JP3054215B2 - サンプルの分離方法 - Google Patents
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、化学的分析システムに
関し、詳しくは高速液体クロマトグラフィーにおけるピ
ーク幅とピーク分離度を改善するための新規な方法に関
する。
関し、詳しくは高速液体クロマトグラフィーにおけるピ
ーク幅とピーク分離度を改善するための新規な方法に関
する。
【０００２】
【従来の技術及びその問題点】分析化学は、タンパク質
等の複雑な分子を同定及び定量するために分離可能な成
分に分解することにより、生体システムに対する我々の
理解を進歩させた。例えば、エドマン分解法は、ペプチ
ドの順序が確認できるようにペプチドを構成しているア
ミノ酸を順次生成する。クロマトグラフィーは、エドマ
ン分離法の構成生成物を分離することによって、この確
認に貢献することができる。
等の複雑な分子を同定及び定量するために分離可能な成
分に分解することにより、生体システムに対する我々の
理解を進歩させた。例えば、エドマン分解法は、ペプチ
ドの順序が確認できるようにペプチドを構成しているア
ミノ酸を順次生成する。クロマトグラフィーは、エドマ
ン分離法の構成生成物を分離することによって、この確
認に貢献することができる。
【０００３】高速クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にお
いては、固定相、例えば担体に吸収させた溶媒を充填し
たカラムに、サンプルを注入する。移動相、一般に液体
の溶媒を、固定相を通過させることにより、サンプルが
カラムから取り出される。サンプルがカラムを通過する
につれて、このサンプルの各化学種成分が固定相と移動
相に分配される。ある所定の条件の組合せにおいては、
各成分は特徴的な分布係数Ｋｄを有し、Ｋｄ＝Ｃｓ／Ｃ
ｉとして定義される。この式においてＣｓは固定相にお
ける化学種の濃度、Ｃｉは移動相における化学種の濃度
である。
いては、固定相、例えば担体に吸収させた溶媒を充填し
たカラムに、サンプルを注入する。移動相、一般に液体
の溶媒を、固定相を通過させることにより、サンプルが
カラムから取り出される。サンプルがカラムを通過する
につれて、このサンプルの各化学種成分が固定相と移動
相に分配される。ある所定の条件の組合せにおいては、
各成分は特徴的な分布係数Ｋｄを有し、Ｋｄ＝Ｃｓ／Ｃ
ｉとして定義される。この式においてＣｓは固定相にお
ける化学種の濃度、Ｃｉは移動相における化学種の濃度
である。
【０００４】分離は、カラムによる成分の選択的な保持
によって実現される。成分の保持時間はその保持比Ｋ′
と関係があり、Ｋ′は分布係数と固定相の体積との積
を、間隙移動相の体積（固定相内の隙間に存在する移動
相の体積《ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｍｏｂｉｌｅ
ｐｈａｓｅ》）で割ったものとして表示される。異なる
成分の分離には、これらの成分が異なるＫ′値を有する
ことが必要となる。異なるサンプル成分の保持比が余り
に小さい場合には、分離は不充分になる。大きな数値の
Ｋ′は、分離を改善するが、バンド幅を増大させ、分析
時間を長引かせる。
によって実現される。成分の保持時間はその保持比Ｋ′
と関係があり、Ｋ′は分布係数と固定相の体積との積
を、間隙移動相の体積（固定相内の隙間に存在する移動
相の体積《ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ ｍｏｂｉｌｅ
ｐｈａｓｅ》）で割ったものとして表示される。異なる
成分の分離には、これらの成分が異なるＫ′値を有する
ことが必要となる。異なるサンプル成分の保持比が余り
に小さい場合には、分離は不充分になる。大きな数値の
Ｋ′は、分離を改善するが、バンド幅を増大させ、分析
時間を長引かせる。
【０００５】理想的には、サンプル成分は、比較的分離
したバンドで分離カラムを通過する。そして、成分の分
布係数が大きくなる順番に分離カラムからバンドが現れ
る。適切に選択され配置された検出器が、成分が通過す
るにつれて順次これらのバンドを検出することができ
る。次に、記録計が、カラムから現れる成分の量を時間
に対してプロットすることにより、溶出液のピークを記
録する。これらの成分は、カラムによる保持時間で同定
することができる。ピークに由来する成分の量に相当す
る夫々の検出ピーク面積によって定量することきができ
る。ある場合には、現れるバンドは、明確な同定及び／
又は定量プロセスのために、別々の容器に収集すること
ができる。
したバンドで分離カラムを通過する。そして、成分の分
布係数が大きくなる順番に分離カラムからバンドが現れ
る。適切に選択され配置された検出器が、成分が通過す
るにつれて順次これらのバンドを検出することができ
る。次に、記録計が、カラムから現れる成分の量を時間
に対してプロットすることにより、溶出液のピークを記
録する。これらの成分は、カラムによる保持時間で同定
することができる。ピークに由来する成分の量に相当す
る夫々の検出ピーク面積によって定量することきができ
る。ある場合には、現れるバンドは、明確な同定及び／
又は定量プロセスのために、別々の容器に収集すること
ができる。
【０００６】濃度検出器、特に紫外線（ＵＶ）吸光検出
器が、分離カラムから溶出する分析対象物（ａｎａｌｙ
ｔｅ）を検出し定量するために、使用される。このよう
な検出器の感度は、個々の分析対象物が極めて少量しか
存在しないときには制限される要因となる。例えば、Ｕ
Ｖ吸光検出器は、連続操作によって生成することの多い
ピコモル量のフェニルチオヒダントインアミノ酸を検出
し同定するのは困難であろう。このような場合には、検
出器を通過する分析対象物の濃度が、検出の可能性と定
量の正確さを改善するために、できるだけ高いことが重
要である。ある所定の分析対象物と所定の線状流量につ
いては、クロマトグラフのカラムの細孔が小さい程、よ
り濃縮された分析対象物のピークが生成する。ピーク振
幅とピーク分離度を増大させることにより、検出感度を
も改善することができる。成分の量が一定のときには、
ピークを細くすることは必然的にピークの振幅を増大さ
せて隣接するピークからの分離を助長する。従って、溶
出液のバンド幅を最小限にすることは、クロマトグラフ
の有効感度を向上させることになる。
器が、分離カラムから溶出する分析対象物（ａｎａｌｙ
ｔｅ）を検出し定量するために、使用される。このよう
な検出器の感度は、個々の分析対象物が極めて少量しか
存在しないときには制限される要因となる。例えば、Ｕ
Ｖ吸光検出器は、連続操作によって生成することの多い
ピコモル量のフェニルチオヒダントインアミノ酸を検出
し同定するのは困難であろう。このような場合には、検
出器を通過する分析対象物の濃度が、検出の可能性と定
量の正確さを改善するために、できるだけ高いことが重
要である。ある所定の分析対象物と所定の線状流量につ
いては、クロマトグラフのカラムの細孔が小さい程、よ
り濃縮された分析対象物のピークが生成する。ピーク振
幅とピーク分離度を増大させることにより、検出感度を
も改善することができる。成分の量が一定のときには、
ピークを細くすることは必然的にピークの振幅を増大さ
せて隣接するピークからの分離を助長する。従って、溶
出液のバンド幅を最小限にすることは、クロマトグラフ
の有効感度を向上させることになる。
【０００７】溶出液バンドの幅は、当初のサンプルプラ
グの幅によって、また溶出液がカラムを通過しながらバ
ンドを拡げるという要因によって決定される。当初のサ
ンプルプラグの幅は、サンプル溶液の注入体積が小さい
程、減少する。しかし、溶液中の分析対象物の濃度を増
加させることく、このことを行うと、検出するための成
分の量が不充分になることがある。他方では、全ての成
分を確実に溶解させるのに充分な溶媒が必要であり、こ
のために得られるサンプルの濃度は節約を受ける。その
上、サンプルの総量に制限があるときには、サンプルの
主要な部分が注入可能になるように、サンプル全体を確
実に溶解させるために比較的多量の溶液の調製が必要に
なることが多い。
グの幅によって、また溶出液がカラムを通過しながらバ
ンドを拡げるという要因によって決定される。当初のサ
ンプルプラグの幅は、サンプル溶液の注入体積が小さい
程、減少する。しかし、溶液中の分析対象物の濃度を増
加させることく、このことを行うと、検出するための成
分の量が不充分になることがある。他方では、全ての成
分を確実に溶解させるのに充分な溶媒が必要であり、こ
のために得られるサンプルの濃度は節約を受ける。その
上、サンプルの総量に制限があるときには、サンプルの
主要な部分が注入可能になるように、サンプル全体を確
実に溶解させるために比較的多量の溶液の調製が必要に
なることが多い。
【０００８】クロマトグラフとして弱い溶媒中の分析対
象物は、選択的に固体相に分布する。最も早く固体相に
到達した分析対象物分子は“ホールドアップ”される一
方、上流の分析対象物分子は“キャッチアップ”され、
分析対象物はカラムのヘッドにおいて濃縮される。この
ようにして、カラム上で濃縮を行うと、当初のサンプル
プラグが細くなる結果になる。クロマトグラフとして弱
い移動相の導入は、分析対象物を、それらのＫ′値に応
じた速度で、カラムから溶出させる。分離中には必然的
にバンドの拡がりが起こるが、溶出バンドは、濃縮によ
って当初のサンプルプラグが細くなる程度に従って細く
なる。バンドの幅が細くなることは、分析対象物の濃度
が高くなることに対応し、より高い検出感度を提供す
る。このようにしてカラム上での濃縮は、特に分析対象
物の含有量が少ないときに該分析対象物の検出及び定量
を向上させる。クロマトグラフィー誌，１９７７年，第
１３６巻の６３〜７２頁のＰ．シャウベッカー等による
“逆相高速液体クロマトグラフィーにおける微量濃縮技
術”を参照して戴きたい。
象物は、選択的に固体相に分布する。最も早く固体相に
到達した分析対象物分子は“ホールドアップ”される一
方、上流の分析対象物分子は“キャッチアップ”され、
分析対象物はカラムのヘッドにおいて濃縮される。この
ようにして、カラム上で濃縮を行うと、当初のサンプル
プラグが細くなる結果になる。クロマトグラフとして弱
い移動相の導入は、分析対象物を、それらのＫ′値に応
じた速度で、カラムから溶出させる。分離中には必然的
にバンドの拡がりが起こるが、溶出バンドは、濃縮によ
って当初のサンプルプラグが細くなる程度に従って細く
なる。バンドの幅が細くなることは、分析対象物の濃度
が高くなることに対応し、より高い検出感度を提供す
る。このようにしてカラム上での濃縮は、特に分析対象
物の含有量が少ないときに該分析対象物の検出及び定量
を向上させる。クロマトグラフィー誌，１９７７年，第
１３６巻の６３〜７２頁のＰ．シャウベッカー等による
“逆相高速液体クロマトグラフィーにおける微量濃縮技
術”を参照して戴きたい。
【０００９】サンプル成分が大きな範囲のＫ′値を有す
るときには、カラム上での濃縮に関して２つの問題があ
る。その第１は、カラム上での濃縮法を適用するために
選択される溶媒は、ある成分についてのＫ′値を非常に
高める結果になり、このためバンドが過度に拡がるとい
うことである。この問題は、主として、こう配溶離を利
用することによって解決される。
るときには、カラム上での濃縮に関して２つの問題があ
る。その第１は、カラム上での濃縮法を適用するために
選択される溶媒は、ある成分についてのＫ′値を非常に
高める結果になり、このためバンドが過度に拡がるとい
うことである。この問題は、主として、こう配溶離を利
用することによって解決される。
【００１０】こう配溶離は、複雑なサンプルについて起
こるバンドの拡がりを減少させるために利用される。こ
う配溶離においては、移動相の化学成分はクロマトグラ
フ分析中に変化する。複雑なサンプルの分離に通常使用
される方法である逆相こう配溶離においては、当初の移
動相は固定相に対しては極性を有し、次第に非極性にな
る。移動相が非極性になる前に、非極性成分は固定相中
に選択的に分布し、極性成分はカラムを通って前進す
る。移動相が徐々に非極性に変わるにつれて、非極性成
分は、分離し、極性成分に追随してカラムを通り始め
る。この方法は、非極性成分がカラム上に保持される時
間を短縮し、このため拡散を減少させる。分析時間を短
縮する以外に、こう配溶離は、ピークの形状を改善して
有効な検出感度を増大させる。
こるバンドの拡がりを減少させるために利用される。こ
う配溶離においては、移動相の化学成分はクロマトグラ
フ分析中に変化する。複雑なサンプルの分離に通常使用
される方法である逆相こう配溶離においては、当初の移
動相は固定相に対しては極性を有し、次第に非極性にな
る。移動相が非極性になる前に、非極性成分は固定相中
に選択的に分布し、極性成分はカラムを通って前進す
る。移動相が徐々に非極性に変わるにつれて、非極性成
分は、分離し、極性成分に追随してカラムを通り始め
る。この方法は、非極性成分がカラム上に保持される時
間を短縮し、このため拡散を減少させる。分析時間を短
縮する以外に、こう配溶離は、ピークの形状を改善して
有効な検出感度を増大させる。
【００１１】カラム上での濃縮技術に関して起こる第２
の問題は、カラム上での濃縮をクロマトグラフによって
行うのに充分弱い溶媒は、全てのサンプルを溶解するの
に充分強力でないということである。このため、ある成
分については、注入されるサンプルが成分の溶解性によ
って制約され、カラム上での濃縮の検出向上という利点
が全く失われる。これに反して、もしサンプルを溶解す
るために、より強力な溶媒が選択されると、この溶媒
は、低いＫ′値を有する成分のカラム上での濃縮を行わ
せるには余りにも強力過ぎて、そのような成分の溶出液
バンドは、注入体積の大きさによって左右される（これ
らの成分のカラム上での濃縮の効果がなくなる）。
の問題は、カラム上での濃縮をクロマトグラフによって
行うのに充分弱い溶媒は、全てのサンプルを溶解するの
に充分強力でないということである。このため、ある成
分については、注入されるサンプルが成分の溶解性によ
って制約され、カラム上での濃縮の検出向上という利点
が全く失われる。これに反して、もしサンプルを溶解す
るために、より強力な溶媒が選択されると、この溶媒
は、低いＫ′値を有する成分のカラム上での濃縮を行わ
せるには余りにも強力過ぎて、そのような成分の溶出液
バンドは、注入体積の大きさによって左右される（これ
らの成分のカラム上での濃縮の効果がなくなる）。
【００１２】エドマン分解法によって生成するフェニル
チオヒダントインアミノ酸は、この種のサンプルを代表
するものである。サンプルの溶解のために、主として使
用される溶媒は、より極性の高い成分のカラム上での濃
縮を効果的に行うことができない。カラムの寸法を小さ
くすることによって検出可能性を増大させようとする
と、より小さいカラム直径によって提供されるどんな利
点も実質的に減殺するのに充分な程度に早く溶出した極
性成分についてバンドの拡がりが増大する。このこと
は、注入体積を減少させることによって解決されるが、
注入体積を減少させることは、他の問題を提起する。制
限されるのはサンプルの量であるから、サンプルのでき
るだけ大部分を注入することが望ましい。注入体積が減
少するにつれて、サンプルの総量も減少する。大抵の状
況下では、サンプル溶解のための実際的な比較的少ない
溶媒体積は、２０〜５０マイクロリットル（以下、μ
Ｌ）である。一般に行われている実施は、よくても検出
可能性、再現性及び溶解性の間の不満足な妥協であるこ
とを示している。
チオヒダントインアミノ酸は、この種のサンプルを代表
するものである。サンプルの溶解のために、主として使
用される溶媒は、より極性の高い成分のカラム上での濃
縮を効果的に行うことができない。カラムの寸法を小さ
くすることによって検出可能性を増大させようとする
と、より小さいカラム直径によって提供されるどんな利
点も実質的に減殺するのに充分な程度に早く溶出した極
性成分についてバンドの拡がりが増大する。このこと
は、注入体積を減少させることによって解決されるが、
注入体積を減少させることは、他の問題を提起する。制
限されるのはサンプルの量であるから、サンプルのでき
るだけ大部分を注入することが望ましい。注入体積が減
少するにつれて、サンプルの総量も減少する。大抵の状
況下では、サンプル溶解のための実際的な比較的少ない
溶媒体積は、２０〜５０マイクロリットル（以下、μ
Ｌ）である。一般に行われている実施は、よくても検出
可能性、再現性及び溶解性の間の不満足な妥協であるこ
とを示している。
【００１３】バンドの幅を最小限にするための前述の解
決策は、最適なものではなかった。必要なものは、極性
成分と非極性成分の両方を含有する複雑なサンプルにつ
いて溶出液のバンド幅を最小限にするようなクロマトグ
ラフ法である。このような方法は、エドマン分解法の代
表的な生成物を分離するのに効果的であることが好まし
く、また当初のサンプルプラグ幅とカラム上でのバンド
の拡がり効果の両方を最小限にすることが好ましい。
決策は、最適なものではなかった。必要なものは、極性
成分と非極性成分の両方を含有する複雑なサンプルにつ
いて溶出液のバンド幅を最小限にするようなクロマトグ
ラフ法である。このような方法は、エドマン分解法の代
表的な生成物を分離するのに効果的であることが好まし
く、また当初のサンプルプラグ幅とカラム上でのバンド
の拡がり効果の両方を最小限にすることが好ましい。
【００１４】
【発明の目的】本発明の目的は、分析効率、延いては分
析精度を向上させるために、バンド幅を最小限にする新
規な方法を提供することにある。
析精度を向上させるために、バンド幅を最小限にする新
規な方法を提供することにある。
【００１５】
【発明の概要】本発明によれば、クロマトグラフシステ
ムによる分析に供するサンプルに、クロマトグラフ分離
の前に、界面活性剤が混合される。界面活性剤は、カラ
ムに注入する前にサンプルに混合することができる。そ
れから、サンプルの成分は、この成分が溶出液のバンド
中に分離されるように、少なくとも１つの移動相をカラ
ムに通過させることにより、分離される。成分は、適当
な検出器によって検出され、定量される。
ムによる分析に供するサンプルに、クロマトグラフ分離
の前に、界面活性剤が混合される。界面活性剤は、カラ
ムに注入する前にサンプルに混合することができる。そ
れから、サンプルの成分は、この成分が溶出液のバンド
中に分離されるように、少なくとも１つの移動相をカラ
ムに通過させることにより、分離される。成分は、適当
な検出器によって検出され、定量される。
【００１６】本発明の主要な利点は、クロマトグラフと
して弱い溶媒を使用して広い範囲のＫ′値を有するサン
プルのカラム上での濃縮を可能にすることである。その
結果として、より濃縮された分析対象物のピーク、従っ
てより高感度の検出と定量が提供される。実験に基づく
研究は、溶出液のバンドにおけるバンド分離の同じ程度
の低下を伴わないで、感度の改善が実現できることを示
している。実際上、分離の準備において、カラム上で濃
縮するために、界面活性剤の添加が極性の範囲を一時的
に圧縮し、その間に極性の範囲は少なくとも部分的に回
復される。
して弱い溶媒を使用して広い範囲のＫ′値を有するサン
プルのカラム上での濃縮を可能にすることである。その
結果として、より濃縮された分析対象物のピーク、従っ
てより高感度の検出と定量が提供される。実験に基づく
研究は、溶出液のバンドにおけるバンド分離の同じ程度
の低下を伴わないで、感度の改善が実現できることを示
している。実際上、分離の準備において、カラム上で濃
縮するために、界面活性剤の添加が極性の範囲を一時的
に圧縮し、その間に極性の範囲は少なくとも部分的に回
復される。
【００１７】サンプルの大きさとカラムの細孔が前述の
ように処理される場合には、本発明は、より細いサンプ
ルプラグと溶出液のピークのより高い分離度を提供す
る。サンプルの大きさとサンプルプラグの最大幅が前述
のように処理される場合には、カラム上での濃縮は、よ
り小さい細孔を有するカラムが使用できるようにする。
このことは、溶出液のバンド中のより高い分析対象物濃
度に対応する。そして、この結果、ＵＶその他の濃度検
出器が使用される場合に、より高い検出感度が提供され
る。
ように処理される場合には、本発明は、より細いサンプ
ルプラグと溶出液のピークのより高い分離度を提供す
る。サンプルの大きさとサンプルプラグの最大幅が前述
のように処理される場合には、カラム上での濃縮は、よ
り小さい細孔を有するカラムが使用できるようにする。
このことは、溶出液のバンド中のより高い分析対象物濃
度に対応する。そして、この結果、ＵＶその他の濃度検
出器が使用される場合に、より高い検出感度が提供され
る。
【００１８】含まれる特定の界面活性剤及び分析対象物
に応じて、界面活性剤は分離中の分析対象物の低下した
極性を維持する。この場合には、非極性分析対象物のバ
ンドの拡がりを減少させることができる。その上、移動
相の極性の要求される範囲も減少され、分離プロセスの
時間が最小になる。その結果として、クロマトグラフシ
ステムの分析速度が向上し、充填容量を増大させる。
に応じて、界面活性剤は分離中の分析対象物の低下した
極性を維持する。この場合には、非極性分析対象物のバ
ンドの拡がりを減少させることができる。その上、移動
相の極性の要求される範囲も減少され、分離プロセスの
時間が最小になる。その結果として、クロマトグラフシ
ステムの分析速度が向上し、充填容量を増大させる。
【００１９】本発明は、広い範囲の極性を有する分析対
象物を含む濃縮されたサンプルプラグのカラム上での濃
縮を提供する。そして、このことは、分析対象物のピー
クのより高感度の検出と、より正確な定量を可能にす
る。新規な方法は、エドマン分解法を利用して、商業的
に利用可能な自動化タンパク質シーケンサによって行わ
れるタンパク質マイクロシーケンス分析に特に適合す
る。本発明によって提供されるこれらの及び他の特徴と
利点は、以下に説明する実施例により明らかである。
象物を含む濃縮されたサンプルプラグのカラム上での濃
縮を提供する。そして、このことは、分析対象物のピー
クのより高感度の検出と、より正確な定量を可能にす
る。新規な方法は、エドマン分解法を利用して、商業的
に利用可能な自動化タンパク質シーケンサによって行わ
れるタンパク質マイクロシーケンス分析に特に適合す
る。本発明によって提供されるこれらの及び他の特徴と
利点は、以下に説明する実施例により明らかである。
【００２０】
【実施例】図１に示すように、クロマトグラフシステム
１００は、タンパク質シーケンサ１０２等のサンプル調
製装置、サンプルマニュピレータ１０４、分析対象物を
含むサンプル１０５、溶媒とクリービング（ｃｌｅａｖ
ｉｎｇ）溶媒と界面活性剤を調製する源泉１０６、貯蔵
槽１０８、クロマトグラフカラム１１０、検出器１１２
及びプロセッサ１１４を含んでいる。本発明によれば、
源泉１０６に貯蔵された界面活性剤１０７がサンプルマ
ニュピレータ１０４から出てくるサンプル１０５と混合
されてサンプル・界面活性剤混合物１０９を生成し、こ
の混合物はサンプル・界面活性剤貯蔵槽１０８中に貯蔵
される。サンプル・界面活性剤混合物１０９は、次にサ
ンプル注入器１１６によって注入される。カラムポンプ
装置１１８は、貯蔵槽１２１中に貯蔵された移動相溶媒
１２０をポンプによってカラム１１０に供給する。移動
相溶媒の組成は、こう配プログラマ１２２によって実現
される。サンプル・界面活性剤貯蔵槽１０８及びカラム
１１０の温度は、夫々温度制御装置１２６及び１２８に
よって制御される。
１００は、タンパク質シーケンサ１０２等のサンプル調
製装置、サンプルマニュピレータ１０４、分析対象物を
含むサンプル１０５、溶媒とクリービング（ｃｌｅａｖ
ｉｎｇ）溶媒と界面活性剤を調製する源泉１０６、貯蔵
槽１０８、クロマトグラフカラム１１０、検出器１１２
及びプロセッサ１１４を含んでいる。本発明によれば、
源泉１０６に貯蔵された界面活性剤１０７がサンプルマ
ニュピレータ１０４から出てくるサンプル１０５と混合
されてサンプル・界面活性剤混合物１０９を生成し、こ
の混合物はサンプル・界面活性剤貯蔵槽１０８中に貯蔵
される。サンプル・界面活性剤混合物１０９は、次にサ
ンプル注入器１１６によって注入される。カラムポンプ
装置１１８は、貯蔵槽１２１中に貯蔵された移動相溶媒
１２０をポンプによってカラム１１０に供給する。移動
相溶媒の組成は、こう配プログラマ１２２によって実現
される。サンプル・界面活性剤貯蔵槽１０８及びカラム
１１０の温度は、夫々温度制御装置１２６及び１２８に
よって制御される。
【００２１】図３に示すように、本発明の方法３００に
よれば、ステップ３０１において、シーケンサ１０２を
使用してサンプルが調製される。ステップ３０２におい
て、このサンプルに界面活性剤が混合される。ステップ
３０３において、得られた混合物１０９がクロマトグラ
フカラム１１０に導入される。サンプル成分は、ステッ
プ３０４において溶離中に分離され、ステップ３０５に
おいて検出器１１２で検出される。ステップ３０６にお
いて、出力（ｏｕｔｐｕｔ）データがプロセッサ１１４
によって処理され、ステップ３０７において結果がクロ
マトグラフ１２４として記録される。
よれば、ステップ３０１において、シーケンサ１０２を
使用してサンプルが調製される。ステップ３０２におい
て、このサンプルに界面活性剤が混合される。ステップ
３０３において、得られた混合物１０９がクロマトグラ
フカラム１１０に導入される。サンプル成分は、ステッ
プ３０４において溶離中に分離され、ステップ３０５に
おいて検出器１１２で検出される。ステップ３０６にお
いて、出力（ｏｕｔｐｕｔ）データがプロセッサ１１４
によって処理され、ステップ３０７において結果がクロ
マトグラフ１２４として記録される。
【００２２】カラム１１０は、図２に示すように、オク
タデシルシラン変性シリカ球よりなる充填剤２０３を充
填した長いステンレス鋼管２０１よりなる。充填剤２０
３は、溶離のための固定相として役立つ。カラム１１０
は、混合物１０９が入口端２０５から導入されてサンプ
ルプラグ２０２が形成されるカラムヘッド２０４を有す
る。管２０１は、約２．１ｍｍの内径と１０〜３０ｃｍ
の長さを有する。移動相が導入されると、混合物１０９
は、分離して成分バンド２０６を生成し、これらのバン
ドは、出口端２０７を経て管２０１から出て行き、検出
器を通過して検出される。検出器１１２は、紫外線・可
視光線分光光度計であって、成分の吸光度及び／又は吸
収スペクトルを測定する。夫々の分析対象物の濃度は、
成分バンド２０６の吸光度から容易に算出される。
タデシルシラン変性シリカ球よりなる充填剤２０３を充
填した長いステンレス鋼管２０１よりなる。充填剤２０
３は、溶離のための固定相として役立つ。カラム１１０
は、混合物１０９が入口端２０５から導入されてサンプ
ルプラグ２０２が形成されるカラムヘッド２０４を有す
る。管２０１は、約２．１ｍｍの内径と１０〜３０ｃｍ
の長さを有する。移動相が導入されると、混合物１０９
は、分離して成分バンド２０６を生成し、これらのバン
ドは、出口端２０７を経て管２０１から出て行き、検出
器を通過して検出される。検出器１１２は、紫外線・可
視光線分光光度計であって、成分の吸光度及び／又は吸
収スペクトルを測定する。夫々の分析対象物の濃度は、
成分バンド２０６の吸光度から容易に算出される。
【００２３】サンプル１０５は、ペプチドの分析に有用
なエドマン分解法を実施するシーケンサ１０２によって
供給される。エドマン分解法は、広い範囲の極性を有す
る成分を含むピコモル単位の微量のサンプルを生成する
ことができる。シーケンサ１０２からの出力としてのサ
ンプルは、収集されて乾燥される。
なエドマン分解法を実施するシーケンサ１０２によって
供給される。エドマン分解法は、広い範囲の極性を有す
る成分を含むピコモル単位の微量のサンプルを生成する
ことができる。シーケンサ１０２からの出力としてのサ
ンプルは、収集されて乾燥される。
【００２４】界面活性剤１０７としては、ドデシル硫酸
ナトリウムが好ましい。濃縮されたドデシル硫酸ナトリ
ウムは、０．１％の水溶液として調製されてサンプルに
混合される。この界面活性剤は、界面活性剤源泉１０６
に貯蔵される。５０〜１００μＬの界面活性剤溶液が乾
燥サンプルと混合される。サンプル・界面活性剤混合物
１０９は、注入器１１６によって直ちにカラムに注入さ
れる。
ナトリウムが好ましい。濃縮されたドデシル硫酸ナトリ
ウムは、０．１％の水溶液として調製されてサンプルに
混合される。この界面活性剤は、界面活性剤源泉１０６
に貯蔵される。５０〜１００μＬの界面活性剤溶液が乾
燥サンプルと混合される。サンプル・界面活性剤混合物
１０９は、注入器１１６によって直ちにカラムに注入さ
れる。
【００２５】説明のためであって、限定するものではな
いが、サンプルに対する界面活性剤の添加は、非極性成
分のミセルを生成させることが考えられる。ミセルにお
いては、界面活性剤の粒子は、非極性の分析対象物分子
の周囲に集合しており、界面活性剤の極性部分が集合体
の表面にある。“界面活性剤の系統的な分析”（ニュー
ヨークのワイリーによる１９７２年第２版）の１８頁に
ローセン及びゴールドスミスによって記述されたミセル
生成を参照。ミセルにおける非極性分子は、極性溶媒に
溶解する。従って、充分に極性を有する溶媒を使用する
ことができ、このため極性成分と非極性成分の両方が固
定相２０３に当初から選択的に保持される。極性成分
は、溶離の前に、非極性成分と共にカラムヘッド２０４
に捕捉される。トラッピングは、サンプルの体積当たり
の成分を濃縮して、より細い溶出バンド２０６に導く。
いが、サンプルに対する界面活性剤の添加は、非極性成
分のミセルを生成させることが考えられる。ミセルにお
いては、界面活性剤の粒子は、非極性の分析対象物分子
の周囲に集合しており、界面活性剤の極性部分が集合体
の表面にある。“界面活性剤の系統的な分析”（ニュー
ヨークのワイリーによる１９７２年第２版）の１８頁に
ローセン及びゴールドスミスによって記述されたミセル
生成を参照。ミセルにおける非極性分子は、極性溶媒に
溶解する。従って、充分に極性を有する溶媒を使用する
ことができ、このため極性成分と非極性成分の両方が固
定相２０３に当初から選択的に保持される。極性成分
は、溶離の前に、非極性成分と共にカラムヘッド２０４
に捕捉される。トラッピングは、サンプルの体積当たり
の成分を濃縮して、より細い溶出バンド２０６に導く。
【００２６】やはり説明のためであるが、移動相が注入
溶媒を希釈するときにミセルが崩壊するか、あるいは変
形して、カラムを通ってカラムヘッドにおいて固体相に
結合している分子から引き離されて導かれる。ミセルが
崩壊すると、前のミセル分子は少なくとも部分的にその
正常なクロマトグラフ的性質を取り戻す。ミセルと会合
しているものを含む界面活性剤は、分析対象物よりも前
に溶離し、及び／又は検出されないで、問題になってい
るピークとの干渉を防止する。移動相が非極性になれば
なる程、極性分子の移動相の選択的な分配及び溶離は少
なくなる。
溶媒を希釈するときにミセルが崩壊するか、あるいは変
形して、カラムを通ってカラムヘッドにおいて固体相に
結合している分子から引き離されて導かれる。ミセルが
崩壊すると、前のミセル分子は少なくとも部分的にその
正常なクロマトグラフ的性質を取り戻す。ミセルと会合
しているものを含む界面活性剤は、分析対象物よりも前
に溶離し、及び／又は検出されないで、問題になってい
るピークとの干渉を防止する。移動相が非極性になれば
なる程、極性分子の移動相の選択的な分配及び溶離は少
なくなる。
【００２７】界面活性剤を伴う注入溶媒の希釈によるミ
セルの崩壊は、非極性分析対象物の極性溶媒中での解離
を効果的に行うには最低界面活性剤濃度が必要であると
いう発見と合致する。例えば、非極性分析対象物の水中
での溶解度は、水中での約０．１％か、それ以上のドデ
シル硫酸ナトリウムの濃度において実質的に増大する。
前述の説明によれば、混合物の温度を高くすると、ミセ
ルの溶解度を増大させることによって濃縮を改善できる
ことが示唆される。従って、貯蔵相１０８を加熱するた
めに、温度制御装置１２６が取付けられている。
セルの崩壊は、非極性分析対象物の極性溶媒中での解離
を効果的に行うには最低界面活性剤濃度が必要であると
いう発見と合致する。例えば、非極性分析対象物の水中
での溶解度は、水中での約０．１％か、それ以上のドデ
シル硫酸ナトリウムの濃度において実質的に増大する。
前述の説明によれば、混合物の温度を高くすると、ミセ
ルの溶解度を増大させることによって濃縮を改善できる
ことが示唆される。従って、貯蔵相１０８を加熱するた
めに、温度制御装置１２６が取付けられている。
【００２８】注入器１１６は、シーケンサ制御の下での
バルブループ注入器よりなる。この注入器は、貯蔵槽１
０８から混合物の少なくとも一部を取り出して、この混
合物をカラム１１０に注入する。サンプルが一旦注入さ
れると、注入器１１６は、溶離が始められるように、カ
ラム１１０にカラムポンプ装置１１８を結合する。
バルブループ注入器よりなる。この注入器は、貯蔵槽１
０８から混合物の少なくとも一部を取り出して、この混
合物をカラム１１０に注入する。サンプルが一旦注入さ
れると、注入器１１６は、溶離が始められるように、カ
ラム１１０にカラムポンプ装置１１８を結合する。
【００２９】カラムポンプ装置１１８は、少なくとも１
つの移動相１２０をカラムに押し込む。少なくとも１つ
の移動相溶媒の混合物は、こう配プログラマ１２２の仲
介によって変化させて移動相の極性を減少させることが
できる。こう配プログラマは、望ましい緩慢な又は段階
的な溶離を提供することができる。そして、極性成分と
含まれる非極性成分は、カラム１１０を通過するときに
分離されて検出器１１２に至る。成分をクロマトグラフ
１２４に示されるそれらの溶離時間によって同定すると
きには、界面活性剤の作用によって起こる保持比Ｋ′の
どのような変化も考慮しなければならない。
つの移動相１２０をカラムに押し込む。少なくとも１つ
の移動相溶媒の混合物は、こう配プログラマ１２２の仲
介によって変化させて移動相の極性を減少させることが
できる。こう配プログラマは、望ましい緩慢な又は段階
的な溶離を提供することができる。そして、極性成分と
含まれる非極性成分は、カラム１１０を通過するときに
分離されて検出器１１２に至る。成分をクロマトグラフ
１２４に示されるそれらの溶離時間によって同定すると
きには、界面活性剤の作用によって起こる保持比Ｋ′の
どのような変化も考慮しなければならない。
【００３０】検出器１１２における溶出液バンド２０６
の幅は、４つの要因、すなわち（１）サンプルプラグ２
０２の幅、（２）拡散オーバータイム、（３）成分が固
定相と移動相の間を連続的に移動するときの物質移動の
動力学の効果、及び（４）異なる分子は固定相中で異な
る流路をとり、かつカラム１１０を通過する時間が異な
るので、バンドが拡がるような多流路効果（ｍｕｌｔｉ
ｐａｔｈ ｅｆｆｅｃｔ）によって左右される。Ｒ．
Ｐ．Ｗ．スコットの小細孔液体クロマトグラフィーカラ
ム（ニューヨークのワイリー、１９８４年）の１１〜２
１頁参照。
の幅は、４つの要因、すなわち（１）サンプルプラグ２
０２の幅、（２）拡散オーバータイム、（３）成分が固
定相と移動相の間を連続的に移動するときの物質移動の
動力学の効果、及び（４）異なる分子は固定相中で異な
る流路をとり、かつカラム１１０を通過する時間が異な
るので、バンドが拡がるような多流路効果（ｍｕｌｔｉ
ｐａｔｈ ｅｆｆｅｃｔ）によって左右される。Ｒ．
Ｐ．Ｗ．スコットの小細孔液体クロマトグラフィーカラ
ム（ニューヨークのワイリー、１９８４年）の１１〜２
１頁参照。
【００３１】開示された解決策は、前述の４つの要因の
全てのために、バンドの拡がりを最小限にして新規なク
ロマトグラフの感度と分離度をもたらす。その上、バン
ド幅を最小限にすると、全体としてのカラムの効率が改
善される。改善された感度、改善されたピーク分離度、
及び改善されたカラム効率の組合せは、クロマトグラフ
システム１００の有用性と正確さを向上させる。
全てのために、バンドの拡がりを最小限にして新規なク
ロマトグラフの感度と分離度をもたらす。その上、バン
ド幅を最小限にすると、全体としてのカラムの効率が改
善される。改善された感度、改善されたピーク分離度、
及び改善されたカラム効率の組合せは、クロマトグラフ
システム１００の有用性と正確さを向上させる。
【００３２】第１の要因、サンプルプラグの幅は、バン
ド幅に対して重要な要因である。カラム上での濃縮のた
めに極性溶媒を使用するときに、サンプルに界面活性剤
を混合することは、カラムヘッド２０４において非極性
成分と共に極性成分の濃縮を可能にする。主要な利点
は、エドマン分解法の生成物等の極性成分と非極性成分
を含む比較的大きいサンプルを逆相こう配溶離の初期に
濃縮することができることである。初期の濃縮は、サン
プルプラグ２０２の幅を最小限にする結果になり、この
ためピークの検出を向上させ、クロマトグラフ分析の有
効性を高める。
ド幅に対して重要な要因である。カラム上での濃縮のた
めに極性溶媒を使用するときに、サンプルに界面活性剤
を混合することは、カラムヘッド２０４において非極性
成分と共に極性成分の濃縮を可能にする。主要な利点
は、エドマン分解法の生成物等の極性成分と非極性成分
を含む比較的大きいサンプルを逆相こう配溶離の初期に
濃縮することができることである。初期の濃縮は、サン
プルプラグ２０２の幅を最小限にする結果になり、この
ためピークの検出を向上させ、クロマトグラフ分析の有
効性を高める。
【００３３】本発明はサンプルがクロマトグラフカラム
１１０を通過するときに起こる拡散を最小限にする。サ
ンプルがカラム１１０を通過するときに、長さ方向の拡
散が溶出液のバンド２０６を拡げる。拡散は、成分がカ
ラム中に残留する時間の長さに比例する。本発明によれ
ば、比較的短いカラム１１０を使用できるので、分離に
かかる時間が短くてすみ、拡散が最低限にしか起こらな
い。
１１０を通過するときに起こる拡散を最小限にする。サ
ンプルがカラム１１０を通過するときに、長さ方向の拡
散が溶出液のバンド２０６を拡げる。拡散は、成分がカ
ラム中に残留する時間の長さに比例する。本発明によれ
ば、比較的短いカラム１１０を使用できるので、分離に
かかる時間が短くてすみ、拡散が最低限にしか起こらな
い。
【００３４】本発明はまた、物質移動効果を最小限にす
る。固定相と移動相との間の成分の物質移動に対する抵
抗も、成分がカラム１１０を通過するときに、溶出液の
バンドを拡げる。分配比は成分によって異なるが、任意
の時間におけるどれか１つの成分の分子が移動相と固定
相の間で分配され、そして互いに異なる速度で移動す
る。カラムの長さ全体にわたる平均的な効果にもかかわ
らず、分配によって領域の拡がりが引き起こされる。
る。固定相と移動相との間の成分の物質移動に対する抵
抗も、成分がカラム１１０を通過するときに、溶出液の
バンドを拡げる。分配比は成分によって異なるが、任意
の時間におけるどれか１つの成分の分子が移動相と固定
相の間で分配され、そして互いに異なる速度で移動す
る。カラムの長さ全体にわたる平均的な効果にもかかわ
らず、分配によって領域の拡がりが引き起こされる。
【００３５】物質移動バンドの拡がりは、カラム上での
平衡が明瞭に確認され、相間の物質移動が迅速に進行す
る場合に減少する。極性溶質又はイオン性溶質と溶媒と
の間の静電気的相互作用は、一般に成分の分配をより明
瞭に確認できるようにする。ミセルの崩壊が部分的であ
る程度に、非極性成分の静電気的相互作用が高まり、非
極性成分の物質移動分散が最小限になる。
平衡が明瞭に確認され、相間の物質移動が迅速に進行す
る場合に減少する。極性溶質又はイオン性溶質と溶媒と
の間の静電気的相互作用は、一般に成分の分配をより明
瞭に確認できるようにする。ミセルの崩壊が部分的であ
る程度に、非極性成分の静電気的相互作用が高まり、非
極性成分の物質移動分散が最小限になる。
【００３６】物質移動効果は、固定相の脱着速度を増大
させることによって更に減少させることができる。この
ことは、移動相の流速を減少させることによって実現さ
れる。しかし、流速の減少は、拡散を増大させてこの解
決策の有用性を制約する。この点で、方法３００は、プ
ラグが比較的狭くなる結果になるので、拡散は最小限に
なる。拡散が最小限になるので、流速は減少し、物質効
果を最小限にする。
させることによって更に減少させることができる。この
ことは、移動相の流速を減少させることによって実現さ
れる。しかし、流速の減少は、拡散を増大させてこの解
決策の有用性を制約する。この点で、方法３００は、プ
ラグが比較的狭くなる結果になるので、拡散は最小限に
なる。拡散が最小限になるので、流速は減少し、物質効
果を最小限にする。
【００３７】方法３００は、また異なる分子が移動する
異なる距離に関連する多流効果に起因するバンドの拡が
りを最小限にする。例えば、ある分子は比較的短い時間
で開放進路を移動してカラム中を移動する。他の分子は
障害物のある進路を移動してカラムを通過するのに比較
的長時間を要する。これらの変化は、カラム中の固定相
充填材料の不均一性に起因して起こる。本発明は、比較
的小さい細孔を有するカラムを使用できるので、多流路
効果を引き起こす流路の差異及びその結果として起こる
バンドの拡がりは最小限になる。
異なる距離に関連する多流効果に起因するバンドの拡が
りを最小限にする。例えば、ある分子は比較的短い時間
で開放進路を移動してカラム中を移動する。他の分子は
障害物のある進路を移動してカラムを通過するのに比較
的長時間を要する。これらの変化は、カラム中の固定相
充填材料の不均一性に起因して起こる。本発明は、比較
的小さい細孔を有するカラムを使用できるので、多流路
効果を引き起こす流路の差異及びその結果として起こる
バンドの拡がりは最小限になる。
【００３８】ある場合には、界面活性剤は、非極性分子
の極性に影響を及ぼし続けることができる。ある場合に
は、本発明はこう配溶離の必要性をなくすことができ
る。開示された方法によって注入された非極性成分のあ
るものは、これらの成分が単一の移動相溶離において溶
離する程度に極性成分の挙動によく似ている。
の極性に影響を及ぼし続けることができる。ある場合に
は、本発明はこう配溶離の必要性をなくすことができ
る。開示された方法によって注入された非極性成分のあ
るものは、これらの成分が単一の移動相溶離において溶
離する程度に極性成分の挙動によく似ている。
【００３９】好ましい実施態様においては、ドデシル硫
酸ナトリウムの０．１％水溶液が調製される。この水溶
液の調製に使用される水は、例えばＨＰ６６１Ａ水純化
装置（米国ヒューレット・パッカード株式会社製）によ
って純化され、脱イオン化されなければならない。この
水は、ゴーストピークの原因になるプラスチックとの接
触を避けてガラス又は石英の器具で２回蒸留される。別
の実施態様では、比較的低濃度、比較的高濃度又は希釈
されていない界面活性剤が使用される。
酸ナトリウムの０．１％水溶液が調製される。この水溶
液の調製に使用される水は、例えばＨＰ６６１Ａ水純化
装置（米国ヒューレット・パッカード株式会社製）によ
って純化され、脱イオン化されなければならない。この
水は、ゴーストピークの原因になるプラスチックとの接
触を避けてガラス又は石英の器具で２回蒸留される。別
の実施態様では、比較的低濃度、比較的高濃度又は希釈
されていない界面活性剤が使用される。
【００４０】本発明によるシステムの有効性の増大によ
って、比較的短いカラム１１０が使用でき、あるいはよ
り複雑なサンプルが分離できる。分析時間は、エドマン
分解法のある成分等を数時間内に分解するサンプルを直
ちに注入して迅速に処理することができるように短縮す
ることができる。
って、比較的短いカラム１１０が使用でき、あるいはよ
り複雑なサンプルが分離できる。分析時間は、エドマン
分解法のある成分等を数時間内に分解するサンプルを直
ちに注入して迅速に処理することができるように短縮す
ることができる。
【００４１】好ましい実施態様においては、サンプル・
界面活性剤貯蔵槽１０８において拡散によって混合が行
われるが、他の混合方法も本発明に適合する。界面活性
剤とサンプルの混合は、サンプルに界面活性剤を添加し
て混合することによって、又はサンプルと界面活性剤の
他の組合せ方法によって行われる。サンプルと界面活性
剤は、カラム１１０に注入する前に手で混合することが
できる。サンプルは、注入中に混合するようにカラムに
同時に注入することができる。サンプルは、界面活性剤
を満たしたヘッドに注入することができる。界面活性剤
は、サンプルプラグに注入することができる。別の１つ
の実施態様においては、界面活性剤はドデシル硫酸ナト
リウムに追加するか、ドデシル硫酸ナトリウムの代わり
に、そして他の１つの界面活性剤を伴うか、又は伴わな
いでデラウエア州のウイルミントン所在のアトラスケミ
カル・インダストリーズによって製造されたポリオキシ
エチレン化ソルビタンモノオレアートの配合物であるＴ
ＷＥＥＮ８０を含んでいてもよい。
界面活性剤貯蔵槽１０８において拡散によって混合が行
われるが、他の混合方法も本発明に適合する。界面活性
剤とサンプルの混合は、サンプルに界面活性剤を添加し
て混合することによって、又はサンプルと界面活性剤の
他の組合せ方法によって行われる。サンプルと界面活性
剤は、カラム１１０に注入する前に手で混合することが
できる。サンプルは、注入中に混合するようにカラムに
同時に注入することができる。サンプルは、界面活性剤
を満たしたヘッドに注入することができる。界面活性剤
は、サンプルプラグに注入することができる。別の１つ
の実施態様においては、界面活性剤はドデシル硫酸ナト
リウムに追加するか、ドデシル硫酸ナトリウムの代わり
に、そして他の１つの界面活性剤を伴うか、又は伴わな
いでデラウエア州のウイルミントン所在のアトラスケミ
カル・インダストリーズによって製造されたポリオキシ
エチレン化ソルビタンモノオレアートの配合物であるＴ
ＷＥＥＮ８０を含んでいてもよい。
【００４２】界面活性剤は、イオン性、非イオン性、両
性及び陽イオン性の界面活性剤を包含している。ＴＷＥ
ＥＮ８０に加えて非イオン界面活性剤は、同じくアトラ
スケミカル・インダストリーズによって製造されたポリ
オキシエチレン化ソルビタンモノオレアートと、グリコ
ール、グルコシド及びソルビトールの長鎖カルボン酸エ
ステルを含む他のエステル、エーテル及びグリコール
と、ポリオキシエチレングリコールのアルキルエーテル
及びアルキルフェニルエーテル等のグリコールのエーテ
ルとポリオキシエチレン化ポリオキシプロピレングリコ
ールよりなる配合物であるＴＷＥＥＮ２０を包含してい
る。陰イオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸マグネシウ
ム等のアルキル硫酸金属を包含している。陰イオン界面
活性剤も広い範囲の金属塩、例えば硫酸グリセリド又は
硫酸化長鎖カルボン酸を包含している。陽イオン性及び
両性の界面活性剤は、第４級アンモニウム塩と〔Ｎ，
Ｎ′，Ｎ″−アルキル′アルキル″アンモニオ〕アルカ
ンスルホネートを包含する。移動相溶媒は、水、メタノ
ール及びクエン酸ナトリウムを包含する。本発明は、非
水溶液溶離、例えばペンタン・塩化メチレンこう配溶離
にも適用される。他の非水溶媒ペアーは、塩化イソプロ
ピル・ペンタン、エーテル・ペンタン及びメタノール・
エーテルを包含する。
性及び陽イオン性の界面活性剤を包含している。ＴＷＥ
ＥＮ８０に加えて非イオン界面活性剤は、同じくアトラ
スケミカル・インダストリーズによって製造されたポリ
オキシエチレン化ソルビタンモノオレアートと、グリコ
ール、グルコシド及びソルビトールの長鎖カルボン酸エ
ステルを含む他のエステル、エーテル及びグリコール
と、ポリオキシエチレングリコールのアルキルエーテル
及びアルキルフェニルエーテル等のグリコールのエーテ
ルとポリオキシエチレン化ポリオキシプロピレングリコ
ールよりなる配合物であるＴＷＥＥＮ２０を包含してい
る。陰イオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸マグネシウ
ム等のアルキル硫酸金属を包含している。陰イオン界面
活性剤も広い範囲の金属塩、例えば硫酸グリセリド又は
硫酸化長鎖カルボン酸を包含している。陽イオン性及び
両性の界面活性剤は、第４級アンモニウム塩と〔Ｎ，
Ｎ′，Ｎ″−アルキル′アルキル″アンモニオ〕アルカ
ンスルホネートを包含する。移動相溶媒は、水、メタノ
ール及びクエン酸ナトリウムを包含する。本発明は、非
水溶液溶離、例えばペンタン・塩化メチレンこう配溶離
にも適用される。他の非水溶媒ペアーは、塩化イソプロ
ピル・ペンタン、エーテル・ペンタン及びメタノール・
エーテルを包含する。
【００４３】本発明は、タンパク質、タンパク質フラグ
メント、ペプチド鎖及びペプチドフラグメント等のペプ
チドを含む広い範囲のサンプル物質、土壌や農薬の分
析、及び内因性及び外因性の血液成分に適用できる。シ
ーケネータを含む他のシーケンサは、本発明に適用でき
る。
メント、ペプチド鎖及びペプチドフラグメント等のペプ
チドを含む広い範囲のサンプル物質、土壌や農薬の分
析、及び内因性及び外因性の血液成分に適用できる。シ
ーケネータを含む他のシーケンサは、本発明に適用でき
る。
【００４４】サンプル注入の代替手段も利用され、ロボ
ット制御によって導かれる注入器による自動的なサンプ
ルの注入が含まれる。他の検出器も本発明に適用され
る。もし、溶融シリカ管が使用されるならば、問題にな
る平衡を乱すことなしに定量的な濃度測定を行うことが
でき、このためサンプルがまだカラム上にある間に溶出
液のバンド２０６を検出するために利用することができ
る。前述の実施態様に対するこれら及び他の変形も変更
態様は、本発明によって用意されており、本発明の範囲
は、特許請求の範囲によってのみ限定されるものであ
る。
ット制御によって導かれる注入器による自動的なサンプ
ルの注入が含まれる。他の検出器も本発明に適用され
る。もし、溶融シリカ管が使用されるならば、問題にな
る平衡を乱すことなしに定量的な濃度測定を行うことが
でき、このためサンプルがまだカラム上にある間に溶出
液のバンド２０６を検出するために利用することができ
る。前述の実施態様に対するこれら及び他の変形も変更
態様は、本発明によって用意されており、本発明の範囲
は、特許請求の範囲によってのみ限定されるものであ
る。
【００４５】
【発明の効果】本発明によれば、クロマトグラフで分離
するサンプルにクロマトグラフのカラムに導入する前
に、界面活性剤を混合したため、該カラムの上部におい
て該サンプルを濃縮することができ、また該カラムに生
成する溶出液の成分バンド幅を最小限にすることができ
る。この結果、バンド幅の確認や識別が容易となり、サ
ンプルの分析効率、延いては分析精度を向上させことが
できる。また、極性，非極性の種々の分析対象物を含む
複雑なサンプルの分析を、容易に、かつ高精度で行うこ
とができる。更に、比較的短いカラムを使用することが
でき、分析に要する時間が短縮し、迅速な分析が可能と
なる。
するサンプルにクロマトグラフのカラムに導入する前
に、界面活性剤を混合したため、該カラムの上部におい
て該サンプルを濃縮することができ、また該カラムに生
成する溶出液の成分バンド幅を最小限にすることができ
る。この結果、バンド幅の確認や識別が容易となり、サ
ンプルの分析効率、延いては分析精度を向上させことが
できる。また、極性，非極性の種々の分析対象物を含む
複雑なサンプルの分析を、容易に、かつ高精度で行うこ
とができる。更に、比較的短いカラムを使用することが
でき、分析に要する時間が短縮し、迅速な分析が可能と
なる。
【図１】本発明の方法における分析システムの概要図で
ある。
ある。
【図２】図１のシステムのクロマトグラフカラムの一部
の詳細図である。
の詳細図である。
【図３】本発明の方法のフローチャートである。
１００ クロマトグラフシステム １０２ サンプル調製装置 １０５ 分析対象物を含むサンプル １０７ 界面活性剤 １０９ サンプル・界面活性剤混合物 １１０ カラム １１２ 検出器 １１６ サンプル注入器 １１８ カラムポンプ装置 １２０ 移動相溶媒 １２４ クロマトグラフ ２０３ 固定相 ２０２ サンプルプラグ ２０６ 成分バンド
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 399117121 395 Ｐａｇｅ Ｍｉｌｌ Ｒｏａｄ Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎ ｉａ Ｕ．Ｓ．Ａ.
Claims (4)
- 【請求項１】 サンプルの成分分析対象物を分離する方
法であって； 該分析対象物は、クロマトグラフカラム中において極性
の範囲を持ち、 該サンプルは、少なくとも１つの相対的に極性分析対象
物と、少なくとも１つの相対的に非極性分析対象物とを
持ち； 前記サンプルと界面活性剤を、前記非極性分析対象物の
ミセルを含む溶液を形成するようなクロマトグラフとし
て比較的弱い溶媒中で、混合するステップ；該溶液中の
該クロマトグラフとして弱い溶媒の濃度は、前記極性分
析対象物を溶解するには十分であるが、界面活性剤の不
存在下では前記非極性分析対象物を溶解するには不十分
な濃度であり； 前記ミセル及び前記極性分析対象物を含む前記溶液を、
前記クロマトグラフカラムのヘッド上に導くステップ；
界面活性剤の濃度は、前記ミセルを、少なくとも、前記
サンプルの主な部分が前記カラムのヘッド上に存在する
まで維持する、のに十分なレベルに維持され； 前記サンプルを、前記ミセルが破壊するように、希釈す
るステップ；及び 前記分析対象物を、前記カラムを通し
て逆相こう配溶離により、分離するステップ；該逆相こ
う配溶離は、前記クロマトグラフとして比較的弱い溶媒
から比較的強い溶媒へと進行し、また該逆相こう配溶離
は、前記ミセルの主な部分が破壊した後に前記分析対象
物の分離が顕著に生じる時間中生じる； からなるサンプルの分離方法。 - 【請求項２】前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン化
ソルビタンを含む請求項１記載のサンプルの分離方法。 - 【請求項３】 前記界面活性剤が、ポリオキシエチレン
化ソルビタンモノオレアートを含む請求項１記載のサン
プルの分離方法。 - 【請求項４】 サンプル中のアミノ酸を分離する方法で
あって； 該アミノ酸は、クロマトグラフカラム中において極性の
範囲を持ち、 該サンプルは、少なくとも１つの相対的な極性アミノ酸
と、少なくとも１つの相対的な非極性アミノ酸とを持
ち； 前記サンプルと界面活性剤を、前記非極性アミノ酸のミ
セルを含む溶液を形成 するようなクロマトグラフとして
比較的弱い溶媒中で、混合するステップ；該溶液中の該
クロマトグラフとして弱い溶媒の濃度は、前記極性アミ
ノ酸を溶解するには十分であるが、界面活性剤の不存在
下では前記非極性アミノ酸を溶解するには不十分な濃度
であり； 前記ミセル及び前記極性アミノ酸を含む前記溶液を、前
記クロマトグラフカラムのヘッド上に導くステップ；界
面活性剤の濃度は、前記ミセルを、少なくとも、前記サ
ンプルの主な部分が前記カラムのヘッド上に存在するま
で維持する、のに十分なレベルに維持され； 前記サンプルを、前記ミセルが破壊するように、希釈す
るステップ；及び 前記アミノ酸を、前記カラムを通して
逆相こう配溶離により、分離するステップ；該逆相こう
配溶離は、前記クロマトグラフとして比較的弱い溶媒か
ら比較的強い溶媒へと進行し、また該逆相こう配溶離
は、前記ミセルの主な部分が破壊した後に前記分析対象
物の分離が顕著に生じる時間中生じる； からなるサンプルの分離方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48733290A | 1990-03-01 | 1990-03-01 | |
| US487,332 | 1990-03-01 | ||
| US487332 | 1990-03-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0772129A JPH0772129A (ja) | 1995-03-17 |
| JP3054215B2 true JP3054215B2 (ja) | 2000-06-19 |
Family
ID=23935308
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3059644A Expired - Fee Related JP3054215B2 (ja) | 1990-03-01 | 1991-03-01 | サンプルの分離方法 |
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| EP (1) | EP0444441B1 (ja) |
| JP (1) | JP3054215B2 (ja) |
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| JP2002511147A (ja) * | 1997-06-27 | 2002-04-09 | ライフ テクノロジーズ インク． | 生体分子の濃縮および精製のための一工程装置および方法 |
| EP1946783B1 (en) * | 2000-03-09 | 2011-09-07 | CaridianBCT, Inc. | Extracorporeal blood processing apparatus |
| AU2002243220A1 (en) | 2000-11-21 | 2002-07-01 | Waters Investments Limited | Mobile phase dilution scheme for enhanced chromatography |
| KR100530546B1 (ko) | 2001-07-27 | 2005-11-23 | 아스텔라스세이야쿠 가부시키가이샤 | 구강내에서 신속하게 붕괴되는 정제용 서방성 미립자가함유된 조성물 및 그의 제조 방법 |
| US20090056541A1 (en) * | 2001-08-01 | 2009-03-05 | Davison Dale A | Method and apparatus for high resolution flash chromatography |
| GB0202682D0 (en) * | 2002-02-05 | 2002-03-20 | Glaxo Group Ltd | Novel separation technique |
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| EP1631829B1 (en) * | 2003-06-06 | 2016-04-13 | GE Healthcare Bio-Sciences AB | Method and apparatus for characterization of interactions |
| SE0301639D0 (sv) | 2003-06-06 | 2003-06-06 | Biacore Ab | Method and apparatus for characterization of intercations |
| BR112014008339A2 (pt) | 2011-11-10 | 2017-04-25 | Hoffmann La Roche | sistema de cromatografia e utilização de um sistema de cromatografia e da proporção |
| EP3742160B1 (en) * | 2019-05-24 | 2023-08-09 | Sartorius Stedim Biotech GmbH | Chromatography method, method of determining the concentration of at least one compound in a chromatography method and method of obtaining at least one chromatography method parameter |
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|---|---|---|---|---|
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| CA1198051A (en) * | 1981-03-26 | 1985-12-17 | Mary A. Fletcher | Purified glycoproteins from cow, horse and sheep and use in diagnosing infectious mononucleosis |
| US4551288A (en) * | 1982-08-16 | 1985-11-05 | Sandoz, Inc. | Processes for the preparation of liposome drug delivery systems |
| US4548904A (en) * | 1982-12-03 | 1985-10-22 | Molecular Genetics Research & Development | Protein sequencing method |
| JP2524573B2 (ja) * | 1983-04-21 | 1996-08-14 | ラ トローブ ユニバーシティ | 酵素の抽出および精製方法 |
| JPS60199819A (ja) * | 1984-03-23 | 1985-10-09 | Kowa Co | トロンビン結合性物質およびその製法 |
| US4743680A (en) * | 1985-02-01 | 1988-05-10 | New York University | Method for purifying antihemophilic factor |
| US4715217A (en) * | 1985-06-06 | 1987-12-29 | The Dow Chemical Company | Determining organic compounds using a membrane |
| US4828799A (en) * | 1985-06-26 | 1989-05-09 | Research Corporation | Therapeutic drug monitoring and analyte determination utilizing micellar chromatography |
| US4681761A (en) * | 1985-10-24 | 1987-07-21 | State Of Oregon, Acting By And Through The Oregon State Board Of Higher Education, Acting For And On Behalf Of The Oregon Health Sciences University | Major iron-regulated protein of Neisseria gonorrhoeae and its use as vaccine |
| AU597924B2 (en) * | 1985-12-11 | 1990-06-14 | Natinco Nv | Solubilization of protein aggregates |
| US4665037A (en) * | 1986-04-28 | 1987-05-12 | Analytichem International, Inc. | Method of sequencing peptides |
| US4732683A (en) * | 1986-12-02 | 1988-03-22 | Biospectrum, Inc. | Purification method for alpha interferon |
| CA1325980C (en) * | 1987-04-22 | 1994-01-11 | Sho Kikyotani | Apparatus for the treatment of biological samples and treatment methods using the same |
| US4832849A (en) * | 1988-06-16 | 1989-05-23 | Merrell Dow Pharmaceuticals Inc. | Extraction and purification of an anticoagulant principle from the south american leech, haementeria ghilianii |
| WO1989012643A1 (en) * | 1988-06-24 | 1989-12-28 | Synergen, Inc. | Purified vasopressin v1 receptor, method of making same, and use of the receptor in a diagnostic assay |
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| WO1990012030A1 (en) * | 1989-04-06 | 1990-10-18 | Washington State University Research Foundation, Inc. | Rickettsial antigens for vaccination and diagnosis |
-
1991
- 1991-02-05 EP EP91101528A patent/EP0444441B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-05 DE DE69122280T patent/DE69122280T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-03-01 JP JP3059644A patent/JP3054215B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1991-08-26 US US07/750,153 patent/US5135657A/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5135657A (en) | 1992-08-04 |
| JPH0772129A (ja) | 1995-03-17 |
| DE69122280T2 (de) | 1997-04-24 |
| EP0444441A2 (en) | 1991-09-04 |
| DE69122280D1 (de) | 1996-10-31 |
| EP0444441A3 (en) | 1992-09-09 |
| EP0444441B1 (en) | 1996-09-25 |
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