JP2937757B2 - Ｃ３Ｇ蛋白遺伝子のｃＤＮＡ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、ｒａｓ蛋白グアニン
ヌクレオチド交換因子であるＣ３Ｇ蛋白遺伝子のｃＤＮ
Ａと、このｃＤＮＡを含む組換えベクター、この組換え
ベクターを保有する形質転換体、形質転換体により産生
されるＣ３Ｇ蛋白、およびそのＣ３Ｇ蛋白を抗原として
調製した抗Ｃ３Ｇ蛋白抗体に関するものである。 この
発明のｃＤＮＡ、その発現産物であるＣ３Ｇ蛋白および
抗Ｃ３Ｇ蛋白抗体は、癌遺伝子ｒａｓの活性化により生
じる悪性腫瘍の診断、基礎研究および新たな癌治療方法
の開発等に極めて有用である。

【０００２】

【従来の技術とその課題】近年の遺伝子工学技術の進歩
には目覚ましいものがあり、発癌のメカニズム等につい
ても遺伝子レベルでの研究が活発に行なわれ、ヒトの発
癌に関係する多数の癌遺伝子や癌抑制遺伝子が明らかに
なってきている。そのような癌遺伝子の一種として、レ
トロウイルス（マウス肉腫ウイルス）より見い出された
ｒａｓ群遺伝子が知られており、このｒａｓ群遺伝子の
発現する蛋白（以下、ｒａｓ蛋白と記載する）は、高等
真核動物細胞の増殖に関与する蛋白の主たるものの一つ
であり、ヒトの膵臓癌や大腸癌を始めとする多くの悪性
腫瘍部位で活性化していることが明らかになっている。

【０００３】さらにこのｒａｓ蛋白は、ｒａｓ蛋白グア
ニンヌクレオチド交換因子によって活性化されることも
明らかになっている。このため、ｒａｓ蛋白グアニンヌ
クレオチド交換因子は、ｒａｓ群遺伝子の活性化に伴う
悪性腫瘍の診断指標として、また各種抗癌剤によるミサ
イル療法等の標的としてその重要性が関心を集めてい
る。

【０００４】従来、高等動物におけるｒａｓ蛋白グアニ
ンヌクレオチド交換因子としては、ｍＣＤＣ２５、ｍＳ
ＯＳおよびＧＤＳという３種類の蛋白が知られていた
が、この発明の発明者等は、ｒａｓ蛋白と他の癌遺伝子
発現産物との関係を広く研究する過程で、上記３種類の
蛋白とは異なった新しいｒａｓ蛋白グアニンヌクレオチ
ド交換因子が存在することを見い出し、この蛋白の分離
精製にも成功して、これをＣ３Ｇ蛋白と命名した。

【０００５】この発明は、従って、上記のＣ３Ｇ蛋白
を、たとえば癌の診断や発癌メカニズムの解明、あるい
は新たな癌療法の開発等に広く有効利用するために為さ
れたものであり、このＣ３Ｇ蛋白遺伝子のｃＤＮＡと、
このｃＤＮＡの簡便な操作および蛋白の多量発現を可能
とする遺伝子工学材料を提供することを目的としてい
る。

【０００６】さらにこの発明は、上記ｃＤＮＡの発現産
物であるＣ３Ｇ蛋白と、Ｃ３Ｇ蛋白に対する抗体を提供
することを目的としてもいる。

【０００７】

【課題を解決するための手段】この発明は、上記の課題
を解決するものとして、ｒａｓ蛋白グアニンヌクレオチ
ド交換因子であるＣ３Ｇ蛋白遺伝子のｃＤＮＡを提供す
る。またこの発明は、上記ｃＤＮＡを含有するクローニ
ングベクターおよび発現ベクター、並びにこの発現ベク
ターを保有する大腸菌の形質転換体を提供する。

【０００８】さらにこの発明は、上記形質転換体により
生産されるＣ３Ｇ蛋白と、この蛋白を抗原として調製し
た抗Ｃ３Ｇ蛋白抗体をも提供する。以下、この発明につ
いて詳しく説明する。

【０００９】ｒａｓ蛋白グアニンヌクレオチド交換因子
であるＣ３Ｇ蛋白の遺伝情報を担うｃＤＮＡは、例え
ば、ヒト、マウス、ニワトリ等の高等真核動物細胞か
ら、例えばSambrookらの方法（Molecular Cloning Seco
nd edition, Cold Spring HarborLaboratory, New York
，１９８９）に従って単離精製することができる。す
なわち、動物細胞のゲノムＤＮＡからＣ３Ｇ蛋白遺伝子
のｍＲＮＡを精製し、次いでこのｍＲＮＡから逆転写酵
素を用いてｃＤＮＡ鎖を合成すればよい。このようにし
て合成することのできるＣ３Ｇ蛋白のｃＤＮＡのうち、
ヒト細胞由来のｃＤＮＡの塩基配列およびその翻訳領域
のアミノ酸配列を配列表の配列番号１および２にそれぞ
れに示した。

【００１０】次に、この発明のクローニングベクター
は、上記方法により得たｃＤＮＡの断片を、公知のクロ
ーニング用ベクターに挿入結合することによって作成す
ることができる。ｃＤＮＡ断片とベクターの結合は、例
えば上記Sambrookらの方法に従えばよい。なお、使用す
るベクターとしては、大腸菌を宿主とするベクタープラ
スミドまたはラムダファージが好ましく、ベクタープラ
スミドとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９またはｐ
ＢＲ３２２由来のもの等を用いることができる。またラ
ムダファージを用いる場合にはラムダｇｔ１１が好適な
ものとして例示できる。

【００１１】さらに、上記ｃＤＮＡを組み込んだクロー
ニングベクターの選択も公知の方法（例えば上記Sambro
okら）に従って行なうことができ、たとえば、ベクター
としてラムダファージ由来のラムダｇｔ１１を用いた場
合の組換え体の選択は、次のように行なうことができ
る。すなわち、この発明の上記ｃＤＮＡを結合した組換
えラムダｇｔ１１を３７℃の温度条件下で大腸菌Ｙ１０
９０に感染させ、トリプトン、イーストエキストラク
ト、ＮａＣｌ、アンピシリン、寒天を含む培地（以下Ｌ
Ａ寒天培地と略する）に培養する。次に、イソプロピル
チオ−Ｄ−ガラクトシド（以下ＩＰＴＧと略する）を含
むニトロセルロースあるいはナイロン膜を乗せ、さらに
数時間培養して、感染した大腸菌を膜に転写する。この
膜と酵素標識したＣＲＫ蛋白（Matsudaet al., Mol, Ce
ll, Biol,１２：３４８２−３４８９，１９９２）を反
応させた後、酵素に対する基質を入れることで、Ｃ３Ｇ
蛋白のｃＤＮＡを組み込んだクローニングベクターを有
する大腸菌株を選択することができる。酵素標識として
はアルカリフォスファターゼあるいはペルオキシダーゼ
が好適に用いられる。またＣＲＫ蛋白をグルタチオンＳ
トランスフェレーゼ（以下ＧＳＴと略する）との融合蛋
白として製造し、このＧＳＴに対する抗体を用いて選択
することも可能である。

【００１２】この発明では、下記実施例に示した通り、
ベクタープラスミドｐＵＣ１１８に、配列番号１の塩基
配列をコードするｃＤＮＡを結合して、組換えベクター
ｐＣ３ＧＩを実際に作成し、さらにこれを大腸菌Ｋ１２
株由来のＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株に導入してＥ．ｃｏｌｉＣ
３ＧＩを作成し、工業技術院生命工学工業技術研究所に
寄託して受託番号ＦＥＲＭ Ｐ−１３６５１を得た。

【００１３】この発明の発現ベクターは、Ｃ３Ｇ蛋白遺
伝子のｃＤＮＡを公知の遺伝子発現ベクターに組み込む
ことにより作成することができる。ｃＤＮＡは、動物細
胞のｍＲＮＡから合成したものでもよいが、より好まし
くは、この発明の上記クローニングベクターから調製し
て用いることができる。また、遺伝子発現用ベクターと
しては、特に制限はないが、好ましくは大腸菌を宿主と
するｐＧＥＸ１、ｐＧＥＸ２ＴまたはｐＧＥＸ３Ｘ等を
用いるようにする。

【００１４】以上のようにして作成したこの発明の発現
ベクターを公知の方法により大腸菌に導入することによ
りこの発明の形質転換菌を作成することができ、さらに
この形質転換体を公知の方法によって培養することによ
り、この発明のＣ３Ｇ蛋白を容易かつ大量に製造するこ
とができる。その具体例を示せば、たとえば次のとおり
である。すなわち、形質転換大腸菌をアンピシリン含有
Ｌ−ブロスを用い３７℃で３〜２４時間培養し、集菌し
た菌体を超音波破砕またはトリトンＸ−１００とリゾチ
ームにより溶菌し、この試料を担体に接着させることに
より目的とするＣ３Ｇ蛋白を分離精製することができ
る。

【００１５】さらに、このようにして精製したＣ３Ｇ蛋
白を常法に従って動物に接種することにより、Ｃ３Ｇ蛋
白に対する抗体を得ることができる。動物としては、た
とえばウサギ、マウス、ヤギ、ヒツジ、ウマ、ハムスタ
ー等を用いることができるが、ウサギまたはマウスが特
に好ましい。このようにして得た抗Ｃ３Ｇ蛋白抗体は、
たとえば試料中のＣ３Ｇ蛋白の定量や分離に用いること
ができ、その結果、ｒａｓ群遺伝子の活性化の程度を測
定すること（すなわち、癌の診断）が可能となる。

【００１６】また、この発明のｃＤＮＡ、蛋白および抗
体は、新たな癌療法の開発に有用な各種の遺伝子操作材
料を提供する。すなわち、Ｃ３Ｇ蛋白遺伝子のアンチセ
ンスＲＮＡやＣ３Ｇの変異タンパク、あるいはこれらの
ＲＮＡ、変異タンパクまたは抗Ｃ３Ｇ蛋白抗体を癌細胞
中で発現させるウィルスベクター等である。以下、実施
例を示してこの発明をさらに詳細かつ具体的に説明する
が、この発明は以下の例に限定されるものではない。

【００１７】

【実施例】実施例１ （ヒトＣ３Ｇ蛋白遺伝子のｃＤＮＡの単離）ヒト脾臓か
ら単離したＣ３Ｇ蛋白遺伝子のｍＲＮＡより合成したｃ
ＤＮＡをラムダｇｔ１１に組み込み、この組換え体を大
腸菌Ｙ１０９０に感染させ、ＬＡ寒天培地に塗末した。
６時間後この培地上に１ｍＭ ＩＰＴＧを含むニトロセ
ルロース膜を乗せ、さらに３時間培養した後、このニト
ロセルロース膜を２％スキムミルク、０．０５％Ｔｗｅ
ｅｎ２０を含むリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）と１時間反
応させた。ついで、１ｕｇ／ｍｌ ＧＳＴ−ＣＲＫ、１
ｕｇ／ｍｌ 抗ＧＳＴモノクローナル抗体を含むリン酸
緩衝液と１時間、１ｕｇ／ｍｌ アルカリフォスファタ
ーゼ標識抗マウス抗体（ＴＡＧＯ社製品）と１時間反応
させた後、アルカリフォスファターゼの基質であるＡＰ
パープル（Ｂｉｏ１０１社製品）を用いてＣＲＫ蛋白と
結合するファージを同定した。このファージを３回のプ
ラーク形成を行って純化したのち、そのＤＮＡをフェノ
ール抽出法により調製し、制限酵素ＥｃｏＲＩで切断
後、電気泳動することによりヒト由来Ｃ３Ｇ蛋白のｃＤ
ＮＡの一部分を調製した。ついでこのｃＤＮＡ部分をラ
ンダムオリゴプライマー（ベーリンガー社製品）と³²ｐ
デオキシシチヂン三リン酸とをもちいてアイソトープ標
識し，標識ＤＮＡを用いてSambrookらの方法（Molecula
r Cloning Second edition, Cold Spring Harbor Labor
atory, New York,１９８９）により、先に述べたヒト膵
臓由来のｃＤＮＡ組換えラムダｇｔ１１をプラークハイ
ブリダイゼーションによりスクリーニングし、さらに６
種類のＣ３Ｇ蛋白ｃＤＮＡを有する組換えラムダｇｔ１
１を得た。これらのファージのＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで切断し、Ｃ３Ｇ蛋白のｃＤＮＡを精製してファー
ジェミドベクターｐＵＣ１１８にサブクローニングし
た。得られた組替えベクターより１本鎖ＤＮＡを精製
し、その塩基配列を自動核酸配列読み取り機（ファルマ
シア社製品）を用いて決定した。その塩基配列を配列表
の配列番号１に、また予想される翻訳領域のアミノ酸配
列を同じく配列番号２に示す。このアミノ酸配列をヨー
ロッパ分子生物学研究所（ＥＭＢＬ）、ジーンバンク(G
enBank) に登録されているデータベースで検索したとこ
ろ、Ｃ３Ｇ蛋白のカルボキシル末端側は酵母のＣＤＣ２
５を始めとして、ｒａｓ蛋白のグアニンヌクレオチド交
換因子群と３０％以上同一であったが、既知の高等動物
ｒａｓ蛋白グアニンヌクレオチド交換因子群とは異なる
もので、新しいｒａｓ蛋白グアニンヌクレオチド交換因
子であることを確認した。実施例２ （クローニングベクターと形質転換菌の作成）実施例１
で、Ｃ３Ｇ蛋白のｃＤＮＡをサブクローニングするのに
用いたｐＵＣ１１８の組換え体群から、各々重複する部
分を除いた断片を切り出し、それらを結合して７．４ｋ
ｂからなるクローニングベクターｐＣＧ３Ｉを作成し
た。このｐＣ３ＧＩの構成は図１に示した通りである。

【００１８】さらにこのクローニングベクターｐＣ３Ｇ
Ｉを、大腸菌Ｋ１２株由来のＸＬＩ−Ｂｌｕｅ株に導入
し、形質転換菌Ｅ．ｃｏｌｉＣ３ＧＩを得た。実施例３ （Ｃ３Ｇ蛋白の製造）実施例２で得たクローニングベク
ターｐＣ３ＧＩをＥｃｏＲＩで切断し、Ｃ３Ｇ蛋白のｃ
ＤＮＡ領域を調製して、これを発現プラスミドｐＧＥＸ
１に組み込んだ。この発現ベクターを大腸菌ＤＨ５に導
入して形質転換菌を作成し、この形質転換菌を、１リッ
トルのアンピシリン含有Ｌ−ブロース中で、吸光度が
０．６になるまで培養した後、ＩＰＴＧを０．５ｍＭに
なるように加え、さらに３時間培養を続けた。次いで、
菌体を集菌した後、超音波処理し、菌体破砕物を除いた
上清をグルタチオンセファロース（ファルマシア社製
品）と混ぜ、グルタチオンセファロースをリン酸緩衝液
で洗浄した後、５ｍＭのグルタチオンを含むリン酸緩衝
液でＣ３Ｇ蛋白を遊離させた。この蛋白をリン酸緩衝液
で透析した後、一部をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル
にて分析した結果、純度９０％以上のＧＳＴ融合蛋白が
合成されていた。実施例４ （抗Ｃ３Ｇ蛋白抗体の作成）実施例３で精製したＣ３Ｇ
蛋白を、完全フロイントアジュバントとともに家兎に２
週間おきに３回皮下接種したのち、その血清を採取し
た。

【００１９】この血清は、ウエスタンブロッティング法
を用いて試験したところ、約１０００の希釈でもＣ３Ｇ
蛋白に対する確かな反応性を示したことから、Ｃ３Ｇ蛋
白に対する抗体として使用可能であることが確認され
た。

【００２０】

【発明の効果】以上詳しく説明した通り、この発明によ
って、ｒａｓ群遺伝子の活性化に伴う悪性腫瘍の新たな
診断方法や治療法の開発が可能となる。

【００２１】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：４０６２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ to ｍＲＮＡ 起源 生物名：ホモ サピエンス 細胞の種類：脾臓細胞 配列の特徴 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１２３．．３３５６ 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TTTTCTGGGC ACCGCCTTCT GCTAGGGGGT TGTAGATGAA AGTGCCTGCT CCCAGAGAAG 60 CTTGTCTAAC CTAGCACAGT TTCTAAGCTA CCCAGGCTGC CAGACCGAGC GACCGTGCTG 120 CCATGGACAC AGACTCTCAG CGTTCTCATC TCTCTTCCTT CACCATGAAG CTGATGGACA 180 AATTCCACTC ACCCAAAATC AAGAGAACGC CATCAAAGAA GGGAAAACCA GCTGAGGTGT 240 CCGTAAAGAT TCCAGAGAAG CCTGTGAACA AAGAGGCAAC AGACAGATTT CTACCAGAGG 300 GCTACCCTCT CCCCTTGGAT CTGGAGCAGC AGGCAGTAGA ATTTATGTCC ACCAGTGCTG 360 TGGCTTCCAG GTCTCAAAGG CAGAAGAACC TGAGCTGGCT GGAGGAGAAA GAGAAGGAAG 420 TTGTCAGTGC CCTGCGCTAC TTTAAGACCA TTGTGGACAA AATGGCAATT GATAAGAAGG 480 TACTGGAGAT GCTTCCAGGG TCAGCCAGCA AGGTGCTGGA GGCCATCTTA CCCCTGGTGC 540 AGAACGATCC TCGAATTCAG CACAGCTCAG CCCTCTCTTC CTGCTATAGC CGAGTGTACC 600 AAAGCCTCGC CAACCTCATT CGCTGGTCTG ACCAAGTGAT GCTGGAAGGC GTGAACTCAG 660 AAGACAAGGA GATGGTGACG ACTGTGAAGG GGGTCATCAA GGCTGTGCTG GATGGAGTGA 720 AGGAGCTGGT CAGGCTCACC ATCGAGAAGC AGGGACGTCC GTCTCCGACG AGCCCCGTGA 780 AGCCCAGTTC CCCTGCCAGC AAGCCTGATG GCCCAGCAGA GCTCCCCCTG ACAGACCGCG 840 AGGTAGAGAT CCTAAACAAG ACGACTGGGA TGTCACAGTC AACTGAGCTC CTCCCAGATG 900 CCACGGATGA AGAGGTCGCG CCCCCCAAGC CTCCTCTGCC TGGCATTCGG GTGGTTGATA 960 ATAGTCCTCC ACCAGCATTG ACACCCAAGA AAAGACAGTC GGCGCCGTCC CCTACCCGAG 1020 TGGCTGTGGT GGCCCCCATG AGCCGAGCCA CCAGTGGCTC CAGTTTGCCT GTTGGAATCA 1080 ATAGGCAGGA TTTTGATGTT GACTGTTACG CACAGAGGCG ACTGTCAGGA GGCAGCCACT 1140 CATATGGTGG AGAGTCGCCC CGCCTCTCCC CCTGCAGCAG CATAGACAAG CTCAGCAAGT 1200 CAGACGAGCA GCTGTCCTCT CTGGACAGGG ACAGTGGGCA GTGCTCCCGG AACACAAGCT 1260 GTGAAACACT AGACCACTAT GATCCCGACT ATGAATTCCT CCAGCAAGAC CTCTCTAACG 1320 CAGACCAGAT ACCTCAGCAG ACGGCCTGGA ACCTTAGCCC GTTGCCAGAG TCTTTGGGGG 1380 AGTCTGGGTC TCCATTTCTT GGCCCTCCTT TCCAGCTGCC TCTTGGCGGC CATCCCCAGC 1440 CAGACGGACC TCTGGCCCCA GGGCAGCAGA CAGATACGCC ACCTGCTCTC CCCGAGAAGA 1500 AGCGCAGGAG CGCAGCCTCC CAGACGGCGG ACGGCTCTGG CTGCAGGGTG TCCTACGAGC 1560 GGCATCCCTC GCAGTATGAC AACATCTCTG GGGAGGACCT GCAGAGCACA GCCCCGATCC 1620 CATCCGTCCC CTACGCGCCC TTTGCTGCTA TTCTGCCCTT TCAGCATGGA GGTTCCTCAG 1680 CCCCTGTCGA ATTTGTGGGT GATTTTACTG CTCCTGAGTC AACCGGTGAC CCAGAAAAAC 1740 CACCTCCTCT ACCAGAGAAG AAAAACAAAC ACATGCTGGC CTACATGCAG TTGCTGGAGG 1800 ACTACTCGGA GCCGCAGCCC TCTATGTTCT ACCAGACGCC ACAGAACGAG CACATCTACC 1860 AGCAGAAGAA CAAGCTCCTC ATGGAGGTAT ACGGCTTCAG CGACTCCTTC AGTGGGGTGG 1920 ACTCCGTGCA GGAGCTGGCC CCGCCGCCCG CCCTACCCCC CAAGCAGCGG CAGCTGGAGC 1980 CACCGGCTGG GAAAGACGGA CATCCCAGAG ATCCCTCAGC GGTCAGCGGC GTCCCTGGGA 2040 AGGACAGCAG AGACGGCAGT GAGAGGGCCC CAAAGTCACC AGATGCTCTG GAGTCGGCTC 2100 AGTCGGAGGA GGAAGTGGAC GAGCTGTCCC TCATTGACCA CAACGAAATT ATGTCCAGGC 2160 TGACGCTCAA GCAGGAGGGT GATGACGGGC CGGACGTCCG CGGAGGATCT GGGGACATCT 2220 TACTGGTCCA TGCTACTGAG ACTGACAGGA AAGATTTGGT GTTGTACTGC GAGGCATTCC 2280 TGACCACCTA CAGGACCTTC ATCTCCCCAG AGGAGCTCAT CAAGAAGCTG CAGTACAGAT 2340 ATGAGAAATT CTCTCCCTTT GCCGACACAT TCAAGAAGCG CGTCAGCAAG AACACGTTCT 2400 TCGTGCTGGT ACGGGTGGTG GATGAGCTCT GCCTGGTGGA GTTGACAGAA GAGATCCTGA 2460 AGCTGCTGAT GGAACTGGTC TTCCGCCTGG TGTGCAATGG GGAGCTGAGC CTGGCCCGTG 2520 TGCTCCGGAA GAACATCCTG GACAAGGTGG ACCAGAAGAA GCTACTCAGG TGTGCCACCT 2580 CCAGCCAGCC CCTGGCAGCC CGGGGGGTAG CAGCCAGGCC GGGGACCTTG CACGACTTTC 2640 ACAGCCATGA GATAGCGGAG CAGCTAACGC TGCTGGATGC TGAGCTCTTC TATAAAATAG 2700 AGATTCCTGA GGTTTTGCTT TGGGCAAAAG AGCAGAATGA GGAGAAGAGC CCCAACTTGA 2760 CCCAGTTCAC GGAGCACTTC AACAACATGT CCTACTGGGT CCGGTCCATA ATCATGTTAC 2820 AGGAAAAGGC CCAGGACAGG GAACGGCTGC TCTTGAAGTT CATCAAGATC ATGAAGCACT 2880 TGCGGAAGCT GAATAACTTC AACTCCTACT TGGCCATCCT CTCTGCCCTG GACTCGGCGC 2940 CCATCCGCAG GCTGGAGTGG CAGAAGCAGA CTTCAGAGGG CCTGGCCGAG TACTGCACAC 3000 TGATCGACAG CTCGTCCTCC TTCCGAGCCT ACCGGGCCGC CCTCTCGGAG GTGGAACCGC 3060 CGTGCATCCC GTACCTGGGG CTGATCCTGC AGGACCTGAC CTTCGTTCAC CTGGGAAACC 3120 CAGACTACAT CGACGGGAAA GTGAACTTCT CCAAGCGGTG GCAGCAGTTC AACATCCTCG 3180 ACAGCATGCG CTGCTTCCAG CAGGCGCACT ATGACATGCG GAGGAACGAC GACATTATAA 3240 ACTTCTTCAA TGACTTCAGT GACCACCTGG CTGAGGAGGC CCTATGGGAA CTGTCTCTGA 3300 AAATTAAACC CAGGAACATA ACAAGGAGAA AAACAGACCG GGAAGAGAAG ACCTAGGAGC 3360 AGACGCCGGG ATCCAGGAGA ATGCTCGAGG GGCGCAGAGG GCAGCTCCCA GACCGGAGAG 3420 GACCTTGGAC CTGTTAGGCG CATGGCAGGA GTCCCGGCCT CGGAGCCATG AGGCTGGCCA 3480 GCCCTCAGCG GGGCCGGGCG GGAGCTGGAG CCTGCCAGCC GCTTCCTGCC TCCTTCCTCT 3540 GTGGGAGCAG ACCCGTGGGC CTCAGGGCAG CCAGCAGGCA GGTCTTGTTG CCAATTTACA 3600 AACCGGTGGT TTTCTGGTTT GGTTTTGTTT TCTGCTTTTA CTTCCATCTC TCCCCTCTTG 3660 ACCTTCCACC CACTCCCCTC CAGGGAGAGA GCAGCAGAGA CCTCATCAGC AGACCAAGGA 3720 AGTGGTGGGT GCTCCCCCTC CCTAAGCTCC AGGGTCCCTG AATCTTCTGA AATCTCAAAT 3780 GAGTGGAGGC CTCCTGGGGT GGCCTGTCCT GCAGGGGCCC TGGAATGGGG GCAAGCAGCT 3840 GGGTGGGCAG AATGCAGAGT AGACTCGGGG GAGGATCCTT TCACTTTCCG CTTCCCCTTC 3900 TGATGCATGG AGGATGGTGT GAGCTTTTCA GCAGGCCCGG AAAGGTACGC AGGTGACGCC 3960 TTAGCAGCCC CGCAGCTGGT GCTCTGCCCC GCGGTACTGG CGCCATCAGG GCCTCCCTTG 4020 CCCGCCTGAG AGCAGCAGCA GTCTCTGTCA TCCCGTCGCC CC 4062 配列番号：２ 配列の長さ：１０７７ 配列の型：アミノ酸 配列の種類：タンパク質 起源 生物名：ホモ サピエンス 細胞の種類：脾臓細胞 配列 Met Asp Thr Asp Ser Gln Arg Ser His Leu Ser Ser Phe Thr Met 5 10 15 Lys Leu Met Asp Lys Phe His Ser Pro Lys Ile Lys Arg Thr Pro 20 25 30 Ser Lys Lys Gly Lys Pro Ala Glu Val Ser Val Lys Ile Pro Glu 35 40 45 Lys Pro Val Asn Lys Glu Ala Thr Asp Arg Phe Leu Pro Glu Gly 50 55 60 Tyr Pro Leu Pro Leu Asp Leu Glu Gln Gln Ala Val Glu Phe Met 65 70 75 Ser Thr Ser Ala Val Ala Ser Arg Ser Gln Arg Gln Lys Asn Leu 80 85 90 Ser Trp Leu Glu Glu Lys Glu Lys Glu Val Val Ser Ala Leu Arg 95 100 105 Tyr Phe Lys Thr Ile Val Asp Lys Met Ala Ile Asp Lys Lys Val 110 115 120 Leu Glu Met Leu Pro Gly Ser Ala Ser Lys Val Leu Glu Ala Ile 125 130 135 Leu Pro Leu Val Gln Asn Asp Pro Arg Ile Gln His Ser Ser Ala 140 145 150 Leu Ser Ser Cys Tyr Ser Arg Val Tyr Gln Ser Leu Ala Asn Leu 155 160 165 Ile Arg Trp Ser Asp Gln Val Met Leu Glu Gly Val Asn Ser Glu 170 175 180 Asp Lys Glu Met Val Thr Thr Val Lys Gly Val Ile Lys Ala Val 185 190 195 Leu Asp Gly Val Lys Glu Leu Val Arg Leu Thr Ile Glu Lys Gln 200 205 210 Gly Arg Pro Ser Pro Thr Ser Pro Val Lys Pro Ser Ser Pro Ala 215 220 225 Ser Lys Pro Asp Gly Pro Ala Glu Leu Pro Leu Thr Asp Arg Glu 230 235 240 Val Glu Ile Leu Asn Lys Thr Thr Gly Met Ser Gln Ser Thr Glu 245 250 255 Leu Leu Pro Asp Ala Thr Asp Glu Glu Val Ala Pro Pro Lys Pro 260 265 270 Pro Leu Pro Gly Ile Arg Val Val Asp Asn Ser Pro Pro Pro Ala 275 280 285 Leu Thr Pro Lys Lys Arg Gln Ser Ala Pro Ser Pro Thr Arg Val 290 295 300 Ala Val Val Ala Pro Met Ser Arg Ala Thr Ser Gly Ser Ser Leu 305 310 315 Pro Val Gly Ile Asn Arg Gln Asp Phe Asp Val Asp Cys Tyr Ala 320 325 330 Gln Arg Arg Leu Ser Gly Gly Ser His Ser Tyr Gly Gly Glu Ser 335 340 345 Pro Arg Leu Ser Pro Cys Ser Ser Ile Asp Lys Leu Ser Lys Ser 350 355 360 Asp Glu Gln Leu Ser Ser Leu Asp Arg Asp Ser Gly Gln Cys Ser 365 370 375 Arg Asn Thr Ser Cys Glu Thr Leu Asp His Tyr Asp Pro Asp Tyr 380 385 390 Glu Phe Leu Gln Gln Asp Leu Ser Asn Ala Asp Gln Ile Pro Gln 395 400 405 Gln Thr Ala Trp Asn Leu Ser Pro Leu Pro Glu Ser Leu Gly Glu 410 415 420 Ser Gly Ser Pro Phe Leu Gly Pro Pro Phe Gln Leu Pro Leu Gly 425 430 435 Gly His Pro Gln Pro Asp Gly Pro Leu Ala Pro Gly Gln Gln Thr 440 445 450 Asp Thr Pro Pro Ala Leu Pro Glu Lys Lys Arg Arg Ser Ala Ala 455 460 465 Ser Gln Thr Ala Asp Gly Ser Gly Cys Arg Val Ser Tyr Glu Arg 470 475 480 His Pro Ser Gln Tyr Asp Asn Ile Ser Gly Glu Asp Leu Gln Ser 485 490 495 Thr Ala Pro Ile Pro Ser Val Pro Tyr Ala Pro Phe Ala Ala Ile 500 505 510 Leu Pro Phe Gln His Gly Gly Ser Ser Ala Pro Val Glu Phe Val 515 520 525 Gly Asp Phe Thr Ala Pro Glu Ser Thr Gly Asp Pro Glu Lys Pro Pro Pro Leu Pro Glu Lys Lys Asn Lys His Met Leu Ala Tyr Met 545 550 555 Gln Leu Leu Glu Asp Tyr Ser Glu Pro Gln Pro Ser Met Phe Tyr 560 565 570 Gln Thr Pro Gln Asn Glu His Ile Ty Gln Gln Lys Asn Lys Leu 575 580 585 Leu Met Glu Val Tyr Gly Phe Ser Asp Ser Phe Ser Gly Val Asp 590 595 600 Ser Val Gln Glu Leu Ala Pro Pro Pro Ala Leu Pro Pro Lys Gln 605 610 615 Arg Gln Leu Glu Pro Pro Ala Gly Lys Asp Gly His Pro Arg Asp 620 625 630 Pro Ser Ala Val Ser Gly Val Pro Gly Lys Asp Ser Arg Asp Gly 635 640 645 Ser Glu Arg Ala Pro Lys Ser Pro Asp Ala Leu Glu Ser Ala Gln 650 655 660 Ser Glu Glu Glu Val Asp Glu Leu Ser Leu Ile Asp His Asn Glu 665 670 675 Ile Met Ser Arg Leu Thr Leu Lys Gln Glu Gly Asp Asp Gly Pro 680 685 690 Asp Val Arg Gly Gly Ser Gly Asp Ile Leu Leu Val His Ala Thr 695 700 705 Glu Thr Asp Arg Lys Asp Leu Val Leu Tyr Cys Glu Ala Phe Leu 710 715 720 Thr Thr Tyr Arg Thr Phe Ile Ser Pro Glu Glu Leu Ile Lys Lys 725 730 735 Leu Gln Tyr Arg Tyr Glu Lys Phe Ser Pro Phe Ala Asp Thr Phe 740 745 750 Lys Lys Arg Val Ser Lys Asn Thr Phe Phe Val Leu Val Arg Val 755 760 765 Val Asp Glu Leu Cys Leu Val Glu Leu Thr Glu Glu Ile Leu Lys 770 775 780 Leu Leu Met Glu Leu Val Phe Arg Leu Val Cys Asn Gly Glu Leu 785 790 795 Ser Leu Ala Arg Val Leu Arg Lys Asn Ile Leu Asp Lys Val Asp 800 805 810 Gln Lys Lys Leu Leu Arg Cys Ala Thr Ser Ser Gln Pro Leu Ala 815 820 825 Ala Arg Gly Val Ala Ala Arg Pro Gly Thr Leu His Asp Phe His 830 835 840 Ser His Glu Ile Ala Glu Gln Leu Thr Leu Leu Asp Ala Glu Leu 845 850 855 Phe Tyr Lys Ile Glu Ile Pro Glu Val Leu Leu Trp Ala Lys Glu 860 865 870 Gln Asn Glu Glu Lys Ser Pro Asn Leu Thr Gln Phe Thr Glu His 875 880 885 Phe Asn Asn Met Ser Tyr Trp Val Arg Ser Ile Ile Met Leu Gln 890 895 900 Glu Lys Ala Gln Asp Arg Glu Arg Leu Leu Leu Lys Phe Ile Lys 905 910 915 Ile Met Lys His Leu Arg Lys Leu Asn Asn Phe Asn Ser Tyr Leu 920 925 930 Ala Ile Leu Ser Ala Leu Asp Ser Ala Pro Ile Arg Arg Leu Glu 935 940 945 Trp Gln Lys Gln Thr Ser Glu Gly Leu Ala Glu Tyr Cys Thr Leu 950 955 960 Ile Asp Ser Ser Ser Ser Phe Arg Ala Tyr Arg Ala Ala Leu Ser Glu Val Glu Pro Pro Cys Ile Pro Tyr Leu Gly Leu Ile Leu Gln 980 985 990 Asp Leu Thr Phe Val His Leu Gly Asn Pro Asp Tyr Ile Asp Gly 995 1000 1005 Lys Val Asn Phe Ser Lys Arg Trp Gln Gln Phe Asn Ile Leu Asp 1010 1015 1020 Ser Met Arg Cys Phe Gln Gln Ala His Tyr Asp Met Arg Arg Asn 1025 1030 1035 Asp Asp Ile Ile Asn Phe Phe Asn Asp Phe Ser Asp His Leu Ala 1040 1045 1050 Glu Glu Ala Leu Trp Glu Leu Ser Leu Lys Ile Lys Pro Arg Asn 1055 1060 1065 Ile Thr Arg Arg Lys Thr Asp Arg Glu Glu Lys Thr 1070 1075

【図面の簡単な説明】

【図１】この発明のクローニングベクターの一実施例で
あるｐＣ３ＧＩの構成図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）

Claims (9)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ｒａｓ蛋白グアニンヌクレオチド交換因
   子であって、配列番号２のアミノ酸配列からなるＣ３Ｇ
   蛋白をコードする遺伝子のｃＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列番号１の塩基配列からなる請求項１
   のｃＤＮＡ。
3. 【請求項３】 請求項１または２のｃＤＮＡを含有する
   クローニングベクター。
4. 【請求項４】 クローニングベクターが、E.ｃｏｌｉＣ
   ３ＧＩ（ＦＥＲＭＰ−１３６５１）の保有するプラスミ
   ドｐＣ３ＧＩである請求項３のクローニングベクター。
5. 【請求項５】 請求項１または２のｃＤＮＡを含有する
   発現ベクター。
6. 【請求項６】 ｃＤＮＡが、請求項３または４のクロー
   ニングベクターより調製されたＤＮＡ断片である請求項
   ５の発現ベクター。
7. 【請求項７】 請求項５または６の発現ベクターを保有
   する大腸菌の形質転換体。
8. 【請求項８】 請求項７の形質転換体により生産される
   蛋白質であって、配列番号２のアミノ酸配列からなるＣ
   ３Ｇ蛋白。
9. 【請求項９】 請求項８のＣ３Ｇ蛋白を抗原として調製
   した抗Ｃ３Ｇ蛋白抗体。