JP2904432B1 - 土壌中の有機塩素系化合物を好気的に分解する分解菌、その分解菌の集積又は単離方法及びその分解菌を保持する分解菌保持担体 - Google Patents
土壌中の有機塩素系化合物を好気的に分解する分解菌、その分解菌の集積又は単離方法及びその分解菌を保持する分解菌保持担体Info
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Abstract
【要約】
【課題】 従来の土壌還流法を改善し、難分解性の
有機塩素系農薬ＰＣＮＢを分解する細菌を短期間で集積
・単離する技術を提供するとともにＰＣＮＢを効率的に
処理する分解菌を提供することを目的とする。 【解決手段】 有機塩素系農薬ＰＣＮＢを含有する土壌
に、細孔を無数に有し且つＰＣＮＢに対する吸着につい
て該土壌よりも大きな吸着力を有する多孔質材を砕片化
して混入させて集積用土壌層２を形成し、この集積用土
壌層２にＰＣＮＢのみを炭素源及び窒素源とする無機塩
培地３を還流させることで前記砕片化多孔質材に好気性
細菌ブルクホルデリア セパシアを集積させるものとし
た。
有機塩素系農薬ＰＣＮＢを分解する細菌を短期間で集積
・単離する技術を提供するとともにＰＣＮＢを効率的に
処理する分解菌を提供することを目的とする。 【解決手段】 有機塩素系農薬ＰＣＮＢを含有する土壌
に、細孔を無数に有し且つＰＣＮＢに対する吸着につい
て該土壌よりも大きな吸着力を有する多孔質材を砕片化
して混入させて集積用土壌層２を形成し、この集積用土
壌層２にＰＣＮＢのみを炭素源及び窒素源とする無機塩
培地３を還流させることで前記砕片化多孔質材に好気性
細菌ブルクホルデリア セパシアを集積させるものとし
た。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、農薬等の有機塩素
系化合物で汚染された土壌の処理、即ち土壌中の農薬に
よる河川水及び地下水の汚染等を防止するために用いる
ことのできる分解菌を集積する技術とこれを利用した分
解菌の単離する技術に関し、特に難分解性有機塩素系農
薬を分解する分解菌の集積や単離をするための技術に関
する。
系化合物で汚染された土壌の処理、即ち土壌中の農薬に
よる河川水及び地下水の汚染等を防止するために用いる
ことのできる分解菌を集積する技術とこれを利用した分
解菌の単離する技術に関し、特に難分解性有機塩素系農
薬を分解する分解菌の集積や単離をするための技術に関
する。
【０００２】
【従来の技術】今日の農業生産を維持するには農薬が欠
かせず、また、ゴルフ場などで場内の植物相を保つのに
も農薬が多用されている。その一方で農薬は汚染物質と
なって環境に好ましからざる影響をもたらし、特に河川
水及び地下水の汚染源になっている。その汚染の原因物
質の一つとして、土壌病害の殺菌に用いられている有機
塩素系農薬ＰＣＮＢが指摘されている。このＰＣＮＢは
非常に分解されにくい難分解性の有機塩素系化合物であ
り、土壌等に残留するＰＣＮＢを効率的に処理する方法
は未だ提案されていないのが現状である。
かせず、また、ゴルフ場などで場内の植物相を保つのに
も農薬が多用されている。その一方で農薬は汚染物質と
なって環境に好ましからざる影響をもたらし、特に河川
水及び地下水の汚染源になっている。その汚染の原因物
質の一つとして、土壌病害の殺菌に用いられている有機
塩素系農薬ＰＣＮＢが指摘されている。このＰＣＮＢは
非常に分解されにくい難分解性の有機塩素系化合物であ
り、土壌等に残留するＰＣＮＢを効率的に処理する方法
は未だ提案されていないのが現状である。
【０００３】ところで、従来より農薬などの有機塩素系
化合物で汚染された土壌を分解菌により回復させること
が有用な技術として考えられている。これは、土壌中に
膨大な数で生息する微生物のなかで、農薬などの機能骨
格となっている有機化合物を分解して無害化したり、あ
るいは環境中から消失させたりする分解菌を利用するも
のである。つまり、有機塩素系化合物を分解できる細菌
を集め、その分解菌の能力を利用することで農薬のよう
な汚染物質を環境から除去することができる。
化合物で汚染された土壌を分解菌により回復させること
が有用な技術として考えられている。これは、土壌中に
膨大な数で生息する微生物のなかで、農薬などの機能骨
格となっている有機化合物を分解して無害化したり、あ
るいは環境中から消失させたりする分解菌を利用するも
のである。つまり、有機塩素系化合物を分解できる細菌
を集め、その分解菌の能力を利用することで農薬のよう
な汚染物質を環境から除去することができる。
【０００４】このような土壌中に生息する多種多様な細
菌の中から特定の細菌を集積・単離する方法として土壌
還流法がある。土壌還流法では、分解菌が生息する土壌
をカラムなどに充填して集積用土壌層を形成し、この集
積用土壌層に農薬などの有機塩素系化合物のみを炭素源
及び窒素源とする無機塩培地を連続的に還流させること
で、特定の分解菌すなわち無機塩培地に含ませた炭素源
と窒素源を質化できたり供役代謝（co−metabolism）に
利用できる分解菌を選択的に集積して単離するものであ
る。しかしながら、この従来の土壌還流法による分解菌
の集積・単離には、一般に、半年から１年の長期間を必
要としているのが実情であり、有機化学物質の種類によ
っては適当な分解菌が集積されない場合もある。そし
て、このように長時間を要することは分解菌の利用によ
る河川水及び地下水の汚染防止技術等を実用的なものと
するためには大きな障害となっている。
菌の中から特定の細菌を集積・単離する方法として土壌
還流法がある。土壌還流法では、分解菌が生息する土壌
をカラムなどに充填して集積用土壌層を形成し、この集
積用土壌層に農薬などの有機塩素系化合物のみを炭素源
及び窒素源とする無機塩培地を連続的に還流させること
で、特定の分解菌すなわち無機塩培地に含ませた炭素源
と窒素源を質化できたり供役代謝（co−metabolism）に
利用できる分解菌を選択的に集積して単離するものであ
る。しかしながら、この従来の土壌還流法による分解菌
の集積・単離には、一般に、半年から１年の長期間を必
要としているのが実情であり、有機化学物質の種類によ
っては適当な分解菌が集積されない場合もある。そし
て、このように長時間を要することは分解菌の利用によ
る河川水及び地下水の汚染防止技術等を実用的なものと
するためには大きな障害となっている。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】このような事情を背景
になされたのが本発明でその目的は、従来の土壌還流法
を改善することにより、難分解性の有機塩素系農薬ＰＣ
ＮＢを分解する細菌を短期間で集積・単離する技術を提
供するとともにＰＣＮＢを効率的に処理する分解菌を提
供することである。
になされたのが本発明でその目的は、従来の土壌還流法
を改善することにより、難分解性の有機塩素系農薬ＰＣ
ＮＢを分解する細菌を短期間で集積・単離する技術を提
供するとともにＰＣＮＢを効率的に処理する分解菌を提
供することである。
【０００６】
【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は従
来の土壌還流法を次のように改良し、分解菌の集積及び
単離の速度を大幅に向上できる技術を確立した。その改
良の要点は、無数の細孔を有する多孔質材を、取り扱い
易く、しかも有効表面積を大きくできる、例えば数〜十
数ｍｍ程度の大きさに砕片化し、この砕片化多孔質材を
人工マイクロハビタットとして集積用土壌層に加えるよ
うにした。この技術によれば汚染物資の種類及びこれを
分解する分解菌の種類により多少の相違はあるものの、
３週間〜３ヶ月程度で実効的な分解菌の集積・単離が行
えるものである。この技術に関して本発明者等は、すで
に特許出願（平成９年特許願第３０１７６号）を行って
いる。
来の土壌還流法を次のように改良し、分解菌の集積及び
単離の速度を大幅に向上できる技術を確立した。その改
良の要点は、無数の細孔を有する多孔質材を、取り扱い
易く、しかも有効表面積を大きくできる、例えば数〜十
数ｍｍ程度の大きさに砕片化し、この砕片化多孔質材を
人工マイクロハビタットとして集積用土壌層に加えるよ
うにした。この技術によれば汚染物資の種類及びこれを
分解する分解菌の種類により多少の相違はあるものの、
３週間〜３ヶ月程度で実効的な分解菌の集積・単離が行
えるものである。この技術に関して本発明者等は、すで
に特許出願（平成９年特許願第３０１７６号）を行って
いる。
【０００７】本発明は上記改良土壌還流法を用いて、集
積用土壌層に有機塩素系農薬ＰＣＮＢを唯一の炭素及び
窒素源とする無機塩培地を連続的に還流させることで特
定の分解菌を選択的に集積して単離を行った。その結
果、ＰＣＮＢを実効的に完全分解する好気性細菌を非常
に短期間で得ることができた。この集積・単離された分
解菌のうちＰＣＮＢ分解活性の高い３菌株を同定したと
ころ、３菌株ともブルクホルデリア セパシア（Burkho
lderia cepacia）という好気性細菌であることが判明し
た。本発明者等の知る限りでもＰＣＮＢを分解する分解
菌としては嫌気性細菌が主であり、上記の改良土壌還流
法により得られたブルクホルデリア セパシア（Burkho
lderia cepacia KTYY97 生命研寄託第ＦＥＲＭ Ｐ−
１６８０９号、以下、本件分解菌という）はそれが好気
性細菌である点及びＰＣＮＢを完全分解する点において
全く新たな利用可能性を有するものである。
積用土壌層に有機塩素系農薬ＰＣＮＢを唯一の炭素及び
窒素源とする無機塩培地を連続的に還流させることで特
定の分解菌を選択的に集積して単離を行った。その結
果、ＰＣＮＢを実効的に完全分解する好気性細菌を非常
に短期間で得ることができた。この集積・単離された分
解菌のうちＰＣＮＢ分解活性の高い３菌株を同定したと
ころ、３菌株ともブルクホルデリア セパシア（Burkho
lderia cepacia）という好気性細菌であることが判明し
た。本発明者等の知る限りでもＰＣＮＢを分解する分解
菌としては嫌気性細菌が主であり、上記の改良土壌還流
法により得られたブルクホルデリア セパシア（Burkho
lderia cepacia KTYY97 生命研寄託第ＦＥＲＭ Ｐ−
１６８０９号、以下、本件分解菌という）はそれが好気
性細菌である点及びＰＣＮＢを完全分解する点において
全く新たな利用可能性を有するものである。
【０００８】本件分解菌によれば、３〜４ｍｇ／ｌ濃度
のＰＣＮＢを含む無機塩培地３０ｍｌに対して、本件分
解菌を一白金耳加えると約５日間で完全に分解すること
ができ、その際ＰＣＮＢ分子中に結合している塩素をす
べて脱塩素することが判明した。また、本発明者等の研
究によると、この本件分解菌は、従来より分解が非常に
困難とされている有機塩素系農薬ＣＮＰをも分解できる
性質を有することも判明した。本件分解菌のような好気
性細菌は、嫌気性細菌のように取り扱いの制限を受ける
ことが少ないため、ＰＣＮＢに汚染された土壌に本件分
解菌を適用するだけでＰＣＮＢを実効的に分解すること
ができ、河川水及び地下水の汚染防止等が可能となる。
のＰＣＮＢを含む無機塩培地３０ｍｌに対して、本件分
解菌を一白金耳加えると約５日間で完全に分解すること
ができ、その際ＰＣＮＢ分子中に結合している塩素をす
べて脱塩素することが判明した。また、本発明者等の研
究によると、この本件分解菌は、従来より分解が非常に
困難とされている有機塩素系農薬ＣＮＰをも分解できる
性質を有することも判明した。本件分解菌のような好気
性細菌は、嫌気性細菌のように取り扱いの制限を受ける
ことが少ないため、ＰＣＮＢに汚染された土壌に本件分
解菌を適用するだけでＰＣＮＢを実効的に分解すること
ができ、河川水及び地下水の汚染防止等が可能となる。
【０００９】本件分解菌は本発明者等が提案する改良土
壌還流法により集積・単離をすることができる。それ
は、有機塩素系農薬ＰＣＮＢを含有する土壌に、細孔を
無数に有し且つＰＣＮＢに対する吸着について該土壌よ
りも大きな吸着力を有する多孔質材を砕片化して混入さ
せて集積用土壌層を形成し、この集積用土壌層にＰＣＮ
Ｂのみを炭素源及び窒素源とする無機塩培地を還流させ
ることで前記砕片化多孔質材に集積させるものである。
壌還流法により集積・単離をすることができる。それ
は、有機塩素系農薬ＰＣＮＢを含有する土壌に、細孔を
無数に有し且つＰＣＮＢに対する吸着について該土壌よ
りも大きな吸着力を有する多孔質材を砕片化して混入さ
せて集積用土壌層を形成し、この集積用土壌層にＰＣＮ
Ｂのみを炭素源及び窒素源とする無機塩培地を還流させ
ることで前記砕片化多孔質材に集積させるものである。
【００１０】有機塩素系農薬ＰＣＮＢを含有する土壌
は、例えばＰＣＮＢを農薬として連用している土壌であ
ることが好ましい。本件分解菌は一般の土壌中には殆ど
生息しておらず、その一方でＰＣＮＢを使用している土
壌に比較的密度が高い状態で生息しているので、そのよ
うな土壌を利用するれば本件分解菌の効率的な集積が可
能となる。
は、例えばＰＣＮＢを農薬として連用している土壌であ
ることが好ましい。本件分解菌は一般の土壌中には殆ど
生息しておらず、その一方でＰＣＮＢを使用している土
壌に比較的密度が高い状態で生息しているので、そのよ
うな土壌を利用するれば本件分解菌の効率的な集積が可
能となる。
【００１１】また、この集積の際に使用する砕片化多孔
質材としては、例えば木質炭化材のように無数な細孔を
有する多孔質材を数〜十数ｍｍ程度の大きさに砕片化
し、この砕片化多孔質材を人工マイクロハビタットとし
て集積用土壌層に混入させることが好ましい。そしてさ
らに、本件分解菌の迅速な集積を行うためには、４００
〜７００℃程度の低・中温条件で焼成した広葉樹木質炭
化材で、この木質炭化材の有する細孔のうち孔径５〜２
０μｍ程度の細孔が全細孔容積に対して１０％以上であ
り、細孔内ｐＨが７〜８程度の弱アルカリで、さらに、
その比表面積が８０〜１２０ｍ2／ｇ程度のものを使用
することが好ましい。細孔分布、細孔内ｐＨ、比表面積
が異なる種々の人工マイクロハビタットを使用して集積
させた結果、上記諸条件を満たす人工マイクロハビタッ
トが本件分解菌に対して最も迅速且つ効率的に集積でき
ることが判明した。これは、上記諸条件を満たす人工マ
イクロハビタットには、本件分解菌が住み着きやすく、
また、その細孔へのＰＣＮＢの吸着形態が本件分解菌に
とって、効率的に利用できるものになるためであると考
えられる。
質材としては、例えば木質炭化材のように無数な細孔を
有する多孔質材を数〜十数ｍｍ程度の大きさに砕片化
し、この砕片化多孔質材を人工マイクロハビタットとし
て集積用土壌層に混入させることが好ましい。そしてさ
らに、本件分解菌の迅速な集積を行うためには、４００
〜７００℃程度の低・中温条件で焼成した広葉樹木質炭
化材で、この木質炭化材の有する細孔のうち孔径５〜２
０μｍ程度の細孔が全細孔容積に対して１０％以上であ
り、細孔内ｐＨが７〜８程度の弱アルカリで、さらに、
その比表面積が８０〜１２０ｍ2／ｇ程度のものを使用
することが好ましい。細孔分布、細孔内ｐＨ、比表面積
が異なる種々の人工マイクロハビタットを使用して集積
させた結果、上記諸条件を満たす人工マイクロハビタッ
トが本件分解菌に対して最も迅速且つ効率的に集積でき
ることが判明した。これは、上記諸条件を満たす人工マ
イクロハビタットには、本件分解菌が住み着きやすく、
また、その細孔へのＰＣＮＢの吸着形態が本件分解菌に
とって、効率的に利用できるものになるためであると考
えられる。
【００１２】そして、本発明による本件分解菌の単離方
法は、上記した集積方法を利用して行うもので、本件分
解菌を集積させた砕片化多孔質材を新たな砕片化多孔質
材に混入させて砕片化多孔質材のみによる集積用層を形
成し、この集積用層にＰＣＮＢのみを炭素源及び窒素源
とする無機塩培地を還流させることで前記新たな砕片化
多孔質材にも本件分解菌を集積させて該本件分解菌の集
積度を高め単離するものである。この単離操作を迅速且
つ効率的に行うためには、上記諸条件を満たす人工マイ
クロハビタットを新たな砕片化多孔質材として用い、こ
の単離操作を複数繰り返すことが好ましい。
法は、上記した集積方法を利用して行うもので、本件分
解菌を集積させた砕片化多孔質材を新たな砕片化多孔質
材に混入させて砕片化多孔質材のみによる集積用層を形
成し、この集積用層にＰＣＮＢのみを炭素源及び窒素源
とする無機塩培地を還流させることで前記新たな砕片化
多孔質材にも本件分解菌を集積させて該本件分解菌の集
積度を高め単離するものである。この単離操作を迅速且
つ効率的に行うためには、上記諸条件を満たす人工マイ
クロハビタットを新たな砕片化多孔質材として用い、こ
の単離操作を複数繰り返すことが好ましい。
【００１３】さらに、本発明による集積・単離方法によ
り本件分解菌が集積した砕片化多孔質材は、有機塩素系
農薬分解菌保持担体として用いることができる。このよ
うに本件分解菌を扱い易い人工マイクロハビタットの形
態、即ち本件分解菌を保持した担体として取り出すこと
ができることは、本件分解菌保持担体をＰＣＮＢで汚染
された土壌に適用すること、例えば、ＰＣＮＢを処理す
る対象土壌に混入する作業等を容易にし、特別な設備を
配慮しなくても土壌中のＰＣＮＢを分解処理することが
可能となる。
り本件分解菌が集積した砕片化多孔質材は、有機塩素系
農薬分解菌保持担体として用いることができる。このよ
うに本件分解菌を扱い易い人工マイクロハビタットの形
態、即ち本件分解菌を保持した担体として取り出すこと
ができることは、本件分解菌保持担体をＰＣＮＢで汚染
された土壌に適用すること、例えば、ＰＣＮＢを処理す
る対象土壌に混入する作業等を容易にし、特別な設備を
配慮しなくても土壌中のＰＣＮＢを分解処理することが
可能となる。
【００１４】
【発明の実施形態】以下、本発明の実施形態について説
明する。本発明者等が提案する改良土壌還流法によるＰ
ＣＮＢを分解する分解菌の集積は、以下の条件で行っ
た。
明する。本発明者等が提案する改良土壌還流法によるＰ
ＣＮＢを分解する分解菌の集積は、以下の条件で行っ
た。
【表１】 供試農薬：ＰＣＮＢ標準品（この構造式を図１に示す） 供試土壌：ＰＣＮＢを連用している畑地土壌、２ｍｍ以
下に篩分 還流液：炭素源及び窒素源としてＰＣＮＢのみを１０ｍ
ｇ／ｌ加えた無機塩培地 還流条件：２５℃、暗所
下に篩分 還流液：炭素源及び窒素源としてＰＣＮＢのみを１０ｍ
ｇ／ｌ加えた無機塩培地 還流条件：２５℃、暗所
【００１５】また、集積する際に用いた人工マイクロハ
ビタットは、図２に示す物性をそれぞれ有する人工マイ
クロハビタットＡ〜ＥのうちＡを使用した。図２中の人
工マイクロハビタットＡ〜Ｅは以下のものを示してい
る。
ビタットは、図２に示す物性をそれぞれ有する人工マイ
クロハビタットＡ〜ＥのうちＡを使用した。図２中の人
工マイクロハビタットＡ〜Ｅは以下のものを示してい
る。
【表２】Ａ：広葉樹通常焼成（通常焼成温度５００℃、
以下同じ）木質炭化材の５〜１０ｍｍ砕片 Ｂ：キトサン処理の広葉樹通常焼成木質炭化材の５〜１
０ｍｍ砕片 Ｃ：広葉樹通常焼成木質炭化材を更に１０００℃で４時
間焼成した木質炭化材の５〜１０ｍｍ砕片 Ｄ：１０００℃で８時間焼成の針葉樹木質炭化材の５〜
１０ｍｍ砕片 Ｅ：市販の粒状活性炭（粒径５ｍｍ）
以下同じ）木質炭化材の５〜１０ｍｍ砕片 Ｂ：キトサン処理の広葉樹通常焼成木質炭化材の５〜１
０ｍｍ砕片 Ｃ：広葉樹通常焼成木質炭化材を更に１０００℃で４時
間焼成した木質炭化材の５〜１０ｍｍ砕片 Ｄ：１０００℃で８時間焼成の針葉樹木質炭化材の５〜
１０ｍｍ砕片 Ｅ：市販の粒状活性炭（粒径５ｍｍ）
【００１６】本実施形態における分解菌の集積は次のよ
うにして行った。図３に示すように、まず容量５００ｍ
ｌの土壌層タンク１に集積用土壌層２を形成した。この
集積用土壌層２は、５〜１０ｍｍ程度に砕片化した人工
マイクロハビタットＡ２ｇを供試土壌４０ｇに混入して
形成したものである。そして供試農薬、ＰＣＮＢを唯一
の炭素源及び窒素源とする無機塩培地３（３００ｍｌ）
を貯液タンク４から集積用土壌層２に還流させ、２５℃
の暗所で集積を行った。
うにして行った。図３に示すように、まず容量５００ｍ
ｌの土壌層タンク１に集積用土壌層２を形成した。この
集積用土壌層２は、５〜１０ｍｍ程度に砕片化した人工
マイクロハビタットＡ２ｇを供試土壌４０ｇに混入して
形成したものである。そして供試農薬、ＰＣＮＢを唯一
の炭素源及び窒素源とする無機塩培地３（３００ｍｌ）
を貯液タンク４から集積用土壌層２に還流させ、２５℃
の暗所で集積を行った。
【００１７】この集積操作における還流液中のＰＣＮＢ
濃度及びＰＣＮＢの分解副産物であるＣｌ-（Chlorid
e）とＮＯ3 -（Nitrate）の濃度を測定した結果を図４の
グラフに示す。図４のグラフ中、Ｃｌ-濃度に注目する
と、第１回目の還流液交換（その時点で還流液を新たに
調整して交換したことを意味する、以下同じ）以降Ｃｌ
-濃度の増加速度が大きくなる傾向が認められ、第２回
目の還流液交換以降はＣｌ-濃度の増加速度が急激に大
きくなり、分解菌の集積が進行していることが確認され
た。このＣｌ-濃度の増加は、分解菌の集積が進むこと
に比例して大きくなるもので、これに応じてＰＣＮＢの
分解が活発になっていること意味している。
濃度及びＰＣＮＢの分解副産物であるＣｌ-（Chlorid
e）とＮＯ3 -（Nitrate）の濃度を測定した結果を図４の
グラフに示す。図４のグラフ中、Ｃｌ-濃度に注目する
と、第１回目の還流液交換（その時点で還流液を新たに
調整して交換したことを意味する、以下同じ）以降Ｃｌ
-濃度の増加速度が大きくなる傾向が認められ、第２回
目の還流液交換以降はＣｌ-濃度の増加速度が急激に大
きくなり、分解菌の集積が進行していることが確認され
た。このＣｌ-濃度の増加は、分解菌の集積が進むこと
に比例して大きくなるもので、これに応じてＰＣＮＢの
分解が活発になっていること意味している。
【００１８】そして、上記集積操作によって分解菌を集
積した人工マイクロハビタットＡを取り出し、この集積
済み人工マイクロハビタットＡ０．２５ｇと未使用の人
工マイクロハビタットＡ〜Ｅの各７．５ｇとをそれぞれ
混入して、ＰＣＮＢの分解菌を単離するための６種類の
集積用層を作成した。本実施形態における分解菌の単離
操作は、図３に示す集積用土壌層２の代わりに前記集積
用層をそれぞれ土壌層タンク１内に形成し、上記した集
積操作と同様な条件でＰＣＮＢを唯一の炭素源及び窒素
源とする無機塩培地３を還流することで行った。図５の
グラフには、６種類の人工マイクロハビタットＡ〜Ｅに
よって単離操作を行った際のＰＣＮＢ分解副産物である
塩素イオン（Ｃｌ-）濃度を測定した結果を示してあ
る。図５のグラフで判るように人工マイクロハビタット
Ａを用いて形成した集積用層の場合のみ、第３回目の還
流液交換以降Ｃｌ-濃度の増加速度が大きくなり、第４
回目から急激に増加速度が大きくなることが確認され
た。
積した人工マイクロハビタットＡを取り出し、この集積
済み人工マイクロハビタットＡ０．２５ｇと未使用の人
工マイクロハビタットＡ〜Ｅの各７．５ｇとをそれぞれ
混入して、ＰＣＮＢの分解菌を単離するための６種類の
集積用層を作成した。本実施形態における分解菌の単離
操作は、図３に示す集積用土壌層２の代わりに前記集積
用層をそれぞれ土壌層タンク１内に形成し、上記した集
積操作と同様な条件でＰＣＮＢを唯一の炭素源及び窒素
源とする無機塩培地３を還流することで行った。図５の
グラフには、６種類の人工マイクロハビタットＡ〜Ｅに
よって単離操作を行った際のＰＣＮＢ分解副産物である
塩素イオン（Ｃｌ-）濃度を測定した結果を示してあ
る。図５のグラフで判るように人工マイクロハビタット
Ａを用いて形成した集積用層の場合のみ、第３回目の還
流液交換以降Ｃｌ-濃度の増加速度が大きくなり、第４
回目から急激に増加速度が大きくなることが確認され
た。
【００１９】次に、本実施形態の集積・単離操作により
得られたＰＣＮＢを分解する分解菌の分解能について説
明する。人工マイクロハビタットＡを用いて上記した集
積・単離操作を行い、この集積済みの人工マイクロハビ
タットＡ１．０ｇを粉砕し、リン酸緩衝液で適当に希釈
した。そしてＰＣＮＢを唯一の炭素源及び窒素源とした
無機塩寒天培地にこの希釈液を接種し、定法に従って分
解菌の単離を行った。ここでいう定法とは、希釈平板法
のことをいう。
得られたＰＣＮＢを分解する分解菌の分解能について説
明する。人工マイクロハビタットＡを用いて上記した集
積・単離操作を行い、この集積済みの人工マイクロハビ
タットＡ１．０ｇを粉砕し、リン酸緩衝液で適当に希釈
した。そしてＰＣＮＢを唯一の炭素源及び窒素源とした
無機塩寒天培地にこの希釈液を接種し、定法に従って分
解菌の単離を行った。ここでいう定法とは、希釈平板法
のことをいう。
【００２０】培養３週間後に平板培地中にクリアゾーン
が確認されたので、そのクリアゾーン中、活性が高い
（クリアゾーンの面積が広い）と認められる部分より１
０菌株を釣菌した。その釣菌した１０菌株をさらに無機
塩寒天培地で培養後、ＰＣＮＢ５ｍｇ／ｌ含有の無機塩
培地に接種して分解活性を調査した結果、１０菌株のう
ち６菌株に高い分解活性が認められた。
が確認されたので、そのクリアゾーン中、活性が高い
（クリアゾーンの面積が広い）と認められる部分より１
０菌株を釣菌した。その釣菌した１０菌株をさらに無機
塩寒天培地で培養後、ＰＣＮＢ５ｍｇ／ｌ含有の無機塩
培地に接種して分解活性を調査した結果、１０菌株のう
ち６菌株に高い分解活性が認められた。
【００２１】この分解活性の高い６菌株を無機塩寒天培
地で培養後、ＰＣＮＢ３．６６ｍｇ／ｌ含有の無機塩溶
液３０ｍｌに対し、それぞれ一白金耳接種して分解活性
を調査した結果を図６及び図７のグラフに示す。図６の
グラフはＰＣＮＢ濃度変化を示したもので、分解活性の
高い６菌株（ＰＤ１、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ６、ＰＤ
９、ＰＤ１０）のいずれもが、５日間で完全にＰＣＮＢ
を分解していることが確認された。また、図７のグラフ
に示すＰＣＮＢ分解副産物である塩素イオン（Ｃｌ-）
濃度を測定した結果によると、６菌株とも５日間でＣｌ
-濃度を２ｍｇ／ｌ前後にまで増加させていることが確
認できた。これは、ＰＣＮＢ３．６６ｍｇ／ｌを完全分
解したときの理論塩素イオン濃度２．２０ｍｇ／ｌとほ
ぼ同程度の値であり、本発明により集積・単離された６
菌株の分解菌が、ＰＣＮＢ分子中（図１参照）に存在す
る塩素をすべて脱塩素できる能力を有することを示すも
のである。
地で培養後、ＰＣＮＢ３．６６ｍｇ／ｌ含有の無機塩溶
液３０ｍｌに対し、それぞれ一白金耳接種して分解活性
を調査した結果を図６及び図７のグラフに示す。図６の
グラフはＰＣＮＢ濃度変化を示したもので、分解活性の
高い６菌株（ＰＤ１、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ６、ＰＤ
９、ＰＤ１０）のいずれもが、５日間で完全にＰＣＮＢ
を分解していることが確認された。また、図７のグラフ
に示すＰＣＮＢ分解副産物である塩素イオン（Ｃｌ-）
濃度を測定した結果によると、６菌株とも５日間でＣｌ
-濃度を２ｍｇ／ｌ前後にまで増加させていることが確
認できた。これは、ＰＣＮＢ３．６６ｍｇ／ｌを完全分
解したときの理論塩素イオン濃度２．２０ｍｇ／ｌとほ
ぼ同程度の値であり、本発明により集積・単離された６
菌株の分解菌が、ＰＣＮＢ分子中（図１参照）に存在す
る塩素をすべて脱塩素できる能力を有することを示すも
のである。
【００２２】このＰＣＮＢの分解活性が高い６菌株を用
いて、難分解性有機塩素農薬の一つとして挙げられるＣ
ＮＰ（この構造式を図８に示す）の分解能を評価した。
ＣＮＰ４．２６ｍｇ／ｌ含有の無機塩溶液３０ｍｌに対
し、６菌株をそれぞれ一白金耳接種して分解活性を調査
した結果を図９及び図１０のグラフに示す。図９のグラ
フが示すように、ＰＣＮＢの分解活性が高い６菌株のす
べてにおいてＣＮＰ４．２６ｍｇ／ｌ濃度の無機塩溶液
を４日間でほぼ１ｍｇ／ｌ濃度まで低下させ、ＣＮＰを
分解していることが確認できた。しかしながら４日間を
過ぎてもそれ以上の分解は殆ど進行しなかった。また、
図１０のグラフに示すＣＮＰの分解副産物である塩素イ
オン（Ｃｌ-）濃度の測定結果より、最も分解能が高い
と見られる分解菌ＰＤ１でも最高０．２７ｍｇ／ｌ程度
にまでしかＣｌ-濃度の増加は認められなかった。ＣＮ
Ｐ４．２６ｍｇ／ｌが完全分解したときの理論塩素イオ
ン濃度が１．４２ｍｇ／ｌであることを考えると、６菌
株によるＣＮＰの分解では、図８に示す構造式のＣＮＰ
分子中に存在する３個の塩素のうち一部しか脱塩素され
ていないことが判明した。
いて、難分解性有機塩素農薬の一つとして挙げられるＣ
ＮＰ（この構造式を図８に示す）の分解能を評価した。
ＣＮＰ４．２６ｍｇ／ｌ含有の無機塩溶液３０ｍｌに対
し、６菌株をそれぞれ一白金耳接種して分解活性を調査
した結果を図９及び図１０のグラフに示す。図９のグラ
フが示すように、ＰＣＮＢの分解活性が高い６菌株のす
べてにおいてＣＮＰ４．２６ｍｇ／ｌ濃度の無機塩溶液
を４日間でほぼ１ｍｇ／ｌ濃度まで低下させ、ＣＮＰを
分解していることが確認できた。しかしながら４日間を
過ぎてもそれ以上の分解は殆ど進行しなかった。また、
図１０のグラフに示すＣＮＰの分解副産物である塩素イ
オン（Ｃｌ-）濃度の測定結果より、最も分解能が高い
と見られる分解菌ＰＤ１でも最高０．２７ｍｇ／ｌ程度
にまでしかＣｌ-濃度の増加は認められなかった。ＣＮ
Ｐ４．２６ｍｇ／ｌが完全分解したときの理論塩素イオ
ン濃度が１．４２ｍｇ／ｌであることを考えると、６菌
株によるＣＮＰの分解では、図８に示す構造式のＣＮＰ
分子中に存在する３個の塩素のうち一部しか脱塩素され
ていないことが判明した。
【００２３】次に、上記したＰＣＮＢの分解活性が高い
６菌株（ＰＤ１、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ６、ＰＤ９、Ｐ
Ｄ１０）を用いて行った分解菌の同定について説明す
る。ＰＣＮＢを唯一の炭素源及び窒素源とした無機塩寒
天培地を使用し定法に従い、この６菌株の純化を繰り返
した。そして、純化された６菌株のうち、さらに分解活
性の高い３菌株（ＰＤ１、ＰＤ３、ＰＤ６）を選択し
た。選択した３菌株について、菌体の形態観察（グラム
染色、形状、運動性、コロニーの形状）、菌体脂肪酸分
析、キノン分析、ＤＮＡ塩基組成分析（Ｇ＋Ｃ含量）を
行い、同定を行った。
６菌株（ＰＤ１、ＰＤ３、ＰＤ４、ＰＤ６、ＰＤ９、Ｐ
Ｄ１０）を用いて行った分解菌の同定について説明す
る。ＰＣＮＢを唯一の炭素源及び窒素源とした無機塩寒
天培地を使用し定法に従い、この６菌株の純化を繰り返
した。そして、純化された６菌株のうち、さらに分解活
性の高い３菌株（ＰＤ１、ＰＤ３、ＰＤ６）を選択し
た。選択した３菌株について、菌体の形態観察（グラム
染色、形状、運動性、コロニーの形状）、菌体脂肪酸分
析、キノン分析、ＤＮＡ塩基組成分析（Ｇ＋Ｃ含量）を
行い、同定を行った。
【００２４】図１１の表に３菌株の同定実験結果を示
す。この３菌株は、すべて単桿状の形態で、運動性はな
く、グラム染色は陰性であった。また、３菌株ともに肉
汁寒天平板培養が可能で、黄色のコロニーを形成するも
のであった。そして、これらの形態観察及びそれぞれの
菌体脂肪酸分析、キノン分析、ＤＮＡ塩基組成分析の結
果により、この３菌株はすべて学名ブルクホルデリア
セパシア（Burkholderiacepacia KTYY97 生命研寄託
第ＦＥＲＭ Ｐ−１６８０９号）と同定された[同定判
定の根拠となった文献：International journal of
Systematic Bacteriology，Vol.47，No.4，1188-120
0，(1997)、同，Vol.45，No.2，274-289，(1995)、Hand
book of New Bacterial Systematics，196-231，Ac
ademic Press，(1993)、新しい分類学に伴走する細菌
同定法＜日本細菌学会教育委員会編＞菜根出版，56-6
4，(1987)]。このブルクホルデリア セパシアは好気性
細菌であり、上記したように有機塩素系農薬ＰＣＮＢの
高い分解能を有するものである。
す。この３菌株は、すべて単桿状の形態で、運動性はな
く、グラム染色は陰性であった。また、３菌株ともに肉
汁寒天平板培養が可能で、黄色のコロニーを形成するも
のであった。そして、これらの形態観察及びそれぞれの
菌体脂肪酸分析、キノン分析、ＤＮＡ塩基組成分析の結
果により、この３菌株はすべて学名ブルクホルデリア
セパシア（Burkholderiacepacia KTYY97 生命研寄託
第ＦＥＲＭ Ｐ−１６８０９号）と同定された[同定判
定の根拠となった文献：International journal of
Systematic Bacteriology，Vol.47，No.4，1188-120
0，(1997)、同，Vol.45，No.2，274-289，(1995)、Hand
book of New Bacterial Systematics，196-231，Ac
ademic Press，(1993)、新しい分類学に伴走する細菌
同定法＜日本細菌学会教育委員会編＞菜根出版，56-6
4，(1987)]。このブルクホルデリア セパシアは好気性
細菌であり、上記したように有機塩素系農薬ＰＣＮＢの
高い分解能を有するものである。
【００２５】
【発明の効果】以上説明したように本発明の分解菌ブル
クホルデリア セパシアによると、有機塩素系農薬ＰＣ
ＮＢを分解することができ、さらに難分解性有機塩素系
農薬の一つであるＣＮＰをも分解することが可能とな
る。この分解菌は好気性細菌であるため、土壌に残存す
る農薬を処理するに際して容易に適用することができ、
農薬による河川水及び地下水の汚染を防止する技術に大
きく寄与できるものである。
クホルデリア セパシアによると、有機塩素系農薬ＰＣ
ＮＢを分解することができ、さらに難分解性有機塩素系
農薬の一つであるＣＮＰをも分解することが可能とな
る。この分解菌は好気性細菌であるため、土壌に残存す
る農薬を処理するに際して容易に適用することができ、
農薬による河川水及び地下水の汚染を防止する技術に大
きく寄与できるものである。
【図１】ＰＣＮＢの構造式。
【図２】本実施形態で用いた各人工マイクロハビタット
の物性表。
の物性表。
【図３】本実施形態の集積・単離方法で用いる装置の模
式図。
式図。
【図４】本実施形態の集積操作におけるＰＣＮＢ還流液
中のＰＣＮＢ、Ｃｌ-(Chloride）及びＮＯ3 -(Nitrate)
の濃度変化を示すグラフ。
中のＰＣＮＢ、Ｃｌ-(Chloride）及びＮＯ3 -(Nitrate)
の濃度変化を示すグラフ。
【図５】本実施形態の単離操作における各人工マイクロ
ハビタットについてのＰＣＮＢ分解菌の集積速度の違い
を塩素イオン（Ｃｌ-）濃度に関して示すグラフ。
ハビタットについてのＰＣＮＢ分解菌の集積速度の違い
を塩素イオン（Ｃｌ-）濃度に関して示すグラフ。
【図６】ＰＣＮＢの分解活性が高い６菌株によるＰＣＮ
Ｂの分解状態をＰＣＮＢ濃度に関して示すグラフ。
Ｂの分解状態をＰＣＮＢ濃度に関して示すグラフ。
【図７】ＰＣＮＢの分解活性が高い６菌株によるＰＣＮ
Ｂの分解状態を塩素イオン（Ｃｌ-）濃度に関して示す
グラフ。
Ｂの分解状態を塩素イオン（Ｃｌ-）濃度に関して示す
グラフ。
【図８】ＣＮＰの構造式。
【図９】ＰＣＮＢの分解活性が高い６菌株によるＣＮＰ
の分解状態をＣＮＰ濃度に関して示すグラフ。
の分解状態をＣＮＰ濃度に関して示すグラフ。
【図１０】ＰＣＮＢの分解活性が高い６菌株によるＣＮ
Ｐの分解状態を塩素イオン（Ｃｌ -）濃度に関して示す
グラフ。
Ｐの分解状態を塩素イオン（Ｃｌ -）濃度に関して示す
グラフ。
【図１１】ＰＣＮＢの分解活性が高い３菌株の同定実験
結果を示す表。
結果を示す表。
１ 土壌層タンク ２ 集積用土壌層（集積用層） ３ 無機塩培地 ４ 貯液タンク
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:01） (56)参考文献 特開 平６−296500（ＪＰ，Ａ) Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ ｅｔ Ａｌ．, Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔ ｙ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，Ｊａｐ ａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｃｉ ｅｔｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ，1997，ｐ. 113−121 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 1/00 - 7/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】 有機塩素系農薬ＰＣＮＢを好気的に分解
することのできる好気性細菌ブルクホルデリア セパシ
ア（Burkholderia cepacia KTYY97 生命研寄託第ＦＥ
ＲＭ Ｐ−１６８０９号）。 - 【請求項２】 有機塩素系農薬ＰＣＮＢを含有する土壌
に、細孔を無数に有し且つＰＣＮＢに対する吸着につい
て該土壌よりも大きな吸着力を有する多孔質材を砕片化
して混入させて集積用土壌層を形成し、この集積用土壌
層にＰＣＮＢのみを炭素源及び窒素源とする無機塩培地
を還流させることで前記砕片化多孔質材に好気性細菌ブ
ルクホルデリア セパシアを集積させるものである分解
菌の集積方法。 - 【請求項３】 請求項２に記載の集積方法を利用して分
解菌を単離する方法であって、好気性細菌ブルクホルデ
リア セパシアを集積させた砕片化多孔質材を新たな砕
片化多孔質材に混入させて砕片化多孔質材のみによる集
積用層を形成し、この集積用層にＰＣＮＢのみを炭素源
及び窒素源とする無機塩培地を還流させることで前記新
たな砕片化多孔質材にも好気性細菌ブルクホルデリア
セパシアを集積させて該分解菌の集積度を高め単離する
ものである分解菌の単離方法。 - 【請求項４】 請求項２又は請求項３に記載する分解菌
の集積又は単離方法により得られた好気性細菌ブルクホ
ルデリア セパシアを保持した多孔質材からなる有機塩
素系農薬分解菌保持担体。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10135156A JP2904432B1 (ja) | 1998-05-18 | 1998-05-18 | 土壌中の有機塩素系化合物を好気的に分解する分解菌、その分解菌の集積又は単離方法及びその分解菌を保持する分解菌保持担体 |
| EP99918364A EP1002858A4 (en) | 1998-05-18 | 1999-05-11 | BACTERIUM DERIVED FROM AEROBIC ORGANIC CHLORINE COMPOUNDS IN THE GROUND, METHOD FOR THEIR ENRICHMENT OR INSULATION AND SUPPORT OF THE BACTERIUM |
| CA002296658A CA2296658A1 (en) | 1998-05-18 | 1999-05-11 | Bacterium aerobically degrading organic chlorine compounds in soil, method for accumulating or isolating the bacterium and support carrying this bacterium |
| PCT/JP1999/002420 WO1999060098A1 (fr) | 1998-05-18 | 1999-05-11 | Bacterie induisant une degradation aerobie des composes chlores organiques dans le sol, procede relatif a l'accumulation ou a l'isolation de ladite bacterie et support porteur de cette bacterie |
| US09/462,877 US6498028B1 (en) | 1998-05-18 | 1999-05-11 | Method for enriching and isolating bacteria which aerobically degrades PCNB |
| KR1020007000229A KR100336195B1 (ko) | 1998-05-18 | 1999-05-11 | 토양중의 유기염소계 화합물을 호기적으로 분해하는분해균, 그 분해균의 집적 또는 분리방법 및 그 분해균을유지하는 분해균 유지담체 |
| AU36301/99A AU735417B2 (en) | 1998-05-18 | 1999-05-11 | Bacterium aerobically degrading organic chlorine compounds in soil, method for accumulating or isolating the bacterium and support carrying this bacterium |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10135156A JP2904432B1 (ja) | 1998-05-18 | 1998-05-18 | 土壌中の有機塩素系化合物を好気的に分解する分解菌、その分解菌の集積又は単離方法及びその分解菌を保持する分解菌保持担体 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2904432B1 true JP2904432B1 (ja) | 1999-06-14 |
| JPH11318435A JPH11318435A (ja) | 1999-11-24 |
Family
ID=15145132
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10135156A Expired - Fee Related JP2904432B1 (ja) | 1998-05-18 | 1998-05-18 | 土壌中の有機塩素系化合物を好気的に分解する分解菌、その分解菌の集積又は単離方法及びその分解菌を保持する分解菌保持担体 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP1002858A4 (ja) |
| JP (1) | JP2904432B1 (ja) |
| KR (1) | KR100336195B1 (ja) |
| AU (1) | AU735417B2 (ja) |
| CA (1) | CA2296658A1 (ja) |
| WO (1) | WO1999060098A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| JP4768332B2 (ja) | 2005-01-26 | 2011-09-07 | 独立行政法人農業環境技術研究所 | 複合分解菌集積保持担体及びその製造方法、新規細菌、並びに汚染環境の浄化方法及びその装置 |
| GB2431926B (en) * | 2005-11-08 | 2010-07-28 | Univ Surrey | Bioremediation materials |
| DE102006056341A1 (de) * | 2006-11-29 | 2008-06-05 | Emc Gmbh | Verfahren zur Selektion von aus Böden isolierten Mikroorganismen |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4493895A (en) * | 1981-09-24 | 1985-01-15 | Occidental Chemical Corporation | Microbial degradation of obnoxious organic wastes into innocuous materials |
| US4535061A (en) * | 1981-12-28 | 1985-08-13 | University Of Illinois Foundation | Bacteria capable of dissimilation of environmentally persistent chemical compounds |
| US4511657A (en) * | 1982-05-25 | 1985-04-16 | Occidental Chemical Corporation | Treatment of obnoxious chemical wastes |
| US4859594A (en) * | 1986-10-14 | 1989-08-22 | Louisana State University Board Of Supervisors, Louisana State University | Microorganisms for biodegrading toxic chemicals |
| CZ318494A3 (cs) * | 1994-12-16 | 1996-11-13 | Kastanek Frantisek | Způsob dekontaminace vod kontaminovaných polychlorovanými bifenyly kombinacíjejich sorpce a následné biodegradace selektovanými bakteriemi |
| JPH0975074A (ja) | 1995-09-14 | 1997-03-25 | Unitika Ltd | バクフォルデリアｎ３７２ｂ株及び１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸で汚染された水又は土壌の浄化方法 |
| JP2787015B2 (ja) | 1995-09-25 | 1998-08-13 | 泰則 松葉 | 油脂資化性細菌およびそれを使用した油脂の処理方法 |
| MY118003A (en) * | 1996-04-22 | 2004-08-30 | Toyota Motor Co Ltd | Microorganisms that decompose halogenated hydrocarbons and their use |
| JP3030370B2 (ja) | 1997-02-14 | 2000-04-10 | 農林水産省農業環境技術研究所長 | 土壌中の有機汚染物質を分解する分解菌の集積方法及びそれを用いた分解菌の単離方法 |
-
1998
- 1998-05-18 JP JP10135156A patent/JP2904432B1/ja not_active Expired - Fee Related
-
1999
- 1999-05-11 EP EP99918364A patent/EP1002858A4/en not_active Withdrawn
- 1999-05-11 AU AU36301/99A patent/AU735417B2/en not_active Ceased
- 1999-05-11 US US09/462,877 patent/US6498028B1/en not_active Expired - Fee Related
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- 1999-05-11 CA CA002296658A patent/CA2296658A1/en not_active Abandoned
- 1999-05-11 WO PCT/JP1999/002420 patent/WO1999060098A1/ja not_active Application Discontinuation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｈｏｒｉｋｏｓｈｉ ｅｔ Ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ａｎｄ ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｓｏｃｉｅｔｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ，１９９７，ｐ．１１３−１２１ |
Also Published As
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|---|---|
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| CA2296658A1 (en) | 1999-11-25 |
| EP1002858A4 (en) | 2005-09-14 |
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