JP2914393B2 - ヒトサイトカイン、インターロイキン―９ - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［技術分野］ 本発明は造血機能、特に造血系において赤芽コロニー
の生長を刺激し及び免疫応答を刺激する事のできる新規
なサイトカイン及び該精製因子を組み換え遺伝子工学法
によって得る方法に関する。

［背景技術］ 近年造血系と免疫系の細胞間に信号を送る多くの調節
タンパク質が同定されている。これらの調節分子はサイ
トカインとして知られている。サイトカインのうちの多
くのものが造血系及び免疫系細胞の成長、生長及び生物
活性を制御することが知られている。これらの調節分子
はコロニー刺激因子（GM−CSF,G−CSF,M−CSF及び多能
性CSF若しくはインターロイキン−３）、インターロイ
キン類（IL−１からIL−10）、インターフェロン類（ア
ルファ、ベータ及びガンマ）腫瘍壊死因子（アルファ及
びベータ）、エリスロポエチン及び白血病阻害因子（LI
F）のすべてを含む。これらサイトカイン類は骨髄、末
梢血液、胎児肝臓及びその他のリンパ球または造血臓器
に由来する標的細胞に広範な生物活性を示す。例えばG.
Wong and S,Clark,Immunology Today、９（５）:137（1
988）を参照されたい。

ある種のサイトカインの生化学的及び生物学的同定と
特性づけは、血液や尿などの天然材料から得られる天然
因子の量が少量であるために妨げられて来た。多くのサ
イトカインが最近になって分子的にクローン化され、異
形的に発現されまた均一に精製されている。［D,Metcal
f,“The Molecular Biology and Functions of the Gra
nulocyto−Macrophage Colony Stimulating Facotrs",B
lood，67（２）:257−267（1986）］ これらのサイトカインにはガンマインターフェロン、
ヒト及びネズミGM−CSF、ヒトＧ−CSF、ヒトCSF−１や
ヒト及びネズミIL−３がある。これらの精製因子のうち
のいくつかは造血系及び免疫系に対してin vivoで調節
効果を示すことが見いだされており、GM−CSF,MIP,M−C
SF,G−CSF,IL−3,IL−2,IL−1,IL−7,IL−6,LIF,TNF,ガ
ンマーインターフェロン及びエリスロポエチンがこれに
含まれる。

近年、P40と命名された新規ネズミＴ細胞成長因子が
J,Van Snickら、J.Exp,Med.,169:363−368（1989）によ
って報告されている。

骨髄または末梢血液前駆細胞から赤血球を生成するこ
とは、培養下ではいくつかの異なる造血成長因子を必要
とする複雑な過程である。赤血球循環過程においてin v
ivoでは主要な調節役を果たすエリスロポエチン（Epo）
が、培養下でもヘモグロビン化を含む赤血球生成の最終
過程に絶対に必要である。赤芽バースト形成細胞（eryt
hroid burst forming units）（BFU−Ｅ）として知られ
る初期赤血球前駆体の成長と生長には、インターロイキ
ン３（IL−３），顆粒球マクロファージコロニー刺激因
子（GM−CSF）、及び少なくともマウス系においてはIL
−４を含むいくつかの異なるサイトカインが必要であ
る。［R,Donahueら、Blood，66:1479（1985）;C.Sieff
ら、Science，230:1171（1985）;Y,Yangら、Cell，47:3
（1986）;S,Emersonら、J,Clin.Invest.,82:1282（198
8）;S,Emersonら、Blood，74:49（1989）;D,Rennick,Pr
oc.Natl.Acad.Sci.,84:6889（1987）（Rennick I）;D,R
ennick,Blood，73:1828（1989）（Rennick II）参照］
しかしながら、これらサイトカインのそれぞれはいくつ
かの異なる造血細胞系統と反応し、そのいずれもが血球
増生をサポートするのに特異的ではない。

従って、造血機能、とりわけ赤血球の生長を促進し、
或いは免疫の反応性を増加することができ、かつ医薬用
途に適したタンパク質をさらに天然源から精製するか、
或いは精製した形で生産する需要が当業界において存在
する。

［発明の開示］ 本発明は一面において、哺乳動物の他のタンパク質と
は本質的に無関係なIL−９と称される新規ヒトサイトカ
インを提供する。この生物活性な新規因子は、下記の表
Ｉで示されるものと同一または本質的に同一なDNA及び
アミノ酸配列の全てまたは一部分を含むことを特徴とす
る。

IL−９はさらに、還元的条件下にドデシル硫酸ポリア
クリルアミドゲル電気泳動法で測定した見かけ分子量が
約20−30kdであるという特徴を有する。本発明のIL−９
因子は造血機能の調節に関与する事を示唆するM07Eアッ
セイにおいて生物活性を示した。末梢血液、帯血液また
は骨髄標的細胞を用いるクローン培養系で試験したとこ
ろ、IL−９とEpoの組み合わせもまた赤血球前駆細胞の
増殖を特異的にサポートする生物活性を示した。従って
IL−９はリンパ球及び造血系の双方において調節物質と
して作用する可能性を有するサイトカインである。IL−
９は比較的初期のBFU−Ｅ群の生長を優先的にサポート
する。更にIL−９単独である種の混合コロニーの生長を
サポートする。これらの培養におけるIL−９の応答性
は、赤血球となる事を決定する前の初期前駆体細胞群を
刺激する役割を示唆している。このIL−９の応答性は少
なくとも赤血球生成の初期段階を通じて選択的に保持さ
れる。

本発明の他の面は、ヒトIL−９ポリペプチドの発現を
コードするDNA配列を含むDNA配列を包含する。これらの
DNA配列の一つは、下記の表Ｉの示される約630塩基ヌク
レオチド配列またはその断片と同一または本質的に同一
である。

更に本発明は、発現制御配列と有機的に関連する、IL
−９をコードするDNA配列を含むベクターを提供する。
組み換えIL−９の製造に用いるかかるベクターによって
形質転換された宿主細胞も本発明によって提供される。

本発明のベクター及び形質転換細胞は、組み換えヒト
IL−９ポリペプチドの新規製造方法にも用いられる。該
製造法ではIL−９をコードするDNA配列で細胞系を形質
転換する。該IL−9DNA配列は上記細胞中において発現制
御配列と作用可能な状態で結合している。形質転換され
た細胞を次いで培養する。本発明で請求する製造法は、
ポリペプチド発現の宿主細胞として多くの公知の細胞を
用いることができる。好ましい細胞系は哺乳動物細胞系
及びバクテリア細胞である。

本発明の他の面は治療的に有効な量のIL−９またはそ
の断片を含む医薬組成物を提供することにある。該医薬
組成物は赤血球欠乏を特徴とする病気や障害の治療法に
用いることができる。また本発明の因子は例えばＴ細胞
欠乏症に用いるなど、免疫系刺激剤として用いることが
できる。

従って、本発明は更に、適当な医薬担体中に保持され
た治療的に有効な量のIL−９またはその活性断片を患者
に投与する事によって、かかる病気、障害、組織損傷な
どを治療する方法を提供する。該治療法は、IL−９ポリ
ペプチドと同時にまたは連続的に、治療的に有効な量の
少なくとも一種の他のサイトカイン、造血素、インター
ロイキン、成長因子または抗体を投与することも含む。

本発明の更に他の面はIL−９に対する抗体である。こ
れらの抗体は、モノクローナル抗体を調整する公知の方
法において、免疫原物質としてIL−９またはその断片を
用いることによって得られる。かかる抗IL−９抗体は診
断薬または治療薬として用いることができる。

本発明の他の画並びに利点は、以下に詳述する実施態
様により明らかであろう。

［発明を実施するための最良の形態］ 本発明は哺乳動物の他のタンパク性物質とは本質的に
無関係な、生物的に活性なヒトリンフォカインIL−９を
提供する。該タンパク質は治療用途に用い得る純粋で活
性なIL−９を大規模に生産し得る組み換えDNA法を含む
様々な方法によって製造できる。

本発明の活性ヒトIL−９は、下記の表Ｉに示すものと
同一または本質的に同一な約144アミノ酸タンパク質配
列によって特徴付けられる。また本発明の組み換えヒト
IL−９は、哺乳動物細胞で発現させるとき、還元的条件
下に行うドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動法（SDS−PAGE）で測定した見かけ分子量が2
0−30kdであるという特徴も有する。この分子量の不均
質は炭化水素鎖の長さにバラツキがあるためで多くの糖
タンパク質に見られる性質である。

表ＩのDNA配列は約630ヌクレオチドを有し、該タンパ
ク質の正規の読み取り枠には約450ヌクレオチドを含
む。IL−９は元々ヒトＴリンパ芽球細胞系であるC5MJ2
［A.G.Learyら、Blood，69（３）:953−956（1987）参
照］のmRNAから調製されたcDNAライブラリーを用いて発
現クローニング法によってクローンした。IL−９はその
他のヒト細胞系を用いても生産できる。

発現クローニング法は既にC.G.Wongら、Science，22
8:810−815（1985）;Y.C.Yangら、Cell，47:3−10（198
6）及びA.E.Namenら、Nature，333:571−573（1988）に
記載されている。簡潔に言えば、発現クローニング法で
は、COS−１細胞のような哺乳動物細胞中でcDNA挿入物
を発現させ得るような発現ベクターpXM中にライブラリ
ーを構築する。ライブラリーのスクリーニングは、cDNA
クローンのプールを用いてCOS−１細胞をトランスフェ
クションさせることによって行う。上澄み液を用いてIL
−９活性を定量することにより、IL−９活性を発現する
cDNAクローンを同定した。

何種類かの細胞系から得たmRNAを用いて、選択したIL
−９のcDNAクローンとのハイブリダイゼーション能力を
試験した。ノザン法により、Ｔ細胞系であるC5MJ2及びC
10MJ2,並びにレクチン刺激したヒト末梢血液リンパ球
（PBL）が、IL−９クローンとハイブリダイゼーション
した容易に検知し得るレベルのmRNAを形成することが明
らかになった。

250、000個のクローンよりなるライブラリーから単離
したポジティブなクローンの配列を決定した。このクロ
ーンから得られるIL−９のcDNA配列は、これによってコ
ードされる約144アミノ酸配列を有しており、以下の表
Ｉに示す。

表ＩのcDNA配列は、ヌクレオチド17−19に位置するAT
Gコドンで始まる、432ヌクレオチドからなる長い読み取
り枠を含む。このATGに続いて143コドンがあり、ヌクレ
オチド449−451の位置にTGAからなる翻訳終止コドンを
有する。432のヌクレオチドは、概算分子量16、000の14
4アミノ酸ポリペプチドをコードする。

多くの分泌タンパク質と同様に、表Ｉに示すIL−９の
DNA配列はＮ−末端に通常の分泌リーダー配列［D.Perlm
anら、J.Mol.Biol.,167:391−409（1983）参照］に似た
疎水性のアミノ酸残基を含む。この強い疎水性配列は、
シグナルペプチドに特有であり、IL−９分泌のメカニズ
ムが典型的な分泌タンパク質のものであることを示唆し
ている。

IL−９のcDNA配列はまたアミノ酸50−52（Asn−Val−
Thr）;63−65（Asn−Cys−Thr）；及び78−80（Asn−Th
r−Thr）の位置で、３つのアスパラギン結合グリコシル
化部位をコードする。［例えば、R.J.Wintler,“The Ch
emistry of Gly−coproteins in Hormonal Proteins an
d Peptides",Vol.1,C.H.Li,ed.Academic Press,New Yor
k,pp.1（1973）参照］IL−９のDNA配列は、14、21、4
5、47、54、56、64、68、104、109及び113のアミノ酸位
置で、11個のシステイン残基をコードする。

本発明のIL−9 cDNAのヌクレオチド配列をGenbankに
記録されたヌクレオチド配列と比較した。IL−９が有意
な配列類似性を有していると信じられる唯一の因子は、
ネズミP40［上記Van Snickら参照］である。従って、本
発明のヒトIL−９は、他の公知のヒト因子やタンパク質
とは免疫学的に異なるものである。IL−９因子はまた免
疫的に異なるネズミ因子P40とも十分に異なるものであ
るる。

本発明のcDNA配列は、哺乳動物細胞によって生産され
る機能性ポリペプチドを検知することによって、生物的
に活性なヒトIL−９をコードする。プラスミドpC5.22−
３にクローンされた配列は、American type Culture Co
llecton,12301 Parklawn Drive,Rockville,Marylandに1
989年５月23日、ATCC Accession No.67988の寄託番号で
寄託された。この寄託は、特許手続きのための微生物の
寄託の国際協定に基づくブダペスト条約の規定及び規則
に従って行われた。

上述したIL−９因子をコードする表Ｉに記載のDNA配
列の対立遺伝子変異体は、それらの類似体及び誘導体と
共に本発明に含まれる。従って、本発明はまた他の霊長
類タンパク質をコードするDNA配列とは無関係でかつ、I
L−９ポリペプチドの発現をコードする、これらの新規D
NA配列をも包含する。これらのDNA配列は、緊縮ハイブ
リダイゼーション条件下に［T.Maniatisら，Mo-lecular
Cloning(A Laboratory Manual),Cold Spring Horbor L
aboratory （1982）,pp387−389参照］表ＩのDNA配列に
ハイブリダイゼーションするような配列も含む。かかる
緊縮ハイブリダイゼーション条件の一例としては、4XSS
C中、65℃でハイブリダイゼーションを行い、次いで0.1
XSSC中、65℃で30分間洗浄する。緊縮ハイブリダイゼー
ション条件の他の一例は、50％ホルムアミド、4XSSC
中、42℃である。

弛緩ハイブリダイゼーション条件下にIL−９に対する
配列とハイブリダイゼーションし、かつIL−９の生物学
的特質を有するIL−９ペプチドの発現をコードするDNA
配列は、ネズミP40のDNA配列以外に、新規IL−９ポリペ
プチドをもコードする。かかる非緊縮ハイブリダイゼー
ション条件の例としては、4XSSC,50℃で行うか、30−40
％ホルムアミドを用いて42℃でハイブリダイゼーション
を行う。例えば、IL−９の配列と有意にホモロジーな領
域（例えば、グリコシル化またはジスルフィド結合部
位）を共有し、かつIL−９の生物学的特質の一つまたは
それ以上を有するタンパク質をコードするDNA配列は、
たとえこのようなDNA配列が表ＩのIL−９配列と緊縮的
にハイブリダイゼーションしなくてもIL−９ポリペプチ
ドをコードする。

同様に、IL−９ポリペプチドをコードするけれども、
遺伝暗号の縮重や対立遺伝子変異（アミノ酸の変化を伴
ったり、伴わなかったりする天然に起こる塩基変化）の
ためにコドン配列が異なっているDNA配列もまた本発明
に包含される。点変異または活性を増すために行う修飾
によって起きるDNA配列中の変異、ハーフライフまたは
それによってコードされるポリペプチドの生産も本発明
に含まれる。

IL−９ポリペプチドはまた公知の化学的合成法によっ
ても生産することができる。本発明のポリペプチドを合
成法によって製造する方法は当業者に公知である。合成
的に製造されたIL−９ポリペプチド配列は、IL−９ポリ
ペプチドと同じ一次、二次、三次構造とコンホーメイシ
ョンとをとることによって、IL−９と共通な生物学的特
質を有するとができる。従って、これを治療及び免疫学
的過程において、天然の精製IL−９ポリペプチドの生物
学的に活性な或いは免疫学的な代替物として用いること
ができる。

本発明で提供されるIL−９ポリペプチドは、精製組み
換えIL−９の配列と似てはいるが、その修飾が自然に起
こったり或いは人為的になされて得られる配列によって
コードされる因子をも含む。

ペプチドまたはDNA配列への修飾は当業者により公知
の手法でなされる。IL−９配列における興味ある修飾
は、コードする配列中で選ばれたアミノ酸残基の置換、
挿入或いは削除を含む。例えば、一個またはそれ以上の
システイン残基を削除または他のアミノ酸で置換するこ
とによって分子のコンホーメイションを変えることがで
きる。かかる置換、挿入または削除のための突然変異誘
導技術は当業者に公知である。［例えば米国特許第4,51
8,584号参照］ 本発明のIL−９ポリペプチド配列の他の特異的な突然
変異は、グリコシル化部位の修飾を含む。グリコシル化
の欠如または部分的グリコシル化は、アスパラギン−結
合グリコシル化認識部位或いはＯ−結合炭化水素の付加
によって修飾された分子のいずれかの部位におけるアミ
ノ酸の置換または削除に由来するものである。アスパラ
ギン−結合グリコシル化認識部位は、適当な細胞グリコ
シル化酵素によって特異的に認識されるトリペプチド配
列からなる。ここで言うトリペプチドとは、アスパラギ
ン−Ｘ−スレオニン，またはアスパラギン−Ｘ−セリン
（式中、Ｘは通常いかなるアミノ酸でもよい）のいずれ
かである。グリコシル化認識部位における第一または第
三アミノ酸部分の一方または両方における各種アミノ酸
の置換または削除（及び／または第二部分のアミノ酸削
除）は、修飾トリペプチド配列における非グリコシル化
をもたらす。かかる変則的ヌクレオチド配列を発現させ
ると、該当部位でグリコシル化されていない変異体を生
じる。

IL−９活性を全てまたは部分的に保持すると期待され
るIL−９配列のその他の同類体並びに誘導体も、本明細
書に記載の当業者に公知の技術により容易に製造され
る。かかる修飾の一例としては、存在するリジン残基上
にポリエチレングリコール（PEG）を付着するか、或い
はPEG分子の付着のために配列中にリジン残基を挿入す
ることが挙げられる。かかる修飾も本発明に包含され
る。

本発明はまたIL−９ポリペプチドを製造する方法を提
供する。本発明の方法は、公知の調節配列の制御のもと
に、IL−９ポリペプチドの発現をコードするDNA配列ま
たはその活性断片であらかじめ形質転換しておいた、適
当な細胞または細胞系を培養することを含む。調節配列
は、プロモーター断片、ターミネイター断片及び適当な
宿主細胞中で本タンパク質の発現を指示する他の適当な
配列を含む。適当な細胞または細胞系とは、チャイニー
ズハムスター卵巣細胞（CHO）や3T3細胞のような哺乳動
物細胞であり得る。適当な哺乳動物宿主細胞の選択、及
び形質転換、培養、増幅、スクリーニング、製品製造や
精製の方法は当業者に公知である。［例えば、Gething
and Sambrook,Nature，293:620−625（1981）またはKau
fmanら、Mol.Cell.Biol.,５（７）:1750−1759（1985）
またはHowleyら、U.S.Pattent4,419,446号参照］その他
の適当な哺乳動物細胞系はサルCOS−１細胞系及びCV−
１細胞系である。IL−９因子の発現には、該分子の折り
畳み度が大きくなる可能性を高めるシステイン残基数の
ために、哺乳動物細胞が好ましい。

バクテリア細胞も本発明の宿主細胞として用い得る
が、哺乳動物細胞とバクテリア細胞中における上記因子
の発現に由来するグリコシル化に差があるために、バク
テリア細胞中に生産される分子が折り畳まれていない状
態か、或いは部分的にのみ、または変則的に折り畳まれ
た状態で活性を保持できる場合に限る。別法としては、
完全に変成したIL−９タンパク質を再生し、次いで天然
タンパク質の生物活性を保持するか、或いはその活性に
似たものを持たせる為に、該再生したIL−９分子を天然
分子に十分似たものとするための酸化を行う。例えば、
生物工学の分野においては各種の大腸菌（HB101,MC1061
及び以下の実施例で使用する菌株等）が宿主細胞として
よく知られている。B.subtilis，Pseudomonasの各種菌
株及びその他のバチルス菌などもこの方法に用い得る。

当業者に公知な各種の酵母細胞も本発明のポリペプチ
ド発現用宿主として用い得る。更に、望む場合には、昆
虫細胞を本発明による方法の宿主細胞として用い得る。
Millerら、Genetic Engineering，８:277−298（Plenus
Press）及びそこに引用される文献を参照されたい。

本発明はまた、新規IL−９ポリペプチドの発現方法に
使用するベクターも提供する。これらのベクターは本発
明のIL−９ポリペプチドをコードする新規IL−9 DNA配
列を含む。IL−９の先端を切った断片或いは変性断片、
その対立遺伝子変異体、または上記した修飾配列も本発
明の実施態様であり、IL−９ポリペプチドの生産に用い
得る。該方法に使用するベクターは、本発明のDNAコー
ディング配列と作用可能に結合しており、かつ選択した
宿主細胞中でその複製と発現を指示しうる選択さた調節
配列をも有している。COS細胞中でIL−９を良好に発現
し、以下の実施例に記載されるベクターはpXMである。
［Y.C.Yangら、Cell，47:3−10（1986）参照］CHO細胞
中でIL−９を良好に発現し、以下の実施例に記載される
ベクターはpEMC2B1である。

かくして細胞源から均一に精製されるか、或いは組み
換え法または合成法で生産されたIL−９は、造血系また
は免疫系の機能を調節するための医薬製剤または調剤と
して用い得る。特にIL−９は血球増生を調節する。従っ
てIL−９は赤血球欠乏を特徴とする病状の治療に有用で
ある。赤血球細胞刺激剤として、手術前の患者に血液組
成を改善する目的でIL−９を投与するとよい。IL−９
は、赤芽球前駆体の生産を刺激するために化学療法と組
み合わせて用いることができる。例えば、IL−９は胎児
ヘモグロビンを発現させる赤血球増加をもたらすことか
ら、ベータサラセミアや鎌状赤血球貧血の治療に単独で
または他の治療剤と組み合わせて用いることができる。
IL−９は輸血や骨髄移植後の血球増生細胞欠乏症に付属
物として用いることができる。IL−９は組織損傷を修復
し、傷の治癒を促進し、或いは宿主防御力を一般的に高
めるためにも用いることができる。

宿主防御力を高めるという有用性においては、IL−９
は病気、放射線被曝または医薬に由来する各種病状、及
び例えば白血球減少症、AIDSのようなバクテリアやウイ
ルス感染症、貧血、免疫細胞欠乏症を含むＢ細胞または
Ｔ細胞欠乏症の治療に用いることができる。IL−９ポリ
ペプチド組成物を用いる傷や病気の治療は、現在使用さ
れている医薬の治療によって引き起こされる好ましくな
い副作用を避けることがきる。本発明のポリペプチド
は、単独でまたは他の医薬、サイトカイン類、造血素、
インターロイキン、成長因子または抗体と組み合わせて
傷または病気の治療に用いることができる。

該新規ポリペプチドまたはその活性断片の他の用途と
しては、モノクローナル及びポリクローナル抗体の生産
にある。IL−9,その断片またはその修飾体または対立遺
伝子変異体を抗原として用いることにより、上記抗体を
生産することができる。当業者に公知な抗体生産の標準
的手法を用いることにより、診断薬または治療薬として
有用なポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を生
産することができる。

従って、本発明の更に他の一面は、上述したような状
態の治療または診断のための治療組成物及び診断組成
物、及びそれらの使用方法である。

かかる組成物は、本発明の治療的に有効な量のIL−９
ポリペプチド、その断片または修飾体と、医薬的に受容
しうる担体とを混合してなる。この組成物は規則的に非
経口投与される。またはこの組成物を静脈投与してもよ
い。希望するならば、該組成物を皮下投与してもよい。
規則的に投与するならば、本発明の実用的治療組成物は
発熱物質を含まない、非経口的に受容しうる水溶液であ
る。組織修復用には、IL−９因子を局所投与に適した製
剤形で用いる。かかる医薬的に受容しうるタンパク質溶
液または製剤の調製は、pH、等張性、安定性などを考慮
に入れて、当業者の知るところである。

上記した状態の治療法に用いる用量は、医薬活性を変
化させる各種要因、例えば患者の病状、体重、性別及び
食事、感染症の重篤度、投与時間及びその他の医学的要
因を考慮に入れて、主治医によって決定される。一般的
には、一日の投与量は、体重1kg当たり１−1000マイク
ログラムのポリペプチド、または、50−5000ユニットの
ポリペプチド（1ml当たり１ユニットのポリペプチド
は、以下に述べるM07Eにおける最大効果の半量をもたら
す）である。

本発明の治療法及び組成物は、他のヒト因子との同時
投与も含む。IL−９との同時投与で特に好ましい因子
は、他の造血過程よりもむしろ赤血球に選択的に作用す
るエリスロポエチンである。かかる目的に使用されるサ
イトカインまたは造血剤の他の例としては、IL−1,IL−
2,IL−3,IL−4,IL−6,IL−7,GM−CSF,G−CSF,M−CSF,MI
F,Meg−CSF、CSF−１及びインターフェロン類の既知因
子が挙げられる。Ｂ細胞成長因子のような成長因子、Ｂ
細胞分化因子、または好酸球分化因子もIL−９との同時
投与に有用であるだろう。上記した投与量は、治療用組
成物中のかかる付加的成分によって調整する。治療した
患者の経過は定法で追跡する。

以下の実施例は、ヒトIL−９のクローニング、発現及
び生産並びに本発明の方法及び生産性を記載するもので
ある。これら実施例は本発明の範囲を何ら制限するもの
ではない。

実施例1:mRNAの単離とcDNAライブラリーの構築 ヒトＴリンパ芽球細胞系C5MJ2をRNA抽出源として選択
した。HTLVIで形質転換されたこのＴ細胞は元々、菌状
息肉症（mycosis fun−goides）と診断された患者から
採取した。前述したLearyらの文献に記載の方法により
細胞を培養した。あらかじめ0.1％フィトヘマグルチニ
ン（PHA）と5ng/mlのフォルボール12−ミリステート13
−アセテート（PMA）で24時間刺激しておいたC5MJ2細胞
から、全RNAをChirgwinら、Biochemistry，18:5294−52
99（1979）に記載の方法により抽出した。

オリゴ（dT）−セルロースクロマトグラフィー［H.Av
ivら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，69:1408−1412（197
2）参照］によりmRNAを調製した。上記Wongらの文献に
記載してあるように、５μｇのmRNAを用いて二重鎖cDNA
を合成し、第二鎖反応にはDNAポリメラーゼＩとRNase H
を用いた［上記Maniatisら参照］。この二重鎖DNAをブ
ラントし、合成セミーNhoアダプターに連結した［Yang
ら、Cell，47:3−10（1986）参照］。

COS−１細胞発現用ベクターpXM（上記Y.C.Yangら参
照）をユニークXho部位でリニアライズし、アダプトし
た後、セミーXhoアダプトしたcDNAに連結した。この連
結反応は、コンピテントな大腸菌HB101株（上記Y.C.Yan
gら参照）を形質転換して、約250,000のアンピシリン耐
性コロニーのライブラリーを得るために行った。

実施例2:DNA調製とCOS−１細胞トランスフェクション 上記のG.G.Wongらの文献に記載の発現クローニング系
を用いて、IL−９活性をコードするcDNAを以下のように
単離した。上記のcDNAライブラリーから得たバクテリア
コロニーをニトロセルロースフィルター上に複製した。
各フィルターからのコロニーをＬ−ブロス中にはがし取
り、前述の方法［J.A.Meyerら、J.Bacteriｏl.,127:152
9−1536（1976）参照］のよってプラスミドDNAを単離し
た。各プライマリーDNAサンプルは、200−500個のコロ
ニーのプールから調製した。

各プラスミドDNAの５μｇを用いて、0.1mMクロロキン
処理を加えて、DEAE−デキストラン−仲介DNAトランス
フェクションによってCOS−１細胞をトランスフェクシ
ョンした［L.M.Sompayracら、Proc.Natl.Acad.Sci.US
A，78:7575−7578（1981）及びH.Luthmanら、Nucl.Acid
s Res.,11:1295−1308（1983）参照］。トランスフェク
ションの72時間後にトランスフェクションされたCOS−
１細胞から培養上澄み液を回収し、実施例６に記載のM0
7Eアッセイによって、IL−９活性を測定した。

ポジティブなプールから得たプラスミドDNAをCOS−１
細胞に再度トランスフェクションして、トランスフェク
ションした上澄みのIL−９活性を再度測定した。次いで
このサンプルをより少数のクローンに分けていき、個々
のクローンを単離した。プライマリープールで最初にCO
S−１細胞をトランスフェクションして得られる550の上
澄みのうち、最良の総体的IL−９活性を示す一個のサン
プルを得た。

最高のIL−９活性を有するプールを選択し、より少数
のクローンを保持するように株分けし、そのDNAを調製
し、トランスフェクションし、トランスフェクションし
た上澄みのIL−９活性を測定して、IL−９活性を示すシ
ングルクローンを得た。常に最高のIL−９活性を示した
クローンを用いて、実施例６に記載のM07E法で再度測定
した。このクローンのIL−９活性を他のサイトカイン
（IL−3,GM−CSF,IL−１α,IL−１β,IL−6,LIF,リンフ
ォトキシン及びIL−４）と比較した。

実施例3:タンパク質分析 pC5.22−３のcDNAによってコードされるポリペプチド
をパルス標識法により同定した。クロロキン処理48時間
後に、IL−９ポジティブなクローンの組み換えDNAでト
ランスフェクションされたCOS−１細胞から得られる培
養上澄みを除去して、細胞を0.5mCiの［35S］メチオニ
ンを用いて、0.5ml DMEM中、37℃、４時間でパルス標識
した。ラベルした上澄みを回収して、12％SDS−PAGE
［U.K.Laemmli,Nature，227:680−685（1970）］に付し
た。電気泳動後、ゲルをフルオログラフィー感度上昇剤
（Enhance;New England Nuclear,Boston,MA）に浸し、
乾燥してＸ線フィルムに露出した。

pC5.22−3 DNAでトランスフェクションしたCOS−１細
胞から分泌されたタンパク質の分析により、モックでト
ランスフェクションした対照群には見られない、20−30
kdのポリペプチドの存在が明らかとなった。

実施例4:RNAブロット分析 PHA/PMA刺激したか、或いは刺激しないC5MJ2細胞、C1
0MJ2,PHA/PMA刺激したヒトPBLからのmRNA各５μｇを、
2.2Mホルムアルデヒドを含む1.2％アガロースゲルを用
いて電気泳動を行った［H.Lehrachら、Biochemistry，1
6:4743（1977）参照］。ホルムアルデヒド変成したRNA
をE.M.Southern,J.Mol.Biol.,98:503−517（19775）に
記載の方法で、ナイロンフィルター（Zetabind;Cuno,Me
riden,CT）に転写した。

ベクターからのcDNA挿入物をXhoI制限酵素で切断し、
DNAポリメラーゼＩの大断片の存在下にランダムオリゴ
ヌクレオチドをプライマーとして用いて該挿入物を³²P
でラベルすることにより、cDNAプローブを作成した［A.
P.Feinbergら，Analy.Biochemistry，132:6−13（198
3）参照］。ナイロンフィルターを65℃、４時間でプレ
ハイブリダイゼーションし、次いで4 X SSC,0.5％SDS,5
Xデンハルト溶液及び100μg/mlの変性サケ精子DNAから
なるハイブリダイゼーション溶液中、65℃、16時間、³²
P−ラベルしたcDNAとハイブリダイゼーションを行っ
た。

ハイブリダイゼーション後、フィルターを2 X SSC/0.
1％SDSで65℃、30分、２回洗浄し、次に0.2 X SSC/0/1
％SDSで65℃、30分洗浄した。次にフィルターを乾燥
し、Ｘ線フィルムに付した。

このRNAブロット分析により、Ｔ細胞系、C5MJ2及びC1
0MJ2並びにレクチン刺激したヒトPBLは、IL−９クロー
ンとハイブリダイゼーションした、容易に検知できるレ
ベルの0.8kbのmRNAを合成した。

実施例5:DNA配列分析 pC5.22−３のcDNAクローンのヌクレオチド配列を上記
G.G.Wongら及びY.C.Yangらのが記載するように、Bal 31
ヌクレアーゼ消化により重複断片セットを作り、M13ベ
クターにサブクローニングすることによって決定した
［M.Ponczら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79:4298−4302
（1982）及びJ.Messingら、Gene，19:269−276（1982）
参照］。一本鎖DNAを調製し、ヌクレオチド配列をジデ
オキシヌクレオチド鎖末端法により決定した［F.Sanger
ら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74:5463−5467（197
7）］。

実施例6:IL−９のM07E細胞アッセイ 急性巨核球白血病の幼児の末梢血液からM07E細胞系を
得た［G.C.Avanziら、Brit.J.Haemetol．69:359−366
（1988）］。M07E細胞の成長は、培地中にGM−CSFまた
はIL3が存在するか否かによる。

M07E細胞を約８ユニット/mlの濃度の組み換えヒトIL
−３存在下に成長させる。基本的にアッセイは以下の方
法によった:2−４日後にM07E細胞を培地から除去し、一
回洗浄し、カウントしておく。

アッセイすべき試料を含む100ulの培地［熱不活性化
ウシ胎児血清（HIFCS）／ペンストレップ（PS）及びグ
ルタミン入りダルベッコ改変イーグル培地（DME）］を
マイクロタイタープレートの各ウェルに入れる。このよ
うに調製した細胞を遠沈し、10％HIFCS/DME＋PS＋グル
タミン中に１−2 x 10⁵細胞/mlの濃度で再懸濁した。各
ウェルに100μｌの細胞を入れて、抗ヒトGM−CSFまたは
抗IL−６抗体の存在下または不存在下に、10％CO₂中、3
7℃、72時間、サンプルとインキュベーションした。そ
の後、0.5uCiの3^H−チミジンを各ウェルに加え、ウェル
を37℃、４時間インキュベーションした。自動細胞回収
器を用いて、細胞をGFCタイプＣフィルターペーパー（L
KB）上に回収し、エタノールで洗滌し、乾燥した。シン
チレーション液にフィルターを浸し、³Hの取り込みをカ
ウントした。

C5MJ2細胞から調製した培地はM07Eアッセイにおい
て、公知のサイトカインによってこの細胞に生産される
と考えられるよりも高レベルの刺激を示した。これはC5
MJ2細胞上澄みと抗GM−CSF,抗IL−3,抗IL−６抗体とを
用いて確認した。本実験における残余取り込みは、新規
“IL−9"の存在を示唆し、該因子の発現クローニングの
ためのバイオアッセイを提供した。

チミジン取り込み実験に基づき、IL−９タンパク質は
白血病幼若細胞の増殖を刺激する点において、本アッセ
イで活性である。この活性は、本アッセイにおいて同じ
く活性である公知リンフォカインに対する抗体にさらす
ことによっても消えないので、IL−９は公知因子の誘発
を介して作用するのではなく、マイトジェンとして細胞
に直接作用することを示唆している。

実施例7:組み換えヒトIL−９の発現 IL−９を製造するには、これをコードするcDNAを適当
な発現ベクターに挿入する。発現ベクターは哺乳動物、
昆虫、酵母、菌、バクテリアなどのための多くの種類が
標準的分子生物学手法において、当業者に公知である。

哺乳動物細胞用ベクターとしてpXMが挙げられる［Y.
C.Yang,Cell，47:3−10（1986）］このベクターはSV40
複製オリジン及びエンハンサー、アデノウィルス主要後
期プロモーター、アデノウィルス３分節系リーダー配列
のcDNAコピー、小ハイブリッド介在配列、SV40ポリアデ
ニル化シグナル及びアデノウィルスVA I遺伝子を有して
おり、哺乳動物細胞中で所望するcDNAの高レベルでの発
現を指示するように配置されている［例えば、Kaufman,
Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:689−693（1985）］。pXM
ベクターをエンドヌクレアーゼXhoIでリニアライズし、
次いであらかじめ合成オリゴヌクレオチド（これは発現
ベクター用XhoI相補的末端を作るためである）を添加し
て改変しておいたIL−９をコードするcDNAと、各等モル
量で連結した。

哺乳動物発現用の他のベクターはpEMC2B1である。こ
のベクターはAmerican Type Culture Collection（ATC
C）,Rockville,MD（USA）にATCC寄託番号40348で寄託し
てあるpMT2pcから作成することができる。プラスミドを
PstIで消化してDNAをリニアライズする。次にT₄DNAポリ
メラーゼでDNAをブラントする。次にこのDNAにオリゴヌ
クレオチド５′TGCAGGCGAGCCTGAATTCCTCGA3′を連結
し、５′末端にPstI部位を再度作り、DHFR cNDAのATGの
前にEcoRI部位及びXhoI部位を付加する。このプラスミ
ドをpMT21と呼ぶ。pMT21をEcoRI及びXhoIで切断し、近
くに２つのクローニング部位を有するプラスミドを得
る。制限酵素EcoRI及びTaqαＩを用いてpMT₂ECAT₁［S.
K.Jongら、J.Virol.，63:1651−1660（1989）］から508
塩基対のEMCV断片を切り出す。ATGまでのEMCV配列を複
写するために、68ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオ
チド対を合成した。ATGをATTに変えて、Ｃを付け加え、
３′末端にXhoI部位を作成した。TaqαＩ部位は５′末
端にある。オリゴヌクレオチドの配列は、５′CGAGGTTA
AAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAA
ACACGATTGC3′及びその相補鎖である。

pMT21 EcoRI−to−XhoI断片を、EMCV EcoRI−to−Taq
αＩ断片及びTaqαI/XhoIオリゴヌクレオチドに連結し
てベクターpEMC2B1を得た。このベクターは、SV40複製
オリジン及びエンハンサー、アデノウィルス主要後期プ
ロモーター、アデノウィルス３分節系リーダー配列主要
部のcDNAコピー、小ハイブリッド介在配列、SV40ポリア
デニル化シグナル及びアデノウィルスVA I遺伝子、DHFR
及びβ−ラクタマーゼマーカー、並びにEMC配列を有し
ており、哺乳動物細胞中で所望するcDNAの高レベルでの
発現を指示するように配置されている。EMC2B1ベクター
をエンドヌクレアーゼEcoRIでリニアライズし、次いで
あらかじめ合成オリゴヌクレオチド（これは発現ベクタ
ー用EcoRI相補的末端を作るためである）を添加して改
変しておいた。IL−９をコードするcDNAと、各等モル量
で連結した。かくして得られた構築物は、適当なベクタ
ーを有する各種宿主中で発現させることができる。

a.哺乳動物発現系 以下に述べるアッセイに用いるIL−９タンパク質の発
現を得るために、IL−９用のcDNAを含むpXM構築物を実
施例５に記載の方法でCOS細胞にトランスフェクション
する。同様にIL−９用のcDNAを含むpEMC−2B1構築物をC
HO細胞にトランスフェクションする（実施例８参照）。
トランスフェクションしたCOS細胞から得る調整培地
は、M07Eアッセイで測定すると、IL−９生物活性を有し
ている。

ここに記載の哺乳動物細胞発現ベクターは、当業者に
公知の方法で合成することもできる。レプリコン、選択
遺伝子、エンハンサー、プロモーターなどのベクター成
分は、公知の手段により天然材料から得るか、或いは合
成することができる。Kaufmanら、J.Mol.Biol.,159:511
−521（1982）及びKaufmen,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，
82:689−693（1985）参照。哺乳動物宿主細胞として
は、特に霊長類細胞系及びげっし類細胞系が、形質転換
細胞系も含めて例示される。正常２倍体細胞、１次組織
のin vitro培養に由来する細胞株及び１次外植片も適当
である。候補となる細胞は、選択遺伝子が優勢に作用す
る限り、選択遺伝子が遺伝子型的に欠失している必要は
ない。ベクターDNAの安定な組み込みと、それに続く組
み込まれたベクターの増幅のためには、伝統的手法によ
りCHO細胞が用いられうる。若しくは、ベクターDNAはウ
シパピローマウィルスゲノムの全てまたは一部分を含ん
でいてもよく、安定なエピソーム要素としてのC127マウ
ス細胞のような細胞系中で実施することもできる。その
他の適当な哺乳動物細胞系は、HeLa,COS−１サル細胞、
マウスＬ−929細胞、Swiss,Balb−ｃまたはNIHマウスに
由来する3T3系、BHKまたはHaKハムスター細胞系を含む
が、必ずしもこれに限定されるものではない。

次いで標準的免疫的、生物的または酵素的アッセイに
よって生産物の発現を測定する。IL−９ポリペプチドを
コードするDNA及びRNAの存在は、サザンブロッティング
及びRNAブロッティングのような標準的手法で検出し
た。COS−１サル細胞のような適当な宿主細胞中に発現
ベクターDNAを導入した後数日間における該ポリペプチ
ドをコードするDNAの一時的発現は、培地中のタンパク
質の活性または免疫アッセイを無差別に測定する。当業
者であれば、pXMベクターに比較しうる他の哺乳動物発
現ベクターを構築することも可能である。例えば、適当
な酵素でプラスミドからのIL−9 DNA配列を挿入した
り、公知の組み換え遺伝子工学手法やpJL3,pJL4［Gough
ら、EMBO J.，４:645−653（1985）］及びpMT2［ATCC＃
67122のpMT2−VWFより得る。PCT/US87/00033参照］のよ
うな公知のベクターを用いることにより行う。IL−９を
含むベクターを適当な宿主細胞に形質転換すると、IL−
９ポリペプチドの発現が得られる。

b.バクテリア発現系 同様に当業者であれば、コーディング配列外の哺乳動
物調節配列を除去し、代わりにバクテリア調節配列を挿
入することによって、IL−９をコードする配列を操作
し、バクテリア細胞による本発明のIL−９を細胞内また
は細胞外で発現させるためのバクテリアベクターを構築
することができる。公知の方法によりバクテリアの発現
を改良するために、IL−９をコードするDNAを更に修飾
して異なるコドンを持たせることもできる。公知手法に
より、成熟IL−９をコードする配列は、成熟IL−９ポリ
ペプチドのバクテリアでの発現、分泌、プロセッシング
を可能にする分泌リーダーポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列と枠内で作用可能な状態で結合している
ことが好ましい。かかる分泌系を用いる大腸菌でIL−９
を発現させると、活性ポリペプチドを分泌させることに
なる。若しくは、もしも細胞内発現が変性または不活性
ポリペプチドをもたらす場合には、このバクテリア種に
活性IL−９を得るための標準的なタンパク質再生法を施
す。

いずれのバクテリア宿主を用いるにしろ、これによっ
て発現される化合物を回収し、精製し、及び／または生
理化学的、生物化学的及び／または臨床的特質を公知の
方法により決定する。

c.昆虫または酵母細胞発現系 昆虫細胞中でIL−９ポリペプチドを発現させるための
昆虫ベクターの構築は、同様の操作によって行われる
［例えば、ヨーロッパ特許出願第155,476号参照］。

同様に、細胞外に活性IL−９を分泌させるためには、
IL−９をコードするcDNAを酵母細胞中で発現させるため
の酵母調節配列を用いて酵母ベクターを構築する［例え
ば、公開されたPCT出願WO 86/00639及びヨーロッパ特許
出願EP 123,289参照］。

実施例8:高レベルのIL−９を発現するためのCHO細胞系
の構築 本発明のIL−９タンパク質を高レベルで哺乳動物から
得る為の一方法は、IL−９をコードするcDNAの多重（mu
ltiple）コピーを含む細胞を構築することである。

cDNAは、増幅し得るマーカー（例えば、順次増加する
濃度のメトトレキセート（MTX）を含む細胞用のDHFR遺
伝子）と同時トランスフェクションさせる。［前出Kauf
man and Sharp,J.Mol.Biol.,（1982）参照］この方法は
多くの型の細胞に用いることができる。若しくは、IL−
9 cDNAと薬剤耐性選択遺伝子（DHFRなど）とを同じベク
ターに導入することもできる。この方法に好ましいベク
ターはpEMC2B1である。

例えば、IL−９遺伝子とその発現を可能にする他のプ
ラスミド配列とを有するpEMC2B1ベクターを、原形質融
合及びトランスフェクションによってDHFR−欠乏CHO細
胞、DUKX−BII中に導入する。IL−９がpEMC2B1に導入さ
れると、IL−９遺伝子及びDHFRマーカー遺伝子はいずれ
も効率よく発現される。DHFR発現形質転換体は、透析ウ
シ胎児血清を含むアルファ培地中で生育させるために選
択される。形質転換体は、生物アッセイ、免疫アッセイ
またはRNAブロッティングによってIL−９の発現をチェ
ックし、ポジティブなプールを選択して、順次増加する
濃度のMTX（0.02,0.2,1.0及び5uMの一連の濃度）中での
培養により増幅する［Kaufmanら、Mol.Cell.Biol.,５:1
750（1983）参照］。増幅された系をクローンし、IL−
９タンパク質の発現をIL−９アッセイにより追跡する。
IL−９発現は、MTX耐性のレベルが増加するにつれて増
加すると期待される。

上記のいずれの発現系においても、得られる細胞系を
適当な薬剤の選択によって更に増幅することができる
し、得られる細胞系を再クローン化して、本明細書に記
載のIL−９アッセイを用いて発現レベルを評価すること
もできる。

実施例9:末梢血液前駆体を用いるコロニー生成に対する
IL−９の効果 造血系の前駆体細胞に対するIL−９の効果を評価する
ために、以下のようなクローンアッセイを行った。

a.サイトカイン及び抗体の調製 組み換えヒトGM−CSF,IL−3,IL−6,顆粒球コロニー刺
激因子（Ｇ−CSF）及びエリスロポエチン（Epo）はいず
れも精製タンパク質であり、各々8.7x10⁶,3.9x10⁶,1x10
⁶,2.0x10⁶及び1.5x10⁵unit/mgタンパク質の特異活性を
有している。最終濃度2U/mlで用いたEpoを除いて、上記
タンパク質は10ng/mlの最終濃度で培養に用いた。IL−
4,IL−9,白血病阻害因子（LIF）及びIL−１αは、適当
なcDNAでトランスフェクションしたCOS−１細胞からの
調整培地を用いた。このトランスフェクションした上澄
みは、各々1.3x10⁴,6x10³,1x10⁵,1.5x10³のハーフマク
シマム活性を有していた。IL−１αは培養中、5U/mlの
濃度を用いた。その他のトランスフェクション上澄み
は、1:100の最終希釈度で用いた。

リンパ球や単球の混入による内在的（endogenous）GM
−CSFを除くために、対GM−CSF用ヒツジヘテロ抗血清
（Genetics institute,Cambridge,MA）を1:100の最終希
釈度で培養に直接加えた。この抗体濃度は本アッセイ系
において、90Uを完全に除くことができる。

b.細胞調製−末梢血液 健康なドナーの血小板フェレーシス（pleteletpheres
is）からの副産物として残余白血球をFenwal CS−3000
血液分離器を用いて得た。この残余白血球の単核細胞を
用いて、Mentzerら、Cell Immunol.,101:101（1986）に
記載の方法により調製した冷たい集合単球から末梢血由
来の前駆体を単離した。集合細胞を穏やかに破砕し、こ
れを37℃、45分で鉄粒子（Lymphocyte Separator Reage
nt,Technicon,Tarrytown,NY）を取り込むように放置し
た後、磁気粒子濃縮器（Dynal,Great Neck,NY）で磁気
的に単球を除去した。混入した単球を更に除去するため
に、残る細胞を１−２時間プラスティックディッシュに
付着させておく。この細胞を１−2x10⁴個/mlの細胞密度
で通常のクローン培養した。この条件下では、IL−９と
エリスロポエチン中にプレートする場合、細胞調製物は
典型的には10⁵個細胞当たり118のBFU−Ｅコロニー形成
率を示した。顆粒球／マクロファージコロニーは、もし
あったとしても、少数であった。より高度に精製された
前駆体細胞を、初期造血細胞表面マーカーCD34＋のため
のポジティブ免疫−磁気選択によって調製した。この方
法は既に文献に記載してある［T.Leeら、Scand.J.Immun
ol.,22:207（1985）］。CD34のためのポジティブ選択
は、Becton−Dickinson社（Mountainview,CA）から買っ
た市販のHPCA−１抗体を用いて行った。この高度に精製
された細胞調製物は、100−250細胞/mlの濃度でクロー
ンアッセイに用い、典型的にはIL−３の存在下で約50％
のBFU−Ｅコロニー形成率を示した。

c.クローンアッセイ培養 強化（enriched）前駆体細胞を、30％FCSを含むIMDM
中の0.9％メチルセルロース,0.9％脱イオン化ウシ血清
アルブミン（Sigma Fraction V）及び10⁴M 2−メルカプ
トエタノール中で培養した。３日目に１ユニットの組み
換えエリスロポエチン（Genetic Institute,Cambridge,
MA）を、各0.5ml培養液に一滴ずつ滴下した。三重試験
開始後12−14日目に典型的に1000以上の細胞を含む赤色
コロニーをBFU−Ｅとして計算した。

IL−９を用いる最初の研究のためには、血小板の副産
物として得られる白血球から単離した赤血球前駆体を用
いた。赤血球前駆体精製過程において、末梢単核細胞を
４℃でインキュベーションするとき、前駆体細胞は単球
と選択的に集合することが観察された。

集合前駆体を更に分画し、Epoの存在下に、標準的赤
血球メチルセルロース培養における標的細胞として用い
た。IL−３及びGM−CSFに加えて、IL−９は赤芽球コロ
ニー群形成細胞（BFU−Ｅ）の形成促進に効果的である
ことが認められたが、Ｇ−CSF,IL−１α,IL−4,IL−６
及びLIFは全て効果的ではなかった（表II参照）。この
培養系では、IL−９は、IL−３またはGM−CSFの約40−5
0％の数のBFU−Ｅを産出した。IL−９の赤芽球コロニー
群促進作用（BPA）は、この培養中における補助細胞に
よって最も多く産出されるBPAであるGM−CSFに対する中
和抗血清を添加してもブロックされなかった。このこと
は、IL−９が赤血球前駆体に直接作用することを示唆し
ている。IL−３単独で最大のBFU−Ｅ形成頻度を示し、
このレベルはIL−９またはGM−CSFの添加によっては増
大されなかった。このことはIL−９とGM−CSFとがそれ
ぞれIL−３−応答性赤血球前駆体のサブセットと相互に
作用しあうことを示唆している。IL−９によってサポー
トされるBFU−Ｅの多くは分散性の後期ヘモグロビン化
形態であり、このことはIL−３−応答性赤血球前駆体の
比較的初期のサブポピュレーションと相互に作用しあう
ことの可能性を示唆している。

IL−９が赤血球前駆体に間接に作用するのか、或いは
直接に作用するのかを研究するために、末梢血液前駆体
をCD34＋細胞用の免疫−磁気ビーズ選択（immuno−magn
etic bead selection）によって更に精製した。IL−３
及びEpoの存在下に、100または250細胞/mlの濃度でコロ
ニー形成させたとき、この細胞の46％が赤芽球コロニー
群（erythroid bursts）を生産した（表II）。この同じ
細胞群は、IL−９の存在下に約20％、GM−CSFの存在下
に42％のBFU−Ｅコロニー形成率を示した。この前駆体
の高度の精製度とコロニー形成の低密度の故に、この結
果はIL−９に直接応答するBFU−Ｅのサブポピュレーシ
ョンが存在することの大きな証拠を提供する。

実施例10:骨髄及び帯血液（cord blood）によるコロニ
ー生成に対するIL−９の効果 末梢血液は顆粒球／マクロファージ（GM）の比較的乏
しい供給源であるので、成人骨髄由来の前駆体とヒト帯
血液由来の前駆体とを用いて、コロニー生成をサポート
する能力についてIL−９をIL−３及びGM−CSFと比較し
た。これらの供給源、特に骨髄はあらゆる系統からの前
駆体のレベルが豊富であり、各種サイトカインの系統特
異性を試験するうえで末梢血液よりも有用である。

a.細胞調製−骨髄 正常な成人志願者からの骨髄を、吸引によって防腐剤
を含まないヘパリン中に回収した。単核細胞をFicoll−
Paque（Pharmacia,Piscataway,NJ）を用いて密度遠心法
により分離し、20％のウシ胎児血清（FCS）を含むイス
コフの改変ダルベッコ培地中、37℃、５％CO₂で、100x1
5−mmのプラスティック組織培養皿（Corning,Corning,N
Y）に一夜固着させることにより、固着細胞を除去し
た。クローンのアッセイを2.5x10⁴細胞/mlで行った。

b.細胞調製−帯血液 Brigham and Women′s Hospital Investigation Comm
itteeにより認められた協定書に基づき、廃棄用臍帯及
び胎盤組織から臍帯血液を得た。帯血液を防腐剤を含ま
ないヘパリン中に回収し、単核細胞をFicoll−Paque（P
harmacia,Piscatawy,NJ）を用いて密度遠心法により分
離した。プラスティッック組織培養皿に一夜固着させる
ことにより、固着細胞を除去した。得られる非固着性分
画を2.5x10⁴細胞/mlの細胞濃度でクローンアッセイし
た。

c.結果 表IIIにまとめたように、いずれの供給源のターゲッ
ト細胞を用いた場合でも、IL−９はBFU−Ｅ生成をかな
りサポートし、場合によっては混合（CFU−GEMM）コロ
ニーのサポートも観察された。しかし、好中球やマクロ
ファージ系統の後期前駆体（CFU−GM,CFU−Ｍ及びCFU−
Ｇ）からのコロニーはIL−９サポートの培養にほとんど
観察されなかった。一方、IL−３及びGM−CSFはこれら
のコロニータイプを高レベルで生産した。IL−９はヒト
及びネズミの巨核球前駆体の培養において、単独ででも
IL−３との組み合わせでも何ら活性を示さない。従っ
て、多くの造血系統で活性を示すIL−３やGM−CSFとは
異なり、IL−９は赤血球の生長に特異的であると思われ
る。

本発明の多くの修飾及び変更が本明細書には含まれて
おり、これらは当業者に自明である。本発明の組成物及
び方法に対するかかる修飾及び変更は以下に記載する請
求の範囲に含まれるものと信じる。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 ＡＢＹ (72)発明者 リッチアルディ，スーザン・ティー アメリカ合衆国マサチューセッツ州 02368，ランドルフ，ウエスト・ストリ ート 39 (72)発明者 クラーク，スティーヴン・シー アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01890，ウィンチェスター，ジョンソ ン・ロード 122 (72)発明者 ドナヒュー，ロバート・イー アメリカ合衆国マサチューセッツ州 01464，シャーリー，ランカスター・ロ ード 59 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07K 14/54 C12P 21/02 C12N 15/00 C12N 1/21 C12N 5/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（ａ）下記に示すアミノ酸配列全てまたは
   一部分であるヒトIL−９活性を有するタンパク質、又は （ｂ）下記に示すアミノ酸配列中の１又は数個のアミノ
   酸を置換、欠失又は付加することにより、誘導されるヒ
   トIL−９活性を有するタンパク質、 のいずれかであり、実質上他のタンパク質とは会合して
   いないヒトIL−９因子タンパク質。
2. 【請求項２】下記に示すDNA配列からなるDNA分子；下記
   のDNA配列中の１又は数個のヌクレオチド塩基を置換、
   欠失又は付加して誘導されるDNA配列からなるDNA分子；
   それらの断片；又はそれらとハイブリダイズすることの
   できる天然型DNA配列；から選択されるDNA分子の全てま
   たは一部分によってコードされ（ただし、当該DNA配列
   の一部分又はDNA配列の断片はIL−９活性を有するタン
   パク質をコードするものである）、実質上その他のタン
   パク質と会合していないヒトIL−９因子タンパク質。
3. 【請求項３】以下に記載する特性の１つ又はそれ以上を
   有する請求の範囲第１項記載のタンパク質： １）還元的条件下でのSDS−PAGEによる見かけ分子量が
   約20−30kd: ２）MO7Eバイオアッセイにおける生物活性；及び ３）骨髄、末梢血液または帯血液細胞の培養において赤
   芽球細胞の生長をサポートする能力。
4. 【請求項４】その発現制御配列と作用可能な状態で結合
   されている、IL−９の発現をコードするDNA配列で形質
   転換した細胞系を培養することによって生産される請求
   の範囲第１項記載のタンパク質。
5. 【請求項５】その発現制御配列と作用可能な状態で結合
   されている、IL−９の発現をコードする下記のDNA配列
   又はIL−９活性を有するタンパク質をコードするそのDN
   A断片で形質転換した細胞系を培養することからなる、I
   L−９タンパク質又はそのIL−９活性を有する断片の製
   造方法。
6. 【請求項６】下記に示すDNA配列で示されるで示されるD
   NA分子；下記のDNA配列中の１又は数個のヌクレオチド
   塩基を置換、欠失又は付加して誘導されるDNA配列から
   なるDNA分子；それらの断片；又はそれらとハイブリダ
   イズすることのできる天然型DNA配列（ただし、当該誘
   導されたDNA分子又はDNA配列の断片はIL−９活性を有す
   るタンパク質をコードするものである）、からなるIL−
   ９タンパク質をコードするDNA分子、
7. 【請求項７】下記のアミノ酸配列を有するタンパク質を
   コードする、単離されたDNA分子。
8. 【請求項８】発現制御配列と作用可能な状態で結合され
   ているDNA分子で形質転換した細胞であって、該DNA分子
   は、 下記のDNA配列で示されるDNA分子；下記のDNA配列中の
   １又は数個のヌクレオチド塩基を置換、欠失又は付加し
   て誘導されるDNA配列からなるDNA分子；それらの断片；
   又はそれらとハイブリダイズすることのできる天然型DN
   A配列；から選択されるものである（ただし、当該誘導
   されたDNA分子又はDNA配列の断片はIL−９活性を有する
   タンパク質をコードするものである）、ことを特徴とす
   る細胞。
9. 【請求項９】哺乳動物細胞またはバクテリア細胞からな
   る請求の範囲第８項記載の細胞。
10. 【請求項１０】医薬的に有効な賦形剤中に、治療的に有
    効な量のIL−９またはその生物活性な断片を含む、赤血
    球欠乏によって引き起こされる症状を治療するための医
    薬組成物。
11. 【請求項１１】治療的に有効な量のサイトカイン、造血
    素、成長因子または腫瘍活性化抗体を更に含む請求の範
    囲第10項記載の組成物。
12. 【請求項１２】造血素がエリスロポエチンである請求の
    範囲第11項記載の組成物。
13. 【請求項１３】サイトカインがIL−１、IL−２、IL−
    ３、IL−４、IL−６、IL−７、GM−CSF、Ｇ−CSF、Ｍ−
    CSF、インターフェロン類、TNF、LIFからなる群から選
    択される請求の範囲第11項記載の組成物。
14. 【請求項１４】下記のDNA配列で示されるDNA分子；下記
    のDNA配列中の１又は数個のヌクレオチド塩基を置換、
    欠失又は付加して誘導されるDNA配列からなるDNA分子；
    それらの断片；又はそれらとハイブリダイズすることの
    できる天然型DNA配列を含む（ただし、当該誘導されたD
    NA分子又はDNA配列の断片はIL−９活性を有するタンパ
    ク質をコードするものである）、プラスミドベクター。