JP2793850B2 - 蛍光染料 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の分野 サンプル中の被検物質の検出の方法および試薬には絶
えず改良の必要がある。被検物質は、リガンドとその対
応受容体からなる特異的結合ペア（sbp）の一要素であ
つてよい。sbp要素の例としては、抗原および抗体があ
る。
えず改良の必要がある。被検物質は、リガンドとその対
応受容体からなる特異的結合ペア（sbp）の一要素であ
つてよい。sbp要素の例としては、抗原および抗体があ
る。
一般には、抗原に対して相補性のsbp要素が検定試薬
として使用される。検出検定に用いられる他の試薬はそ
の検定への使用に適当であるためには特定の性質をもた
なければならない。被検物質が粒子の表面上にあるかま
たは粒子に結合できるものである場合には、被検物質と
その対応sbp要素の間の反応を妨害することなく、再現
性ある様式でその粒子を染色できる染料、たとえば螢光
染料の使用が望ましい。
として使用される。検出検定に用いられる他の試薬はそ
の検定への使用に適当であるためには特定の性質をもた
なければならない。被検物質が粒子の表面上にあるかま
たは粒子に結合できるものである場合には、被検物質と
その対応sbp要素の間の反応を妨害することなく、再現
性ある様式でその粒子を染色できる染料、たとえば螢光
染料の使用が望ましい。
哺乳類動物の赤血球は多数の抗原をもつていて、その
一部は、たとえば輸血のような医療操作に際して患者お
よび供血者の両者において正確に同定する必要がある。
A,B,AB,OおよびＤ（Rh0）の血液型の正確を決定はとく
に重要である。また、このような血液型抗原ならびに循
環抗原に対する抗体が、診断上重要な場合もある。
一部は、たとえば輸血のような医療操作に際して患者お
よび供血者の両者において正確に同定する必要がある。
A,B,AB,OおよびＤ（Rh0）の血液型の正確を決定はとく
に重要である。また、このような血液型抗原ならびに循
環抗原に対する抗体が、診断上重要な場合もある。
通常は、顕微鏡スライド上または試験管内で凝集法を
行い、結果は視覚的に評価されている。実施される検定
の重要性、このような検定の労働強度および試験が必要
な厖大なサンプル数から考えて、迅速、正確で、自動化
された血液スクリーング法の改良が望まれる。
行い、結果は視覚的に評価されている。実施される検定
の重要性、このような検定の労働強度および試験が必要
な厖大なサンプル数から考えて、迅速、正確で、自動化
された血液スクリーング法の改良が望まれる。
発明の背景 この分野の研究者は、基本骨格としてスクアル酸（sq
uaric acid） の構造をもつ様な様々な化合物を記述するのに、スクア
レート、スクアレインおよびスクアリリウムのような語
を用いている。
uaric acid） の構造をもつ様な様々な化合物を記述するのに、スクア
レート、スクアレインおよびスクアリリウムのような語
を用いている。
この発明の目的において、他の研究者の報告を引用す
る場合には、その個々の文献に用いられている用語を使
用する。本発明を記述するに際しては、スクアル酸から
誘導され、所望の螢光染色性をもつように修飾されるス
クアレイン化合物を指す場合、「スクアレイン」の語を
用いることとする。
る場合には、その個々の文献に用いられている用語を使
用する。本発明を記述するに際しては、スクアル酸から
誘導され、所望の螢光染色性をもつように修飾されるス
クアレイン化合物を指す場合、「スクアレイン」の語を
用いることとする。
様々なスクアル酸染料が、Sprengerら（Angew.Chem.,
80:541,1968）:Sprengerら（Angew.Chem.,79:581,196
7）;Sprengerら（Angew.Chem.Internat.Edit.,５:894,1
966）およびmaaksら（同誌、５:888,1966）によつて記
載されている。
80:541,1968）:Sprengerら（Angew.Chem.,79:581,196
7）;Sprengerら（Angew.Chem.Internat.Edit.,５:894,1
966）およびmaaksら（同誌、５:888,1966）によつて記
載されている。
600nm以上に吸収極大を有し、親水性もしくは親油性
のいずれかを示す新規なスクアレイン染料が、係属中の
米国特許出願第834,168号（1986年２月27日出願）に記
載されている。
のいずれかを示す新規なスクアレイン染料が、係属中の
米国特許出願第834,168号（1986年２月27日出願）に記
載されている。
新規なスクアレイン染料を用いるリガンドおよび受容
体の検定は、係属中の米国特許出願第773,401号（1985
年９月６日出願；欧州特許出願第86306859.9号、カナダ
特許出願SN517566号および日本特許出願61−210516号に
相当）に記載されている。細胞への取り込みが可能な螢
光染料を用いる検定方法も米国特許第4,748,129号に記
載されている。赤血球のスクリーニングのための、受容
体に抱合した螢光ビーズの使用については、米国特許第
4,550,017号に記載がある。
体の検定は、係属中の米国特許出願第773,401号（1985
年９月６日出願；欧州特許出願第86306859.9号、カナダ
特許出願SN517566号および日本特許出願61−210516号に
相当）に記載されている。細胞への取り込みが可能な螢
光染料を用いる検定方法も米国特許第4,748,129号に記
載されている。赤血球のスクリーニングのための、受容
体に抱合した螢光ビーズの使用については、米国特許第
4,550,017号に記載がある。
赤血球抗原の凝集法による同定は標準的な方法であ
り、たとえばC.Hudson ＆ F.C.Hay著:Practical Immuno
logy,第２版、Blackwell Scientific Publications,Oxf
ord（1980）に記載がある。米国特許第3,862,303号に
は、ラテツクスビーズのような担体粒子を用いる血清因
子の免疫学的検出および同定の典型的な例が記載されて
いる。螢光免疫検定はSmith（FEBS Lett.,77:25,1977）
によつて報告されている。
り、たとえばC.Hudson ＆ F.C.Hay著:Practical Immuno
logy,第２版、Blackwell Scientific Publications,Oxf
ord（1980）に記載がある。米国特許第3,862,303号に
は、ラテツクスビーズのような担体粒子を用いる血清因
子の免疫学的検出および同定の典型的な例が記載されて
いる。螢光免疫検定はSmith（FEBS Lett.,77:25,1977）
によつて報告されている。
さらに最近になつて、電子写真画像処理システムの電
子写真板の製造に用いられるスクアル酸化合物が報告さ
れている。とくに光伝導能を有するスクアル酸染料が米
国特許第4,500,621号に記載されている。赤外および可
視イルミネーシヨンに対して感受性を有する感光装置に
おける他のスクアレイン化合物の利用が米国特許第4,50
8,803号に記載されている。とくに、スクアル酸のフル
オロベンジルアミノ誘導体について述べられている。
子写真板の製造に用いられるスクアル酸化合物が報告さ
れている。とくに光伝導能を有するスクアル酸染料が米
国特許第4,500,621号に記載されている。赤外および可
視イルミネーシヨンに対して感受性を有する感光装置に
おける他のスクアレイン化合物の利用が米国特許第4,50
8,803号に記載されている。とくに、スクアル酸のフル
オロベンジルアミノ誘導体について述べられている。
電子写真術におけるスクアル酸化合物のさらに他の使
用例としては、ヒドロキシル基またはハロゲン原子が結
合した直鎖アルキル基を有するスクアリリウム化合物が
米国特許第4,707,427号に記載されている。
用例としては、ヒドロキシル基またはハロゲン原子が結
合した直鎖アルキル基を有するスクアリリウム化合物が
米国特許第4,707,427号に記載されている。
発明の要約 サンプル中における、リガンドおよびその対応受容体
からなる特異的結合ペアの一要素（sbp要素）の存在を
測定するための螢光剤が提供される。この螢光剤は、全
血または他の水性メジウム懸濁液中の細胞によつて容易
に取り込まれるスクアレイン染料である。本発明の一態
様においては、スクアレイン染料は、本明細書では界面
活性染料と呼ぶ一群のスクアル酸染料から選ばれる。こ
の染料は、タンパク質や他の血漿成分の存在下に細胞内
にはいつて細胞により保持されるように設計されてい
る。染料の漏出は起こるとしても、きわめて遅い。
からなる特異的結合ペアの一要素（sbp要素）の存在を
測定するための螢光剤が提供される。この螢光剤は、全
血または他の水性メジウム懸濁液中の細胞によつて容易
に取り込まれるスクアレイン染料である。本発明の一態
様においては、スクアレイン染料は、本明細書では界面
活性染料と呼ぶ一群のスクアル酸染料から選ばれる。こ
の染料は、タンパク質や他の血漿成分の存在下に細胞内
にはいつて細胞により保持されるように設計されてい
る。染料の漏出は起こるとしても、きわめて遅い。
本発明のスクアレイン染料は、式 で表される化合物である。
式中、R1およびR2は独立に、低級アルキル（炭素原子
１〜５個）からなる群より選ばれるが、R1およびR2基の
少なくとも一方は−SO3H、−OSO3H、−PO3H2、−OPO
3H2、−COOHおよび−NHSO3Hからなる群より選ばれる置
換基を有し、R3およびR4は独立に、アルキル（炭素原子
５〜15個）からなる群より選ばれ、R5およびR6は独立
に、水素、ヒドロキシルおよび低級アルコキシル（炭素
原子１〜５個）からなる群より選ばれる。
１〜５個）からなる群より選ばれるが、R1およびR2基の
少なくとも一方は−SO3H、−OSO3H、−PO3H2、−OPO
3H2、−COOHおよび−NHSO3Hからなる群より選ばれる置
換基を有し、R3およびR4は独立に、アルキル（炭素原子
５〜15個）からなる群より選ばれ、R5およびR6は独立
に、水素、ヒドロキシルおよび低級アルコキシル（炭素
原子１〜５個）からなる群より選ばれる。
本発明の方法においては、sbp要素を含有すると考え
られるサンプルを、水性メジウム中、相補性sbp要素と
混合する。この場合、sbp要素またはその相補性sbp要素
が少なくとも細胞の表面に結合される。細胞は、細胞内
に取り込まれる螢光剤、すなわちスクアレイ染料で染色
する。sbp要素の存在は、細胞の凝集の結果としての細
胞懸濁液の螢光の変化によつて指示される。
られるサンプルを、水性メジウム中、相補性sbp要素と
混合する。この場合、sbp要素またはその相補性sbp要素
が少なくとも細胞の表面に結合される。細胞は、細胞内
に取り込まれる螢光剤、すなわちスクアレイ染料で染色
する。sbp要素の存在は、細胞の凝集の結果としての細
胞懸濁液の螢光の変化によつて指示される。
本発明は、血液型判定、たとえば血液型抗原A,B,AB,
O,D（Rh0）、およびこの種類の抗原に対する抗体、なら
びに抗原M,N,S,s,Lewis,Lutheran,Kell,Duffy,Kidd等に
対する抗体の存在の測定にとくに応用できる。
O,D（Rh0）、およびこの種類の抗原に対する抗体、なら
びに抗原M,N,S,s,Lewis,Lutheran,Kell,Duffy,Kidd等に
対する抗体の存在の測定にとくに応用できる。
特定の態様の説明 本発明は、サンプル中の被検物質、通常はsbp要素の
存在を測定するための新規な試薬およびその試薬の製造
方法を提供する。この検出方法では、相補性sbp要素を
使用し、この場合、sbp要素またはその相補性sbp要素の
少なくとも一方が細胞の表面に結合される。また、この
方法では、細胞内に取り込まれる螢光剤が使用される。
存在を測定するための新規な試薬およびその試薬の製造
方法を提供する。この検出方法では、相補性sbp要素を
使用し、この場合、sbp要素またはその相補性sbp要素の
少なくとも一方が細胞の表面に結合される。また、この
方法では、細胞内に取り込まれる螢光剤が使用される。
好ましくは、サンプル中のsbp要素が細胞の表面に結
合せず、サンプルが細胞を含む場合には、最初、相補性
sbp要素に結合する細胞中に螢光剤を取り込ませ、つい
でこの配合物をサンプルと混合することによつて、螢光
剤をサンプルと混合する。サンプルが細胞を含まない場
合には、染料はサンプルと細胞を混合する前もしくは後
に加えてもよく、またサンプルを染色細胞と混合しても
よい。サンプル中のsbp要素が細胞表面に結合する場合
には、螢光剤は、サンプルを相補性sbp要素と混合する
前後いずれの時点でサンプルと混合してもよい。好まし
くは、螢光剤はサンプルと相補性sbp要素を混合する前
にサンプルに添加される。したがつて、「サンプルと混
合する」の語は、上述の２種または３種以上の試薬を、
残りの試薬と混合する前に、互いに混合することを含む
意味である。「試薬」の語は、サンプル、相補性sbp要
素（細胞に結合するかまたは結合しない）、および細胞
に取り込まれる螢光剤を包含し、また本方法の好都合な
操作に必要な任意の付加的試薬をさらに包含するもので
ある。
合せず、サンプルが細胞を含む場合には、最初、相補性
sbp要素に結合する細胞中に螢光剤を取り込ませ、つい
でこの配合物をサンプルと混合することによつて、螢光
剤をサンプルと混合する。サンプルが細胞を含まない場
合には、染料はサンプルと細胞を混合する前もしくは後
に加えてもよく、またサンプルを染色細胞と混合しても
よい。サンプル中のsbp要素が細胞表面に結合する場合
には、螢光剤は、サンプルを相補性sbp要素と混合する
前後いずれの時点でサンプルと混合してもよい。好まし
くは、螢光剤はサンプルと相補性sbp要素を混合する前
にサンプルに添加される。したがつて、「サンプルと混
合する」の語は、上述の２種または３種以上の試薬を、
残りの試薬と混合する前に、互いに混合することを含む
意味である。「試薬」の語は、サンプル、相補性sbp要
素（細胞に結合するかまたは結合しない）、および細胞
に取り込まれる螢光剤を包含し、また本方法の好都合な
操作に必要な任意の付加的試薬をさらに包含するもので
ある。
本発明の方法の一態様の実施に際しては、サンプル、
相補性sbp要素、および細胞に取り込まれる螢光剤を水
性検定メジウム中に混合し、細胞の凝集の結果としての
混合物の螢光の変化をついで測定する。サンプル中のsb
p要素の存在は、この螢光の変化によつて示される。
相補性sbp要素、および細胞に取り込まれる螢光剤を水
性検定メジウム中に混合し、細胞の凝集の結果としての
混合物の螢光の変化をついで測定する。サンプル中のsb
p要素の存在は、この螢光の変化によつて示される。
この方法は、広範囲のsbp要素被検物質についての広
範囲の検定測定法に適用することができる。sbp要素お
よび相補性sbp要素の少なくとも一方が、細胞表面の正
常成分である場合に、この方法はとくに有利である。細
胞表面sbp要素としては、天然の膜成分たとえば抗原、
細胞壁抗原、とくに細菌細胞壁、細胞表面受容体たとえ
ば活性化、成長および阻止因子に対する受容体、抗体、
HLA抗原、Fc受容体、ホルモン受容体、イオンチヤネ
ル、糖脂質、リポタンパク質、補体成分、ウイルス抗
原、膜結合酵素、ペプチドグリカン、かび抗原、イデイ
オタイプ抗原等が包含される。興味ある細胞の種類に
は、白血球、細菌かび細胞、赤血球、網状赤血球、リン
パ球たとえば単球、マクロフアージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、
好酸球等がある。本方法がとくに適合するのは、血液型
判定の分野である。血液型抗原、ならびにそれに対する
抗体が上述の方法を用いて確認できる。
範囲の検定測定法に適用することができる。sbp要素お
よび相補性sbp要素の少なくとも一方が、細胞表面の正
常成分である場合に、この方法はとくに有利である。細
胞表面sbp要素としては、天然の膜成分たとえば抗原、
細胞壁抗原、とくに細菌細胞壁、細胞表面受容体たとえ
ば活性化、成長および阻止因子に対する受容体、抗体、
HLA抗原、Fc受容体、ホルモン受容体、イオンチヤネ
ル、糖脂質、リポタンパク質、補体成分、ウイルス抗
原、膜結合酵素、ペプチドグリカン、かび抗原、イデイ
オタイプ抗原等が包含される。興味ある細胞の種類に
は、白血球、細菌かび細胞、赤血球、網状赤血球、リン
パ球たとえば単球、マクロフアージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、
好酸球等がある。本方法がとくに適合するのは、血液型
判定の分野である。血液型抗原、ならびにそれに対する
抗体が上述の方法を用いて確認できる。
本方法は、赤血球を、検定時に凝集し、螢光を取り込
む担体として用いることにより、赤血球型の判定または
赤血球抗原およびそれに対する抗体の同定にとくに有用
である。凝集の結果としての螢光変化を測定する。これ
が特定の赤血球抗原またはそれに対する抗体の存在の指
標となる。赤血球抗原に結合する物質、通常は抗体また
はレクチンが、細胞の凝集を引き起こすのに必要であ
る。血液型抗原を測定する本発明の一態様においては、
全血を、水性メジウムたとえば適当な緩衝液中で細胞に
取り込まれる螢光剤および興味ある抗原に対する受容体
と混合する。興味ある抗原が血液中の赤血球の表面に存
在する場合には、凝集を生じ、興味ある抗原の存在の指
標としての螢光の変化が観察されることになる。
む担体として用いることにより、赤血球型の判定または
赤血球抗原およびそれに対する抗体の同定にとくに有用
である。凝集の結果としての螢光変化を測定する。これ
が特定の赤血球抗原またはそれに対する抗体の存在の指
標となる。赤血球抗原に結合する物質、通常は抗体また
はレクチンが、細胞の凝集を引き起こすのに必要であ
る。血液型抗原を測定する本発明の一態様においては、
全血を、水性メジウムたとえば適当な緩衝液中で細胞に
取り込まれる螢光剤および興味ある抗原に対する受容体
と混合する。興味ある抗原が血液中の赤血球の表面に存
在する場合には、凝集を生じ、興味ある抗原の存在の指
標としての螢光の変化が観察されることになる。
用いられる受容体は、興味ある血液型表面抗原に優先
的に結合する。したがつて、与えられた赤血球サンプル
中に、与えられた抗原が存在する場合には、与えられた
抗原が存在しない場合に比べて、螢光分析法で測定可能
な変化を生じる。たとえば、A,B,Oシステムでは、抗−
Ａ抗体を使用した場合や、被検物質がＡ型またはAB型血
液のＡ抗原を含有すれば、被検物質がＢ型またはＯ型血
液を含む場合以上に凝集を生じ、螢光の変化がある。
的に結合する。したがつて、与えられた赤血球サンプル
中に、与えられた抗原が存在する場合には、与えられた
抗原が存在しない場合に比べて、螢光分析法で測定可能
な変化を生じる。たとえば、A,B,Oシステムでは、抗−
Ａ抗体を使用した場合や、被検物質がＡ型またはAB型血
液のＡ抗原を含有すれば、被検物質がＢ型またはＯ型血
液を含む場合以上に凝集を生じ、螢光の変化がある。
抗体のほかに、ある種のレクチンが赤血球表面抗原と
様々な程度に結合することが知られていて、本検定に使
用するのに便利な受容体である。
様々な程度に結合することが知られていて、本検定に使
用するのに便利な受容体である。
本方法はまた、赤血球抗原に対する抗体の存在を測定
するために使用することもできる。この検定方法では、
問題の抗体に対応する表面抗原を有する赤血球が使用さ
れる。抗原をもつ細胞と螢光剤を好ましくは最初に混合
し、ついで水性メジウム中のサンプルと混合する。問題
の抗体がサンプル中に存在する場合には、凝集の結果と
して、螢光の変化を生じる。この場合、螢光の変化は問
題の抗体の存在の指標となる。
するために使用することもできる。この検定方法では、
問題の抗体に対応する表面抗原を有する赤血球が使用さ
れる。抗原をもつ細胞と螢光剤を好ましくは最初に混合
し、ついで水性メジウム中のサンプルと混合する。問題
の抗体がサンプル中に存在する場合には、凝集の結果と
して、螢光の変化を生じる。この場合、螢光の変化は問
題の抗体の存在の指標となる。
本方法はまた、交差適合性の決定にも重要である。こ
の決定には、供血者の血液と受血候補者の血液を混合
し、この混合物を本発明の方法に従つて処理する。好ま
しくは、供血者の血液は、患者のサンプルと混合する前
に螢光剤と混合する。一般に、陽性シグナルは交差不適
合を示す。
の決定には、供血者の血液と受血候補者の血液を混合
し、この混合物を本発明の方法に従つて処理する。好ま
しくは、供血者の血液は、患者のサンプルと混合する前
に螢光剤と混合する。一般に、陽性シグナルは交差不適
合を示す。
本方法は単純で、かなり短時間での実施が可能であ
る。大抵の場合、試薬は同時に添加することができる。
遊離の螢光剤およびサンプル中の内因性物質によるバツ
クグランド干渉は微小である。螢光の変化は連続したバ
ツクグランド上で測定できる。本方法のとくに有利な点
は、分離または洗浄工程が全く不要なことである。検定
メジウムまたは混合物から、細胞の凝集の結果としての
螢光の変化を直接観測することができる。
る。大抵の場合、試薬は同時に添加することができる。
遊離の螢光剤およびサンプル中の内因性物質によるバツ
クグランド干渉は微小である。螢光の変化は連続したバ
ツクグランド上で測定できる。本方法のとくに有利な点
は、分離または洗浄工程が全く不要なことである。検定
メジウムまたは混合物から、細胞の凝集の結果としての
螢光の変化を直接観測することができる。
さらに説明を続ける前に、多くの用語について定義す
る。
る。
「細胞に取り込まれる螢光剤」−−分子量2000未満、細
胞内への取り込みが可能で、細胞に螢光を付与する化合
物で、たとえば細胞膜可溶性染料、DNA挿入染料、生体
染料等である。
胞内への取り込みが可能で、細胞に螢光を付与する化合
物で、たとえば細胞膜可溶性染料、DNA挿入染料、生体
染料等である。
「sbp要素」−−２種の異なる分子からなる特異的結合
ペアの一要素。２種の分子の一方は、他の分子の特定の
空間的、極性的構成に特異的に結合する表面上または空
洞内領域を有する。特異的結合ペアの二要素は、リガン
ドと受容体（抗リガンド）とも呼ばれ、また、相補性も
しくは対応とも呼ばれる。
ペアの一要素。２種の分子の一方は、他の分子の特定の
空間的、極性的構成に特異的に結合する表面上または空
洞内領域を有する。特異的結合ペアの二要素は、リガン
ドと受容体（抗リガンド）とも呼ばれ、また、相補性も
しくは対応とも呼ばれる。
「リガンド」−−受容体が天然に存在するかまたは製造
できる任意の有機化合物 「受容体」（抗リガンド）−−ある分子の特定の空間的
および極性的構成、すなわちエピトープまたは抗原決定
部位を認識できる（それに高い結合親和性を有する）任
意の巨大分子化合物または組成物。受容体の例には、天
然の受容体、たとえばサイロキシン結合グロブリン、抗
体、酵素、Fabフラグメント、レクチン等がある。抗体
の語はこの場合、受容体の例証として、もつと一般的な
意味で用いられている。
できる任意の有機化合物 「受容体」（抗リガンド）−−ある分子の特定の空間的
および極性的構成、すなわちエピトープまたは抗原決定
部位を認識できる（それに高い結合親和性を有する）任
意の巨大分子化合物または組成物。受容体の例には、天
然の受容体、たとえばサイロキシン結合グロブリン、抗
体、酵素、Fabフラグメント、レクチン等がある。抗体
の語はこの場合、受容体の例証として、もつと一般的な
意味で用いられている。
「被検物質」−−測定すべき化合物または組成物。sbp
要素であり、リガンドであつてもない。１価もしくは多
価、すなわち１個または複数個の決定基を有する。ハプ
テンおよび抗原が含まれる。単一の化合物でも、また少
くとも１個の共通のエピトープまたは決定基があれば複
数の化合物であつてもよい。受容体でもよい。
要素であり、リガンドであつてもない。１価もしくは多
価、すなわち１個または複数個の決定基を有する。ハプ
テンおよび抗原が含まれる。単一の化合物でも、また少
くとも１個の共通のエピトープまたは決定基があれば複
数の化合物であつてもよい。受容体でもよい。
「相補性sbp要素」−−sbp要素が被検物質である場合、
その特異的結合ペアの対応要素。
その特異的結合ペアの対応要素。
「細胞」−−任意の微小原形質構成体で、有機化された
組織を形成する。原形質密集体からなり、膜によつて囲
まれる。有核および無核のものがあり、細胞小器官を包
含する。
組織を形成する。原形質密集体からなり、膜によつて囲
まれる。有核および無核のものがあり、細胞小器官を包
含する。
細胞に取り込まれる螢光剤は、細胞に取り込まれたの
ち、螢光が増大するものが好ましい。この螢光剤は、細
胞膜に可溶性であることまたは細胞膜透過性であること
によつて細胞内に取り込まれ、細胞外への輸送が阻止さ
れる化学反応を受ける。タンパク質または炭水化物と高
い親和性を有する螢光剤も本発明に有用である。細胞が
デオキシリポ核酸（DNA）を有する場合には、DNAと親和
性を有する螢光剤を使用することもできる。細胞に取り
込まれる螢光剤は、親水性担体に結合することによつて
水溶性になる疎水性染料であつてもよい。
ち、螢光が増大するものが好ましい。この螢光剤は、細
胞膜に可溶性であることまたは細胞膜透過性であること
によつて細胞内に取り込まれ、細胞外への輸送が阻止さ
れる化学反応を受ける。タンパク質または炭水化物と高
い親和性を有する螢光剤も本発明に有用である。細胞が
デオキシリポ核酸（DNA）を有する場合には、DNAと親和
性を有する螢光剤を使用することもできる。細胞に取り
込まれる螢光剤は、親水性担体に結合することによつて
水溶性になる疎水性染料であつてもよい。
細胞に取り込まれる螢光剤は、生物学的干渉を最大限
回避するために、好ましくは540nm以上、さらに好まし
くは540nm以上の極大吸収をもたねばならない。大抵の
場合、極大吸収波長は320〜1000nm、好ましくは600〜80
0nmでなければならない。
回避するために、好ましくは540nm以上、さらに好まし
くは540nm以上の極大吸収をもたねばならない。大抵の
場合、極大吸収波長は320〜1000nm、好ましくは600〜80
0nmでなければならない。
細胞に取り込まれる螢光剤の励起光の波長におけるモ
ル吸光係数は、実用的に大きいことが必要で、1,000以
上、好ましくは10,000以上、とくに好ましくは100,000l
・mol-1・cm-1以上でなければならない。細胞に取り込
まれる螢光剤は高い量子収量をもつものが選ばれ、細胞
に取り込まれた場合、通常0.05以上、好ましくは0.3以
上である。励起波長は、サンプルからのバツクグランド
螢光を最小にし、染色細胞の螢光を最大にし、光源の強
度およびフイルターの信頼度を最大にするように選択さ
れる。とくに有利な波長は488nmおよび515nm、ならびに
633nmである。これらの波長はそれぞれ、アルゴン、ア
ルゴンおよびヘリウム／ネオン（He/Ne）レーザーから
得られるからである。一般に、波長が長いほどバツクグ
ランドは小さくなる。633nmに調整したHe/Neレーザーが
とくに望ましく、したがつて633nmで高い量子収量およ
び高いモル吸光係数をもつ染料が好ましい。
ル吸光係数は、実用的に大きいことが必要で、1,000以
上、好ましくは10,000以上、とくに好ましくは100,000l
・mol-1・cm-1以上でなければならない。細胞に取り込
まれる螢光剤は高い量子収量をもつものが選ばれ、細胞
に取り込まれた場合、通常0.05以上、好ましくは0.3以
上である。励起波長は、サンプルからのバツクグランド
螢光を最小にし、染色細胞の螢光を最大にし、光源の強
度およびフイルターの信頼度を最大にするように選択さ
れる。とくに有利な波長は488nmおよび515nm、ならびに
633nmである。これらの波長はそれぞれ、アルゴン、ア
ルゴンおよびヘリウム／ネオン（He/Ne）レーザーから
得られるからである。一般に、波長が長いほどバツクグ
ランドは小さくなる。633nmに調整したHe/Neレーザーが
とくに望ましく、したがつて633nmで高い量子収量およ
び高いモル吸光係数をもつ染料が好ましい。
さらに、細胞に取り込まれる螢光剤は、使用される励
起波長よりも好ましくは少なくとも15nm、さらに好まし
くは少なくとも30nm長い発光極大を有することが望まし
い。一般的に、このような螢光剤には、吸収極大と発光
極大の間に十分な波長の間隔もしくは差のあることが好
ましい。
起波長よりも好ましくは少なくとも15nm、さらに好まし
くは少なくとも30nm長い発光極大を有することが望まし
い。一般的に、このような螢光剤には、吸収極大と発光
極大の間に十分な波長の間隔もしくは差のあることが好
ましい。
螢光剤は、検定時を通して細胞内に取り込まれたまま
でなければならない。とくに、このような螢光剤を含む
細胞が、他の細胞を含むサンプルと混合される場合、そ
れが必要である。さらに、細胞に取り込まれる螢光剤
は、細胞に取り込まれた場合、水性環境にある場合に比
べて消光しないことが好ましい。すなわち、螢光剤が細
胞内に取り込まれた場合、細胞に取り込まれていない場
合に比べて、与えられた励起波長における吸光係数と量
子収量の積が著しく低下してはならない。螢光の増大は
必要ではないが、細胞に取り込まれる螢光剤の螢光は、
細胞内でも、細胞に取り込まれていないときと少なくと
も等しいことが通常好ましい。
でなければならない。とくに、このような螢光剤を含む
細胞が、他の細胞を含むサンプルと混合される場合、そ
れが必要である。さらに、細胞に取り込まれる螢光剤
は、細胞に取り込まれた場合、水性環境にある場合に比
べて消光しないことが好ましい。すなわち、螢光剤が細
胞内に取り込まれた場合、細胞に取り込まれていない場
合に比べて、与えられた励起波長における吸光係数と量
子収量の積が著しく低下してはならない。螢光の増大は
必要ではないが、細胞に取り込まれる螢光剤の螢光は、
細胞内でも、細胞に取り込まれていないときと少なくと
も等しいことが通常好ましい。
細胞に取り込まれる螢光剤の他の性質としては、sbp
要素の結合、たとえば抗原と抗体の結合を妨害しないこ
とがある。細胞に取り込まれる螢光剤はまた、細胞に対
して高い親和性を示すことが好ましい。
要素の結合、たとえば抗原と抗体の結合を妨害しないこ
とがある。細胞に取り込まれる螢光剤はまた、細胞に対
して高い親和性を示すことが好ましい。
細胞に取り込まれる螢光剤の細胞あたりの分子数は、
効果的に検定を実施するのに十分な数でなければならな
いが、一般には、細胞個あたり、この種の分子約102〜1
07個、好ましくは103〜106個である。
効果的に検定を実施するのに十分な数でなければならな
いが、一般には、細胞個あたり、この種の分子約102〜1
07個、好ましくは103〜106個である。
上述のように、好ましいクラスの細胞に取り込まれる
螢光剤は細胞膜に可溶性の螢光染料である。これは染料
が疎水性であることを意味し、細胞の水性懸濁液に添加
した場合に適当な時間内に細胞内に取り込まれるための
十分な水溶性も必要なことから、通常は両性であること
になる。好ましい膜可溶性染料の群には、吸収極大600n
m以上で適当なモル吸光係数およびストークスのシフト
を有するある種のスクアレイン染料が包含される。
螢光剤は細胞膜に可溶性の螢光染料である。これは染料
が疎水性であることを意味し、細胞の水性懸濁液に添加
した場合に適当な時間内に細胞内に取り込まれるための
十分な水溶性も必要なことから、通常は両性であること
になる。好ましい膜可溶性染料の群には、吸収極大600n
m以上で適当なモル吸光係数およびストークスのシフト
を有するある種のスクアレイン染料が包含される。
細胞に取り込まれる螢光剤の好ましいクラスは、実質
的に非希釈の全血、すなわち２倍以上に希釈されていな
い血液中で細胞を染色する。これらの染料のとくに好ま
しいサブクラスは、細胞が異なるメジウムで希釈され、
それに懸濁される検定の過程を通じ、有意な程度に細胞
から放出されないものである。すなわち、純血漿とイン
キユベートした場合、染色細胞の螢光の低下は10分で30
％未満、好ましくは20分で20％未満、とくに好ましくは
30分で10％未満である。
的に非希釈の全血、すなわち２倍以上に希釈されていな
い血液中で細胞を染色する。これらの染料のとくに好ま
しいサブクラスは、細胞が異なるメジウムで希釈され、
それに懸濁される検定の過程を通じ、有意な程度に細胞
から放出されないものである。すなわち、純血漿とイン
キユベートした場合、染色細胞の螢光の低下は10分で30
％未満、好ましくは20分で20％未満、とくに好ましくは
30分で10％未満である。
このような染料の典型例としては、それに限定される
ものではないが、例えば、式 〔式中、R1およびR2は独立に、低級アルキル（炭素原子
１〜５個）からなる群より選ばれ、非置換でも、また−
SO3H,−COOH,−PO3H2,−OSO3H,−OPO3H2およびそれらの
塩からなる群より選ばれる１個もしくは２個以上の置換
基で置換されていてもよく、R3およびR4はそれぞれ独立
に、５〜15個の炭素原子を有するアルキルからなる群よ
り選ばれ、R5およびR6は独立に、水素、ヒドロキシルお
よび低級アルコキシル（炭素１〜５個）からなる群より
選ばれる〕で表される染料を挙げることができる。
ものではないが、例えば、式 〔式中、R1およびR2は独立に、低級アルキル（炭素原子
１〜５個）からなる群より選ばれ、非置換でも、また−
SO3H,−COOH,−PO3H2,−OSO3H,−OPO3H2およびそれらの
塩からなる群より選ばれる１個もしくは２個以上の置換
基で置換されていてもよく、R3およびR4はそれぞれ独立
に、５〜15個の炭素原子を有するアルキルからなる群よ
り選ばれ、R5およびR6は独立に、水素、ヒドロキシルお
よび低級アルコキシル（炭素１〜５個）からなる群より
選ばれる〕で表される染料を挙げることができる。
上記一般式において、R1およびR2が−SO3H,−COOH,−
PO3H,−OSO3H,−OPO3H、またはそれらの塩からなる群よ
り選ばれる１個または２個以上の置換基で置換されてい
る一群のスクアル酸染料は、「界面活性染料］と呼ばれ
る。
PO3H,−OSO3H,−OPO3H、またはそれらの塩からなる群よ
り選ばれる１個または２個以上の置換基で置換されてい
る一群のスクアル酸染料は、「界面活性染料］と呼ばれ
る。
本発明のスクアレイン染料は、式 で示される化合物である。
式中、R1およびR2は独立に、低級アルキル（炭素原子
１〜５個）からなる群より選択されるが、R1およびR2基
の少なくとも一方は、−SO3H,−OSO3H,−PO3H2,−OPO3H
2,−COOHおよび−NHSO3Hからなる基より選ばれる置換基
を有し、R3およびR4は独立に、アルキル（炭素原子５〜
15個）からなる群より選ばれ、R5およびR6は独立に、水
素、ヒドロキシルおよび低級アルコキシル（炭素原子１
〜５個）からなる群より選ばれる。
１〜５個）からなる群より選択されるが、R1およびR2基
の少なくとも一方は、−SO3H,−OSO3H,−PO3H2,−OPO3H
2,−COOHおよび−NHSO3Hからなる基より選ばれる置換基
を有し、R3およびR4は独立に、アルキル（炭素原子５〜
15個）からなる群より選ばれ、R5およびR6は独立に、水
素、ヒドロキシルおよび低級アルコキシル（炭素原子１
〜５個）からなる群より選ばれる。
このクラスのスクアレイン化合物は、スクアル酸を、
親水性が著しく異なる２種の基にカツプリングさせるこ
とによつて製造するのが好ましい。これらの界面活性染
料は、イオン化して陽イオンまたは陰イオン、好ましく
は陰イオンを生成できる基、とくに好ましくはスルホン
酸を含有し、600nm以上の吸収極大と、高い吸光係数お
よび高い螢光量子収量を有する。
親水性が著しく異なる２種の基にカツプリングさせるこ
とによつて製造するのが好ましい。これらの界面活性染
料は、イオン化して陽イオンまたは陰イオン、好ましく
は陰イオンを生成できる基、とくに好ましくはスルホン
酸を含有し、600nm以上の吸収極大と、高い吸光係数お
よび高い螢光量子収量を有する。
界面活性染料は、極性非プロトン溶媒および慣用溶媒
の存在下に合成するのが便利である。慣用溶媒には低級
アルコール：芳香族溶媒混合物たとえばｎ−ブタノー
ル：ベンゼン、ｎ−ブタノール：トルエン等が包含され
る。アルコール：芳香族溶媒混合物には、好ましくは、
ジオールたとえばエチレングリコールもしくはプロピレ
ングリコール、または適当な極性非プロトン溶媒たとえ
ばジメチルスルホキシド（DMSO），ジメチルホルムアミ
ド（DMF）、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホ
ン、スルホランおよびヘキサメチルリン酸トリアミドを
含有させる。反応混合物中の共溶媒としては、DMSOまた
はエチレングリコールの使用がとくに好ましい。DMSOの
使用により、スクアル酸と、著しく異なる親水性を有す
る２種の基との効率的なカツプリングが達成される。好
ましい合成反応のひとつでは、上述の式においてR3およ
びR4が炭化水素鎖であり、R1および／またはR2がさらに
スルホン酸で置換されているスクアレイ染料の製造にDM
SOが使用される。炭素原子５〜８個を有する非置換炭化
水素鎖をもつ界面活性染料が好ましい。
の存在下に合成するのが便利である。慣用溶媒には低級
アルコール：芳香族溶媒混合物たとえばｎ−ブタノー
ル：ベンゼン、ｎ−ブタノール：トルエン等が包含され
る。アルコール：芳香族溶媒混合物には、好ましくは、
ジオールたとえばエチレングリコールもしくはプロピレ
ングリコール、または適当な極性非プロトン溶媒たとえ
ばジメチルスルホキシド（DMSO），ジメチルホルムアミ
ド（DMF）、ジメチルアセトアミド、ジメチルスルホ
ン、スルホランおよびヘキサメチルリン酸トリアミドを
含有させる。反応混合物中の共溶媒としては、DMSOまた
はエチレングリコールの使用がとくに好ましい。DMSOの
使用により、スクアル酸と、著しく異なる親水性を有す
る２種の基との効率的なカツプリングが達成される。好
ましい合成反応のひとつでは、上述の式においてR3およ
びR4が炭化水素鎖であり、R1および／またはR2がさらに
スルホン酸で置換されているスクアレイ染料の製造にDM
SOが使用される。炭素原子５〜８個を有する非置換炭化
水素鎖をもつ界面活性染料が好ましい。
界面活性染料は標準条件を用い、すなわちｎ−ブタノ
ール−ベンゼンまたはｎ−ブタノール−トルエン中還流
によつて製造できるが、合成時に極性非プロトン溶媒た
とえばDMSOを添加すると、スクアル酸とのカツプリング
の効率は著しく上昇することが明らかにされた。５〜30
％（容量：容量）、好ましくは10〜20％のDMSOが界面活
性染料の合成効率を上昇させる。界面活性染料の合成お
よび精製の例は、例2,3および４に記述する。
ール−ベンゼンまたはｎ−ブタノール−トルエン中還流
によつて製造できるが、合成時に極性非プロトン溶媒た
とえばDMSOを添加すると、スクアル酸とのカツプリング
の効率は著しく上昇することが明らかにされた。５〜30
％（容量：容量）、好ましくは10〜20％のDMSOが界面活
性染料の合成効率を上昇させる。界面活性染料の合成お
よび精製の例は、例2,3および４に記述する。
本発明の検定に用いられる染料は望ましくは、以上の
要求するものでなければならない。すなわち、吸収は好
ましくは600nm以上、吸光係数は少なくとも150,000・
mole-1・cm-1,螢光量子吸収量は少なくとも0.1,螢光源
を与えるための細胞の染色能，問題の抗原との干渉がな
い、検定時細胞内に維持される能力である。界面活性染
料はいずれも、例外なく、これらの要求によく合致す
る。
要求するものでなければならない。すなわち、吸収は好
ましくは600nm以上、吸光係数は少なくとも150,000・
mole-1・cm-1,螢光量子吸収量は少なくとも0.1,螢光源
を与えるための細胞の染色能，問題の抗原との干渉がな
い、検定時細胞内に維持される能力である。界面活性染
料はいずれも、例外なく、これらの要求によく合致す
る。
本発明の一態様を実施するに際しては、サンプル、被
検物質に相補性のsbp要素、および細胞に取り込まれる
螢光剤を水性検定メジウム中に混合し、ついで細胞の凝
集の結果としての混合物の螢光変化を測定する。サンプ
ル中の被検物質の存在は、この螢光の変化によつて示さ
れる。
検物質に相補性のsbp要素、および細胞に取り込まれる
螢光剤を水性検定メジウム中に混合し、ついで細胞の凝
集の結果としての混合物の螢光変化を測定する。サンプ
ル中の被検物質の存在は、この螢光の変化によつて示さ
れる。
本方法は、広範囲のsbp要素被検物質に対する広範囲
の検定測定法に適用できる。被検物質およびその相補性
sbp要素の少なくとも一方が細胞表面の正常成分である
場合がとくに興味がある。細胞表面sbp要素には、天然
の膜成分、たとえば抗原、細胞壁抗原とくに細菌細胞
壁、細胞表面受容体たとえば、活性化、成長および阻止
因子に対する受容体、抗体、HLA抗原、Fc受容体、ホル
モン受容体、イオンチヤネル、糖脂質、リポタンパク
質、補体成分、ウイルス抗原、膜結合酵素、ペプチドグ
リカン、かび抗原、イデイオタイプ抗原等がある。興味
ある細胞の種類には、白血球、細菌、かび細胞、赤血
球、生殖母細胞、網状赤血球、リンパ球たとえば単球、
マクロフアージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好酸球等がある。本
発明の方法がとくに適合性を示すのは、血液型判定の領
域である。血液型抗原ならびにそれに対する抗体が上述
の方法を用いて確認できる。
の検定測定法に適用できる。被検物質およびその相補性
sbp要素の少なくとも一方が細胞表面の正常成分である
場合がとくに興味がある。細胞表面sbp要素には、天然
の膜成分、たとえば抗原、細胞壁抗原とくに細菌細胞
壁、細胞表面受容体たとえば、活性化、成長および阻止
因子に対する受容体、抗体、HLA抗原、Fc受容体、ホル
モン受容体、イオンチヤネル、糖脂質、リポタンパク
質、補体成分、ウイルス抗原、膜結合酵素、ペプチドグ
リカン、かび抗原、イデイオタイプ抗原等がある。興味
ある細胞の種類には、白血球、細菌、かび細胞、赤血
球、生殖母細胞、網状赤血球、リンパ球たとえば単球、
マクロフアージ、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好酸球等がある。本
発明の方法がとくに適合性を示すのは、血液型判定の領
域である。血液型抗原ならびにそれに対する抗体が上述
の方法を用いて確認できる。
本発明は、赤血球を、検定時に凝集し、螢光を取り込
む担体として用いることにより、赤血球型の判定または
赤血球抗原およびそれに対する抗体の同定を行う新規か
つとくに有用な方法を提供する。凝集の結果としての螢
光の変化を測定する。これが特定の赤血球抗原またはそ
れに対する抗体の存在の指標となる。赤血球抗原に結合
する物質、通常は抗体またはレクチンが細胞の凝集を引
き起こすのに必要である。血液型抗原を測定する本発明
の一態様においては、全血を水性メジウムたとえば適当
な緩衝液中で、細胞に取り込まれる螢光剤、通常は上記
式においてR3およびR4が非置換でR1〜R4が好ましくはエ
チルであるスクアレイン化合物、およびおよび興味ある
抗原に対する受容体を混合する。興味ある抗原が赤血球
の表面上に存在すると、細胞の凝集を生じ、興味ある抗
原の存在の指標としての螢光の変化が観察される。
む担体として用いることにより、赤血球型の判定または
赤血球抗原およびそれに対する抗体の同定を行う新規か
つとくに有用な方法を提供する。凝集の結果としての螢
光の変化を測定する。これが特定の赤血球抗原またはそ
れに対する抗体の存在の指標となる。赤血球抗原に結合
する物質、通常は抗体またはレクチンが細胞の凝集を引
き起こすのに必要である。血液型抗原を測定する本発明
の一態様においては、全血を水性メジウムたとえば適当
な緩衝液中で、細胞に取り込まれる螢光剤、通常は上記
式においてR3およびR4が非置換でR1〜R4が好ましくはエ
チルであるスクアレイン化合物、およびおよび興味ある
抗原に対する受容体を混合する。興味ある抗原が赤血球
の表面上に存在すると、細胞の凝集を生じ、興味ある抗
原の存在の指標としての螢光の変化が観察される。
用いられる受容体は、興味ある血液型表面抗原に優先
的に結合する。したがつて、与えられた赤血球サンプル
中に、与えられた抗原が存在する場合には、与えられた
抗原が存在しない場合に比べて、螢光分析法で測定可能
な変化を生じる。たとえば、A,B,Oシステムでは、抗−
Ａ抗体を使用した場合、被検物質がＡ型またはAB型血液
のＡ抗原を含有すれば、被検物質がＢ型またはＯ型血液
を含む場合以上に凝集を生じ、螢光の変化がある。
的に結合する。したがつて、与えられた赤血球サンプル
中に、与えられた抗原が存在する場合には、与えられた
抗原が存在しない場合に比べて、螢光分析法で測定可能
な変化を生じる。たとえば、A,B,Oシステムでは、抗−
Ａ抗体を使用した場合、被検物質がＡ型またはAB型血液
のＡ抗原を含有すれば、被検物質がＢ型またはＯ型血液
を含む場合以上に凝集を生じ、螢光の変化がある。
抗体のほかに、ある種のレクチンが赤血球表面抗原と
特異的に結合することが知られていて、本発明の検定に
使用するのに便利な受容体である。
特異的に結合することが知られていて、本発明の検定に
使用するのに便利な受容体である。
本明細書に記載した化合物および方法はまた、赤血球
抗原に対する抗体の存在の測定に使用することもでき
る。このアプローチでは、問題の抗体に対応する表面抗
原をもつ赤血球が検定に使用される。抗原をもつ細胞お
よび螢光剤を好ましくは最初に混合して染色細胞を与
え、これをついで水性メジウム中のサンプルと混合す
る。染色は、好ましくはR3およびR4がオクチルまたはヘ
プチルであり、R1はエチルであり、R2はトリメチレンス
ルホン酸である本発明の界面活性染料によつてしばしば
達成される。また、R1〜R4が独立に、ブチル、ペンチル
およびヘキシルの群から選ばれる本発明のスクアレイン
染料が、抗体スクリーニング検定に使用できる。問題の
抗体がサンプル中に存在すると、凝集の結果として螢光
に変化が生じる。
抗原に対する抗体の存在の測定に使用することもでき
る。このアプローチでは、問題の抗体に対応する表面抗
原をもつ赤血球が検定に使用される。抗原をもつ細胞お
よび螢光剤を好ましくは最初に混合して染色細胞を与
え、これをついで水性メジウム中のサンプルと混合す
る。染色は、好ましくはR3およびR4がオクチルまたはヘ
プチルであり、R1はエチルであり、R2はトリメチレンス
ルホン酸である本発明の界面活性染料によつてしばしば
達成される。また、R1〜R4が独立に、ブチル、ペンチル
およびヘキシルの群から選ばれる本発明のスクアレイン
染料が、抗体スクリーニング検定に使用できる。問題の
抗体がサンプル中に存在すると、凝集の結果として螢光
に変化が生じる。
本方法はとくに、交差適合性の判定に重要である。こ
の判定には、供血候補者の血球と受血者の血漿を本発明
の方法に従つて混合する。好ましくは、供血者の全血を
最初に螢光剤と混合して細胞を染色し、この混合物をつ
いで受血者の血漿と混合する。別法として、血液と血漿
を混合したのちに螢光剤を加えてもよい。インキユベー
シヨン後、細胞を分離し、洗浄し、抗−免疫グロブリン
を含む溶液中に懸濁して、インキユベートする。凝集に
よつて生じる陽性シグナルは交差不適合を示す。この方
法を効果的に使用するには、螢光剤は界面活性染料であ
ることが要求される。とくに好ましい界面活性染料は、
上述の一般式においてR3およびR4がオクチルまたはヘプ
チル、R1がエチル、R2がトリメチレンスルホン酸の染料
である。
の判定には、供血候補者の血球と受血者の血漿を本発明
の方法に従つて混合する。好ましくは、供血者の全血を
最初に螢光剤と混合して細胞を染色し、この混合物をつ
いで受血者の血漿と混合する。別法として、血液と血漿
を混合したのちに螢光剤を加えてもよい。インキユベー
シヨン後、細胞を分離し、洗浄し、抗−免疫グロブリン
を含む溶液中に懸濁して、インキユベートする。凝集に
よつて生じる陽性シグナルは交差不適合を示す。この方
法を効果的に使用するには、螢光剤は界面活性染料であ
ることが要求される。とくに好ましい界面活性染料は、
上述の一般式においてR3およびR4がオクチルまたはヘプ
チル、R1がエチル、R2がトリメチレンスルホン酸の染料
である。
本明細書に記載の方法は単純で、かなり短時間での実
施が可能である。本発明のとくに有利な点は、供血者の
細胞を予め分離したり洗浄したりすることなく、全血中
の細胞を直接染色できることである。この方法で染色さ
れた細胞は、以後の洗浄、懸濁および分離工程を通じて
螢光染料を維持する。したがつて、検定メジウムまたは
混合物から、細胞の凝集の結果としての螢光の変化を直
接観察することができる。
施が可能である。本発明のとくに有利な点は、供血者の
細胞を予め分離したり洗浄したりすることなく、全血中
の細胞を直接染色できることである。この方法で染色さ
れた細胞は、以後の洗浄、懸濁および分離工程を通じて
螢光染料を維持する。したがつて、検定メジウムまたは
混合物から、細胞の凝集の結果としての螢光の変化を直
接観察することができる。
本発明の染料を使用する方法を、次に、検定サンプル
の例として血液サンプル、本発明の方法に従つて測定さ
れるsbp要素の例として血液型抗原またはそれに対する
抗体を用いて詳細に説明する。この記載は例示のための
みのものであつて、いかなる意味においても本発明の範
囲を限定するものではない。
の例として血液サンプル、本発明の方法に従つて測定さ
れるsbp要素の例として血液型抗原またはそれに対する
抗体を用いて詳細に説明する。この記載は例示のための
みのものであつて、いかなる意味においても本発明の範
囲を限定するものではない。
本発明に従つて、sbp要素である血液型抗原の検定を
行う一操作においては、血液サンプルを所望により、緩
衝水性メジウム中容量％で血液５％以上、好ましくは20
％以上、とくに好ましくは50％以上を含むように希釈し
て使用する。緩衝水性メジウムのpHは通常約５〜9,好ま
しくは約６〜８である。サンプルを適当量の細胞に取り
込まれる螢光剤および血液型抗原に相補性のsbp要素と
混合する。この量は一般に有効な検定結果を得るのに十
分な量でなければならない。細胞に取り込まれる螢光剤
の量は、細胞の性質および螢光剤の性質に依存する。通
常は、細胞に取り込まれる螢光剤を、血液1mlにつき約
0.1〜100μg,好ましくは約１〜10μｇ使用する。使用す
る相補性sbp要素の量は経験的に決定され、通常は血液
型抗原の量の0.01〜1000倍またはそれ以上、好ましくは
血液型抗原の量の0.1〜100倍である。
行う一操作においては、血液サンプルを所望により、緩
衝水性メジウム中容量％で血液５％以上、好ましくは20
％以上、とくに好ましくは50％以上を含むように希釈し
て使用する。緩衝水性メジウムのpHは通常約５〜9,好ま
しくは約６〜８である。サンプルを適当量の細胞に取り
込まれる螢光剤および血液型抗原に相補性のsbp要素と
混合する。この量は一般に有効な検定結果を得るのに十
分な量でなければならない。細胞に取り込まれる螢光剤
の量は、細胞の性質および螢光剤の性質に依存する。通
常は、細胞に取り込まれる螢光剤を、血液1mlにつき約
0.1〜100μg,好ましくは約１〜10μｇ使用する。使用す
る相補性sbp要素の量は経験的に決定され、通常は血液
型抗原の量の0.01〜1000倍またはそれ以上、好ましくは
血液型抗原の量の0.1〜100倍である。
細胞に取り込まれる螢光剤の水溶性が低い場合には、
適当な有機極性溶媒中の螢光剤溶液を血液サンプルに添
加する。通常、添加溶液の容量は血液サンプル量の５％
未満、好ましくは３％またはそれ以下とする。有機溶媒
は一般には１〜６個の炭素原子および酸素、窒素、硫黄
からなる群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を有するも
のである。このような溶媒の例としては、ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸
アミド等がある。混合物をついで相補性のsbp要素と混
合する。
適当な有機極性溶媒中の螢光剤溶液を血液サンプルに添
加する。通常、添加溶液の容量は血液サンプル量の５％
未満、好ましくは３％またはそれ以下とする。有機溶媒
は一般には１〜６個の炭素原子および酸素、窒素、硫黄
からなる群より選ばれるヘテロ原子１〜５個を有するも
のである。このような溶媒の例としては、ジメチルホル
ムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメチルリン酸
アミド等がある。混合物をついで相補性のsbp要素と混
合する。
サンプル、細胞に取り込まれる螢光剤、および相補性
sbp要素を混合し、通常は撹拌しながら、問題の血液型
抗原が存在する場合には細胞の凝集を生じるような条件
下にインキユベートする。インキユベーシヨン時間は、
細胞表面上の血液型抗原の密度、細胞および相補性sbp
要素の濃度、凝集促進剤たとえばポリブレン、デキスト
ランもしくはデキストラン誘導体、低イオン強度メジウ
ム、血清アルブミン、ポリエチレングリコール等の添加
を含めた反応条件に依存して広く変動する。望ましいイ
ンキユベーシヨン時間は約10〜600秒、好ましくは約10
〜200秒で、穏和な温度条件、通常は約10〜37℃が用い
られる。
sbp要素を混合し、通常は撹拌しながら、問題の血液型
抗原が存在する場合には細胞の凝集を生じるような条件
下にインキユベートする。インキユベーシヨン時間は、
細胞表面上の血液型抗原の密度、細胞および相補性sbp
要素の濃度、凝集促進剤たとえばポリブレン、デキスト
ランもしくはデキストラン誘導体、低イオン強度メジウ
ム、血清アルブミン、ポリエチレングリコール等の添加
を含めた反応条件に依存して広く変動する。望ましいイ
ンキユベーシヨン時間は約10〜600秒、好ましくは約10
〜200秒で、穏和な温度条件、通常は約10〜37℃が用い
られる。
サンプル中の特定の血液型抗原に対する抗体の存在を
測定する逆血液型判定では、血漿または全血サンプル
を、水性緩衝メジウム中興味のある特定の型、Ａまたは
Ｂの赤血球と混合する。サンプルが全血である場合に
は、このような細胞中に細胞に取り込まれる螢光剤をサ
ンプルとの混合前に、取り込ませる。しかし、サンプル
が血漿である場合には、サンプルを細胞と混合したのち
に螢光剤を添加することができる。螢光剤の赤血球サン
プルへの取り込みは前述のようにして実施される。つい
でメジウムを上述のように、凝集を起こさせるためにあ
る期間、ある条件下に保持する。
測定する逆血液型判定では、血漿または全血サンプル
を、水性緩衝メジウム中興味のある特定の型、Ａまたは
Ｂの赤血球と混合する。サンプルが全血である場合に
は、このような細胞中に細胞に取り込まれる螢光剤をサ
ンプルとの混合前に、取り込ませる。しかし、サンプル
が血漿である場合には、サンプルを細胞と混合したのち
に螢光剤を添加することができる。螢光剤の赤血球サン
プルへの取り込みは前述のようにして実施される。つい
でメジウムを上述のように、凝集を起こさせるためにあ
る期間、ある条件下に保持する。
上記保持期間に続いて、メジウムを調べ、細胞の凝集
の結果としての螢光の変化を測定する。
の結果としての螢光の変化を測定する。
螢光の変化は様々な方法で測定できる。一操作では、
細胞成分たとえばヘモグロビンが細胞集落中の細胞から
の方が、他の細胞と会合していない細胞からよりも、多
量の入射光または放射光を吸収することから、凝集は螢
光を低下させる。他の方法は、凝集の結果としての螢光
分子の分布に依存するものである。
細胞成分たとえばヘモグロビンが細胞集落中の細胞から
の方が、他の細胞と会合していない細胞からよりも、多
量の入射光または放射光を吸収することから、凝集は螢
光を低下させる。他の方法は、凝集の結果としての螢光
分子の分布に依存するものである。
この目的には、本技術分野で知られている非流動血球
計算法が使用できる。この方法ではスリツトで作つた径
の小さい光ビームまたは好ましくはレーザーを、螢光分
子の高い局所的濃度を検出するために用いる。この方法
では螢光パルス高分析または螢光動揺の相関を採用する
（Briggsら:Homogeneous Fluorescent Immunoassay.Sci
ence,212:1266,1981およびNiooliら:Fluorescence Immu
noassay Based on Long Time Correlation of Number F
luctuations.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77（８）:4904,1
980）。
計算法が使用できる。この方法ではスリツトで作つた径
の小さい光ビームまたは好ましくはレーザーを、螢光分
子の高い局所的濃度を検出するために用いる。この方法
では螢光パルス高分析または螢光動揺の相関を採用する
（Briggsら:Homogeneous Fluorescent Immunoassay.Sci
ence,212:1266,1981およびNiooliら:Fluorescence Immu
noassay Based on Long Time Correlation of Number F
luctuations.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77（８）:4904,1
980）。
本発明による螢光変化の好ましい測定方法では、米国
特許第4,564,598号に記載されている光学繊維血球計算
器が使用される。この米国特許第4,564,598号には、興
味のある物質の存在または存在量の検出に関して、分散
液中の粒子の存在を測定するための方法および装置が提
供されている。光学繊維は比較的小容量を限定するため
に用いられ、ここから螢光を受けて計数を行うことがで
きる。この容量は、既定の動揺を生じる１個または比較
的少数の粒子が存在すると考えられる容量に合致する。
動揺解析のためのいくつかの数学的方法のどれかを用い
ることにより、螢光動揺はサンプル中の被検物質の存在
に関連づけられる。動揺は一定期間、静的様式でまたは
好ましくはサンプル中で複数個の容量をサンプリングす
ることによつて観察される。観察された結果を、被検物
質を含まないことがわかつているサンプルもしくは標準
液について得られた結果および被検物質を含むことがわ
かつている他のサンプルもしくは標準液について得られ
た結果と比較することによつて、未知サンプル中の被検
物質の存在または不存在を決定できる。
特許第4,564,598号に記載されている光学繊維血球計算
器が使用される。この米国特許第4,564,598号には、興
味のある物質の存在または存在量の検出に関して、分散
液中の粒子の存在を測定するための方法および装置が提
供されている。光学繊維は比較的小容量を限定するため
に用いられ、ここから螢光を受けて計数を行うことがで
きる。この容量は、既定の動揺を生じる１個または比較
的少数の粒子が存在すると考えられる容量に合致する。
動揺解析のためのいくつかの数学的方法のどれかを用い
ることにより、螢光動揺はサンプル中の被検物質の存在
に関連づけられる。動揺は一定期間、静的様式でまたは
好ましくはサンプル中で複数個の容量をサンプリングす
ることによつて観察される。観察された結果を、被検物
質を含まないことがわかつているサンプルもしくは標準
液について得られた結果および被検物質を含むことがわ
かつている他のサンプルもしくは標準液について得られ
た結果と比較することによつて、未知サンプル中の被検
物質の存在または不存在を決定できる。
血液型判定標準液は、問題の抗体または適当な血液型
抗原をもつ細胞の既知量を適当なメジウム中に加え、未
知の被検物質含有サンプルについて上述したと同様に処
理する。標準液についての螢光変化を問題の血液型抗原
またはそれに対する抗体の存在の指標として未知サンプ
ルについての螢光変化と比較する。
抗原をもつ細胞の既知量を適当なメジウム中に加え、未
知の被検物質含有サンプルについて上述したと同様に処
理する。標準液についての螢光変化を問題の血液型抗原
またはそれに対する抗体の存在の指標として未知サンプ
ルについての螢光変化と比較する。
本発明の螢光染料は、血清抗原の検出に使用する試薬
の既定量と組合せてパツケージしたキツトとして提供す
ることもできる。典型的なキツトは、螢光染料と被検物
質に相補性のsbp要素とを包含する。また、キツトには
表面に相補性sbp要素を有し、螢光染料で染色される細
胞を含有させてもよい。さらに、サンプル中の問題のsb
p要素を検出するのに必要な他の試薬および補助試薬の
ような添加剤を包含できる。各種試薬の相対量は、検定
の感度を至適にする試薬溶液濃度を与えるようにきわめ
て広範囲に変化させることができる。試薬は通常、粒子
の液体懸濁液として提供されるが、細胞を含まない場合
には、賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥粉末とし
て提供することができ、これは溶解すると検定の実施に
適当な濃度を有する試薬溶液を与える。
の既定量と組合せてパツケージしたキツトとして提供す
ることもできる。典型的なキツトは、螢光染料と被検物
質に相補性のsbp要素とを包含する。また、キツトには
表面に相補性sbp要素を有し、螢光染料で染色される細
胞を含有させてもよい。さらに、サンプル中の問題のsb
p要素を検出するのに必要な他の試薬および補助試薬の
ような添加剤を包含できる。各種試薬の相対量は、検定
の感度を至適にする試薬溶液濃度を与えるようにきわめ
て広範囲に変化させることができる。試薬は通常、粒子
の液体懸濁液として提供されるが、細胞を含まない場合
には、賦形剤を含む乾燥粉末、通常は凍結乾燥粉末とし
て提供することができ、これは溶解すると検定の実施に
適当な濃度を有する試薬溶液を与える。
例 以下の実施例は、例示的なものであり、本発明を限定
するものではない。
するものではない。
例 １ ２−（ｐ−ジエチルアミノ−ｏ−ヒドロキシフエニル）
−４−（４−ジエチルイモニオ−２−ヒドロキシル−2,
5−シクロヘキサジエニリデン）−３−オキソ−１−シ
クロブテノレート（DEAS）の製造 DEASは次のようにして製造された。すなわち、スクア
ル酸（741mg,65ミリモル）を90mlのｎ−ブタノール：ト
ルエン（2:1）中、撹拌しながら2.16g（13ミリモル）の
３−N,N−ジエチルアミノフエノールと混合する。混合
物を、共沸混合物として水を除去しながら、一夜還流す
る。反応の進行は、メタノール：トルエン（1:9）を用
いる薄層クロマトグラフイー（TLC）によつて追跡し
た。次に、反応混合物を蒸留して約40mlのトルエンを除
去し、ついで反応混合物を室温に冷却した。結晶性生成
物が分離し、これを室温で乾燥すると生成物2.5gが得ら
れた。UV（DMF）λmax650nm,ε＝240,000,螢光（DMF）,
650/666nm 例 ２ １−〔４−〔Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）
アミノ〕−２−ヒドロキシフエニル〕−３−〔４−ジヘ
プチルアミノ−２−ヒドロキシフエニル〕2,4−ジヒド
ロキシシクロブテンジイリウムジヒドロキシド，ビス
（分子内塩）（C7SAS）の製造 出発原料の製造 ３−〔Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ヒドロキシフエニル）
アミノ〕プロパンスルホン酸（２）は次のようにして製
造した。
−４−（４−ジエチルイモニオ−２−ヒドロキシル−2,
5−シクロヘキサジエニリデン）−３−オキソ−１−シ
クロブテノレート（DEAS）の製造 DEASは次のようにして製造された。すなわち、スクア
ル酸（741mg,65ミリモル）を90mlのｎ−ブタノール：ト
ルエン（2:1）中、撹拌しながら2.16g（13ミリモル）の
３−N,N−ジエチルアミノフエノールと混合する。混合
物を、共沸混合物として水を除去しながら、一夜還流す
る。反応の進行は、メタノール：トルエン（1:9）を用
いる薄層クロマトグラフイー（TLC）によつて追跡し
た。次に、反応混合物を蒸留して約40mlのトルエンを除
去し、ついで反応混合物を室温に冷却した。結晶性生成
物が分離し、これを室温で乾燥すると生成物2.5gが得ら
れた。UV（DMF）λmax650nm,ε＝240,000,螢光（DMF）,
650/666nm 例 ２ １−〔４−〔Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）
アミノ〕−２−ヒドロキシフエニル〕−３−〔４−ジヘ
プチルアミノ−２−ヒドロキシフエニル〕2,4−ジヒド
ロキシシクロブテンジイリウムジヒドロキシド，ビス
（分子内塩）（C7SAS）の製造 出発原料の製造 ３−〔Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ヒドロキシフエニル）
アミノ〕プロパンスルホン酸（２）は次のようにして製
造した。
プロパンスルトン（1.22g,10ミリモル）と３−（エチ
ルアミノ）フエノール（1.37g,10ミリモル）を25mlの丸
底フラスコ中で一緒に、熔融が始まるまで加温した。５
〜10分後に、メタノール2mlを液体混合物に加えた。30
分後、さらにメタノールを加え（５〜10ml）、混合物を
還流するまで加熱した。暗所の下層が淡い桃色の粉末に
固化した。
ルアミノ）フエノール（1.37g,10ミリモル）を25mlの丸
底フラスコ中で一緒に、熔融が始まるまで加温した。５
〜10分後に、メタノール2mlを液体混合物に加えた。30
分後、さらにメタノールを加え（５〜10ml）、混合物を
還流するまで加熱した。暗所の下層が淡い桃色の粉末に
固化した。
固体をガラス濾斗上で熱メタノールによつて洗浄し
た。ついで還流下にメタノールに取り、冷却放置すると
結晶化した。沸騰メタノール中への溶解は徐々に起こ
り、結晶の生成も緩徐であつた。得られた固体（2.04g,
78％はTLC上単一のスポツトを示した（シリカ,CH3CN/H2
O 88:12v/v,UV検出,Rf0.59） ｍ−（N,N−ジヘプチルアミノ）フエノール塩酸塩
（１）は次のようにして製造した。
た。ついで還流下にメタノールに取り、冷却放置すると
結晶化した。沸騰メタノール中への溶解は徐々に起こ
り、結晶の生成も緩徐であつた。得られた固体（2.04g,
78％はTLC上単一のスポツトを示した（シリカ,CH3CN/H2
O 88:12v/v,UV検出,Rf0.59） ｍ−（N,N−ジヘプチルアミノ）フエノール塩酸塩
（１）は次のようにして製造した。
３−アミノフエノール（3g,0.034モル,Aldrich Chemi
cal Co.Inc.）,1−ヨードヘプタン（15.6g,0.069モル,A
ldrich Chemical Co.Inc.）およびN,N−ジイソプロピル
エチルアミン（13.4g,0.104モル,Aldrich Chemical Co.
Inc.）をメタノール（17ml）中に混合し、この混合物を
窒素下で28時間還流した。反応生成物（Rf 0.55,シリ
カ，酢酸エチル：ヘキサン1:4v/v）をついで室温に放冷
し、N,N−ジイソプロピルエチルアミンヨー化水素酸塩
の固体を濾去した。得られた濾液にエーテル（500ml）
を加え、固体を再度濾去した。こうして得られた濾液を
次に蒸発乾固すると赤色の油状物が生成し、次にこれに
1N塩酸（約121ml）を加えた。生成した二層の液体をつ
いで100mlのエーテルを用いて抽出した。エーテル層を
室温に30分間放置すると結晶性の生成物を生じた。
cal Co.Inc.）,1−ヨードヘプタン（15.6g,0.069モル,A
ldrich Chemical Co.Inc.）およびN,N−ジイソプロピル
エチルアミン（13.4g,0.104モル,Aldrich Chemical Co.
Inc.）をメタノール（17ml）中に混合し、この混合物を
窒素下で28時間還流した。反応生成物（Rf 0.55,シリ
カ，酢酸エチル：ヘキサン1:4v/v）をついで室温に放冷
し、N,N−ジイソプロピルエチルアミンヨー化水素酸塩
の固体を濾去した。得られた濾液にエーテル（500ml）
を加え、固体を再度濾去した。こうして得られた濾液を
次に蒸発乾固すると赤色の油状物が生成し、次にこれに
1N塩酸（約121ml）を加えた。生成した二層の液体をつ
いで100mlのエーテルを用いて抽出した。エーテル層を
室温に30分間放置すると結晶性の生成物を生じた。
粗結晶性生成物をメタノール：エーテル（1:10v/v）1
65ml中で再結晶すると純粋なｍ−（N,N−ジヘプチル）
アミノフエノール塩酸塩（6.0g）が得られた。同様に母
液からの粗生成物（2.0g）をメタノール：エーテルから
再結晶すると純粋なｍ−（N,N−ジヘプチル）アミノフ
エノール塩酸塩1.2gが得られた。生成物の総収量は72g
（69％）であつた。融点110〜111℃ A.合成 100mlの三頚フラスコにDean−Starkの捕集冷却器を付
し、アルゴン陽圧に維持した。固体の３−〔Ｎ−エチル
−Ｎ−（３−ヒドロキシフエニル）アミノ〕プロパンス
ルホン酸（２）（906.5mg,3.5ミリモル）をフラスコに
加え、続いて共沸により乾燥したエチレングリコールと
ｎ−ブタノール（1:1）の混合物20mlを加えた。混合物
を油浴中で、澄明な溶液が得られるまで加熱した。
65ml中で再結晶すると純粋なｍ−（N,N−ジヘプチル）
アミノフエノール塩酸塩（6.0g）が得られた。同様に母
液からの粗生成物（2.0g）をメタノール：エーテルから
再結晶すると純粋なｍ−（N,N−ジヘプチル）アミノフ
エノール塩酸塩1.2gが得られた。生成物の総収量は72g
（69％）であつた。融点110〜111℃ A.合成 100mlの三頚フラスコにDean−Starkの捕集冷却器を付
し、アルゴン陽圧に維持した。固体の３−〔Ｎ−エチル
−Ｎ−（３−ヒドロキシフエニル）アミノ〕プロパンス
ルホン酸（２）（906.5mg,3.5ミリモル）をフラスコに
加え、続いて共沸により乾燥したエチレングリコールと
ｎ−ブタノール（1:1）の混合物20mlを加えた。混合物
を油浴中で、澄明な溶液が得られるまで加熱した。
ｍ−（N,N−ジヘプチル）アミノフエノール塩酸塩
（１）（1g,3.2モル）をｎ−ベタノールとベンゼン（1:
2）の共沸により乾燥した混合物10ml中に溶解した。こ
の混合物中に炭酸水素ナトリウム（600mg,7ミリモル）
を懸濁し、パスツールピペツトで反応容器に移した。二
酸化炭素の発生による激しい発泡はすぐ鎮まつた。混合
物を30分間還流して痕跡の水も除去した。
（１）（1g,3.2モル）をｎ−ベタノールとベンゼン（1:
2）の共沸により乾燥した混合物10ml中に溶解した。こ
の混合物中に炭酸水素ナトリウム（600mg,7ミリモル）
を懸濁し、パスツールピペツトで反応容器に移した。二
酸化炭素の発生による激しい発泡はすぐ鎮まつた。混合
物を30分間還流して痕跡の水も除去した。
還流を中止し、まだ熱い混合物にスクアル酸（３）
（400mg,3.5ミリモル）を一度に加え、続いてさらに5ml
のエチレングリコール−ｎ−ブタノール混合物を加え
た。反応混合物を再び還流させると、数分以内に青色を
生じた。還流を約７時間続けたのち、ベンゼンを留去し
て、反応混合物を放冷した。反応容器に栓をして冷凍庫
に48時間以上放置した。
（400mg,3.5ミリモル）を一度に加え、続いてさらに5ml
のエチレングリコール−ｎ−ブタノール混合物を加え
た。反応混合物を再び還流させると、数分以内に青色を
生じた。還流を約７時間続けたのち、ベンゼンを留去し
て、反応混合物を放冷した。反応容器に栓をして冷凍庫
に48時間以上放置した。
冷い混合物を濾過して、暗い緑黒色の結晶を集め、冷
ｎ−ブタノールついでメタノールで洗浄し、65℃で真空
乾燥した。回収された染料混合物の重量は1.3gであつ
た。
ｎ−ブタノールついでメタノールで洗浄し、65℃で真空
乾燥した。回収された染料混合物の重量は1.3gであつ
た。
B.精製 界面活性染料混合物をソツクスレー装置の抽出筒に移
した。メタノール−メチレンクロリドの混合物による抽
出で1,3−ビス〔４−（ジヘプチルアミノ）−２−ヒド
ロキシフエニル〕−2,4−ジヒドロキシシクロブテンジ
イリウムジヒドロキシド、ビス（分子内塩）（THpS）と
少量のC7SAS染料が除去された。メチレンクロリドをRot
ovapを用いて蒸発させて除き、残つたメタノールから結
晶化したTHpSを濾過して除いた。メタノール濾液をさら
にメタノールで希釈し（総容量約250ml）、これを用い
て抽出を続けた。抽出完了後、フラスコをソツクスレー
装置からはずし、内容物を放冷した。撹拌しながらRP−
８シリカゲル25gを加え、ついで水150mlを滴加した。撹
拌を止め、上澄液を傾瀉した。暗青色のシリカゲル懸濁
液を、さらに10gのRP−８シリカゲルを含みメタノール
中40％水で平衡化したカラムに移した。カラムを、すべ
ての1,3−ビス〔４−〔Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホ
プロピル）アミノ〕−２−ヒドロキシフエニル〕−2,4
−ジヒドロキシシクロブテンジイリウムジヒドロキシ
ド、ビス（分子内塩）（BSAS）が除去されるまでメタノ
ール中40％水で洗浄し。次にカラムを、メタノール中30
％水で、C7SASの溶出が始まるまで洗浄した。溶出はメ
タノール中20％水で完結させた。C7SAS染料を含む分画
を合し、Rotovap上で蒸発乾固し、残留物をメタノール
−メチレンクロリド（1:1）に溶解した。メチレンクロ
リドを徐々に留去して、メタノールを濃縮した。冷却
後、暗青色の混合物を一夜０℃の冷凍庫に入れた。濾過
し、真空乾燥すると、0.513gの分析的に純粋なC7SASが
帯緑黒色の固体として得られた。収率は理論量の44％で
あつた。
した。メタノール−メチレンクロリドの混合物による抽
出で1,3−ビス〔４−（ジヘプチルアミノ）−２−ヒド
ロキシフエニル〕−2,4−ジヒドロキシシクロブテンジ
イリウムジヒドロキシド、ビス（分子内塩）（THpS）と
少量のC7SAS染料が除去された。メチレンクロリドをRot
ovapを用いて蒸発させて除き、残つたメタノールから結
晶化したTHpSを濾過して除いた。メタノール濾液をさら
にメタノールで希釈し（総容量約250ml）、これを用い
て抽出を続けた。抽出完了後、フラスコをソツクスレー
装置からはずし、内容物を放冷した。撹拌しながらRP−
８シリカゲル25gを加え、ついで水150mlを滴加した。撹
拌を止め、上澄液を傾瀉した。暗青色のシリカゲル懸濁
液を、さらに10gのRP−８シリカゲルを含みメタノール
中40％水で平衡化したカラムに移した。カラムを、すべ
ての1,3−ビス〔４−〔Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホ
プロピル）アミノ〕−２−ヒドロキシフエニル〕−2,4
−ジヒドロキシシクロブテンジイリウムジヒドロキシ
ド、ビス（分子内塩）（BSAS）が除去されるまでメタノ
ール中40％水で洗浄し。次にカラムを、メタノール中30
％水で、C7SASの溶出が始まるまで洗浄した。溶出はメ
タノール中20％水で完結させた。C7SAS染料を含む分画
を合し、Rotovap上で蒸発乾固し、残留物をメタノール
−メチレンクロリド（1:1）に溶解した。メチレンクロ
リドを徐々に留去して、メタノールを濃縮した。冷却
後、暗青色の混合物を一夜０℃の冷凍庫に入れた。濾過
し、真空乾燥すると、0.513gの分析的に純粋なC7SASが
帯緑黒色の固体として得られた。収率は理論量の44％で
あつた。
元素分析値はＣ＝61.73,H＝7.54,N＝4.06,Na＝3.23
で、ナトリウム塩の一水和物と一致した。
で、ナトリウム塩の一水和物と一致した。
SO6N2C35H47Na−H2O,UV,λmax＝642nm（MoOH）。
例 ３ ジメチルスルホキシド（DMSO）を用いるC7SASの製造 A.合成 ｍ−（N,N−ジヘプチル）アミノフエノール塩酸塩
（１）（770mg,2.25ミリモル）,3−〔Ｎ−エチル−Ｎ−
（３−ヒドロキシフエニル）アミノ〕プロパンスルホン
酸（２）（678mg,2.5ミリモル）、ジヒドロキシ−３−
シクロブテン1,2−ジオン（３）（285mg,2.5ミリモル,A
ldrich Chemical Co.,Inc.）,DMSO（4ml）および炭酸水
素ナトリウム（389mg）のｎ−ブタノール−ベンゼン
（2:1容量比，共沸混合物を用いて予め２時間乾燥）40m
l中混合物を窒素下に２時間還流して、水を共沸的に除
去した。この混合物にエーテル（500ml）を加え、生成
した沈殿を濾過し、水50mlで洗浄した。C7SAS界面活性
染料（４）の粗沈殿（370mg）が得られた。
（１）（770mg,2.25ミリモル）,3−〔Ｎ−エチル−Ｎ−
（３−ヒドロキシフエニル）アミノ〕プロパンスルホン
酸（２）（678mg,2.5ミリモル）、ジヒドロキシ−３−
シクロブテン1,2−ジオン（３）（285mg,2.5ミリモル,A
ldrich Chemical Co.,Inc.）,DMSO（4ml）および炭酸水
素ナトリウム（389mg）のｎ−ブタノール−ベンゼン
（2:1容量比，共沸混合物を用いて予め２時間乾燥）40m
l中混合物を窒素下に２時間還流して、水を共沸的に除
去した。この混合物にエーテル（500ml）を加え、生成
した沈殿を濾過し、水50mlで洗浄した。C7SAS界面活性
染料（４）の粗沈殿（370mg）が得られた。
B.精製 C7SAS界面活性染料の精製は例２の記載に従つた。C7S
AS染料の性質、すなわち、C7SAS染料の漏出はわずか
で、血漿の存在下に細胞を染色できることは、例5,6お
よび７に記載の血液型検定、ならびに抗体スクリーニン
グ検定および交差適合性の検定にDEAS染料に代えて適当
に使用できることを示している。
AS染料の性質、すなわち、C7SAS染料の漏出はわずか
で、血漿の存在下に細胞を染色できることは、例5,6お
よび７に記載の血液型検定、ならびに抗体スクリーニン
グ検定および交差適合性の検定にDEAS染料に代えて適当
に使用できることを示している。
例 ４ １〔４−〔Ｎ−エチル−Ｎ−（３−スルホプロピル）ア
ミノ〕−２−ヒドロキシフエニル〕−３−〔４−ジオク
チルアミノ−２−ヒドロキシフエニル〕−2,4−ジヒド
ロキシシクロブテンジイリウムジヒドロキシド、ビス
（分子内塩）（C8SAS）の製造 出発原料の製造 ｍ−（N,N−ジオクチル）アミノフエノール塩酸塩は
以下のようにして製造した。
ミノ〕−２−ヒドロキシフエニル〕−３−〔４−ジオク
チルアミノ−２−ヒドロキシフエニル〕−2,4−ジヒド
ロキシシクロブテンジイリウムジヒドロキシド、ビス
（分子内塩）（C8SAS）の製造 出発原料の製造 ｍ−（N,N−ジオクチル）アミノフエノール塩酸塩は
以下のようにして製造した。
３−アミノフエノール（5g,0.046モル,Aldrich Chemi
cal Co.,Inc.）,1−ヨードオクタン（22g,0.092モル,Al
drioh Chemical Co.,Inc.）およびN,N−ジイソプロピル
エチルアミン（18g,0.139モル,Aldrich Chemical Co.,I
nc.）のメタノール（25ml）中混合物を窒素下に24時間
還流した。反応生成物の一部をTLC上にスポツトした
（シリカ,20％ EtoAc:ヘキサン）。TLCは、ジアルキル
化およびモノアルキル化生成物の形成を示し、したがつ
て、さらにヨードオクタン（10g,0.042モル）を追加し
て、生成した混合物をさらに４時間還流した。
cal Co.,Inc.）,1−ヨードオクタン（22g,0.092モル,Al
drioh Chemical Co.,Inc.）およびN,N−ジイソプロピル
エチルアミン（18g,0.139モル,Aldrich Chemical Co.,I
nc.）のメタノール（25ml）中混合物を窒素下に24時間
還流した。反応生成物の一部をTLC上にスポツトした
（シリカ,20％ EtoAc:ヘキサン）。TLCは、ジアルキル
化およびモノアルキル化生成物の形成を示し、したがつ
て、さらにヨードオクタン（10g,0.042モル）を追加し
て、生成した混合物をさらに４時間還流した。
反応生成物（Rf0.64,シリカ,20％酢酸エチル：ヘキサ
ン）を、沈殿が形成するまで濃縮した。生成したN,N−
ジイソプロピルエチルアミンヨー化水素酸塩の固体を集
め、エーテルで洗浄した。濾過操作をもう１回反復し、
残つた濾液を1N HClを用いて酸性にし、エーテルで抽出
した。エーテル層を、結晶が形成するまで室温に放置し
た。結晶を集めると、560mgのｍ−（N,N−ジオクチル）
アミノフエノール塩酸塩が得られた。生成物をさらに調
製用TLCで精製し（シリカ,2:1酢酸エチル／ヘキサ
ン）、生成物20％MeOH/CH2Cl2で溶出して回収すると、
純粋な生成物400mgが得られた。融点112〜114℃。大量
の精製にはメタノール−エーテルからの再結晶が好まし
い。
ン）を、沈殿が形成するまで濃縮した。生成したN,N−
ジイソプロピルエチルアミンヨー化水素酸塩の固体を集
め、エーテルで洗浄した。濾過操作をもう１回反復し、
残つた濾液を1N HClを用いて酸性にし、エーテルで抽出
した。エーテル層を、結晶が形成するまで室温に放置し
た。結晶を集めると、560mgのｍ−（N,N−ジオクチル）
アミノフエノール塩酸塩が得られた。生成物をさらに調
製用TLCで精製し（シリカ,2:1酢酸エチル／ヘキサ
ン）、生成物20％MeOH/CH2Cl2で溶出して回収すると、
純粋な生成物400mgが得られた。融点112〜114℃。大量
の精製にはメタノール−エーテルからの再結晶が好まし
い。
３−〔Ｎ−エチル−Ｎ−（３−ヒドロキシフエニル）
アミノ〕プロパンスルホン酸（２）の製造は例２の記載
に従つた。
アミノ〕プロパンスルホン酸（２）の製造は例２の記載
に従つた。
A.合成 ｍ−（N,N−ジオクチル）アミノフエノール塩酸塩
（５）（600mg,1.62ミリモル）,3−〔Ｎ−エチル−Ｎ−
（３−ヒドロキシフエニル）アミノ〕プロパンスルホン
酸（２）（648mg,2.5ミリモル），スクアル酸（３）（2
85mg,2.5ミリモル,Aldrich Chemical Co.,Inc.より）,D
MSO（4ml），および炭酸水素ナトリウム（410mg）のｎ
−ブタノール−ベンゼン（2:1容量比，共沸を利用して
予め２時間乾燥）40ml中混合物を窒素下に２時間還流
し、この間共沸混合物によつて水を除去した。ついで窒
素下室温に一夜放置した。生成した青色染料を濾過し、
沈殿を0.1N HCl5mlついで水1mlで洗浄すると、粗C8SAS
スクアレイン染料（６）（700mg）が得られた。
（５）（600mg,1.62ミリモル）,3−〔Ｎ−エチル−Ｎ−
（３−ヒドロキシフエニル）アミノ〕プロパンスルホン
酸（２）（648mg,2.5ミリモル），スクアル酸（３）（2
85mg,2.5ミリモル,Aldrich Chemical Co.,Inc.より）,D
MSO（4ml），および炭酸水素ナトリウム（410mg）のｎ
−ブタノール−ベンゼン（2:1容量比，共沸を利用して
予め２時間乾燥）40ml中混合物を窒素下に２時間還流
し、この間共沸混合物によつて水を除去した。ついで窒
素下室温に一夜放置した。生成した青色染料を濾過し、
沈殿を0.1N HCl5mlついで水1mlで洗浄すると、粗C8SAS
スクアレイン染料（６）（700mg）が得られた。
B.精製 方法1:粗C8SASスクアレイン染料（50mg）を少量の水
（約1ml）と撹拌し、得られた懸濁液を濾過し、ジ−SO3
スクアレイン染料が完全に除去されるまで水で洗浄し
た。残つたC8SAS染料を次にメタノール（約10ml）中で
加熱し、濾過した。得られた熱濾液にエーテル10mlを加
え、混合物を５℃に冷却した。この方法では7.8mgの純
粋なC8界面活性染料が生成した。UV（DMSO,H+），λmax
＝657.8nm 方法2:粗C8SAS界面活性染料（120mg）を約5mlの20％MeO
H/CH2Cl2に溶解し、８個の薄層シリカゲル板（Analtech
Uniplate,シリカゲルGF,20×20cm,1000ミクロン，カタ
ログNo.02013）上クロマトグラフイーに付した。中央の
バンド（Rf0.48）をかき落とし、30％MeOH/CH2Cl2を用
いて溶出すると、精製C8−SAS界面活性染料15mgが得ら
れた。
（約1ml）と撹拌し、得られた懸濁液を濾過し、ジ−SO3
スクアレイン染料が完全に除去されるまで水で洗浄し
た。残つたC8SAS染料を次にメタノール（約10ml）中で
加熱し、濾過した。得られた熱濾液にエーテル10mlを加
え、混合物を５℃に冷却した。この方法では7.8mgの純
粋なC8界面活性染料が生成した。UV（DMSO,H+），λmax
＝657.8nm 方法2:粗C8SAS界面活性染料（120mg）を約5mlの20％MeO
H/CH2Cl2に溶解し、８個の薄層シリカゲル板（Analtech
Uniplate,シリカゲルGF,20×20cm,1000ミクロン，カタ
ログNo.02013）上クロマトグラフイーに付した。中央の
バンド（Rf0.48）をかき落とし、30％MeOH/CH2Cl2を用
いて溶出すると、精製C8−SAS界面活性染料15mgが得ら
れた。
例 ５ Ｄ（Rho）血液型抗原の測定のための検定 DEASのジメチルホルムアミド（DMF）飽和溶液を調製
し、ついでDMFで1:10（容量比）に希釈した。希釈DEAS
溶液50μを全血サンプル1mlに滴加混合した。次に直
ちに、この混合物10μをＤ（Rho）血液型抗原に特異
的な抗体（市販の判定試薬）10μと混合した。混合物
を１分間室温に保持したのち、血清アルブミンとスクロ
ースを含むリン酸緩衝液1.5mlで希釈した。
し、ついでDMFで1:10（容量比）に希釈した。希釈DEAS
溶液50μを全血サンプル1mlに滴加混合した。次に直
ちに、この混合物10μをＤ（Rho）血液型抗原に特異
的な抗体（市販の判定試薬）10μと混合した。混合物
を１分間室温に保持したのち、血清アルブミンとスクロ
ースを含むリン酸緩衝液1.5mlで希釈した。
このメジウムについて、細胞の凝集の結果としての螢
光の変化を、米国特許第4,564,598号に開示された制限
容量法および粒子計数装置で解析した。
光の変化を、米国特許第4,564,598号に開示された制限
容量法および粒子計数装置で解析した。
Ｙ字型の光学繊維カプラー（Kaptron,Inc.,Palo Alt
o,Californiaより入手,Splitter−Monitor FOMS−850−
Ｐ型）の一つの繊維端をメジウム中に浸漬した。繊維の
直径は50μで、二分角12゜，有効サンプリング容量１×
10-7mlの励起光錐を生成した。He−Neレーザーからの励
起光（632.9nm）を２本の分岐繊維の一方に送つた。浸
漬した繊維端に入つた細胞から発光された螢光の部分は
繊維分岐点で等しく２つに分かれて、２本の分岐繊維に
沿つて伝達された。ついで、第２の分岐繊維を伝達して
きた部分を、50〜500秒の期間0.1秒毎に１回の割合の1m
secのゲート時間内で干渉を濾過したのち、高ゲインのE
MI光増幅器で読み取つた。ついで、ゲート時間あたりの
螢光パルス平均数をコンピユーターにより測定した。平
均螢光（ｘ）を求めるため、ゲート時間あたりの螢光パ
ルスの変動を、動揺またはピーク高解析で定量化した。
o,Californiaより入手,Splitter−Monitor FOMS−850−
Ｐ型）の一つの繊維端をメジウム中に浸漬した。繊維の
直径は50μで、二分角12゜，有効サンプリング容量１×
10-7mlの励起光錐を生成した。He−Neレーザーからの励
起光（632.9nm）を２本の分岐繊維の一方に送つた。浸
漬した繊維端に入つた細胞から発光された螢光の部分は
繊維分岐点で等しく２つに分かれて、２本の分岐繊維に
沿つて伝達された。ついで、第２の分岐繊維を伝達して
きた部分を、50〜500秒の期間0.1秒毎に１回の割合の1m
secのゲート時間内で干渉を濾過したのち、高ゲインのE
MI光増幅器で読み取つた。ついで、ゲート時間あたりの
螢光パルス平均数をコンピユーターにより測定した。平
均螢光（ｘ）を求めるため、ゲート時間あたりの螢光パ
ルスの変動を、動揺またはピーク高解析で定量化した。
標準発光レベルを確立するために、２種類の対照実験
を行つた。すなわち、（ａ）慣用の判定法でＤ（Rho）
陰性と判定されたサンプルを同じ方法で検定した。
（ｂ）抗体を除いてＤ（Rho）判定試薬の全成分を含む
市販のRh対照試薬を、上記検定の抗体試薬の代わりに使
用した。
を行つた。すなわち、（ａ）慣用の判定法でＤ（Rho）
陰性と判定されたサンプルを同じ方法で検定した。
（ｂ）抗体を除いてＤ（Rho）判定試薬の全成分を含む
市販のRh対照試薬を、上記検定の抗体試薬の代わりに使
用した。
５名の陽性および５名の陰性被検者からのサンプルに
ついての結果を第１表にまとめる。
ついての結果を第１表にまとめる。
第１表 血液型 シグナル＊ 84 108 Ｄ（Rho）陽性 72 46 74 18 23 Ｄ（Rho）陰性 22 17 20 21 対照 19 17 ＊シグナルは明細書に記載したようにして動揺解析に
よつて求めた。40以上のシグナルを陽性とみなした。
よつて求めた。40以上のシグナルを陽性とみなした。
例 ６ Ａ血液型抗原に特異的な抗体の測定のための検定 Ａ型の全血を2800rpmで遠心分離し、上澄液と白血球
のバフイーコートを吸引して除去した。パツクされた細
胞を等張性緩衝食塩溶液で洗浄して血漿を除き、10％ウ
シ血清アルブミンを含む緩衝液中に50％ヘマトクリツト
になるように懸濁した。
のバフイーコートを吸引して除去した。パツクされた細
胞を等張性緩衝食塩溶液で洗浄して血漿を除き、10％ウ
シ血清アルブミンを含む緩衝液中に50％ヘマトクリツト
になるように懸濁した。
DFM中DEASの飽和溶液を調製し、DMFで1:10（容量比）
に希釈した。希釈DEAM溶液50μを、上記Ａ型細胞懸濁
液1mlに絶えず撹拌しながら滴加、混合した。
に希釈した。希釈DEAM溶液50μを、上記Ａ型細胞懸濁
液1mlに絶えず撹拌しながら滴加、混合した。
この懸濁液10μを全血サンプル20μと混合した。
この混合物を室温に１分間保持したのち、血清アルブミ
ンとデキストランを含む緩衝液3mlで希釈し、限定容量
法および粒子計数装置を用いて、例５に上述したのと同
様にして解析した。結果は第２表にまとめる。
この混合物を室温に１分間保持したのち、血清アルブミ
ンとデキストランを含む緩衝液3mlで希釈し、限定容量
法および粒子計数装置を用いて、例５に上述したのと同
様にして解析した。結果は第２表にまとめる。
第２表 血液型＊ シグナル＊＊ Ａ 18 23 25 13 18 Ｂ 112 110 91 107 56 AB 35 25 19 22 18 Ｏ 106 134 81 116 80 対照＊＊＊ 15 18 16 ＊ 表に示した血液型の各５名の別の被検者からのサンプ
ルについて試験した。＊＊ シグナルは明細書に記載したように動揺解析によつ
て求めた。40以上のシグナルを陽性とみなした。＊＊＊ 対照シグナルはAB型であることがわかつている被
検者からの血液とＡ細胞を反応させることによつて得
た。
ルについて試験した。＊＊ シグナルは明細書に記載したように動揺解析によつ
て求めた。40以上のシグナルを陽性とみなした。＊＊＊ 対照シグナルはAB型であることがわかつている被
検者からの血液とＡ細胞を反応させることによつて得
た。
例 ７ 血液型抗原A,BおよびＯについて、Ａ（αＡ）および
Ｂ（αＢ）血液型抗原に特異的な抗体およびＯ型被検者
（αA,B）から得られた抗体をそれぞれ用いて、例５の
検定を繰り返した。結果を第３表にまとめる。
Ｂ（αＢ）血液型抗原に特異的な抗体およびＯ型被検者
（αA,B）から得られた抗体をそれぞれ用いて、例５の
検定を繰り返した。結果を第３表にまとめる。
第３表 血液型 試 薬 シグナル＊ Ａ αＡ 103 αＢ 21 αA,B 74 対照−試薬なし 21 Ｂ αＡ 19 αＢ 100 αA,B 113 対照−試薬なし 22 Ｏ αＡ 18 αＢ 22 αA,B 17 対照−試薬なし 23 ＊ シグナルは明細書に記載したように動揺解析によつて
得られた。40以上のシグナルを陽性とみなした。
得られた。40以上のシグナルを陽性とみなした。
例 ８ 試薬赤血球の染色 A.食塩溶液中C7SAS界面活性染料 ヒト赤血球を等張性食塩溶液で洗浄し、ウシ血清アル
ブミン（BSA）20g/を含有する食塩溶液中に約４×109
細胞/mlになるように懸濁した。
ブミン（BSA）20g/を含有する食塩溶液中に約４×109
細胞/mlになるように懸濁した。
スクアレインスルホネート染料、C7SAS（10-4M,ジメ
チルアセトアミド中,100μ）を、BSA含有食塩溶液1ml
に絶えず撹拌しながら滴加した。この溶液を直ちに細胞
懸濁液1mlに絶えず撹拌しながら滴加した。得られた細
胞懸濁液を穏やかに混合する。細胞を等張性食塩溶液中
で洗浄し、等張性細胞保存メジウム中に、逆判定の場合
は約５×108細胞/ml（５％ヘマトクリツト），抗体スク
リーニングの場合は１×109細胞/ml（10％ヘマトリクリ
ツト）になるように保存した。
チルアセトアミド中,100μ）を、BSA含有食塩溶液1ml
に絶えず撹拌しながら滴加した。この溶液を直ちに細胞
懸濁液1mlに絶えず撹拌しながら滴加した。得られた細
胞懸濁液を穏やかに混合する。細胞を等張性食塩溶液中
で洗浄し、等張性細胞保存メジウム中に、逆判定の場合
は約５×108細胞/ml（５％ヘマトクリツト），抗体スク
リーニングの場合は１×109細胞/ml（10％ヘマトリクリ
ツト）になるように保存した。
0.5ml食塩溶液中に、10％ヘマトリクリツト細胞10μ
を希釈して螢光を測定し、例５に記載したと同様にし
て平均螢光（ｘ）を求めた。細胞内への螢光の取り込み
を経時的に第４表に示す。
を希釈して螢光を測定し、例５に記載したと同様にし
て平均螢光（ｘ）を求めた。細胞内への螢光の取り込み
を経時的に第４表に示す。
値が約100で装置の十分な感度が得られ、これは食
塩溶液/BSA中細胞を染料と混合して約30分以内に達成さ
れることが明らかにされた。
塩溶液/BSA中細胞を染料と混合して約30分以内に達成さ
れることが明らかにされた。
B.血漿中C7SAS C7SAS界面活性染料（１×10-4M,ジメチルアセトアミ
ド中）50μを全血1mlと混合した。第５表に示した間
隔で、サンプルの一部を取り遠心分離した。細胞を洗浄
し、食塩溶液に懸濁したのち、螢光を測定した。第５表
には、経時的な螢光（）の変化を示す。
ド中）50μを全血1mlと混合した。第５表に示した間
隔で、サンプルの一部を取り遠心分離した。細胞を洗浄
し、食塩溶液に懸濁したのち、螢光を測定した。第５表
には、経時的な螢光（）の変化を示す。
C.食塩溶液中C8SAS 赤血球を食塩溶液中で洗浄し、懸濁メジウム（２％BS
A,2％ブルロニツク,0.4％β−シクロデキストリン）中2
0％ヘマトリクリツトに懸濁した。細胞懸濁液1mlに、撹
拌しながら、ジメチルアセトアミド中１×10-4M C8SAS
染料溶液50μを加えた。細胞を室温に10分間放置し、
ついで食塩溶液で洗浄して等張性保存メジウム中に懸濁
した。３種の異なる懸濁メジウム中で生じた螢光を第６
表に示す。
A,2％ブルロニツク,0.4％β−シクロデキストリン）中2
0％ヘマトリクリツトに懸濁した。細胞懸濁液1mlに、撹
拌しながら、ジメチルアセトアミド中１×10-4M C8SAS
染料溶液50μを加えた。細胞を室温に10分間放置し、
ついで食塩溶液で洗浄して等張性保存メジウム中に懸濁
した。３種の異なる懸濁メジウム中で生じた螢光を第６
表に示す。
例 ９ 検定インキユベーシヨン時における染色細胞からの染料
の喪失 サンプルと37℃でインキユベートしている間の、染色
細胞からの螢光の喪失を調べるために、細胞を様々なス
クアレイン染料で染色し、低イオン強度溶液（LISS）中
血漿の1:1（v/v）混合物に0.9容量％に懸濁した。混合
物を試験管内で37℃においてインキユベートした。選ば
れた時間間隔で、試験管を取り出し、細胞を遠心分離
し、食塩溶液中で洗浄し、0.5mlの食塩溶液に再懸濁し
た。懸濁液の螢光（）を例８と同様にして測定した。
第７表には、各種染料で染色した場合の細胞の相対螢光
を示す。
の喪失 サンプルと37℃でインキユベートしている間の、染色
細胞からの螢光の喪失を調べるために、細胞を様々なス
クアレイン染料で染色し、低イオン強度溶液（LISS）中
血漿の1:1（v/v）混合物に0.9容量％に懸濁した。混合
物を試験管内で37℃においてインキユベートした。選ば
れた時間間隔で、試験管を取り出し、細胞を遠心分離
し、食塩溶液中で洗浄し、0.5mlの食塩溶液に再懸濁し
た。懸濁液の螢光（）を例８と同様にして測定した。
第７表には、各種染料で染色した場合の細胞の相対螢光
を示す。
第７表は、実際の抗体スクリーニングおよび交差適合
性検定の条件で、界面活性染料C7SASおよびC8SASの漏出
速度がDEASに比べて比較的遅いことを示している。DEAS
は、例５に示したように、C7SASを用いた場合の細胞の
染色速度（例８）に比べて、きわめて迅速に細胞を染色
し、したがつて、染色細胞の希釈または分離を要しない
検定には好ましい。
性検定の条件で、界面活性染料C7SASおよびC8SASの漏出
速度がDEASに比べて比較的遅いことを示している。DEAS
は、例５に示したように、C7SASを用いた場合の細胞の
染色速度（例８）に比べて、きわめて迅速に細胞を染色
し、したがつて、染色細胞の希釈または分離を要しない
検定には好ましい。
例10 逆判定におけるC7SAS染色細胞の使用 C7SASで染色した10μ（５％ヘマトクリツト）を反
応カツプに取り、血液サンプル50μを加えた。２分間
混合したのち、懸濁液を0.5mlの食塩溶液で希釈し、凝
集指数を求めるための測定を行つた。結果を第８表に示
す。
応カツプに取り、血液サンプル50μを加えた。２分間
混合したのち、懸濁液を0.5mlの食塩溶液で希釈し、凝
集指数を求めるための測定を行つた。結果を第８表に示
す。
第８表は、標準Ｂ細胞がＢ抗原をもたない血液で凝集
し、したがつて抗−Ｂ−抗体をもつことを示している。
染色Ａ細胞はＡ抗原をもたない血液で凝集し、したがつ
て抗−Ａ−抗体をもつている。DEAS染料の使用は、染料
の漏出、その結果としてのシグナルの喪失により、この
特定の種類の検定には有効ではない。
し、したがつて抗−Ｂ−抗体をもつことを示している。
染色Ａ細胞はＡ抗原をもたない血液で凝集し、したがつ
て抗−Ａ−抗体をもつている。DEAS染料の使用は、染料
の漏出、その結果としてのシグナルの喪失により、この
特定の種類の検定には有効ではない。
例11 抗体スクリーニング検定におけるC7SAS染色細胞の使用 各サンプルについて、前述の方法によつてC7SAS染料
で染色した10％ヘマトクリツトスクリーン細胞10μ
を、新鮮なまたは前もつて凍結した血漿のいずれか50μ
およびLISS50μとともに、ガラス試験管中37℃で10
分間インキユベートした。サンプルを遠心分離または磁
力分離によつてLISSで洗浄した。得られた細胞懸濁液を
LISSで40μに希釈し、10μの抗−ヒトグロブリン−
PVP遮断試薬とともにラテツクス反応に適用した。反応
試薬を混合し、ついでサンプルを希釈し、凝数指数を測
定する自動化プロトコールを使用した。第９表には、陽
性および陰性サンプルについての代表的な凝集指数（A
I）値を示す。
で染色した10％ヘマトクリツトスクリーン細胞10μ
を、新鮮なまたは前もつて凍結した血漿のいずれか50μ
およびLISS50μとともに、ガラス試験管中37℃で10
分間インキユベートした。サンプルを遠心分離または磁
力分離によつてLISSで洗浄した。得られた細胞懸濁液を
LISSで40μに希釈し、10μの抗−ヒトグロブリン−
PVP遮断試薬とともにラテツクス反応に適用した。反応
試薬を混合し、ついでサンプルを希釈し、凝数指数を測
定する自動化プロトコールを使用した。第９表には、陽
性および陰性サンプルについての代表的な凝集指数（A
I）値を示す。
第９表 抗 体 AI 抗−Ｅ陽性 15200 陰性 220 抗−Fya陽性 1302 陰性 115 抗−Jka陽性 804 陰性 166 上記データは、本発明の方法が、広範囲の被検物質の
検定に有用性を示し、とくに血液型判定に有用であるこ
とを示している。方法は単純かつ迅速である。
検定に有用性を示し、とくに血液型判定に有用であるこ
とを示している。方法は単純かつ迅速である。
以上、本発明を明確にしまた理解を容易にするため
に、例示および実例によつて詳細に説明したが、この特
許請求の範囲内において改変および修飾が実行できるこ
とは自明のとおりである。
に、例示および実例によつて詳細に説明したが、この特
許請求の範囲内において改変および修飾が実行できるこ
とは自明のとおりである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 マエ ウォン―レング フ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 ロ ス アルトス ヒルズ，セントフランシ ス 26705 (72)発明者 モウリーン ラニィ アメリカ合衆国 カリフォルニア州 パ ロ アルト，ウィルトン アベニュー 445 (72)発明者 トーマス エル．ターノウスキー アメリカ合衆国 カリフォルニア州 サ ウス サン フランシスコ，ロックウッ ド ドライブ 303 (56)参考文献 特開 昭63−191065（ＪＰ，Ａ) 米国特許4380786（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C09B 57/00 C09B 55/00 G01N 33/533 G01N 33/53 G01N 33/542 ＣＡ（ＳＴＮ)
Claims (9)
- 【請求項１】式 〔式中、R1およびR2は独立に、低級アルキル（炭素原子
１〜５個）からなる群より選ばれるが、R1およびR2基の
少なくとも一方は−SO3H、−OSO3H、−PO3H2、−OPO3H2
および−NHSO3Hからなる群より選ばれる置換基を有し、
R3およびR4は独立に、アルキル（炭素原子５〜15個）か
らなる群より選ばれ、R5およびR6は独立に、水素、ヒド
ロキシルおよび低級アルコキシル（炭素原子１〜５個）
からなる群より選ばれる〕で表される化合物 - 【請求項２】R1およびR2の置換基が−SO3Hである請求項
（１）記載の化合物 - 【請求項３】R1が低級アルキル（炭素原子１〜５個）、
R3およびR4がアルキル（炭素原子５〜15個）、R2が−
（CH2）nSO3H（式中、ｎは２〜５である）であり、好ま
しくはR1がエチル、R3およびR4がヘプチル、ｎが３であ
る請求項（１）記載の化合物 - 【請求項４】水性サンプル中における特異的結合ペアの
一要素（sbp要素）の存在を測定する方法において、
（ａ）水性メジウム中（ｉ）サンプル、（ii）相補性sb
p要素（この場合、少なくとも一方のsbp要素またはその
相補性sbp要素は細胞の表面に結合される）、および（i
ii）細胞内に取り込まれることが可能な蛍光剤を混合
し、（ｂ）sbp要素の存在の指標としての蛍光の変化を
測定する方法であって、蛍光剤は式 〔式中、R1およびR2は独立に、低級アルキル（炭素原子
１〜５個）からなる群より選ばれるが、R1およびR2基の
少なくとも一方は−SO3H、−OSO3H、−PO3H2、−OPO3H2
および−NHSO3Hからなる群より選ばれる置換基を有し、
R3およびR4は独立に、アルキル（炭素原子５〜15個）か
らなる群より選ばれ、R5およびR6は独立に、水素、ヒド
ロキシルおよび低級アルコキシル（炭素原子１〜５個）
からなる群より選ばれる〕で表される化合物である方法 - 【請求項５】請求項（１）記載の蛍光剤で染色された細
胞からなる組成物 - 【請求項６】全血サンプル中における特異的結合ペアの
一要素（sbp要素）の存在を測定する方法において、
（ａ）水性メジウム中（ｉ）サンプル、（ii）相補性sb
p要素（この場合、少なくとも一方のsbp要素またはその
相補性sbp要素は細胞の表面に結合される）、および（i
ii）細胞内に取り込まれることが可能な蛍光剤を混合
し、（ｂ）細胞の凝集の結果として生じ、sbp要素の存
在の指標である蛍光の変化を、細胞を水性メジウムから
分離することなく測定する方法であって、蛍光剤は式 〔式中、R1およびR2は独立に、低級アルキル（炭素原子
１〜５個）からなる群より選ばれるが、R1およびR2基の
少なくとも一方は−SO3H、−OSO3H、−PO3H2、−OPO
3H2、COOHおよび−NHSO3Hからなる群より選ばれる置換
基を有し、R3およびR4は独立に、アルキル（炭素原子５
〜15個）からなる群より選ばれ、R5およびR6は独立に、
水素、ヒドロキシルおよび低級アルコキシル（炭素原子
１〜５個）からなる群より選ばれる〕で表される化合物
である方法 - 【請求項７】細胞の凝集を用いる赤血球型の判定方法に
おいて、赤血球を請求項（６）記載の蛍光剤と混合する
改良方法 - 【請求項８】血液サンプル中における赤血球表面抗原に
対する抗体の存在を測定する方法において、（ａ）表面
に表面抗原を有する細胞を式 〔式中、R1およびR2は独立に、低級アルキル（炭素原子
１〜５個）からなる群より選ばれるが、R1およびR2基の
少なくとも一方は−SO3H、−OSO3H、−PO3H2、−OPO
3H2、−COOHおよび−NHSO3Hからなる群より選ばれる置
換基を有し、R3およびR4は独立に、アルキル（炭素原子
５〜15個）からなる群より選ばれ、R5およびR6は独立
に、水素、ヒドロキシルおよび低級アルコキシル（炭素
原子１〜５個）からなる群より選ばれる〕で表される化
合物で染色し、（ｂ）水性メジウム中に血液サンプルと
（ａ）の細胞を混合し、（ｃ）細胞に抗体が結合しやす
いようにメジウムをインキュベートし、（ｄ）細胞の凝
集の結果として生じ、抗体の存在の指標である蛍光の変
化を測定する方法 - 【請求項９】細胞の凝集を用いる血液サンプル中の抗体
の検出方法において、式 〔式中、R1およびR2は独立に、低級アルキル（炭素原子
１〜５個）からなる群より選ばれるが、R1およびR2基の
少なくとも一方は−SO3H、−OSO3H、−PO3H2、−OPO
3H2、−COOHおよび−NHSO3Hからなる群より選ばれる置
換基を有し、R3およびR4は独立に、アルキル（炭素原子
５〜15個）からなる群より選ばれ、R5およびR6は独立
に、水素、ヒドロキシルおよび低級アルコキシル（炭素
原子１〜５個）からなる群より選ばれる〕で表される化
合物で染色した細胞を混合する改良方法
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