JP2793533B2 - 生物発光および化学発光反応におけるシグナル検出を高めるための白色トリガー調製物 - Google Patents
生物発光および化学発光反応におけるシグナル検出を高めるための白色トリガー調製物Info
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Description
【0001】
【発明の属する技術分野】本発明は、サンプル液を、発
光標識を有する少なくとも1つのレセプターとインキュ
ベートし、そして該サンプル液中の検出すべきアナライ
ト(測定対象物質)の存在および/または量を発光の測
定により判定するリガンド−レセプターアッセイ(例え
ば、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ
またはこれらの組合せ)の原理に従って、発光の測定に
よりサンプル液中のアナライトを検出するための方法に
関するものである。
光標識を有する少なくとも1つのレセプターとインキュ
ベートし、そして該サンプル液中の検出すべきアナライ
ト(測定対象物質)の存在および/または量を発光の測
定により判定するリガンド−レセプターアッセイ(例え
ば、イムノアッセイ、ハイブリダイゼーションアッセイ
またはこれらの組合せ)の原理に従って、発光の測定に
よりサンプル液中のアナライトを検出するための方法に
関するものである。
【0002】
【従来の技術】免疫学的検査法の検出系としてイソルミ
ノールまたはアクリジニウム化合物のような直接的蛍光
標識、あるいは西洋ワサビペルオキシダーゼ/ルミノー
ルまたはアルカリホスファターゼ/安定化ジオキセタン
のような酵素増幅発光標識を使用することは、放射性マ
ーカーグループのような他の試験系よりも高感度である
という長所を有している(特に、Knox van Dyke (発
行):Bioluminescence and Chemiluminescence 中の M
cCapra F. and Beheshti I.; Instruments and Applica
tions, Vol. 1, 9-42, 1985; Knox van Dyke(発行):
Bioluminescence and Chemiluminescence 中の Barnard
G.J.R. ら; Instruments and Applications, Vol. 1,
151-183, 1985; de Luca M.A. and McElroy W.D.(発
行):Methodsin Enzymology, Vol. 133, 366-387, 198
6; McCapra F.ら, Journal of Bioluminescence and Ch
emiluminescence 4, 51-58, 1989; Bronstein I. and M
cGrathP., Nature 338, 599-600, 1989; Thorpe G.H. a
nd Kricka L.J., Journal of Bioluminescence and Che
miluminescence 3, 97-100, 1989を参照されたい)。
ノールまたはアクリジニウム化合物のような直接的蛍光
標識、あるいは西洋ワサビペルオキシダーゼ/ルミノー
ルまたはアルカリホスファターゼ/安定化ジオキセタン
のような酵素増幅発光標識を使用することは、放射性マ
ーカーグループのような他の試験系よりも高感度である
という長所を有している(特に、Knox van Dyke (発
行):Bioluminescence and Chemiluminescence 中の M
cCapra F. and Beheshti I.; Instruments and Applica
tions, Vol. 1, 9-42, 1985; Knox van Dyke(発行):
Bioluminescence and Chemiluminescence 中の Barnard
G.J.R. ら; Instruments and Applications, Vol. 1,
151-183, 1985; de Luca M.A. and McElroy W.D.(発
行):Methodsin Enzymology, Vol. 133, 366-387, 198
6; McCapra F.ら, Journal of Bioluminescence and Ch
emiluminescence 4, 51-58, 1989; Bronstein I. and M
cGrathP., Nature 338, 599-600, 1989; Thorpe G.H. a
nd Kricka L.J., Journal of Bioluminescence and Che
miluminescence 3, 97-100, 1989を参照されたい)。
【0003】しかし、発光標識の欠点はそのシグナル強
度が弱いことである。それは、発光の測定においてシグ
ナルの増幅が可能でない、すなわち、1回の光発生反応
において1つの直接標識または1つの発光酵素基質分子
が消費される、という事実によるものである。それゆ
え、この欠点を排除するための試みが久しく行われてき
た。
度が弱いことである。それは、発光の測定においてシグ
ナルの増幅が可能でない、すなわち、1回の光発生反応
において1つの直接標識または1つの発光酵素基質分子
が消費される、という事実によるものである。それゆ
え、この欠点を排除するための試みが久しく行われてき
た。
【0004】こうして、例えば、ペルオキシダーゼ(P
OD)により触媒されるルミノール酸化からの化学発光
は、ベンゾチアゾール類 (Whitehead T.P.ら, Nature 3
05,158-159, 1983)、p−ヨードフェノールのようなp
−置換フェノール類 (ThorpeG.H. ら, Clinical Chemis
try 31, 1335-1341, 1985; Coyle P.M.ら, Annals of C
linical Biochemistry 23, 42-46, 1986)、フルオレセ
イン (EP 0 228 046 B1)、o−もしくはp−チアゾリル
フェノール類またはo−もしくはp−チエニルフェノー
ル類 (EP 0 455 471 A2)、ヒドロキシフルオレノン類
(WO 90/13665)により増幅し得ることが知られている。
これらの増幅用分子は光を発生するルミノール酸化の協
応 (co-ordination)を改善するものである。
OD)により触媒されるルミノール酸化からの化学発光
は、ベンゾチアゾール類 (Whitehead T.P.ら, Nature 3
05,158-159, 1983)、p−ヨードフェノールのようなp
−置換フェノール類 (ThorpeG.H. ら, Clinical Chemis
try 31, 1335-1341, 1985; Coyle P.M.ら, Annals of C
linical Biochemistry 23, 42-46, 1986)、フルオレセ
イン (EP 0 228 046 B1)、o−もしくはp−チアゾリル
フェノール類またはo−もしくはp−チエニルフェノー
ル類 (EP 0 455 471 A2)、ヒドロキシフルオレノン類
(WO 90/13665)により増幅し得ることが知られている。
これらの増幅用分子は光を発生するルミノール酸化の協
応 (co-ordination)を改善するものである。
【0005】さらに、トリガーとなる安定化されたジオ
キセタンのアルカリホスファターゼ触媒化学発光は、ポ
リビニルベンジル(ベンジルジメチルアンモニウム)ク
ロライド(Bronstein I.らによる米国特許第 5 145 772
号; Tropix News Letter onChemiluminescent Substrat
es, 1993)、ポリビニルベンジル−トリアルキル−ホス
ホニウム塩(Schaap A.P. による EP 0 561 033 A1)に
より増幅し得ることが知られている。これらの疎水性ポ
リマー添加剤は、励起状態で形成される生成物の直接の
環境から水を移動させて、疎水性媒体中でそれらを安定
化させ、その結果として光子の収量を高めるものであ
る。
キセタンのアルカリホスファターゼ触媒化学発光は、ポ
リビニルベンジル(ベンジルジメチルアンモニウム)ク
ロライド(Bronstein I.らによる米国特許第 5 145 772
号; Tropix News Letter onChemiluminescent Substrat
es, 1993)、ポリビニルベンジル−トリアルキル−ホス
ホニウム塩(Schaap A.P. による EP 0 561 033 A1)に
より増幅し得ることが知られている。これらの疎水性ポ
リマー添加剤は、励起状態で形成される生成物の直接の
環境から水を移動させて、疎水性媒体中でそれらを安定
化させ、その結果として光子の収量を高めるものであ
る。
【0006】アクリジニウム化合物の化学発光は、蓄積
を達成するためにジパルミトイルホスホリピドとコレス
テロールから構成されたリポソーム内に、さらに疎水化
されたアクリジニウムエステル分子を保持させることに
より (Law S.J.ら, Journalof Bioluminescence and Ch
emiluminescence 4, 88-98)、またはシグナルの増幅を
達成するために第四級ホスホニウム塩 (EP 0 534 380 A
1)もしくは臭化セチルトリメチルアンモニウムのミセル
(McCapra F. Accounts of Chemical Research9, 201-2
08, 1976)を添加することにより増幅することが可能で
ある。作用機構に関して、この場合(つまり、励起状態
にあって、発光可能な化学生成物の収量の増加)には暗
反応よりもむしろ明反応を選ぶことが論じられている。
を達成するためにジパルミトイルホスホリピドとコレス
テロールから構成されたリポソーム内に、さらに疎水化
されたアクリジニウムエステル分子を保持させることに
より (Law S.J.ら, Journalof Bioluminescence and Ch
emiluminescence 4, 88-98)、またはシグナルの増幅を
達成するために第四級ホスホニウム塩 (EP 0 534 380 A
1)もしくは臭化セチルトリメチルアンモニウムのミセル
(McCapra F. Accounts of Chemical Research9, 201-2
08, 1976)を添加することにより増幅することが可能で
ある。作用機構に関して、この場合(つまり、励起状態
にあって、発光可能な化学生成物の収量の増加)には暗
反応よりもむしろ明反応を選ぶことが論じられている。
【0007】
【発明が解決しようとする課題】上述した増幅方法の欠
点は、これらの各々がある特定の発光系に対して特異的
であるという点である。従って、本発明の課題は、発光
反応におけるシグナル検出を改良するための方法であっ
て、それぞれの発光系とは無関係に、そして所望によ
り、他の増幅方法と併用して、使用することができるこ
うした方法を提供することである。
点は、これらの各々がある特定の発光系に対して特異的
であるという点である。従って、本発明の課題は、発光
反応におけるシグナル検出を改良するための方法であっ
て、それぞれの発光系とは無関係に、そして所望によ
り、他の増幅方法と併用して、使用することができるこ
うした方法を提供することである。
【0008】
【課題を解決するための手段】この課題は、本発明によ
ると、発光反応において発生した光のランダム化 (rand
omization)を引き起こし、そして所望により光散乱にお
いて選択的方向の形成をもたらす、分散成分を含有する
測定媒体中で発光を測定することを特徴とする、サンプ
ル液を発光標識を有する少なくとも1つのレセプターと
インキュベートし、該サンプル液中の検出すべきアナラ
イトの存在および/または量を発光の測定により判定す
るリガンド−レセプターアッセイの原理に従って、サン
プル液中のアナライトを検出する方法により達成され
る。
ると、発光反応において発生した光のランダム化 (rand
omization)を引き起こし、そして所望により光散乱にお
いて選択的方向の形成をもたらす、分散成分を含有する
測定媒体中で発光を測定することを特徴とする、サンプ
ル液を発光標識を有する少なくとも1つのレセプターと
インキュベートし、該サンプル液中の検出すべきアナラ
イトの存在および/または量を発光の測定により判定す
るリガンド−レセプターアッセイの原理に従って、サン
プル液中のアナライトを検出する方法により達成され
る。
【0009】驚いたことに、分散成分の存在により引き
起こされた、発光反応において発生した光のこのランダ
ム化つまり反射は、発光測定の感度および精度を相当に
向上させるものである。さらに、例えば固相上に発光標
識レセプターを固定化することによって、光源の上と下
の層の厚さの関係によって好ましい光散乱の方向を達成
することが可能となる。これらの作用は用いるそれぞれ
の発光系とは無関係で、そのため様々な用途に応用しう
る。本発明の方法の更なる利点は、簡便かつ費用効率的
に実施し得るということである。
起こされた、発光反応において発生した光のこのランダ
ム化つまり反射は、発光測定の感度および精度を相当に
向上させるものである。さらに、例えば固相上に発光標
識レセプターを固定化することによって、光源の上と下
の層の厚さの関係によって好ましい光散乱の方向を達成
することが可能となる。これらの作用は用いるそれぞれ
の発光系とは無関係で、そのため様々な用途に応用しう
る。本発明の方法の更なる利点は、簡便かつ費用効率的
に実施し得るということである。
【0010】本発明の方法により発光測定を実施するた
めの測定媒体は、通常、その中に分散された気体、液体
および/または固体の成分を含有する液相を含むもので
ある。この分散液は、分散成分の有意な分離(例えば、
相分離または沈降による)が測定過程で生じないように
十分な安定性を有することが好ましい。本発明の方法を
自動測定装置において使用する場合は、分散液が少なく
とも1日間、より好ましくは少なくとも1週間、最も好
ましくは少なくとも3週間、安定していることが望まし
い。かかる分散液の例を以下に示す。
めの測定媒体は、通常、その中に分散された気体、液体
および/または固体の成分を含有する液相を含むもので
ある。この分散液は、分散成分の有意な分離(例えば、
相分離または沈降による)が測定過程で生じないように
十分な安定性を有することが好ましい。本発明の方法を
自動測定装置において使用する場合は、分散液が少なく
とも1日間、より好ましくは少なくとも1週間、最も好
ましくは少なくとも3週間、安定していることが望まし
い。かかる分散液の例を以下に示す。
【0011】好適な実施態様において、測定媒体は、好
ましくは平均粒径10nm〜3μmを有する、固体粒子
の懸濁液またはコロイド溶液(ゾル)を含むものであ
る。より好ましくは、固体粒子の平均粒径は100nm
〜800nmであり、150nm〜600nmが最も好
ましい。測定中の固体粒子の量は測定媒体に対して0.
01〜2.5%(質量/容量)とすることが好ましく、
0.05〜1.5%(質量/容量)がより好ましいもの
である。
ましくは平均粒径10nm〜3μmを有する、固体粒子
の懸濁液またはコロイド溶液(ゾル)を含むものであ
る。より好ましくは、固体粒子の平均粒径は100nm
〜800nmであり、150nm〜600nmが最も好
ましい。測定中の固体粒子の量は測定媒体に対して0.
01〜2.5%(質量/容量)とすることが好ましく、
0.05〜1.5%(質量/容量)がより好ましいもの
である。
【0012】分散安定性の理由のために、固体分散粒子
の比重量は測定媒体の比重量と著しく相違しないことが
好適であり、好ましくはわずか25%、より好ましくは
10%しか相違しないものである。その例として、アク
リルポリマー、スチレンポリマーなどの有機ポリマー粒
子の分散液(例えば、官能化され得るスルフェートラテ
ックス、アミジンラテックス、双性イオンラテックス)
がある。更なる例として、エチレン、プロピレン、ブタ
ジエン、ビニルおよびウレタンのポリマーならびに前記
ポリマーのコポリマーが挙げられる。特定の例を以下の
表に示す。
の比重量は測定媒体の比重量と著しく相違しないことが
好適であり、好ましくはわずか25%、より好ましくは
10%しか相違しないものである。その例として、アク
リルポリマー、スチレンポリマーなどの有機ポリマー粒
子の分散液(例えば、官能化され得るスルフェートラテ
ックス、アミジンラテックス、双性イオンラテックス)
がある。更なる例として、エチレン、プロピレン、ブタ
ジエン、ビニルおよびウレタンのポリマーならびに前記
ポリマーのコポリマーが挙げられる。特定の例を以下の
表に示す。
【0013】 ポリマー 比重量(g/cm3 ) ポリメチルメタクリレート 1.19 ポリスチレン 1.05 ポリビニルトルエン 1.027 スチレン/ブタジエン 95/5 (%w) 1.05 スチレン/ブタジエン 60/40 (%w) 0.99 ビニルトルエン/t−ブチルスチレン 63/37 (%w) 1.00
【0014】分散粒子を選択する際には、該粒子上に存
在しうる反応性の基が、用いるそれぞれの発光系と適合
するものであることにも注意を払うべきである。本発明
の他の好適な実施態様において、測定媒体は平均粒径が
好ましくは10nm〜3μm、より好ましくは100n
m〜1500nmの液体粒子のエマルジョンまたはコロ
イド溶液を含むものである。これらの液体粒子は測定媒
体に対して0.01〜3.5%(質量/容量)の量で測
定中に存在することが好ましく、0.1〜1.5%(質
量/容量)の量で存在することがより好ましい。液体粒
子を含有する安定な分散液の例は水中に含まれる脂質の
エマルジョンであり、例えばホモジナイズしたミルク、
またはダイズ脂質もしくはミセル形成物質のエマルジョ
ンである。
在しうる反応性の基が、用いるそれぞれの発光系と適合
するものであることにも注意を払うべきである。本発明
の他の好適な実施態様において、測定媒体は平均粒径が
好ましくは10nm〜3μm、より好ましくは100n
m〜1500nmの液体粒子のエマルジョンまたはコロ
イド溶液を含むものである。これらの液体粒子は測定媒
体に対して0.01〜3.5%(質量/容量)の量で測
定中に存在することが好ましく、0.1〜1.5%(質
量/容量)の量で存在することがより好ましい。液体粒
子を含有する安定な分散液の例は水中に含まれる脂質の
エマルジョンであり、例えばホモジナイズしたミルク、
またはダイズ脂質もしくはミセル形成物質のエマルジョ
ンである。
【0015】基本的に、直接的な生物発光または化学発
光標識、間接的な酵素増幅標識、電気化学発光標識など
の公知の発光標識はすべて本発明の方法に適している。
好ましい発光標識の例は、カルシウムによって活性化さ
れる発光タンパク質、例えばエクオリン (aequorin) 、
オベリン (obelin) 、クリチン (clytin) 、ミトロコミ
ン (mitrocomin) 、ベロビン (berovin)およびネミオプ
シン (mnemiopsin) である。エクオリンは発光オワンク
ラゲ (Aequorea victoria)由来のカルシウムによって活
性化され得る生物発光タンパク質である。エクオリンの
組換え生産は、Stultsら (Biochemistry 31 (1992), 14
33-1442)によって記述されている。生物オベリア・ロン
ギシマ (Obelia longissima)由来の発光タンパク質オベ
リンの単離および精製は、Vysotskii ら (Biokhimiya 5
4 (1989), 965-973)によって記述されている。オベリン
のクローニング、発現および配列は、Illarionovら (J.
Bioluminescence and Chemiluminescence 8 (1993), V
II. International Symposium-Abstracts, 88)によって
記述されている。発光タンパク質のクリチンおよびミト
ロコミンのクローニング、発現および配列は、Inouye a
nd Tsuji (FEBS 315(1993), 343-346) および Faganら
(FEBS 333 (1993), 301-305) に記載されている。エク
オリンファミリーのその他のメンバーには発光タンパク
質のベロビンとネミオプシンが含まれる (Ward and Sel
iger, Biochemistry 13 (1974), 1491-1499 and 1500-1
510)。
光標識、間接的な酵素増幅標識、電気化学発光標識など
の公知の発光標識はすべて本発明の方法に適している。
好ましい発光標識の例は、カルシウムによって活性化さ
れる発光タンパク質、例えばエクオリン (aequorin) 、
オベリン (obelin) 、クリチン (clytin) 、ミトロコミ
ン (mitrocomin) 、ベロビン (berovin)およびネミオプ
シン (mnemiopsin) である。エクオリンは発光オワンク
ラゲ (Aequorea victoria)由来のカルシウムによって活
性化され得る生物発光タンパク質である。エクオリンの
組換え生産は、Stultsら (Biochemistry 31 (1992), 14
33-1442)によって記述されている。生物オベリア・ロン
ギシマ (Obelia longissima)由来の発光タンパク質オベ
リンの単離および精製は、Vysotskii ら (Biokhimiya 5
4 (1989), 965-973)によって記述されている。オベリン
のクローニング、発現および配列は、Illarionovら (J.
Bioluminescence and Chemiluminescence 8 (1993), V
II. International Symposium-Abstracts, 88)によって
記述されている。発光タンパク質のクリチンおよびミト
ロコミンのクローニング、発現および配列は、Inouye a
nd Tsuji (FEBS 315(1993), 343-346) および Faganら
(FEBS 333 (1993), 301-305) に記載されている。エク
オリンファミリーのその他のメンバーには発光タンパク
質のベロビンとネミオプシンが含まれる (Ward and Sel
iger, Biochemistry 13 (1974), 1491-1499 and 1500-1
510)。
【0016】上記の発光タンパク質にカルシウムが結合
するとコンホメーションの変化が起こり、それによって
該タンパク質が発光を伴う酸化反応を触媒する酵素に変
換される。
するとコンホメーションの変化が起こり、それによって
該タンパク質が発光を伴う酸化反応を触媒する酵素に変
換される。
【0017】本発明に適する他の発光標識はイソルミノ
ールまたはアクリジニウム化合物、例えばアリールエス
テル、N−官能化塩、ベンゾアクリジニウム化合物また
はカルボキサミドである。イソルミノールの場合は、発
光反応がH2 O2 /OH- および触媒、例えばミクロペ
ルオキシダーゼまたはこの触媒の修飾補欠分子族(例:
ジュウテロ−フェリヘム)によって引き起こされる。ア
クリジニウム化合物はH2 O2 /H+ およびOH- の連
続的添加によって誘発される。イソルミノールやアクリ
ジニウム化合物を用いる発光イムノアッセイの手法は、
例えば、Analytical Applications of Bioluminescence
and Chemiluminescence (1984), Academic Press 社、
特に pp 149-158 および 159-162に記載されている。そ
の開示内容を参照されたい。
ールまたはアクリジニウム化合物、例えばアリールエス
テル、N−官能化塩、ベンゾアクリジニウム化合物また
はカルボキサミドである。イソルミノールの場合は、発
光反応がH2 O2 /OH- および触媒、例えばミクロペ
ルオキシダーゼまたはこの触媒の修飾補欠分子族(例:
ジュウテロ−フェリヘム)によって引き起こされる。ア
クリジニウム化合物はH2 O2 /H+ およびOH- の連
続的添加によって誘発される。イソルミノールやアクリ
ジニウム化合物を用いる発光イムノアッセイの手法は、
例えば、Analytical Applications of Bioluminescence
and Chemiluminescence (1984), Academic Press 社、
特に pp 149-158 および 159-162に記載されている。そ
の開示内容を参照されたい。
【0018】さらに、発光金属キレートのような電気化
学発光標識も本発明による方法に適している。発光金属
キレートは検出可能な電気化学発光反応を生じる金属キ
レートである。こうした金属キレートの金属は遷移金属
または希土類金属であることが好ましく、例えばルテニ
ウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、
白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチ
ウム、銅、クロムまたはタングステンである。ルテニウ
ムが最も好ましい。
学発光標識も本発明による方法に適している。発光金属
キレートは検出可能な電気化学発光反応を生じる金属キ
レートである。こうした金属キレートの金属は遷移金属
または希土類金属であることが好ましく、例えばルテニ
ウム、オスミウム、レニウム、イリジウム、ロジウム、
白金、インジウム、パラジウム、モリブデン、テクネチ
ウム、銅、クロムまたはタングステンである。ルテニウ
ムが最も好ましい。
【0019】金属と一緒になって金属キレートを形成す
る配位子は、通常、窒素を含む芳香族ポリ複素環、例え
ば置換されていてもよいビピリジン、ビピラゾール、タ
ーピリジンおよびフェナントロリンである。ビピリジン
とフェナントロリンが特に好ましいものである。適当な
金属キレートの例および電気化学発光アッセイの手法
は、EP-A-0 178-450、EP-A-0 580 979、WO 90/05301 、
WO 90/11511 および WO92/14138に記述されている。
る配位子は、通常、窒素を含む芳香族ポリ複素環、例え
ば置換されていてもよいビピリジン、ビピラゾール、タ
ーピリジンおよびフェナントロリンである。ビピリジン
とフェナントロリンが特に好ましいものである。適当な
金属キレートの例および電気化学発光アッセイの手法
は、EP-A-0 178-450、EP-A-0 580 979、WO 90/05301 、
WO 90/11511 および WO92/14138に記述されている。
【0020】本発明の方法において、分散成分は、発光
トリガー (luminescent trigger)、すなわち発光反応の
引き金となる物質、とともに測定媒体に添加することが
できる。また、分散成分はトリガーの前に別個に加える
こともできる。本発明の方法では、それぞれのアナライ
トの検出に適した、発光標識を有するレセプターが用い
られる。この発光標識は直接発光しうる原子団または発
光反応を触媒する酵素(例:ペルオキシダーゼまたはア
ルカリホスファターゼ)でありうる。発光標識は直接発
光しうる原子団であることが好ましい。
トリガー (luminescent trigger)、すなわち発光反応の
引き金となる物質、とともに測定媒体に添加することが
できる。また、分散成分はトリガーの前に別個に加える
こともできる。本発明の方法では、それぞれのアナライ
トの検出に適した、発光標識を有するレセプターが用い
られる。この発光標識は直接発光しうる原子団または発
光反応を触媒する酵素(例:ペルオキシダーゼまたはア
ルカリホスファターゼ)でありうる。発光標識は直接発
光しうる原子団であることが好ましい。
【0021】発光標識を有するレセプターは、検査フォ
ーマットに応じて、例えば抗体または抗体フラグメン
ト、抗原またはその一部(例:エピトープ)または必要
であれば担体に結合されるハプテン、あるいは特異的結
合対(例:ビオチン/ストレプトアビジン)の結合相手
または核酸でありうる。発光標識をレセプターに結合さ
せる方法は当技術分野で知られているので、ここで詳述
する必要はない。
ーマットに応じて、例えば抗体または抗体フラグメン
ト、抗原またはその一部(例:エピトープ)または必要
であれば担体に結合されるハプテン、あるいは特異的結
合対(例:ビオチン/ストレプトアビジン)の結合相手
または核酸でありうる。発光標識をレセプターに結合さ
せる方法は当技術分野で知られているので、ここで詳述
する必要はない。
【0022】本発明の方法はリガンド−レセプターアッ
セイの原理(すなわち、サンプル液中に存在するアナラ
イトが標識されたレセプターへの結合によって定性的お
よび/または定量的に検出される)に従って実施され
る。アナライトの検出は、例えば、抗原と抗体の特異的
結合に基づくイムノアッセイにより達成し得る。一方、
アナライトはハイブリダイゼーションアッセイでも検出
することができ、その場合はサンプル液中に存在する核
酸が標識されたレセプター核酸プローブとのハイブリダ
イゼーションにより検出される。また、イムノアッセイ
とハイブリダイゼーションアッセイの組合せも、例えば
核酸レセプターを発光標識抗体によって認識されるハプ
テンに結合させることによって、可能である。
セイの原理(すなわち、サンプル液中に存在するアナラ
イトが標識されたレセプターへの結合によって定性的お
よび/または定量的に検出される)に従って実施され
る。アナライトの検出は、例えば、抗原と抗体の特異的
結合に基づくイムノアッセイにより達成し得る。一方、
アナライトはハイブリダイゼーションアッセイでも検出
することができ、その場合はサンプル液中に存在する核
酸が標識されたレセプター核酸プローブとのハイブリダ
イゼーションにより検出される。また、イムノアッセイ
とハイブリダイゼーションアッセイの組合せも、例えば
核酸レセプターを発光標識抗体によって認識されるハプ
テンに結合させることによって、可能である。
【0023】本発明の方法はリガンド−レセプターアッ
セイの任意の検査フォーマットに従って行うことがで
き、例えば、ただ1つの反応相を用いる均一イムノアッ
セイまたは複数の反応相を用いる不均一イムノアッセイ
として行うことができる。しかし、本発明の方法は不均
一のハイブリダイゼーションアッセイまたはイムノアッ
セイ、あるいはこれらの組合せとして行うことが好適で
ある。このような不均一アッセイでは、発光標識レセプ
ターが、少なくとも1つの反応性固相の存在下でサンプ
ル液とインキュベートされる。任意に相分離を行った後
で、液相中および/または固相上において発光標識が測
定される。固相上の発光標識を測定することが好まし
い。
セイの任意の検査フォーマットに従って行うことがで
き、例えば、ただ1つの反応相を用いる均一イムノアッ
セイまたは複数の反応相を用いる不均一イムノアッセイ
として行うことができる。しかし、本発明の方法は不均
一のハイブリダイゼーションアッセイまたはイムノアッ
セイ、あるいはこれらの組合せとして行うことが好適で
ある。このような不均一アッセイでは、発光標識レセプ
ターが、少なくとも1つの反応性固相の存在下でサンプ
ル液とインキュベートされる。任意に相分離を行った後
で、液相中および/または固相上において発光標識が測
定される。固相上の発光標識を測定することが好まし
い。
【0024】本発明の方法を実施するにあたって、特に
発光標識を固相上で測定する場合には、光発生反応が起
こる測定容器の側面および/または下に取り付けた検出
モジュールによって発光を測定することが好ましい。こ
のような方法の設計において分散成分を添加するという
本発明の最大効果が達成される。なぜならば、固相(例
えば、測定容器の壁面)上の発光標識が常にその支持壁
から比較的一定の距離(典型的には3〜250nm)に
位置づけられるからである。
発光標識を固相上で測定する場合には、光発生反応が起
こる測定容器の側面および/または下に取り付けた検出
モジュールによって発光を測定することが好ましい。こ
のような方法の設計において分散成分を添加するという
本発明の最大効果が達成される。なぜならば、固相(例
えば、測定容器の壁面)上の発光標識が常にその支持壁
から比較的一定の距離(典型的には3〜250nm)に
位置づけられるからである。
【0025】この距離は光を透さない層を形成するには
小さすぎる(それにはおよそ1μm以上の層の厚さが必
要となろう)。例えば、免疫学的反応の終了時にトリガ
ーとともに添加される分散成分の存在下で本発明に従っ
て発光を測定する場合、十分に大容量が加えられるとき
には光源の上に白色の反射カバーが形成され、これは、
容器壁と光源の間の層が薄いために、光散乱の好ましい
方向、すなわち横方向および/または底方向を提供する
こととなる。
小さすぎる(それにはおよそ1μm以上の層の厚さが必
要となろう)。例えば、免疫学的反応の終了時にトリガ
ーとともに添加される分散成分の存在下で本発明に従っ
て発光を測定する場合、十分に大容量が加えられるとき
には光源の上に白色の反射カバーが形成され、これは、
容器壁と光源の間の層が薄いために、光散乱の好ましい
方向、すなわち横方向および/または底方向を提供する
こととなる。
【0026】この方法によって、より多くの光が測定容
器の側面および/または下に配置された検出モジュー
ル、例えば光電子増倍管の感光性カソードに向けられ、
かくしてその収量がシグナル検出において増加する。発
光反応において発生した光のランダム化による感度およ
び精度の増加は、直接標識の場合にも酵素増幅標識の場
合にも、特に緩和時間が短いために拡散依存的距離散乱
が低い励起生成物の場合にも見られる。
器の側面および/または下に配置された検出モジュー
ル、例えば光電子増倍管の感光性カソードに向けられ、
かくしてその収量がシグナル検出において増加する。発
光反応において発生した光のランダム化による感度およ
び精度の増加は、直接標識の場合にも酵素増幅標識の場
合にも、特に緩和時間が短いために拡散依存的距離散乱
が低い励起生成物の場合にも見られる。
【0027】本発明の方法を実施する場合、5〜100
0μl、好ましくは10〜200μlの測定媒体中での
測定を可能にする微量測定容器を用いることが有利であ
る。
0μl、好ましくは10〜200μlの測定媒体中での
測定を可能にする微量測定容器を用いることが有利であ
る。
【0028】本発明はさらに、発光反応において発生し
た光をランダム化し、そして所望により光散乱の選択的
方向を形成するために、発光リガンド−レセプターアッ
セイにおいて、気体、液体および/または固体の成分を
液体中に分散させてなる分散液を使用することに関す
る。この分散液は少なくとも1日間、より好ましくは少
なくとも1週間、最も好ましくは少なくとも3週間、安
定していることが望ましい。こうした安定な分散液は自
動化された検査法において有利に使用される。
た光をランダム化し、そして所望により光散乱の選択的
方向を形成するために、発光リガンド−レセプターアッ
セイにおいて、気体、液体および/または固体の成分を
液体中に分散させてなる分散液を使用することに関す
る。この分散液は少なくとも1日間、より好ましくは少
なくとも1週間、最も好ましくは少なくとも3週間、安
定していることが望ましい。こうした安定な分散液は自
動化された検査法において有利に使用される。
【0029】さらに、分散液は発光反応を引き起こすま
たは活性化するのに必要な成分を含むことができる。カ
ルシウムによって活性化される発光タンパク質を発光標
識として用いる場合、分散液は20〜200mmol/
lのCa2+イオンを含むことが好ましい。さらに、分散
液は緩衝物質、防腐剤および/または安定剤を含んでい
てもよい。
たは活性化するのに必要な成分を含むことができる。カ
ルシウムによって活性化される発光タンパク質を発光標
識として用いる場合、分散液は20〜200mmol/
lのCa2+イオンを含むことが好ましい。さらに、分散
液は緩衝物質、防腐剤および/または安定剤を含んでい
てもよい。
【0030】本発明はさらに、発光反応において発生し
た光のランダム化を引き起こし、そして所望により光散
乱において選択的方向の形成をもたらす、気体、液体お
よび/または固体の成分を液体中に分散させてなる分散
液を含むことを特徴とする、リガンド−レセプターアッ
セイの原理に従ってサンプル液中のアナライトを検出す
るための試薬に関する。この試薬は少なくとも1日間安
定していることが望ましい。さらに、この試薬は発光反
応を引き起こすのに必要な成分を含むことができる。
た光のランダム化を引き起こし、そして所望により光散
乱において選択的方向の形成をもたらす、気体、液体お
よび/または固体の成分を液体中に分散させてなる分散
液を含むことを特徴とする、リガンド−レセプターアッ
セイの原理に従ってサンプル液中のアナライトを検出す
るための試薬に関する。この試薬は少なくとも1日間安
定していることが望ましい。さらに、この試薬は発光反
応を引き起こすのに必要な成分を含むことができる。
【0031】最後に、本発明はまた、本発明による試薬
および該試薬とは空間的に分離された発光標識を有する
レセプターを含んでなる、リガンド−レセプターアッセ
イの原理に従ってサンプル液中のアナライトを検出する
ための試薬キットに関する。さらに、以下の実施例によ
って本発明を詳しく説明することにする。
および該試薬とは空間的に分離された発光標識を有する
レセプターを含んでなる、リガンド−レセプターアッセ
イの原理に従ってサンプル液中のアナライトを検出する
ための試薬キットに関する。さらに、以下の実施例によ
って本発明を詳しく説明することにする。
【0032】
【発明の実施の形態】最初の実験群(実施例1〜5)に
おいては、組換えエクオリン(AequaLiteTM,SeaLite Sc
ience Inc.Co.)の連続希釈物を調製し、ルミノメータ
ーで測定した。このルミノメーターは高速フラッシュ速
度論に基づく高感度の検出用に特別に設計されたもので
ある。検出は下から行った。
おいては、組換えエクオリン(AequaLiteTM,SeaLite Sc
ience Inc.Co.)の連続希釈物を調製し、ルミノメータ
ーで測定した。このルミノメーターは高速フラッシュ速
度論に基づく高感度の検出用に特別に設計されたもので
ある。検出は下から行った。
【0033】このために、緩衝化エクオリン溶液5μl
を各濃度別に小型反応容器に入れ、Ca2+トリガー 40μl
の注入によって、生物発光反応を開始させた。測定時
間は1または2秒のどちらかにした。標準の緩衝溶液
(10mmol/l Tris-HCl 、pH7.5 中100mmol/l CaCl2 )
または必要に応じて安定化した特別の白色分散液をカル
シウムトリガーとして比較のために使用した。
を各濃度別に小型反応容器に入れ、Ca2+トリガー 40μl
の注入によって、生物発光反応を開始させた。測定時
間は1または2秒のどちらかにした。標準の緩衝溶液
(10mmol/l Tris-HCl 、pH7.5 中100mmol/l CaCl2 )
または必要に応じて安定化した特別の白色分散液をカル
シウムトリガーとして比較のために使用した。
【0034】さらに実施例6〜8において、両方の異種
トリガーを、好適なワンステップ生物発光イムノアッセ
イによって、TSHおよびジゴキシゲニンの検量系列を
定量するために、比較検討を行なった。ワンステップ生
物発光イムノアッセイにおいては、使用した反応容量お
よびインキュベート時間は現技術水準に比較してかなり
縮小されたが、検出感度への最大要求を満たす高試験感
度を達成することが意図された。
トリガーを、好適なワンステップ生物発光イムノアッセ
イによって、TSHおよびジゴキシゲニンの検量系列を
定量するために、比較検討を行なった。ワンステップ生
物発光イムノアッセイにおいては、使用した反応容量お
よびインキュベート時間は現技術水準に比較してかなり
縮小されたが、検出感度への最大要求を満たす高試験感
度を達成することが意図された。
【0035】検出シグナルの増加および精度の向上、最
後に達成される試験感度への効果を試験した。 略記法: S/Aラテックス=スルフェートまたはアミジンラテックス RLU =比光量単位 RLU/sec =比光量単位/秒 cps =インパルス/秒 SD =標準偏差=標準偏差(n−1加重による) X =数回測定値の平均 イントラリピド =大豆油、ホスファチジルコリンおよびグリセロールの水中エ (intralipid) マルジョン(Pfrimmer Kabi GmbH & Co.KG company の登録 商標)
後に達成される試験感度への効果を試験した。 略記法: S/Aラテックス=スルフェートまたはアミジンラテックス RLU =比光量単位 RLU/sec =比光量単位/秒 cps =インパルス/秒 SD =標準偏差=標準偏差(n−1加重による) X =数回測定値の平均 イントラリピド =大豆油、ホスファチジルコリンおよびグリセロールの水中エ (intralipid) マルジョン(Pfrimmer Kabi GmbH & Co.KG company の登録 商標)
【0036】実施例1a 脂質エマルジョンを含有するトリガー媒体によるエクオ
リン標識の感度 トリガー媒体: a.10mmol/l Tris、pH7.5中 100mmol/l CaCl2 b.Tris/CaCl2 中、1:20に希釈したホモジナイズし
たミルク、3.5%脂肪分
リン標識の感度 トリガー媒体: a.10mmol/l Tris、pH7.5中 100mmol/l CaCl2 b.Tris/CaCl2 中、1:20に希釈したホモジナイズし
たミルク、3.5%脂肪分
【0037】結果:[RLU/sec ]で表示
【0038】
【0039】Fは、範囲10-16〜10-19mol での平均有効
係数である。標準トリガーaの有効係数を基準として使
用した。脂質エマルジョンを含有するトリガー媒体の方
が標準トリガーよりも良好な平均有効係数を有すること
がわかった。
係数である。標準トリガーaの有効係数を基準として使
用した。脂質エマルジョンを含有するトリガー媒体の方
が標準トリガーよりも良好な平均有効係数を有すること
がわかった。
【0040】実施例1b 脂質エマルジョンを含有するトリガー媒体によるエクオ
リン標識の感度 比較:透明 CaCl2溶液対 Tris/CaCl2中の白色イントラ
リピドエマルジョン(0.48%)
リン標識の感度 比較:透明 CaCl2溶液対 Tris/CaCl2中の白色イントラ
リピドエマルジョン(0.48%)
【0041】開始0.2〜1.2秒後の結果、[RLU/se
c] 4回の反復実験の測定からの平均値
c] 4回の反復実験の測定からの平均値
【0042】
【0043】 F=範囲10-14〜10-19mol での平均有効係数
【0044】実施例2 ラテックス懸濁液を含有するトリガー媒体によるエクオ
リン標識の感度 トリガー媒体: a.10mmol/l Tris、pH7.5 中 100mmol/l CaCl2 b.0.5%アミジンラテックス(粒径 299nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 c.0.5%双性イオンラテックス(粒径 238nm)懸濁液
中 100mmol/l CaCl2 どちらのラテックスも0.1% Tween-20を含有する1mmol
/lグリシン緩衝液、pH7.4 に懸濁させた。
リン標識の感度 トリガー媒体: a.10mmol/l Tris、pH7.5 中 100mmol/l CaCl2 b.0.5%アミジンラテックス(粒径 299nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 c.0.5%双性イオンラテックス(粒径 238nm)懸濁液
中 100mmol/l CaCl2 どちらのラテックスも0.1% Tween-20を含有する1mmol
/lグリシン緩衝液、pH7.4 に懸濁させた。
【0045】結果:[RLU/sec ]で表示 4回の反復実験の測定からの平均値
【0046】
【0047】r=測定範囲10-15〜10-19mol での回帰分
析。対照は標準トリガー溶液aである。 F=範囲10-15〜10-19mol での平均有効係数
析。対照は標準トリガー溶液aである。 F=範囲10-15〜10-19mol での平均有効係数
【0048】実施例3 エクオリン標識の感度に及ぼす固体含有量の影響 トリガー媒体: a.10mmol/l Tris、pH7.5 中 100mmol/l CaCl2 b.0.5%アミジンラテックス(粒径 299nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 c.1.0%アミジンラテックス(粒径 299nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 どちらのラテックスも0.1% Tween-20を含有する1mmol
/lグリシン緩衝液、pH7.4 に懸濁させた。
100mmol/l CaCl2 c.1.0%アミジンラテックス(粒径 299nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 どちらのラテックスも0.1% Tween-20を含有する1mmol
/lグリシン緩衝液、pH7.4 に懸濁させた。
【0049】結果:[RLU/2sec ]で表示 4回の反復実験の測定からの平均値
【0050】
【0051】r=測定範囲10-15〜10-19mol での回帰分
析。対照は標準トリガー溶液aである。 F=範囲10-15〜10-19mol での平均有効係数
析。対照は標準トリガー溶液aである。 F=範囲10-15〜10-19mol での平均有効係数
【0052】実施例4 エクオリン標識の感度に及ぼす粒径(≦ 299nm)の影響 トリガー媒体: a.10mmol/l Tris、pH7.5 中 100mmol/l CaCl2 b.0.1%アミジンラテックス(粒径 116nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 c.0.1%アミジンラテックス(粒径 299nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 d.0.1%両性イオンラテックス(粒径 238nm)懸濁液
中 100mmol/l CaCl2 すべてのラテックスを0.1% Tween-20を含有する1mmol
/lグリシン緩衝液、pH7.4 に懸濁させた。
100mmol/l CaCl2 c.0.1%アミジンラテックス(粒径 299nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 d.0.1%両性イオンラテックス(粒径 238nm)懸濁液
中 100mmol/l CaCl2 すべてのラテックスを0.1% Tween-20を含有する1mmol
/lグリシン緩衝液、pH7.4 に懸濁させた。
【0053】結果:[RLU/2sec ]で表示
【0054】
【0055】r=測定範囲10-15〜10-19mol での回帰分
析。対照は標準トリガー溶液aである。 F=範囲10-15〜10-19mol での平均有効係数
析。対照は標準トリガー溶液aである。 F=範囲10-15〜10-19mol での平均有効係数
【0056】実施例5a エクオリン標識の感度に及ぼす粒径(≧ 299nm)の影響 トリガー媒体: a.10mmol/l Tris、pH7.5 中 100mmol/l CaCl2 b.0.5%アミジンラテックス(粒径 299nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 c.0.5%アミジンラテックス(粒径 480nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 d.0.5%アミジンラテックス(粒径 600nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 すべてのラテックスを0.1% Tween-20を含有する1mmol
/lグリシン緩衝液、pH7.4 に懸濁させた。調製直後の
懸濁液を使用した。
100mmol/l CaCl2 c.0.5%アミジンラテックス(粒径 480nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 d.0.5%アミジンラテックス(粒径 600nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 すべてのラテックスを0.1% Tween-20を含有する1mmol
/lグリシン緩衝液、pH7.4 に懸濁させた。調製直後の
懸濁液を使用した。
【0057】結果:[RLU/2sec ]で表示
【0058】
【0059】r=測定範囲10-15〜10-19mol での回帰分
析。対照は標準トリガー溶液aである。 F=範囲10-15〜10-19mol での平均有効係数
析。対照は標準トリガー溶液aである。 F=範囲10-15〜10-19mol での平均有効係数
【0060】実施例5b エクオリン標識の感度に及ぼす粒径(≧ 299nm)の影響 トリガー媒体: a.10mmol/l Tris、pH7.5 中 100mmol/l CaCl2 b.0.5%アミジンラテックス(粒径 299nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 c.0.5%アミジンラテックス(粒径 480nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 d.0.5%アミジンラテックス(粒径 600nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 すべてのラテックスを0.1% Tween-20を含有する1mmol
/lグリシン緩衝液、pH7.4 に懸濁させた。懸濁液を4
℃で3週間保存した。
100mmol/l CaCl2 c.0.5%アミジンラテックス(粒径 480nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 d.0.5%アミジンラテックス(粒径 600nm)懸濁液中
100mmol/l CaCl2 すべてのラテックスを0.1% Tween-20を含有する1mmol
/lグリシン緩衝液、pH7.4 に懸濁させた。懸濁液を4
℃で3週間保存した。
【0061】結果:[RLU/2sec ]で表示
【0062】
【0063】r=測定範囲10-15〜10-19mol での回帰分
析。対照は標準トリガー溶液aである。 F=範囲10-15〜10-19mol での平均有効係数
析。対照は標準トリガー溶液aである。 F=範囲10-15〜10-19mol での平均有効係数
【0064】実施例6 TSH生物発光イムノアッセイにおける白色トリガー調
製物の使用 標準溶液 13μl および試験用緩衝液 27μl の混合液を
ストレプトアビジンで被覆した小型反応容器に入れた。
試験用緩衝液には2×10-8mol/l ビオチニル化抗−TS
H−IgGおよび約106 RLU/sec の抗−TSH−I
gG−エクオリン結合体を含有させておいた。この結合
体は2−イミノチオランと予め反応させて導入したエク
オリンのSH基にマレイミド活性化抗−TSH抗体をカ
ップリングさせることによって調製したものである。ビ
オチニル化抗体および発光標識抗体のそれぞれはTSH
の異なるエピトープに対して特異的であった。撹拌せず
に室温で15分間同時インキュベート後、免疫複合体を介
して固定化された固相結合の結合体を液相に残存してい
る未結合の結合体から分離した。その後、ルミノメータ
ーでそれぞれ下記の100mmol/l Ca2+イオンを添加するこ
とによって、エクオリン生物発光を開始させた。 A.第一に、10mmol/l Tris、pH7.5 に溶解させたCa2+
イオン(標準トリガー) B.第二に、無色アミジンラテックスビーズ(粒径 480
nm)を固体含有率 0.5%濃度で懸濁させた1mmol/lグリ
シン緩衝液に溶解させたCa2+イオン(=白色トリガー)
製物の使用 標準溶液 13μl および試験用緩衝液 27μl の混合液を
ストレプトアビジンで被覆した小型反応容器に入れた。
試験用緩衝液には2×10-8mol/l ビオチニル化抗−TS
H−IgGおよび約106 RLU/sec の抗−TSH−I
gG−エクオリン結合体を含有させておいた。この結合
体は2−イミノチオランと予め反応させて導入したエク
オリンのSH基にマレイミド活性化抗−TSH抗体をカ
ップリングさせることによって調製したものである。ビ
オチニル化抗体および発光標識抗体のそれぞれはTSH
の異なるエピトープに対して特異的であった。撹拌せず
に室温で15分間同時インキュベート後、免疫複合体を介
して固定化された固相結合の結合体を液相に残存してい
る未結合の結合体から分離した。その後、ルミノメータ
ーでそれぞれ下記の100mmol/l Ca2+イオンを添加するこ
とによって、エクオリン生物発光を開始させた。 A.第一に、10mmol/l Tris、pH7.5 に溶解させたCa2+
イオン(標準トリガー) B.第二に、無色アミジンラテックスビーズ(粒径 480
nm)を固体含有率 0.5%濃度で懸濁させた1mmol/lグリ
シン緩衝液に溶解させたCa2+イオン(=白色トリガー)
【0065】結果:下記の検量曲線が得られた。
【0066】
【0067】a =最高/最低標準値b =[ゼロ標準の4回の反復実験の測定からの平均]+
[シグナルに基づいた標準偏差]×2によって算出し、
直線回帰によって濃度に変換した数値
[シグナルに基づいた標準偏差]×2によって算出し、
直線回帰によって濃度に変換した数値
【0068】この実験により、生物発光イムノアッセイ
における分析感度の増強に関する本発明方法の効果が示
される。
における分析感度の増強に関する本発明方法の効果が示
される。
【0069】実施例7 DIG生物発光イムノアッセイにおける白色トリガー調
製物の使用 配列 Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Valを有し、ビオチニル
化されかつジゴキシゲニンで標識されたヘプタペプチド
標準溶液 13μl および約2×106 RLU/sの抗−DI
G−Fabエクオリン結合体を含有させた試験用緩衝液
27μl の混合液をストレプトアビジンで被覆した小型
反応容器にピペットで入れた。
製物の使用 配列 Ser-Gln-Asn-Tyr-Pro-Ile-Valを有し、ビオチニル
化されかつジゴキシゲニンで標識されたヘプタペプチド
標準溶液 13μl および約2×106 RLU/sの抗−DI
G−Fabエクオリン結合体を含有させた試験用緩衝液
27μl の混合液をストレプトアビジンで被覆した小型
反応容器にピペットで入れた。
【0070】撹拌せずに室温で15分間同時インキュベー
ト後、免疫複合体を介して固定化された固相結合の結合
体を液相に残存している未結合の結合体から分離した。
その後、ルミノメーターでそれぞれ下記の100mmol/l Ca
2+イオンを添加することによって、エクオリン生物発光
を開始させた。 A.第一に、10mmol/l Tris、pH7.5 に溶解させたCa2+
イオン(標準トリガー) B.第二に、無色アミジンラテックスビーズ(粒径 600
nm)を固体含有率 0.5%濃度で懸濁させた1mmol/lグリ
シン緩衝液に溶解させたCa2+イオン(=白色トリガー)
ト後、免疫複合体を介して固定化された固相結合の結合
体を液相に残存している未結合の結合体から分離した。
その後、ルミノメーターでそれぞれ下記の100mmol/l Ca
2+イオンを添加することによって、エクオリン生物発光
を開始させた。 A.第一に、10mmol/l Tris、pH7.5 に溶解させたCa2+
イオン(標準トリガー) B.第二に、無色アミジンラテックスビーズ(粒径 600
nm)を固体含有率 0.5%濃度で懸濁させた1mmol/lグリ
シン緩衝液に溶解させたCa2+イオン(=白色トリガー)
【0071】結果:下記の検量曲線が得られた。 DIGアッセイ1(標準トリガー)
【0072】
【0073】 下方検出限界(LDL): LDL(A+2×SD、直線回帰)=8.7×10-19mol DIG =5.3×105DIG分子数
【0074】DIGアッセイ2(白色トリガー)
【0075】
【0076】 下方検出限界(LDL): LDL(A+2×SD、直線回帰)=3.4×10-19mol DIG =2.0×105DIG分子数 この結果もまた、シグナル検出および精度の向上、そし
てこれに伴う分析感度の改善に関する本発明方法の効果
を示している。
てこれに伴う分析感度の改善に関する本発明方法の効果
を示している。
【0077】実施例8 DIG生物発光イムノアッセイにおける白色トリガー調
製物の使用 実験計画は実施例7と同様である。低濃度範囲の精度に
特に注意した。試験毎に高度に精製した<DIG>−F
abエクオリン1:1結合体 1.5×106 RLU/sおよび非
常に高い機能性評価を与えられた製造バッチからのスト
レプトアビジン被覆反応容器を使用した。この実験にお
いて、シグナルの増幅およびランダム化による精度の向
上が殊に明らかであった。
製物の使用 実験計画は実施例7と同様である。低濃度範囲の精度に
特に注意した。試験毎に高度に精製した<DIG>−F
abエクオリン1:1結合体 1.5×106 RLU/sおよび非
常に高い機能性評価を与えられた製造バッチからのスト
レプトアビジン被覆反応容器を使用した。この実験にお
いて、シグナルの増幅およびランダム化による精度の向
上が殊に明らかであった。
【0078】結果:下記の検量曲線が得られた: DIGアッセイ1(標準トリガー)
【0079】
【0080】 下方検出限界(LDL): LDL(A+2×SD、直線回帰)=2.4×10-18mol DIG =1.45×106 DIG分子数
【0081】DIGアッセイ2(白色トリガー;固体含
有率 0.5%)
有率 0.5%)
【0082】
【0083】 下方検出限界(LDL): LDL(A+2×SD、直線回帰)=3.2×10-19mol DIG =2.0×105DIG分子数
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭59−190664(JP,A) 特開 昭59−10837(JP,A) 特開 平3−154850(JP,A) 特開 平5−79970(JP,A) 特開 平5−504830(JP,A) (58)調査した分野(Int.Cl.6,DB名) G01N 33/53
Claims (11)
- 【請求項1】 サンプル液を、化学発光標識、生物発光
標識または電気化学発光標識から選ばれる発光標識を有
する少なくとも1つのレセプターとインキュベートし、
そして該サンプル液中の検出すべきアナライトの存在お
よび/または量を発光の測定により判定するリガンドー
レセプターアッセイの原理に従ってサンプル液中のアナ
ライトを検出する方法であって、発光反応において発生
した光のランダム化を引き起こし、そして所望により光
散乱の選択的方向の形成をもたらす、分散成分を含有す
る測定液体媒体中で発光を測定することを特徴とする上
記方法。 - 【請求項2】 測定液体媒体がその中に分散された気
体、液体および/または固体の成分を含有する液相を含
むものである、請求項1に記載の方法。 - 【請求項3】 測定液体媒体が平均粒径10nm〜3μ
mの固体粒子の懸濁液またはコロイド溶液を含むもので
ある、請求項1または2に記載の方法。 - 【請求項4】 固体粒子の平均粒径が100nm〜80
0nmである、請求項3に記載の方法。 - 【請求項5】 固体粒子が測定液体媒体に対して0.0
1〜2.5%(質量/容量)の比率で測定中に存在す
る、請求項3または4に記載の方法。 - 【請求項6】 レセプターの発光標識が直接的な生物発
光または化学発光標識、酵素増幅標識または電気化学発
光標識から選ばれる、請求項1〜5のいずれか1つに記
載の方法。 - 【請求項7】 発光標識を有するレセプターを、不均一
アッセイの原理に従って、少なくとも1つの反応性固相
の存在下でサンプル液とインキュベートする、請求項1
〜6のいずれか1つに記載の方法。 - 【請求項8】 反応容器の側面および/または下に配置
した検出モジュールによって発光を測定する、請求項1
〜7のいずれか1つに記載の方法。 - 【請求項9】 イムノアッセイ、ハイブリダイゼーショ
ンアッセイまたはこれらの組合せを用いてアナライトの
検出を行う、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方
法。 - 【請求項10】 リガンド−レセプターアッセイの原理
に従ってサンプル液中のアナライトを検出するための試
薬であって、発光反応において発生した光のランダム化
を引き起こし、そして所望により光散乱の選択的方向の
形成をもたらす、気体、液体および/または固体の成分
を液体中に分散させてなる分散液を含むことを特徴とす
る上記試薬。 - 【請求項11】 リガンド−レセプターアッセイの原理
に基づいてサンプル液中のアナライトを検出するための
試薬キットであって、請求項10に記載の試薬および該
試薬とは空間的に分離された発光標識を有するレセプタ
ーを含んでなる上記試薬キット。
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---|---|---|---|
DE4439348A DE4439348A1 (de) | 1994-11-04 | 1994-11-04 | Weiße Trigger-Präparationen zur Verbesserung der Signaldetektion bei bio- und chemilumineszenten Reaktionen |
DE4439348:2 | 1994-11-04 |
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Publication Number | Publication Date |
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JP7287616A Expired - Fee Related JP2793533B2 (ja) | 1994-11-04 | 1995-11-06 | 生物発光および化学発光反応におけるシグナル検出を高めるための白色トリガー調製物 |
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DE (1) | DE4439348A1 (ja) |
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PT2359136T (pt) * | 2008-11-07 | 2019-05-17 | Hoffmann La Roche | Substâncias de enchimento de granulação fina para filmes de reacção fotométrica |
US8153442B2 (en) * | 2009-10-21 | 2012-04-10 | Siemens Healthcare Diagnostics Inc. | Stabilization of signal generation in particles used in assays |
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NL7500951A (nl) * | 1975-01-28 | 1976-07-30 | Akzo Nv | Fluorimetrisch aantonen en bepalen van een gereduceerd co-enzym of derivaat in een waterig systeem. |
US4340564A (en) * | 1980-07-21 | 1982-07-20 | Daryl Laboratories, Inc. | Immunoadsorptive surface coating for solid-phase immunosubstrate and solid-phase immunosubstrate |
DE3213183A1 (de) * | 1982-04-08 | 1983-10-20 | Max Planck Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V., 3400 Göttingen | Anordnung zur optischen messung physikalischer groessen |
US4540660A (en) * | 1983-04-07 | 1985-09-10 | Daryl Laboratories, Inc. | Substrate for fluoroimmunoassay of biological fluids |
US4640898A (en) * | 1983-08-01 | 1987-02-03 | University Of Health Sciences/The Chicago Medical School | Homogeneous fluorescence ligang binding assay based upon preferential alteration of the respective intensities of bound and free label by solvent components |
US4745074A (en) * | 1984-02-23 | 1988-05-17 | Cooper-Lipotech Partnership | Blood-fluid composition for cell lysis system |
US4622294A (en) * | 1985-02-08 | 1986-11-11 | Kung Viola T | Liposome immunoassay reagent and method |
JPS61241639A (ja) * | 1985-04-19 | 1986-10-27 | Hitachi Ltd | 反応試料分析装置 |
US5017009A (en) * | 1986-06-26 | 1991-05-21 | Ortho Diagnostic Systems, Inc. | Scattered total internal reflectance immunoassay system |
JPH0799374B2 (ja) * | 1987-02-06 | 1995-10-25 | 株式会社日立製作所 | 免疫分析用試薬およびこれを用いる免疫分析方法 |
JP2684069B2 (ja) * | 1988-10-13 | 1997-12-03 | 昇一 首藤 | 免疫学的活性物質の測定方法及びそのための試薬 |
GB8827853D0 (en) * | 1988-11-29 | 1988-12-29 | Ares Serono Res & Dev Ltd | Sensor for optical assay |
US5082628A (en) * | 1989-09-19 | 1992-01-21 | Park Pharmaceuticals, Inc. | Luminometer |
JPH03154850A (ja) * | 1989-11-13 | 1991-07-02 | Canon Inc | 検体検査装置 |
JP3102925B2 (ja) * | 1991-09-20 | 2000-10-23 | シスメックス株式会社 | 粒子分析装置 |
CA2076709A1 (en) * | 1992-08-24 | 1994-02-25 | Ulrich J. Krull | Amplified fluorescence emission for chemical transduction |
-
1994
- 1994-11-04 DE DE4439348A patent/DE4439348A1/de not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-11-02 EP EP95117289A patent/EP0710833A3/de not_active Withdrawn
- 1995-11-03 US US08/552,795 patent/US6197594B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-11-06 JP JP7287616A patent/JP2793533B2/ja not_active Expired - Fee Related
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US6197594B1 (en) | 2001-03-06 |
EP0710833A2 (de) | 1996-05-08 |
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