JP2956923B2 - パルス状電場を用いたキャピラリー中におけるポリサッカライドの分離方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はキャピラリー電気泳動と
交替電場（電界）電気泳動の分野に関するものである。
本発明はこれら二つの分野を独特な方法で組み合せ、通
常の方法では期待できないような結果を得ることを可能
にしたものでもある。

【０００２】

【従来の技術】ハイパフォーマンスキャピラリー電気泳
動（ＨＰＣＥ）の開発につながる初期の研究にはジョー
ゲンソン（Jorgenson）とルーカス（Lukacs）の研究が
ある。ジョーゲンソンらの文献であるJorgenson, J.W.,
et al., Anal. Chem. 53:1298(1981); Jorgenson, J.
W., et al., Clin., Chem. 27:1551 (1981);Jorgenson,
J.W., et al., J. Chromatogr. 218:209 (1981)を参照
文献として挙げる。これらの研究に報告されている実験
は、内径100ミクロン以下の小さな穴の開いたキャピラ
リーの両端に一定の高電圧を印加することによって、こ
のキャピラリーの中に入っているイオン性分子をそれぞ
れの分子量に応じて決まるある領域まで一方の電極の方
向に向かって移動させ、非常に効率よく分離できるこ
と、および充分に感度の良い検出器を移動経路のある点
に集中させることによってそれぞれの分子が移動した領
域を検知できることを明らかにしている。ジョーゲンソ
ン（Jorgenson）らの実験の基礎的な構成はそれ以来、
小さな分子から大きな分子までいろいろなタイプの分子
を非常に効率よく分離するのに利用されてきた。あるシ
ステムでは電気泳動の原理が分離の基礎になっている。
また別のシステムではミセル溶液ないしはその他の緩衝
液中での電気浸透現象（electroosmic action）の結果
として分離が起こっている。ツダらの文献であるTsuda,
T., et al., J.Chromatogr. 264:385 (1983)、テラベ
らの文献Terabe, S., et al., Anal. Chem. 56:111 (19
84)及びTerabe, S., et al., Anal. Chem. 57:834 (198
5)、及びフォーレイらの文献Foley, J.P., Anal. Chem.
62:1302 (1990)を参照のこと。なおこれ以外にもミク
ロエマルジョンの電気浸透現象を利用したものがある。
ワタライらの文献であるWatarai, H., Chem.Lett. (Jap
an) 391 (1991)を参照。オリゴヌクレオチドやポリヌク
レオチドのように非常に多くの電荷を持った高分子へこ
の方法を適用した研究はコーエン（Cohen, A.S.）らに
よって報告されており文献Proc. Natl. Acad. Sci. U.
S.A. 85:9660 (1988)に記載されている。そこでは化学
的に固定化した架橋ポリアクリルアミドのようなゲルの
中で分離が行なわれている。これらの研究やこれ以外の
開発の結果、ＨＰＣＥは今や非常に成功し広く商品化さ
れた装置的分析手法になっている。

【０００３】ＨＰＣＥにおけるキャピラリーの内部に使
用する分離媒体の選択が分離を成功させる基本である。
このため多くの研究者たちが分離媒体を注意深く選択あ
るいは修飾し、その他の方法では分離困難な組成物もこ
の方法を使えば分離できることを明らかにした。例えば
このような研究の結果、シクロデキストリンやミセル
系、および光学活性化合物を分離するためのキラルゲル
が使われるようになった。参照文献としては、ファナリ
らの文献Fanali, S., J. Chromatogr. 474:441 (198
9)、リウらの文献Liu, J., et al., J. Chromatogr. 51
9:189 (1990)、テラベらの文献Terabe, S., et al., J.
Chromatogr. 516:23 (1990)、及びグッツマンらの文献
Guttman, A., et al., J. Chromatogr. 448:41 (1988)
が挙げられる。この他には表面を被覆した開放チューブ
中でのタンパク質の分離例がある。参照文献としては、
ヒャーテンの文献Hjerten, S., J. Chromatogr. 347:19
91 (1985)、コブらの文献Cobb, K.A., et al., Anal. C
hem. 62:2478 (1990)、ビルクトロビッツらの文献Wirkt
orowicz, J.E., et al., Electrophoresis 11:769 (199
0)、及びタウンらの文献Town, J.K., et al., J. Chrom
atogr. 516:69(1990)が挙げられる。さらに別の例とし
てオリゴサッカライドを非常に高濃度の固定化ゲルの中
で分離した例がある。この参照文献としては、リウらの
文献Liu, J., etal., J. Chromatogr. 559:223 (1991)
が挙げられる。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】これらの研究にもかか
わらず、ポリサッカライドやある種のタンパク質あるい
は核酸のフラグメントなどは、緩衝液で満たされた開放
チューブ中においても固定化されたゲルを入れたチュー
ブ中においてもキャピラリー電気泳動にはうまくかから
ない。緩衝液を満たした開放チューブ中では大きな生体
分子は一緒に動いてしまう傾向がある。ゲルを満たした
キャピラリー中ではゲルの多孔性構造に非常に大きな分
子が浸透していくには抵抗が大きく、従って分子がうま
く検出器を通過するのが妨げられる。一方、水溶性セル
ロース誘導体や低融点アガロース、ガラクトマンナン、
直線状ポリアクリルアミド、ポリエチレングリコールお
よびポリビニルアルコールのような粘凋な高分子溶液か
らなる分離媒体を使うことによってうまい分離が得られ
た例もある。この参照文献として、チューらの文献Zhu,
M.D., et al., U.S. Patent No.5089111 (February 1
8, 1992)、及びグロスマンらの文献Grossman, P.D., et
al., Biopolymers 31:1221 (1991)を挙げる。これらの
溶液における高分子性の溶質は、分離しようとする大き
な多荷イオン性化合物が電界（電場）の影響下に移動す
る際に、充分にフレキシブルな会合体のネットワークを
形成する。

【０００５】クロモソーマルＤＮＡのような非常に大き
な生体高分子の特質は、電場（電界）に置くと伸長し、
文献中”レプテーション（reptaion）”として知られて
いる性質を示す傾向があることである。この文献とは、
デ ゲネスらの文献De Gennes, P.G., et al., Scaling
Concepts in Polymer Physics, Cornel University Pre
ss, Ithaca, New York (1979)、ラーマンらの文献Lerma
n, L.S., et al., Biopolymers 21:995 (1982)、及びラ
ンプキンらの文献Lumpkin, O.J.., et al., Biopolymer
s 24:1573 (1985)である。レプテーションはまったく異
なる鎖長の分子を分離媒体のネットワークの中で非常に
近似した速度で移動させてしまうので、分離を損なうも
のである。この現象はシュワルツ（Schwartz, D.C.）ら
によって認められ、利用された。この文献は、Cell 37:
67 (1984)である。シュワルツ（Schwartz）らは、この
ような大きな分子を、ふたつの電極が相互にまた移動方
向に対してもある一定角度をなしているような交替電場
にかけた。このような角度で電場が交替しているかある
いは”パルス”になっているかの間、分子形の再編成の
かたちで起こる分子の歪（distortions）ならびにレプ
テーション（reptations）の間に起こるよじれや”ヘル
ニア（hernias）”が分子緩和と交互に起こり、歪と緩
和が起こる速度は問題にしている分子のサイズによって
変わってくる。交替電場の周期の範囲内で分子の応答速
度がこのように異なるために、各分子の全移動速度また
は平均移動速度に違いが生じ、結局分子量の違いが基に
なって化合物が分離されることになる。

【０００６】これまでに報告されたさまざまな研究の中
で、電場の交替は互いにある角度をなす電場の間もしく
は完全に１８０度回転した位置にある二つの電場の間で
スウィッチングすることによってなされ、後者のような
場合を一般に”電場の反転”と呼んでいる。角度のある
電場を使う研究と同様、反転電場を使う研究もおもにス
ラブ型媒体（slab-shaped media）の中で行われ、多く
のそのような研究が非常に大きなＤＮＡ鎖のような大き
さ、即ち約１０⁵から１０⁷塩基（１０⁷から１０⁹ダルト
ン）の大きさの分子の分離を扱っている。このような技
術をより小さな分子を分離するのに応用した場合の効果
についてはほとんど知られていない。もっともひろく使
われている分離媒体は低融点アガロースである。この参
照文献としてはシュワルツらのSchwarts, D.C. et al.,
Cell 37:67 (1984)、及びカールらのCarle, G.F., et
al., Science 232:65 (1986)を挙げる。もっともひろく
使われている電場の強さ（電界強度）は２から１０Ｖ／
ｃｍの範囲内であり、分離には数時間から数日を要す
る。

【０００７】キャピラリーに反転電場（あるいはパルス
状電場）を使う試みは、ハイガー（Heiger, D.N.）らが
文献J. Chromatogr. 516:33 (1990)において報告してい
る。この著者らによって報告されている実験結果の主要
な部分はしかしながらパルス状電場ではなく連続（非交
替）電場を使って得られており、パルス状電場を用いる
試みとしては一本の鎖の分子量がゆうに２００万を越え
る二種の二本鎖ＤＮＡフラグメントの混合物の分離があ
るのみで、しかも著者らはすでに連続電場を用いる実験
でこれらの完全な分離を果たしている。パルス状電場を
使った二つの実験におけるピークセパレーションは連続
電場実験で得られたものほどではなかった。ピークセパ
レーションはパルス周波数を変えていくにつれて良くな
るが、計八つの試みを通して最も良くなった場合でも分
離がわずかに２５％向上しただけであった。これ以外に
パルス電場技術をＨＰＣＥに応用して成功したという報
告はない。これはおそらく通常ＨＰＣＥに用いられるよ
うな高電圧（典型的には１００から３００Ｖ／ｃｍ）を
パルスさせることに関係する実験上の困難さによるも
の、１８０度以外のパルス角を使うことの重要さの認
識、あるいは適切なカラムマトリックスやサンプル濃度
を選択する難しさによるものであろう。

【０００８】これらの理由から本発明は当業者にとって
驚くべきものであり予期せぬものなのである。

【０００９】

【発明の目的・効果】炭水化物とくにポリサッカライド
を効果的かつ効率よく反転電場電気泳動パルス法によっ
てキャピラリーチューブの中で分離できることを見いだ
した。この発見の驚くべきところは連続電気泳動場の影
響下にはキャピラリー中で分離しなかった炭水化物の混
合物が交替する反転電場の条件下ではたしかに分離する
ことである。さらにこの技術は、当該パルス状電場技術
が最もよく使われるＤＮＡフラグメントに比べればはる
かに分子量の小さい炭水化物の分離に有効である。さら
にこの技術は、従来のパルス状電場で使われてきた電場
の強さ（電界強度）に比べてはるかに強い電場を使うシ
ステムにもパルス状電場技術が使えるように拡張した独
創的なものである。

【００１０】本発明のこの他の目的、効果および特徴は
以下の記述から明らかになるであろう。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明の分離は多様な長
さ、直径、構成材料および向きのキャピラリーの中で行
われる。しかしながらほとんどの応用例においてキャピ
ラリーは約５ミクロンから約３００ミクロンの内径を持
っており、好ましくは約２０ミクロンから約１００ミク
ロンの範囲のものであり、長さは約１０ｃｍから約３，
０００ｃｍで、好ましくは約２０ｃｍから約１００ｃｍ
のものである。検出器の位置によっては溶質ゾーンが検
出器に達するまでに移動する距離、即ち有効長はこれよ
り幾分短くなることがある。

【００１２】キャピラリーは多様な材質で構成しうる
が、ただ化学的に不活性で電気的に絶縁性のものでなけ
ればならない。キャピラリーの表面を被覆して化学的不
活性と電気的絶縁性をもたせることもできるが、簡便さ
と安全性および長期にわたって使用するためには、表面
被覆は特に他の目的のために使用するので、キャピラリ
ー自身がこれらの性質を具備していることが望ましい。
これらを考慮するとキャピラリーは例えばガラスないし
はその他のシリカを含む材質、プラスチックまたはステ
ンレスのような金属で構成するのがよい。オンライン検
知をおこなうため、ならびにキャピラリーを分離媒体で
満たし電気泳動を行う間、内部をモニタリングするため
には透明な材質が好ましい。クォーツ製ないしは溶融シ
リカ製のキャピラリーが特に簡便で有用性が高い。

【００１３】多様な分離媒体がキャピラリーに使用でき
るが、本発明は分離媒体がポリマーマトリックスの場合
に特に有用性が高い。架橋したポリマーもそうでないポ
リマーもこの例に入る。架橋されていないポリマーには
直鎖状のポリアクリルアミド、ポリエチレンオキサイ
ド、それに分子修飾したセルロース誘導体やガラクトマ
ンナンのようなポリカーボハイドレイトがある。架橋さ
れたポリマーのうちで傑出した例としては架橋ポリアク
リルアミドがある。ゲルの濃度やキャピラリーへのゲル
の充填の仕方は当業者に既知であり、文献中にもよく記
載されている。例えば、グロスマン ピー．デー．ら著
キャピラリー電気泳動の理論と手法（Capillary Electr
ophoresis, Theory and Practice, Grossman, P.D., et
al., eds., Academic Press, Inc., San Diego, Calif
ornia (1992)）を参照のこと。

【００１４】キャピラリーの両端への電圧の印加は通常
の方法と同様にして行う。電場パルスは前進方向、即ち
サンプル組成物がキャピラリーの注入口から入って検出
点に向けて移動する方向の正の間欠的な電界強度と、そ
の間に入るゼロの電界強度、ないしは逆方向の電界強度
とから成っている。ゼロの電界強度を使わない場合の分
離は、一般に約１０Ｖ／ｃｍかそれ以上の電界強度（即
ち電圧勾配）をかけて行われる。好ましい実施例におけ
る電場の強さ（電界強度）は約３０Ｖ／ｃｍから約３，
０００Ｖ／ｃｍの範囲であり、最も好ましい実施例では
約１００Ｖ／ｃｍから約１，０００Ｖ／ｃｍの範囲であ
る。

【００１５】スウィッチングプロトコールにはさまざま
な方法がありうるが、それぞれの場合にキャピラリー中
における組成物が全体として前進する方向に動き、組成
物それぞれがその分子量に応じて決まる明確なゾーンに
最もよく分離するように選ぶべきである。これを実現す
るために変えられるパラメータには、逆向きの電場を間
欠期に印加するかしないか、前進方向及び後退方向とも
に印加する電界強度をを同一に保つかまたは変化させる
か、電界強度の大きさをどの程度にするか、パルス間隔
はどのくらいにするか、前進方向の電場の持続時間とそ
の間の間欠期の持続時間との比はどのくらいにするかな
どがある。

【００１６】本発明の好ましい実施例においてはプロト
コールとしてゼロ電場よりはむしろ逆向きの電場を印加
する。前進する方向の電場の持続時間および間欠期ない
しは逆方向の電場の持続時間は一定にするかあるいは徐
々に長くしていくというように変化させるかのいづれか
である。しかし好ましい方法においては、前進方向の電
場の持続時間は一定とし、間欠期ないしは逆方向の電場
の持続時間もまた一定としている。さらに前進方向の電
界強度およびその印加時間と、間欠期あるいは逆方向の
電界強度およびその印加時間の比は、正味の効果として
組成物を正の方向に移動させるものでなければならな
い。したがって間欠期の電界強度ないしは逆方向の電界
強度が前進方向の電界強度の強さに等しいかまたはそれ
より大きいときは、前進方向の電場の持続時間を間欠期
ないしは逆方向の電場の持続時間よりも長くしなければ
ならない。前進方向の電界強度が間欠期の電界強度ない
しは逆方向の電界強度よりも大きいときは、間欠期ない
しは逆方向の電場の持続時間を前進方向の電場の持続時
間よりも長くしなければならない。

【００１７】本発明の好ましい実施例では前進方向の電
場間隔は間欠期と周波数約０．０３から約３００Ｈｚ、
最も好ましくは約０．１から１００Ｈｚで交替してい
る。

【００１８】本発明は広範囲の分子量のポリサッカライ
ドの分離に応用できる。本発明は特に分子量が小は1,00
0から大は100,000,000の、好ましくは約3,000から約2,0
00,000にわたる、また最も好ましくは約5,000から約50
0,000にわたるポリサッカライドの分離に有用である。

【００１９】分離しようとするポリサッカライドの混合
物は一般に溶液のかたちでキャピラリーにかけられる。
溶液サンプルをキャピラリーにロード（loading）する
ときは通常の方法に従い、一般にサンプルをキャピラリ
ーの一方の端から少し入ったところに導入する。これを
実行するために特に優れた簡単な方法は電気泳動の原理
を応用したもので、電気泳動を行うときに使うのと同じ
電気装置を利用し、１０秒から２０秒といった限られた
時間だけ続く連続電場を低電圧でかけるものである。

【００２０】ポリサッカライドの電場に対する応答はポ
リサッカライドの分子構造中にある電荷を持った部分の
ために起こる。ヒアルロン酸やコンドロイチン硫酸およ
びヘパリン様分子のようなポリサッカライドには本来電
荷を持った部分が分子内に存在している。そのような部
分を持たない分子においては糖残基のヒドロキシル基が
平衡反応に基づいて荷電分子種と結合する部分として働
く。電荷をもたせるひとつの方法としては、緩衝液にホ
ウ酸イオンを加えておく方法が挙げられる。その他の荷
電分子種ならびに同様の結果をもたらす関連する化学反
応は当業者には明かである。

【００２１】分離した溶質ゾーンの検出は当業者にはよ
く知られたさまざまな方法で行うことができる。その例
としては、蛍光、ＵＶ吸収、サーモオプティカル検出、
質量分析計、電流滴定計、伝導度計、放射計、ラマン分
光光度計、屈折率計などがある。これらの多くはキャピ
ラリーチューブの中に直接設置したオンライン形式か、
あるいは溶質がキャピラリーから出てきたところで検知
する形式で利用できる。そのような検出方法のための装
置や実験の構成はキャピラリー電気泳動の技術分野では
よく知られたものである。オンライン検出が望ましい。

【００２２】蛍光検出法においては、ポリサッカライド
を適当な蛍光物質でラベルする。還元末端を持つ中性の
ポリサッカライドではアルデヒド基を還元的にアミノ化
し、その後ここを蛍光ラベルするという方法で行う。こ
のようにして付加させる蛍光ラベルの例にはオルトフラ
ルアルデヒド（orthphthalaldehyde：ＯＰＡ）、フルオ
レスアミン（fluorescamine）、及び３−（４−カルボ
キシベンゾイル）−２−キノリンカルボキシアルデヒド
（3-(4-Carboxybenzoyl)-2-quinolinecarboxyaldehyd
e：ＣＢＱＣＡ）がある。キトサンのようなアミノポリ
サッカライドはこれらの試薬で直接ラベルされる。これ
にかわる方法では還元的アミノ化反応を利用せず、アミ
ノ基を持ち、中性の糖とシッフベースを形成しうるラベ
ル化剤を使用する。

【００２３】電気泳動システムの残りの部分については
当業者によく知られた通常の装置が利用できる。これに
は緩衝液や電極、電力供給装置などが含まれる。電極は
電力供給装置とパルス状電場電気泳動用に設計された電
場スウィッチングユニットによって動かすのが好まし
い。入手できるいろいろな市販のユニットの中に、バイ
オラッドラボラトリー社（Bio-Rad Laboratories, In
c., Hercules, California, USA）から販売されている
３０００Ｖスウィッチ可能な改良型パルスウェーブ７６
０ 電気泳動電場スウィッチャー（Pulsewave 760 Elec
trophoretic FieldSwitcher）とともにモデル３０００
ｘｉ 電気泳動パワーサプライ（Model 3000xi Electro
phoresis Power Supply）もある。また電極を、トレッ
ク社（Trek, Inc., Medina, New York, USA）から販売
されているユニットのようなスウィッチング電力供給装
置によって動かすこともできる。

【００２４】以下の実施例は具体的に本発明を説明する
ためのものであり、本発明をこれだけに制限したり限定
したりするものではない。

【００２５】

【実施例】以下の実施例に示す実験は内径５０ミクロ
ン、外径１８７ミクロンで、それぞれの実験ごと決まる
異なる長さの溶融シリカ性のキャピラリー中で行った。
キャピラリーの内表面は直鎖状のポリアクリルアミドで
被覆し、外表面はポリイミドで被覆した。各実験ともキ
ャピラリーは電気的な安全性を考慮して設計した透明な
プラスチック性の箱に入れ、電力は３０ｋＶ（Spellman
High Voltage Electronics, Plainview, New York, US
A）高電圧直流電源から取った。周期的な電場の反転は
ファンクションジェネレータ（Beckman Industrial Cor
poration, Emerson Electric Co., Brea, California,
USA）によって制御できる１０ｋＶ可変式増幅器（Model
10/10, supplied by Trek, Inc., Medina, New York,
USA）によって行った。

【００２６】カラム上での蛍光検出はアルゴンイオンレ
ーザー（Omichrom, Supplied by Chino, California, U
SA）を光源として５ｍＷ、４５７ｎｍ光を使用し、溶融
シリカ性キャピラリーのポリイミド被覆してない微小区
間で行った。放射される蛍光は入射レーザー光に対して
直角に設置された６００ミクロンの光ファイバーから波
長５５５ｎｍで集光した。バンドパスフィルターで単離
したシグナルはＲ９２８光増幅管でモニターし、モデル
１２８Ａロック−イン増幅器（EG&G PrincetonApplied
Research, Princeton, New Jersey, USA）で増幅した。

【００２７】分子量8,800、39,100、70,000、503,000、
および2,000,000の標準デキストランはシグマケミカル
カンパニー（Sigma Chemical Company, St. Louis, Mis
souri, USA）から購入し、これ以外の分子量48,600およ
び667,800のデキストランはフルカケミカルコーポレイ
ション（Fluka Chemical Corp., Ronkonkoma, New Yor
k, USA）から購入した。３−（４−カルボキシベンゾイ
ル）−２−キノリンケルボキシアルデヒド（3-(4-carbo
xybenzoyl)-2-quinolinecarboxyaldehyde：ＣＢＱＣ
Ａ）は既知の方法で合成し、蛍光ラベル化剤として使用
した。アクリルアミド、過硫酸アンモニウム、ホウ酸ナ
トリウム、ホウ酸、リン酸ナトリウム、塩化アンモニウ
ム、およびトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）は
Sigma Chemical Companyのアナリティカルグレードの試
薬を使用した。シアノ水素化ホウ素ナトリウムはアルド
リッヒケミカルカンパニーインコーポレイテッド（Aldr
ichChemical Company, Inc., St. Louis, Missouri, US
A）の製品を使用した。シアン化カリウムはマリンクロ
ッツインコーポレイテッド（Mallinkrodt, Inc., St.Lo
uis, Missouri, USA）から購入した。カルボキシメチル
セルロースはアストラハッスレ（Astra Hassle (Swede
n)）から、またトリコデルマビライド（Tricoderma vir
ide）から得られるセルラーゼＥＣ３．２．１．４はシ
グマケミカルカンパニー（Sigma Chemical Company）か
らそれぞれ購入した。

【００２８】（実施例１）この実施例１はオリゴサッカ
ライド混合物の連続電場（即ち一定電場）キャピラリー
電気泳動の検討を行ったものである。本実施例は比較の
ためのもので、本発明による方法は使用していない。

【００２９】オリゴサッカライド混合物はカルボキシメ
チルセルロースをセルラーゼ（基質重量比１：１００）
を用いて、１００ｍＭのｐＨ５リン酸ナトリウム緩衝液
中、３７℃で酵素的に切断して調製した。酵素反応は１
時間後、反応混合物を１０分間１００℃に加熱して停止
させた後、反応混合物全体をＣ−１８カートリッジ（ミ
リポアコーポレイション社：Millipore Corporation, B
edford, Masaachusetts, USA）に通して酵素を除いた。
この後、残ったサンプルを還元的アミノ化反応によって
蛍光ラベルした。サンプルは、０．０２５ミクロンサイ
ズのミリポアＭＦメンブレン（Millipore MF Membran
e：0.025 micron pore size (Millipore Corporatio
n)）上でマイクロダイアリシス（microdialysis）を行
ってソルトフリーとした。

【００３０】電気泳動は、１８％のインスタクリル（In
stacryl：International Biotechnologies, Inc., New
Haven, Connecticut）を充填した有効長３０ｃｍ（全長
４５ｃｍ）のキャピラリー中で行った。使用した緩衝液
は２５ｍＭホウ酸／２５ｍＭリン酸ナトリウム／５０ｍ
ＭＴｒｉｓ（ｐＨ ９．１）である。サンプルはエレク
トロマイグレーションインジェクション法で１０秒間２
ｋＶをかけてでロードした。電気泳動は１５ｋＶ（４μ
Ａ）電圧を印加して行った。

【００３１】トレースを図１に示す。部分的に分岐して
いるというように分子ごとに形が違うので、電気泳動の
結果ピークの分離が起こっているが、期待したほど大き
な分散は見られない。

【００３２】市販の標準ポリデキストランと比較して各
ピークに相当する分子量をアサインしようとしてみれ
ば、期待した分離が起こっていないのが確認できる。標
準ポリデキストランは分子量48,600、273,000、および6
67,800のものである。これらの標準物質は、有効長が２
１ｃｍ（全長３１．５ｃｍ）である点を除けば図１の結
果を得るのに使用したのと類似のキャピラリー電気泳動
法で、同じ１８％インスタクリル（Instacryl）溶液、
５０ｍＭ トリス-ホウ酸（ｐＨ８．７、アンモニア水に
よって塩基性処理してある。）を使用し、サンプルはエ
レクトロマイグレーション インジェクション法で２０
秒間、５ｋＶをかけてロードし、２０ｋＶ（４μＡ）を
かけてそれぞれ個別に電気泳動を行った。このトレース
を、図２（Ａ）、図２（Ｂ）、および図２（Ｃ）に示し
た。これらのトレースにおいては、これら３種類の標準
物質はそれぞれ重さが大幅に異なるにもかかわらず、そ
れぞれがほとんど同じ移動時間を持つ二つのピークを生
ずる。これはそれぞれの場合において、速い方のゾーン
には直鎖状の分子だけが含まれているのに対して、遅い
方のゾーンには分岐した構造の分子が幾らか含まれてい
るためではないかと考えられる。

【００３３】（実施例２）この実施例２は本発明による
パルス状電場テクニックを標準的なポリデキストランか
ら成る二種類の混合物に適用した場合の効果を具体的に
示すものである。最初の混合物は分子量39,000、70,00
0、503,000、および2,000,000の標準物質を含んでお
り、二番目の混合物は分子量8,800、39,000、70,000、5
03,000、607,800、および2,000,000の標準物質を含んで
いる。

【００３４】この実施例２で用いたキャピラリーは有効
長が２０ｃｍ（全長２９ｃｍ）で、５％の直鎖状ポリア
クリルアミドを充填した。緩衝液には５０ｍＭのトリス
−ホウ酸（Tris-borate）と１ｍＭのエチレンジアミン
テトラアセティックアシッド（Ethylenediaminetetraa
cetic acid）から成るｐＨ８．２のものを使用した。サ
ンプルはエレクトロマイグレーションインジェクション
法により２ｋＶにて２０秒かけてロードし、電気泳動は
交替電圧＋／−１０ｋＶ（＋／−３４０Ｖ／ｃｍ）（同
じ電界強度で交互に反転する電場）を周波数３Ｈｚの矩
形波を使って印加して行った。

【００３５】最初の実験は分子量39,000、70,000、503,
000、および2,000,000のポリデキストラン標準物質から
成る混合物に対して行った。印加するパルスの前進方向
対逆方向の時間比（forward-to-reverse）は３：１と
し、この実験で得られたトレースを図３に示した。第二
番目の実験は分子量8,800、39,000、70,000、503,000、
607,800、2,000,000のポリデキストラン標準物質から成
る混合物に対して行った。パルスの前進方向対逆方向の
時間比はこの実験では２：１とし、トレースは図４に示
した。

【００３６】それぞれのトレースにおける各ピークは、
個々のポリサッカライドを同じ実験条件下に電気泳動し
て得られるトレースと比較して同定し、トレース上、標
準物質の分子量が増加する順に番号を付して示した。各
トレースから、分子量に直接対応した順番に標準物質が
溶出し、きれいに分離していることを明瞭に読み取るこ
とができる。

【００３７】パルス状電場テクニックを使えば大幅な分
散が得られるかどうかを検討するため、分子量39,100の
ポリデキストラン標準物質を単独でキャピラリーに流し
てみた。キャピラリーは有効長が１５ｃｍ（全長２４ｃ
ｍ）で、４％の直鎖状ポリアクリルアミドを充填した。
実験条件はすべて図３に示した混合物のときに使用した
のと同じである。その結果を図５に示した。これより大
幅な分散が確かに得られているのがわかる。

【００３８】上記のことは主に本発明を具体的に示す目
的で記述したものである。当業者にはシステムの操作条
件、材料、構成要素は明らかであろうし、ここに述べた
以外のシステムパラメータも本発明の概念の範囲内でさ
まざまにさらに改良または置換できるであろう。

【図面の簡単な説明】

【図１】オリゴサッカライドを連続電場電気泳動にかけ
た実験でのエレクトロフェログラム（electropherogra
m）の検出結果を示すトレース（測定図）である。この
トレースには実施例１のデータが含まれているが、これ
を得るための手法は本発明に含まれない。

【図２】 図２（Ａ）、図２（Ｂ）及び図２（Ｃ）は個
々の標準ポリデキストランを電気泳動したときのエレク
トロフェログラムの検出結果を示すトレース（測定図）
である。実施例１でも言ったのと同様、これを得るため
の手法は本発明とは直接関係がない。

【図３】 実施例２で述べるパルス状電場電気泳動実験
のエレクトロフェログラムの検出結果を示すトレース
（測定図）である。このトレースを得るプロセスは本発
明の範囲に含まれる。

【図４】 実施例２で述べる別のパルス状電場電気泳動
実験のエレクトロフェログラムの検出結果を示すトレー
ス（測定図）であり、これも本発明の範囲に含まれる。

【図５】 実施例２で述べるさらに別のパルス状電場電
気泳動実験のエレクトロフェログラムの検出結果を示す
トレース（測定図）で、これも本発明の範囲に含まれ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ミロス ブイ． ノボトニー アメリカ合衆国 インディアナ州 47408 ブルーミントン ノースベント ンドライブ 4600 (72)発明者 ジャン スードー アメリカ合衆国 インディアナ州 47404 ブルーミントン ウエストサー ドストリート 710 (56)参考文献 特開 平４−43954（ＪＰ，Ａ) 米国特許5122248（ＵＳ，Ａ) Ｍｉｃｒｏｂｉｏｓ，41〔164〕 （1984）ｐｐ．97−104

Claims (10)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】以下の段階（ａ）及び（ｂ）、即ち、 （ａ）ポリサッカライド混合物を含有するサンプルを、
   電気泳動分離媒体で満たされているキャピラリーに、そ
   のキャピラリーのサンプル導入端とされている一方の端
   から吸引させる段階、 （ｂ）前記サンプルの導入端から離れる方向であって前
   進方向と定義される方向に電場を前記キャピラリーに印
   加する段階であって、前記電場は前記前進方向の電場の
   時間間隔と定義した時間間隔にて電場が前記前進方向に
   印加されていない間欠期によって分離されるように印加
   され、前記前進方向及び前記間欠期における前記電場の
   電界強度及び持続時間が、個々のポリサッカライドがキ
   ャピラリー中においてそれらのポリサッカライドの分子
   量に応じて異なる速度で前記前進方向に電気泳動によっ
   て移動するように設定されている段階、 を含むことを特徴とするサンプル内のポリサッカライド
   混合物を分離する方法。
2. 【請求項２】前記電界強度が、１００Ｖ／ｃｍから１０
   ００Ｖ／ｃｍであることを特徴とする請求項１記載のポ
   リサッカライド混合物を分離する方法。
3. 【請求項３】前記前進方向の電場の時間間隔は、前記間
   欠期と０．１Ｈｚから１００Ｈｚの周波数で交替するこ
   とを特徴とする請求項１記載のポリサッカライド混合物
   を分離する方法。
4. 【請求項４】前記分離媒体が、ポリアクリルアミン、ポ
   リエチレングリコール、ガラクトマンナン、及びセルロ
   ースの誘導体からなるグループから選択される媒体であ
   ることを特徴とする請求項１記載のポリサッカライド混
   合物を分離する方法。
5. 【請求項５】前記キャピラリーが、２０ミクロンから１
   ００ミクロンの内径であることを特徴とする請求項１記
   載のポリサッカライド混合物を分離する方法。
6. 【請求項６】前記電場が前進方向の電場と定義されてい
   る場合、その反対方向の電場であって逆方向の電場と定
   義された電場が前記間欠期の間前記キャピラリーに印加
   されていることを特徴とする請求項１記載のポリサッカ
   ライド混合物を分離する方法。
7. 【請求項７】前記前進方向の電場と逆方向の電場が実質
   的に等しい電界強度である場合、前進方向の電場のそれ
   ぞれの時間間隔は、その前進方向の電場の時間間隔直前
   の間欠期の持続時間及び直後の間欠期の持続時間よりも
   長いことを特徴とする請求項６記載のポリサッカライド
   混合物を分離する方法。
8. 【請求項８】前記前進方向の電場の時間間隔が等しい場
   合、前記間欠期も等しい時間間隔であることを特徴とす
   る請求項６記載のポリサッカライド混合物を分離する方
   法。
9. 【請求項９】前記前進方向及び逆方向の電場が実質的に
   等しい電界強度である場合、前記前進方向の電場の持続
   時間が前記間欠期の持続時間よりも長いことを特徴とす
   る請求項８記載のポリサッカライド混合物を分離する方
   法。
10. 【請求項１０】前記前進方向の電場及び前記逆方向の電
    場の前記電界強度が、それぞれ関係なく１００Ｖ／ｃｍ
    から１，０００Ｖ／ｃｍであり、前記前進方向の電場の
    時間間隔が前記間欠期と０．１Ｈｚから１００Ｈｚの周
    波数で交替することを特徴とする請求項６記載のポリサ
    ッカライド混合物を分離する方法。