲルを、一般に、変性
剤を含まない酸性、塩基性又は中性の緩衝系と組合せて
用いる。電極は、使用するpHにおける試料の予想正味電
荷に応じて位置を決める。
複合蛋白質、日本鎖又は一本鎖DNA、合成オリゴヌク
レオチド等の分離並びにDNA配列決定のためのポリアク
リルアミドゲルの広範囲の使用にもかかわらず、ポリア
クリルアミドには多くの不便が伴う。それらには神経毒
性があり、保存期限が短く、製造が煩わしく、そしてゲ
ルは脆い。神経毒性及び不安定性が、最近、適当なプレ
キャストポリアクリルアミドゲルの開発において扱われ
ただけである。ゲルの脆さは、放射性標識したヌクレオ
チドのオートラジオグラフィーにおける最適分離のため
に超薄ゲルが必要とされるDNA配列決定における主要な
難点と考えられる。これらの不便は又、蛋白質の分離等
の電気泳動の他の応用においても見出される。
ポリアクリルアミドゲルの欠点を認識して、多くの者
がゲルの改良を試みた。Ogawaの米国特許第4,657,656号
は、アクリルアミド化合物の重合を架橋することにより
形成したポリアクリルアミドゲル及び架橋剤を含み、更
に、ポリビニルアルコール又はポリアクリルアミド等の
10,000〜1,000,000の範囲の分子量を有する水溶性ポリ
マーを含む電気泳動用の改良された媒質を開示してい
る。固体ポリアクリルアミド等の水溶性ポリマーの組み
込みはポリアクリルアミドゲルの脆弱性を減じると言
う。適当であるとして開示された架橋剤は、N,N′−メ
チレンビスアクリルアミド、N,N′−プロピレンビスア
クリルアミド、ジアクリルアミドジメチルエーテル、1,
2−ジアクリルアミドエチレングリコール、エチレンウ
レアビスアクリルアミド、エチレンジアクリレート、N,
N′−ジアリルタルタルジアミド及びN,N′−ビスアクリ
リルシスタミンである。
Sugihara等の米国特許第4,695,354号は、従来の薄い
ポリアクリルアミドゲルは、核酸断片の分離に使用した
ときにゆがんだパターンを与えるので適当でないことを
開示している。Sugihara等は、ゲルの分離は、ゲルに１
％（w/v）未満のグリセロールを混合することによって
改良し得ることを開示している。
従来のポリアクリルアミドゲル膜の脆さ及び脆弱性
は、分離をよくするために膜を乾燥させることが好まし
い場合に問題となり得る。Ogawa等の米国特許第4,699,7
05に開示されているように、乾燥工程において、ガラス
板と膜の間の粘着力は極僅かであり、膜は容易に破壊さ
れる。これらの問題を緩和するために、Ogawa等は、支
持体としてグロー放電処理したポリマーシートを用いる
ことによって、膜とその支持体との間の粘着力を増強す
ることが出来ることを開示している。この特許は又、ゲ
ル媒質に、改質剤として、少なくとも１種のカルバミル
基含有化合物（尿素又はホルムアミド等）を混合するこ
とをも示唆している。ポリアクリルアミドゲル膜とその
支持体との間の粘着力を改良するための他の開示された
方法は、Ogawa等の米国特許第4,548,869、第4,548,87
0、第4,579,783号及び第4,600,641号、並びに、Nochums
on等の米国特許第4,415,428号に開示された特定の接着
剤の利用を含む。
Ogawa等の米国特許第4,582,868号は、ポリアクリルア
ミドの製造のための重合反応は酸素の存在によって阻害
され得ると記載している。それは酸素の存在下で製造可
能な新規な水性ゲル形態の電気泳動用媒質を開示してい
る。この新規な媒質は特に選択された繰り返し単位を有
するアクリルアミドコポリマーである。
Boschettiの米国特許第4,189,370号は、Ｎ−メチロー
ル−アクリルアミドと二官能性のアリル化合物又はアク
リル化合物とのラジカル重合（架橋を引き起こして三次
元構成のポリマーを生じる）によって製造されるゲルポ
リマーを開示している。この特許に開示された架橋剤の
例は、N,N′−メチレンビスアクリルアミド、ジアリル
タルタルアミド及びエチレンジアクリレートである。
従来のポリアクリルアミドゲルの改良を研究してきた
多くの努力にもかかわらず、依然として、脆弱性、神経
毒性、煩わしい製造及び短い保存期間等のアクリルアミ
ドゲルに伴う問題を克服する新しいゲルの要求がある。
現れつつあるバイオテクノロジー産業の需要に合わせた
分離したDNA及び蛋白質物質の一層大きい分離力及び回
収能力を有する新規なゲルの要求もある。
発明の要約 今度、改良された分離を与え且つ従来のポリアクリル
アミド及びアガロースゲルに伴う多くの不便を克服する
新規な構造のポリマーに基づく電気泳動用媒質を見出し
た。特に、この発明は、本質的に、エトキシ化トリメチ
ルプロパントリアクリレート、ジエチレングリコールジ
アクリレート、ジアセトンアクリルアミド、ペンタエリ
トリトールアクリレート、ポリアルコキシル化脂肪族ト
リアクリレート、1,3−ブチレングリコールジアクリレ
ート、テトラエチレングリコールジアクリレート、ビス
アクリルアミドメチルエーテル及びトリス−（２−ヒド
ロキシエチル）イソシアヌレートトリアクリレートから
なる群より選択する１種以上の架橋剤又はコモノマー剤
の存在下での、水性媒質の存在及び酸素の不在のもとで
の１種以上のアクリルアミド化合物の架橋重合により形
成した水性ゲルからなる電気泳動用媒質に関係する。
モノマー及び架橋剤の異なる組合せによって、生じる
ゲルは、従来のポリアクリルアミドゲルとは化学的及び
構造的に異なるポリマー構造を有し、試験は、それら
が、従来のゲルよりも大いに改良された分離、強度及び
熱特性の利点を提供することを示している。
上述の電気泳動用媒質に加えて、この発明は、そのよ
うな媒質を製造するための重合用混合物（即ち、電気泳
動用媒質を製造するために使用するモノマー、架橋剤及
び触媒、デタージェント並びに緩衝液等の成分の混合
物）に関係する。この発明は又、上述のモノマーと架橋
剤との架橋重合によって製造される新規なポリマーにも
関係する。この発明は又、上述のモノマーと架橋剤との
架橋重合によって形成されるビーズにも関係する。最後
に、この発明は、上述の電気泳動用媒質を用いる化学物
質混合物中の成分のクロマトグラフィー分離を達成する
ための電気泳動法にも関係する。
発明の詳細な説明 上述のように、この発明の新規なゲル及び電気泳動用
媒質は、従来のポリアクリルアミド及びアガロースゲル
の構造とは有意に異なるポリマー構造を有する。
この発明の材料を製造するために用い得るアクリルア
ミド化合物は、アクリルアミド及びN,N−ジメチルアク
リルアミド、Ｎ−メチロールアクリルアミド及びＮ−メ
チルアクリルアミド等の関連するアクリルアミド化合物
を含む。
この発明のポリマーゲルを製造するために、モノマー
と架橋剤とを水性媒質（水又は水と他のジメチルホルム
アミド等の有機溶媒との混合物）に溶解又は分散させて
架橋重合反応を行なう水溶液又は水性分散を製造する。
重合反応は酸素のない状態で行なうことが重要である。
使用するモノマーと架橋剤の相対的な量は、ゲルを用い
る応用によって変化する。しかしながら、一般に、架橋
剤は、モノマー及び架橋剤の総重量の約１〜30重量％、
好ましくは２〜10重量％の量で用い得る。好ましいゲル
濃度は、ゲル中のモノマー及び架橋剤の量が1.5〜15重
量％であるような濃度である。
特に好ましい架橋剤は、化合物ビスアクリルアミドメ
チルエーテル（BAME）（CH2＝CHC（Ｏ）NHCH2）2Oであ
り、架橋剤として単独で又は他の架橋剤と組合せて使用
する。BAMEは、酸若しくは熱又はその両者によるＮ−メ
チロールアクリルアミドの重合等の当業者に公知の方法
で製造することが出来る。例えば、Rostovskii,E.N.
等、Zh.Prikl.Khim.,Moscow,41（２）,346（1968）;J.A
ppl.Chem.,USSR,41（２）,327（1968）;Arbuzova,I.A.
等,Zh.Obshch.Khim.,31:3023（1961）;J.Gen.Chem.USS
R,31:2819（1961）;Mosevich,I.K.等、Zh.Obshch.Khi
m.,38（６）:1224（1968）;J.Gen.Chem.USSR,38（６）:
1180（1968）;Nachbur,H.とMaeder,A.,Ciga−Geigy A.
G.,Ger.2,204,527（1972）;C.A.78:17060Cを参照された
い。
この発明の新規なゲルを製造する架橋重合反応は、一
般に、水性媒質中で行ない、公知の開始剤又は重合触媒
によって開始し得る。適当なフリーラジカル供給触媒系
は、ベンゾイルペルオキシド、ｔ−ブチルヒドロペルオ
キシド、ラウロイルペルオキシド、クメンヒドロペルオ
キシド、テトラリンペルオキシド、アセチルペルオキシ
ド、カプロイルペルオキシド、ｔ−ブチルペルベンゾエ
ート、ｔ−ブチルジペルフタレート、メチルエチルケト
ンペルオキシド、過酸化水素−Fe2+−アスコルビン酸、
リボフラビン−光、並びにN,N,N′,N′−テトラメチル
エチレンジアミン（TEMED）、ジエチルメチルアミンジ
アミン（DEMED）、Ｂ−ジメチルアミノプロピオニトリ
ル若しくは類似の試薬を伴う種々の過硫酸塩及び過硫酸
アンモニウム−メタ重亜硫酸塩である。他のクラスのフ
リーラジカル生成触媒は、アゾジイソブチロニトリル、
アゾジイソブチリルアミド、アゾビス（ジメチルバレロ
ニトリル）、アゾビス（メチルブチロニトリル）、ジメ
チル、ジエチル又はジブチルアゾビスメチルバレレート
等のアゾ触媒である。これらの及び類似の試薬は、脂肪
族炭素原子に結合したＮ、Ｎ二重結合を含む（少なくと
も、その１つは第３炭素である）。触媒及び開始剤の量
及び型は一般に使用するモノマー及び架橋剤の性質と濃
度によって指示される。触媒の最適量は又、任意の付随
の不純物の存在によっても影響を受ける。しかしなが
ら、一般的に言って、触媒は、モノマーと架橋剤の総量
の約0.3〜５重量％にて使用し得る。好ましい開始剤及
び触媒の系はTEMED又はDEMED及び過硫酸塩である。
種々の緩衝液、変性剤又は他の改質剤（技術的に必要
な場合）を重合混合物に含ませることが出来る。この発
明において使用するために適した緩衝系の例は下記の通
りである。
試験は、好ましい緩衝液は使用する特定のポリマーマ
トリックス及び所望の応用の両者によって変わり得るこ
とを示した。例えば、“ゲルＩ及びII"として下記する
ゲルは、DNAの電気泳動に特に有用である。この２者の
うち、ゲルIIは、少量のBAMEを含み、非常に好ましい。
緩衝系トリス−ホウ酸−EDTAは、このゲルを利用して大
いに成功している。トリス−グリシン緩衝系を用いても
優れた結果が得られた。下記のゲル“ゲルIII及びIV"
は、蛋白質の電気泳動に特に有用であるが、この２つの
うちでは少量のBAMEを含むゲルIVが好ましいゲルであ
る。トリス−グリシン−SDS緩衝液はこれらの蛋白質用
ゲルと共に用いて優れた結果を得てきた。最後に、下記
の“ゲルＶ及びVI"は、特にDNAの配列決定に有用であ
り、この２つのうちではゲルVIが好ましいゲルである。
緩衝系トリス−ホウ酸−EDTA及びトリス−グリシンを用
いてこれらの配列決定用ゲルにて最良の結果が達成され
た。
試料を変性状態に維持するために尿素改質剤をゲルに
混合させることはしばしば好ましい。この改質剤は、モ
ノマー及び架橋剤を含む水性ゲルの容積に対して約40〜
60重量％の量で用いることが出来る。
この発明の電気泳動用媒質に混合させ得る他の特定の
変性剤の例は、N,N−ジメチルホルムアミド、ｎ−プロ
ピルアルコール、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド
及びグリシンを含む。
前記のように、この発明の範囲内のゲルは、蛋白質、
DNAの分離及びDNA配列決定等の種々の応用に利用し得
る。このゲルの最終用途は、モノマー及び架橋剤組成物
並びに全電気泳動用媒質に含まれる緩衝液、デタージェ
ント及び触媒等の添加剤の性質に非常に依存する。表Ｉ
に、この発明によってゲルを製造するために利用したモ
ノマー／コモノマー、架橋剤の組合せを列挙し、更に、
各型のゲルに適当であることが見出された電気泳動応用
の型を示す。
この発明による一つの利用に適したゲル媒質は、他の
利用に適さず、おそらく、その他の用途にも適さないで
あろう。この発明による特に好ましいゲル組成物を以下
に提供する。上述のように、ゲルＩ及びIIはDNA鎖の電
気泳動に特に有用であり、ゲルIII及びIVは蛋白質の電
気泳動に特に有用であり、そしてゲルＶ及びVIはDNA配
列決定に特に有用であることが見出された。
ゲルＩ 主成分： Ｎ−メチロールアクリルアミド（NMA）（48％w/v） 7.8 ml テトラエチレングリコールジアクリレート（TEGDA）
0.016 ml 10×トリス−ホウ酸−EDTA 5 ml TEMED 0.1 ml 水を加えて 48.8 mlにする 10％w/v過硫酸アンモニウム（APS） 0.2 ml ゲルII 主成分： Ｎ−メチロールアクリルアミド（NMA）（48％w/v） 5.26 ml ビスアクリルアミドメチルエーテル（BAME） 0.28 g テトラエチレングリコールジアクリレート（TEGDA）
0.016 ml 10×トリス−ホウ酸−EDTA 5 ml TEMED 0.1 ml 水を加えて 48.8 mlにする 10％w/v過硫酸アンモニウム（APS） 0.2 ml ゲルIII NMA 5.26 ml TEGDA 0.025 ml 0.75Mトリス−HCl pH 8.8 25 ml 10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） 0.5 ml TEMED 0.1 ml 水を加えて 48.5 mlにする 10％APS 0.5 ml ゲルIV NMA 5.26 ml BAME 0.28 g 0.75Mトリス−HCl pH 8.8 25 ml 10％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS） 0.5 ml TEMED 0.1 ml 水を加えて 48.5 mlにする 10％APS 0.5 ml ゲルＶ DAA 0.67 g アクリルアミド 2.7 g BGDA 0.021 ml THICTA 0.048 g TEMED 0.05 ml 10×TBE 5 ml 水を加えて 48.6 mlにする 10％APS 0.4 ml ゲルVI アクリルアミド 4 g NMA 1.0 ml BAME 0.15 g １×トリス−ホウ酸−EDTA 6 ml 尿素 42 g 10％APS 500 μｌ TEMED 25 μｌ 水を加えて 100 mlにする 上述の例は、勿論、説明のためであって、この発明の
範囲を制限する意図は有しない。これらの例に示したモ
ノマー及び架橋剤の量を変えて異なる電気泳動応用に有
用なゲルを作ることは当業者にはなし得るであろう。例
えば、モノマーと架橋剤の量を、アクリルアミド3.5〜9
g、NMA0.5〜2.0ml、BAME0.1〜0.3に変えることによって
ゲルVI（好ましい配列決定用ゲル）の変型物を作成し得
ることが見出された。更に、これらのゲル中の好ましい
緩衝液及び改質剤の量を、トリス−ホウ酸−EDTA5〜18m
l、尿素36〜48g、10％APS500〜800μｌ、TEMED50〜80μ
ｌの範囲で変えることが出来る。
この発明の水性ゲル媒質から作られる膜は、一般に、
約0.1〜3mm、好ましくは約0.2〜1.5mmの範囲の厚さを有
している。しかしながら、この発明のゲル膜は又、非常
に薄く作ることも出来（例えば、0.1mm未満の厚み）、
しかも優れた弾力と分離を示す。この発明の水性ゲル媒
質は、当業者に周知の方法によって電気泳動応用に使用
し得る。例として、下記は、ゲルIIとして上記した“DN
A"用ゲルをどのように使用し得るかの説明である。
ゲルIIは、直線状で10〜600塩基の範囲のDNAの二本鎖
又は一本鎖断片の分離に有用である。このゲルは、標準
的な垂直電気泳動装置のガラス板の間で重合させること
が出来る。その10％ゲルは、５〜150塩基対の範囲の大
きさの断片の分離に有用である。５％ゲルは、100〜600
塩基対の分離に有用である。合成オリゴヌクレオチド精
製のための変性は、通常の変性条件（尿素等）を用いて
達成し得る。
より詳細には、ゲルIIは、下記のようにして製造し得
る。この手順は、50mlのゲル（1.5mmのスペーサーを使
用する14×14cmのゲルに十分な量）の製造を記載してい
る。
10％ゲル（５〜150塩基対用） 1. 製造業者の指示に従って、ガラス板を洗浄し、組み
立てる。
2. 25mlのゲル溶液を清浄なビーカーに入れる。
3. 5mlの10×TBE濃縮緩衝液を加える。
4. 19.7mlの脱イオン水を加える。
5. 100μｌのTEMEDを加える。
6. 200μｌの新鮮な10％過硫酸アンモニウムを加え
る。
7. 溶液を穏やかに回転させ、直ちに、針を付けていな
い注射器又は25mlのピペットでそのゲル溶液をガラス板
の上部に注ぐ。
8. 試料用コームを挿入し、15〜30分間置いて重合を完
了させる。
５％ゲル（100〜600塩基対用） 1. ガラス板を、上記の10％ゲル製造の工程１に記した
ようにして準備する。
2. 12.5mlのゲル溶液を清浄なビーカーに入れる。
3. 5mlの10×TBE濃縮緩衝液を加える。
4. 32.2mlの脱イオン水を加える。
5. 100μｌのTEMEDを加える。
6. 200μｌの新鮮な10％過硫酸アンモニウムを加え
る。
7. 10％ゲル製造の工程７及び８に従って操作を行な
う。
電気泳動 1. 上部及び下部チャンバーに十分な１×TBE緩衝液を
用意する。
2. 電気泳動装置を製造業者の指示に従って組み立て
る。
3. 試料用コームを注意して取り出し、ウェルを１×TB
E緩衝液で洗浄する。
4. 約１μｇの試料（４〜10μｌ）を各ウェルに加える
（非常に小さいバンドに関心がある場合は、もっと多量
のDNAを載せる）。
5. ゲルを、200Vの定電圧で、約１〜1/2時間にわたっ
て又はオレンジＧ追跡用染料がガラス板の下に達するま
で泳動する。
6. ガラス板を取りはずし、ゲルをエチジウムブロマイ
ド（１〜５μg/ml）で染色する。
試料調製 ゲルIIは、特に、小さいDNA断片の分離において、標
準的ゲルより優れていることが見出された。従って、異
なる濃度のポリアクリルアミドゲル上での複数の泳動を
必要とするであろう分離を単一のゲルで達成し得る。試
験は、この発明の範囲内の他のゲルも又、電気泳動応用
に非常に適しており且つ同じ理由によって標準的ポリア
クリルアミド及びアガロースゲルより優れていることを
示している。ゲルIVは又、蛋白質、特に20〜205kdの範
囲の大きさの蛋白質の標準的ポリアクリルアミドゲル上
での分離に相当な改良を提供する。ゲルＶは、扱いが著
しく容易に改良され、４％ポリアクリルアミドゲル上で
読み得る塩基の数の10％の増加を示している。６％ポリ
アクリルアミドゲル（操作特性において一層類似してい
る）と比較して、塩基の読みにおける75％の増加が見ら
れた。
ゲルとして用いるためにここに記載した物質は又、電
気泳動応用に用いるための任意の寸法の多孔質、非多孔
質、又は大網状（macroreticular）ビーズとしても製造
し得る。ビーズの製造において、この分野で周知の幾つ
かの重合条件を用いることが出来る。好ましい方法は、
用いる物質に対する溶剤ではない液体中での懸濁重合で
ある。この方法は、懸濁媒質の組成及び重合中の攪拌速
度によって大きさを制御し得る回転だ円面のビースの形
態のポリマーを生成する。最も効果的な条件の決定は、
選択した物質、それらの量及び相対的比率により、それ
ぞれの場合で変化する。重合は又、沈殿剤、即ち、混合
物の溶剤として作用し且つ重合条件下で化学的に不活性
な液体の存在下で行なうことも出来る。この溶剤は、殆
ど溶媒和作用を発揮しないような量で存在しなければな
らない。重合相において、生成物の分離が起こる。使用
する的確な溶剤は、各混合物について、経験的に決定
し、最適化する。典型的に用いられる逆懸濁重合は、存
在する開始剤と共に非常に高速で攪拌されるヘキサン溶
液中の少量の水を含む。重合物質は、それらの親水特性
によって水滴中にとどまる。
上述の物質から製造したビーズは又、クロマトグラフ
ィー形式での、DNA、RNA、蛋白質及びペプチドの分離に
も有用であり得る。分離を、相互作用を介して又は大き
さに基づいて生じるように調節することが出来る。相互
作用クロマトグラフィーは、直接的に、これらのビーズ
物質又は改質剤又は重合前若しくは重合後に加えた置換
された化学基を用いて、イオン交換、疎水性、又は他の
様式から生じ得る。
これらの記載した物質は又、単独で又は他の物質と共
に又は任意の表面に結合して、任意の目的のための細菌
又は細胞生長のための栄養及び支持物を提供する目的の
ためのゲル又はビーズの製造にも使用し得る。例は、ゲ
ル又はビーズを重合し及び／又は単独で又は他の物質と
共にペトリ皿中に置くことであり、或は（共有結合又は
非共有結合で）ガラス、金属、プラスチック、テフロ
ン、任意の組成の紙、ポリビニルクロリド、シリカ又は
その他の表面を被覆することによる。応用は、診断目的
のための細菌塗沫標本又は細胞生長のための付着部位の
提供を含み得る。そのような物質の更なる例は、シリカ
又はガラスで含浸したポリビニルクロリド紙である。重
合工程に参加し得る機能を有するこれらの面の被覆は、
直接的重合及び物質の支持体への共有結合を可能にする
であろう。
これらの応用に加えて、この重合混合物に、蛋白質、
ペプチド、医薬、シリカ、又は電子伝達物質を含むこと
は可能である。上記の物質は、薬物送達、人工臓器若し
くはその部分及びプラスチック型の電気伝導体を含む種
々の応用に使用し得る。
下記は、好ましい架橋剤であるビスアクリルアミドメ
チルエーテルの製造のための例示的手順である。
BAMEの製造 A.1mlの濃硫酸を１リットルのＮ−メチロールアクリル
アミド（NMA）に加える。室温で、８〜16時間にわたっ
て攪拌する。
B.アリコートを取り出し、それを希釈してHPLC分析によ
ってBAME濃度を検査する。
C.溶出プロフィルにより、NMA中のBAMEの量が一度18〜2
3％であれば、NMA/BAME混合物のpHを、１〜2N NaOHで
6.5に調節して反応を停止させる。
D.この混合物を変化していないNMAで希釈してBAME濃度
を10.89％にする。この濃度をHPLC分析により確認す
る。
E.その結果の10.89％BAMEを有するNMAをこの液体形態に
て保存することが出来、及び／又はこの混合物を上記の
ゲルII等のNMA/BAMEゲルを作るのに直接使用することが
出来る。
BAME結晶化 A.1.5mlの濃硫酸を1.0リットルのNMAに加える。その結
果の混合物を２日間室温で又は重い白色結晶が現れるま
で攪拌する。
B.結晶をブフナー漏斗上で混合物から濾過し、濾液を攪
拌し続ける。
C.結晶を300〜1000mlの脱イオン水に懸濁し、懸濁液
を、10N NaOHの滴下によって中和してpH約７〜８にす
る。
D.中和した懸濁液を、攪拌しながら、結晶が溶解するま
で、60〜70℃に加熱する。一度溶解したら、その熱溶液
をブフナー漏斗上で濾過する。
E.全結晶を熱濾液の入った濾過用フラスコから回収す
る。次いで、濾液を攪拌しながら90〜100℃に加熱す
る。この物質をその元の体積の約60％にまで濃縮し、加
熱を止める。
F.濃縮液を再結晶のために室温に冷却する。
G.結晶をブフナー漏斗上で濾過し、冷脱イオン水で２回
洗浄する。
H.この結晶濾塊をブフナー漏斗上で乾燥させる。この結
晶をデシケーター中に置き、少なくとも24時間にわたっ
て真空下で乾燥させる。
I.一度結晶が乾燥したら、138〜139℃でBAME結晶の融点
を確認する。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 27/447 B01D 57/02 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims (20)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】本質的に、水性媒質の存在及び酸素の不在
    の下で、ジエチレングリコールジアクリレート、ジアセ
    トンアクリルアミド、ペンタエリトリトールアクリレー
    ト、1,3−ブチレングリコールジアクリレート、テトラ
    エチレングリコールジアクリレート及びトリス−（２−
    ヒドロキシエチル）イソシアヌレートトリアクリレート
    からなる群より選択する１種以上の異なる架橋剤又はコ
    モノマー剤の存在下で、１種以上のアクリルアミドモノ
    マーの重合によって形成される水性ゲルからなる電気泳
    動用媒質。
  2. 【請求項２】本質的に、水性媒質の存在及び酸素の不在
    の下で、ビスアクリルアミドメチルエーテルよりなる架
    橋剤又はコモノマー剤の存在下で、１種以上のアクリル
    アミドモノマーの重合によって形成される水性ゲルから
    なる電気泳動用媒質。
  3. 【請求項３】前記のアクリルアミドモノマーがＮ−メチ
    ロールアクリルアミドである、請求項１又は２に記載の
    電気泳動用媒質。
  4. 【請求項４】前記の架橋剤又はコモノマーがジエチレン
    グリコールジアクリレートを含む、請求項１に記載の電
    気泳動用媒質。
  5. 【請求項５】前記の架橋剤又はコモノマーがジアセトン
    アクリルアミドを含む、請求項１に記載の電気泳動用媒
    質。
  6. 【請求項６】前記の架橋剤又はコモノマーがペンタエリ
    トリトールアクリレートを含む、請求項１に記載の電気
    泳動用媒質。
  7. 【請求項７】前記の架橋剤又はコモノマーが1,3−ブチ
    レングリコールジアクリレートを含む、請求項１に記載
    の電気泳動用媒質。
  8. 【請求項８】前記の架橋剤又はコモノマーがテトラエチ
    レングリコールジアクリレートを含む、請求項１に記載
    の電気泳動用媒質。
  9. 【請求項９】前記の架橋剤又はコモノマーがトリス−
    （２−ヒドロキシエチル）イソシアヌレートトリアクリ
    レートを含む、請求項１に記載の電気泳動用媒質。
  10. 【請求項１０】前記のアクリルアミドモノマーがＮ−メ
    チロールアクリルアミドであり、前記の１種以上の架橋
    剤がテトラエチレングリコールジアクリレートを含む、
    請求項１に記載の電気泳動用媒質。
  11. 【請求項１１】前記のアクリルアミドモノマーがアクリ
    ルアミドとＮ−メチロールアクリルアミドの組合せであ
    る、請求項２に記載の電気泳動用媒質。
  12. 【請求項１２】１種以上のアクリルアミドモノマーと、
    ジエチレングリコールジアクリレート、ジアセトンアク
    リルアミド、ペンタエリトリトールアクリレート、1,3
    −ブチレングリコールジアクリレート、テトラエチレン
    グリコールジアクリレート及びトリス−（２−ヒドロキ
    シエチル）イソシアヌレートトリアクリレートからなる
    群より選択する１種以上の架橋剤、重合触媒、並びに水
    性媒質を含む請求項１に記載の電気泳動用媒質の製造の
    ための重合用混合物。
  13. 【請求項１３】１種以上のアクリルアミドモノマーと、
    ジエチレングリコールジアクリレート、ジアセトンアク
    リルアミド、ペンタエリトリトールアクリレート、1,3
    −ブチレングリコールジアクリレート、テトラエチレン
    グリコールジアクリレート及びトリス−（２−ヒドロキ
    シエチル）イソシアヌレートトリアクリレートからなる
    群より選択する１種以上の架橋剤のと架橋重合の生成物
    を含むポリマー。
  14. 【請求項１４】化学物質混合物中の成分のクロマトグラ
    フィー分離を行なう方法であって、前記の化学物質混合
    物の試料を請求項１に記載の電気泳動用媒質の一部に加
    え、前記の媒質に電圧を加えるか又は前記の媒質に重力
    をかけ、続いて、前記の成分の前記の媒質中での位置を
    測定することを含む、上記の方法。
  15. 【請求項１５】前記の化学物質混合物がDNA及び／又はR
    NAの混合物である、請求項14に記載の方法。
  16. 【請求項１６】前記の化学物質混合物が蛋白質の混合物
    である、請求項14に記載の方法。
  17. 【請求項１７】アクリルアミドモノマーＮ−メチロール
    アクリルアミド並びに架橋剤テトラエチレングリコール
    ジアクリレートを含む請求項10に記載の電気泳動用媒質
    を調製するための重合用混合物。
  18. 【請求項１８】アクリルアミドモノマーアクリルアミド
    及びＮ−メチロールアクリルアミド並びに架橋剤ビスア
    クリルアミドメチルエーテルを含む請求項11に記載の電
    気泳動用媒質を調製するための重合用混合物。
  19. 【請求項１９】アクリルアミドモノマーＮ−メチロール
    アクリルアミドと架橋剤ビスアクリルアミドメチルエー
    テル及びテトラエチレングリコールジアクリレートとの
    架橋重合の生成物を含むポリマー。
  20. 【請求項２０】アクリルアミドモノマーアクリルアミド
    及びＮ−メチロールアクリルアミドと架橋剤ビスアクリ
    ルアミドメチルエーテルとの架橋重合の生成物を含むポ
    リマー。
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