JP2678994B2 - 不活性化微生物または抗原性物質を使用するウマの鼻内ワクチン接種 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ワクチン接種により病気に対して免疫化することにつ
いて２つの基本的問題は、保護的抗体、すなわち、宿主
動物に有機体を侵入させる病気の能力を阻害または障害
する抗体、の産生を誘発できる抗原の分離、およびこの
免疫性誘発抗原を、免疫性または部分的免疫性を与える
保護的抗体の実際に刺激する方法で、宿主動物に提供す
ることである。歴史的には、免疫化における早期の努力
は、殺したまたは実質的に弱化した有機体を生ずる全体
の病気を含んだ。ある場合において、病原性有機体はそ
れを得た培地から分離さえされず、最も有名な例はパス
ツールによる狂犬病のワクチンの開発であった。多くの
場合において、これらの「全体の培養物」は望ましくな
い副反応を生じた。より最近の努力は、適当な抗体の産
生を誘発する、病原生有機体の分子を単離することに向
けられてきた。

この一般的開発の順序は、ウマのストレプトコッカス
・エクイ（Streptococcus equi）の侵入に対するワクチ
ンの場合において事実実施された。初期のワクチンは米
国特許第3,852,420号に背景の技術において詳述されて
いるように、殺した全細胞から構成されているが、望ま
しくない副反応を誘発した。この特許は、この有機体の
細胞の熱酸処理によって、免疫性誘発抗原を抽出するこ
とに関する。しかしながら、この抽出物は、なお、多少
の望ましくない副反応、例えば注射部位における腫れを
生じる、異質物質を含有する。米国特許第4,582,798号
は、細胞をムタノリジンおよびアニオン性洗浄剤で処理
することによって、問題の抗原の抽出するための別の技
術に関する。この技術は、副反応の発生をさらに減少さ
えする抽出物を生ずる。

抗原性物質を提供する初期の方法は、全有機体または
抽出物にかかわらず、宿主動物の循環系中に導入するこ
とによった。事実、循環する抗体の発生は、抗原性物質
を循環系中に導入することによって最もよく達成され、
免疫性の発生にとって重要であった。引き続いて、ある
場合において、免疫性は抗原性物質の局在化した導入に
よって誘発することができることが発見された。例え
ば、文献「上部の気管における局所の免疫化後の志願者
の群Ａ連鎖球菌Ｍ蛋白質II対抗を使用する保護の研究
（Protective Studies with a Group A Streptococcal
M Protein II Challenge of Volunteers after Local I
mmunization in the Upper Respiratory Tract）」、S.
M.ポリイ（Polly）、R.H.ワルドマン（Waldman）、P.ハ
イ（High）、M.K.ウィットナー（（Wittner）、A.ドル
フマン（Dorfman）およびE.H.フォックス（Fox）著、Vo
l.131、No.3、217−224ページ（1957年３月）、ザ・ジ
ャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ（Th
e Journal of Infectious Diseases）、は、適当な抗原
を含有するエアゾールスプレーを鼻および口腔咽頭の中
に投与することによって、あるクラスの微生物によっ誘
発された臨床的病気に対してヒトを免疫化することを報
告している。この研究の追跡において、ヴィルレント有
機体による引き続く対抗に対する応答を、皮下注射によ
ってワクチン接種した個体のそれおよびワクチン接種し
ない個体のそれと比較した。エアゾール投与歯、保護の
測度を提供し、そして非経口的注射の道筋よりも少ない
かつわずかの副反応を誘発した［参照「３型または12型
の群Ａ連鎖球菌を使用する前身または内部の免疫化後の
志願者の群Ａ連鎖球菌Ｍ蛋白質ワクチンIII対抗を使用
する保護の研究（Protective Studies with Group A St
reptococcal M Protein Vaccine III Challenge of Vol
unteers after System or Internal Immunization with
Type 3 or Type 12 Group A Streptococcus）」、R.ド
アレッサンドリ（D'Alessandri）、G.プロトキン（Plot
kin）、R.M.クルージ（Kluge）、M.K.ウィットナー（Wi
ttner）、F.N.フォックス（Fox）、A.ドルフマン（Dorf
man）およびR.H.ワルドマン（Waldman）著、Vol.133、N
o.6、（1978年12月）、ザ・ジャーナル・オブ・インフ
ェクシャス・ディジージズ（The Journal of Infectiou
s Diseases）］。

ストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus equi）
の場合において、免疫性誘発抗原の発現は標的ウマの筋
肉内注射によってなされてきた。酸または酵素の場合に
おいて、注射したワクチンは抗体の応答を増大するため
にアジュバント中に混入された。これらのアジュバント
は、ヴィルレント有機体による引き続く対抗のときの症
候を減少または抑制するために、十分な抗体の応答を得
ることが必要であると考えられた。抗原抽出物をアジュ
バントからワクチン接種したウマの血液の流れの中に遅
く放出することは、適切なレベルの免疫性を得るために
重要であると考えられた。

最近の研究が示唆するところによると、侵入部位にお
いて局所的に発生した抗体は、ウマにおけるストレプト
コッカス・エクイ（Streptococcus equi）の感染のため
の血清抗体（一般に循環系において見いだされるもの）
よりも意味があることがある。「ストレプトコッカス・
エクイのタンパク質抗原に対するウマの粘膜の鼻咽頭の
免疫応答（Mucosal Nasopharyngeal Immnue Response o
f Hoeses to Protein Antigens Streptococcus equ
i）、J.E.ガロン（Galon）およびJ.F.チメニー（Timene
y）著、vol.47、No.3、362−628ページ（1985年３月）
に報告されているように、血清の抗体と場のタンパク質
との間の相関関係はむしおろ劣っており、そして抗原に
よって認識される局所的に発生した抗体は血清抗体によ
って認識されない。さらに、これらの抗原の中和は保護
を得るとき重要でありうると仮定されている。しかしな
がら、鼻内のワクチン接種は示唆あるいは試みられなか
った。むしろ、あるウマはストレプトコッカス・エクイ
（Streptococcus equi）の水酸化アルミニウムのアジュ
バント添加酸抽出物を筋肉内注射され、次いでこれらの
ワクチン接種されたウマおよびワクチン接種されない対
照のウマはヴィルレント有機体の鼻内噴霧によって対抗
された。対抗したウマのすべては、病気（「腺疫」）を
発生したが、再対抗時の感染に対して対抗性であった。

殺したバクテリア（バクテリン）または抗原性抽出物
を使用するウマの鼻内ワクチン接種は、特別の問題を提
供した。このような道筋は実際になんらかの程度の免疫
性を与えることが出来ることは確立されなかった。従来
の知恵は、変性された生きているワクチンのみがこの方
法で有効に投与出来るであろうということであった。な
ぜなら、このような調製物のみが適切な濃度の抗原を提
供するからである。事実、インフルエンザウイルスを使
用する鼻内ワクチン接種を用いるいくつかの研究は、米
国特許第4,500,513号に報告された。さらに、ワクチン
の供給は、ウマの鼻の構造のため、特別の問題を提供す
る。ワクチンは、鼻の穴から典型的には多少30〜35cm
（12〜14インチ）離れて存在する、扁桃組織に供給すべ
きである。鼻の適用の通常の技術は、前述のドアレッサ
ンドリ（D'Alessandri）およびポリイ（Polly）の論文
に詳述されているように、スプレー噴霧による。しかし
ながら、適切な投与量のウマの鼻への供給はほぼ５分を
要し、そしてウマはこのような噴霧に関連するヒッシン
グノイズ（hissing noise）に実際に耐えない。従来の
ウマの対抗、例えば、前述のガラン（Galan）の論文に
報告されているものは、動物を鎮静した後、動物にスプ
レーを噴霧することによって実施した。

ウマは、殺した有機体または抗原性物質をウマの鼻ま
たは扁桃組織に適用することによって、微生物的感染に
対して免疫化できることが発見された。ワクチンは、便
利に、適当な液体担体中に混入し、そして液体の滴とし
て鼻内の壁の中に扁桃組織の付近において噴霧できる。
この技術は、ことに、ウマの呼吸器の病気、例えば、ス
トレプトコッカス・ズーエピデミクス（Streptococcus
zooepidemicus）、ストレプトコッカス・エクイシミリ
ス（Streptococcus equisimilis）およびストレプトコ
ッカス・エクイ（Streptococcus equi）、ことに最後の
ものに対して有効である。

本発明において利用する抗原性物質は、不活性化した
全有機体またはこのような有機体から調製した適当な抽
出物（サブユニット）、組み換えDNA誘導抗原または合
成ペプチド抗原である。抗原性物質は、好ましくは、ウ
マにおける呼吸器の病気を引き起こすバクテリアであい
り、より好ましくは、群Ｃの連鎖球菌の有機体、例え
ば、ストレプトコッカス・ズーエピデミクス（Streptoc
occus zooepidemicus）およびストレプトコッカス・エ
クイ（Streptococcus equi）、最も好ましくは、後者か
ら誘導される。こうして、抗原性物質は、ウマにおける
ヴィルレンスがウマの分泌系の抗体によって中和されて
いる、微生物から誘導することができる。また、それ
は、組み合わせ、例えば、ウマインフルエンザのマイア
ミ（Miami）およびペンシルバニア（Pennsylvania）の
菌株の殺したウイルスとストレプトコッカス・エクイ
（Streptococcus equi）の抗原（酵素抽出物、熱酸抽出
物など）との組み合わせであることができる。

この抗原性物質は、好ましくは、中和性抗体の増殖を
誘発する抗原決定基を含有する抽出物である。ストレプ
トコッカス・エクイ（Streptococcus equi）の場合にお
いて、米国特許第3,852,420号は適当な酸抽出技術を教
示しており、そして米国特許第4,582,798号は適当な酵
素抽出技術を教示している。後者の技術は、また、スト
レプトコッカス・ズーエピデミクス（Streptococcus zo
oepidemicus）の培養物に適用できる。

本発明の投与技術は、他の投与技術において不都合な
反応性を表わす抗原性物質の利用を可能とする。例え
ば、連鎖球菌の有機体は皮膚組織に対して高い親和性を
有することが知られており、殺した細胞またはある抽出
物を使用して調製したワクチンは注射部位において腫れ
および他の刺激を引き起こす。同様な反応性は、鼻内投
与で観察されない。トッド・ヘイウィット（Todd Hewit
t）ブロスおよび化学的に定められた蛋白質不含培地の
両者の中で増殖させたストレプトコッカス・エクイ（St
oreptococcus equi）の殺した全細胞懸濁液は、認めら
れうる反応を誘発させないで、鼻内に投与された。前者
の物質は、米国特許第3,852,420号において、非経口的
注射のとき実質的な反応を与えることが報告された。

ストレプトコッカス・エクイ（Storeptococcus equ
i）に対して有効な抗原性物質を調製する好ましい技術
は、例えば、ペプシンを使用する、酵素抽出による。と
くに、ムタノリジン（mutanolysin）を利用することが
好ましい。また、実施例抽出に引続いて、アニオン性洗
浄剤、例えば、ドデシル硫酸ナトリウムを使用する抽出
を実施することが好ましい。蛋白質不含の化学的に定め
られた培地、例えば、I.ファン・デ・リジン（Van de R
ijin）の論文、感染および免疫性（Infection and Immu
nity）、Vol.27、444−448（1980）に記載されている培
地中で、抽出すべきストレプトコッカス・エクイ（Stor
eptococcus equi）を増殖させることはとくに有利であ
る。

抗原性物質は、種々の方法で適用するために配合する
ことができる。それに単に無菌の水または坦体または増
粘剤の中に溶解または分散させることができ、そしてア
ジュバントを水に添加することができる。好ましい配合
物は、増粘剤、ことにセルロースから誘導したもの、例
えば、半合成セルロース誘導体、例えば、カルボキシメ
チルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロースおよび
最も特定的にはヒドロキシエチルセルロースを含む。こ
れらの増粘剤は、水中の２重量％の溶液として、約10〜
100,000cps、好ましくは約100〜10,000cps、最も好まし
くは約1000〜8000cpsの粘度を有する。ヒドロキシエチ
ルセルロースにおいて、これは約80,000〜1,200,000の
固有粘度で決定した分子量を意味する。とくに、アンヒ
ドログルコース単位の１モルにつき約2.5モルのエチレ
ンオキシドでエトキシル化したヒドロキシエチルセルロ
ースを使用することは好ましい。このような増粘剤は、
好ましくは、合計配合物に基づいて約0.24〜１重量％の
量で存在する。皮膚浸透剤、例えば、ジメチルスルホキ
シド（DMSO）およびサリチル酸メチルを、また、含める
ことは好ましい。とくに有利な量は、利用する特定の浸
透剤に依存して、合計配合物に基づいて約0.5〜10重量
％である。例えば、DMSOでは好ましい範囲は約2.5〜10
重量％であり、これに対してサリチル酸メチルでは好ま
しい範囲は１〜４重量％である。最後に、配合物は認識
されたワクチンのアジュバント、例えば、水酸化アルミ
ニウムゲルまたは米国特許第3,319,411号において教示
されているものを約５〜40容量％のレベルで含有するこ
とができ、前者のタイプには約10〜40容量％のレベルが
ことに好ましく、そして後者のタイプについて約５〜20
容量％のレベルが好ましい。ことに好ましいアジュバン
トは、ポリアリルスクロールと架橋したポリアクリル
酸、例えば、商品名カルボポル（Carbopol）934Pで販売
されているもの、とポリオキシエチレンソルビタンモノ
ーオレエートおよびソルビタンモノラウレートとの組み
合わせに基づき、そして、好ましくは、配合物の合計容
量に基づいて7.5〜15容量％で使用する。

抗原含量は、それが誘発する生物学的作用によって、
最もよく定められる。連鎖球菌の有機体の生物学的活性
について便利な試験は、米国特許第4,527,581号に記載
されており、試験する抗原性物質がその保護的抗体の既
知の陽性抗血清を消耗する能力を包含する。評価する抗
原性物質の種々の希釈物で予備処理した既知の抗血清で
予備処理した、ヴィルレント有機体で予備処理したマウ
スについて、LD₅₀（致死投与量、50％）の負のlogで結
果を報告する。したがって、高い値は既知の抗血清中の
抗体と結合した抗原性物質の高い含量を反映し、こうし
て結合した抗原性物質の高い含量はヴィルレント有機体
への抗血清の作用を減少または排除して少ない投与量を
致死とすることを意味する。最終配合物中に存在する抗
原性物質は、LD₅₀の負のlogを、未処理抗血清で処理し
たヴィルレント有機体からの結果と比較して、少なくと
も１、好ましくは1.4倍だけ増加するために十分なレベ
ルで存在することが好ましい。抗血清対照および適当な
ワクチン物質について得られた絶対値は、もちろん、ヴ
ィルレント有機体および選択した抗血清の標準に標準に
依存する。

ワクチン配合物は、普通の方法で鼻のリンパ組織に適
用することができる。しかしながら、それを液体の流れ
または液体の滴として鼻の通路の壁に適用することが好
ましい。これは小さい直径の管を使用することによって
有利に達成することができ、この管はその末端が密閉さ
れており、その密閉された端付近の壁中にいくつかの孔
が存在し、そして管はその基部において投与装置、例え
ば、注射器によって供給される。この管をウマの中に約
15〜25cm（６〜10インチ）だけ挿入すると、それが臨海
的組織をバイパスことを考慮しないで、ワクチン配合物
は適用される。とくに結うような管は直径が約1mmであ
り、その末端付近における円周に0.5mmの穴を３つまた
は４つ有する。このような孔を通る強制液体は、本発明
の実施において、液体の流れまたは大きい滴をとくに有
用とする。このような技術は、特別な注意を払わないで
あるいは処置すべきウマを鎮静させないで、便利な現場
の処置を可能とする。典型的には、ウマの頭を傾斜させ
て、液体が鼻の壁を流れ下って扁桃組織へ到達するよう
にする。

ワクチン配合物は、十分な量の抗原性物質（前述の試
験においてLD₅₀の負のlogを増加するために十分な）を
適用するかぎり、いかなる便利な投与量で適用すること
もできる。しかしながら、抗原性物質の濃度は約１〜4m
lの投与量が利用されうるような濃度であることが好ま
しい。

鼻内の道筋は、単独であるいは他の技術と組み合わせ
て使用できる。とくに興味ある養生法は、筋肉内注射お
よび引続く１回または２回以上の鼻内投与である。ある
配合物は両者の道筋に使用することができ、あるいは別
の配合物は各々について使用することができ、例えば、
アジュバント添加した配合物は注射に使用することがで
き、そして純粋な無菌の水の配合物は鼻の道筋に使用で
きる。

適切な保護は１回より多いワクチンの投与を必要とす
るであろう。所定の配合物に最適な投与の回数および時
限は、当業者によって日常の実験によって容易に決定で
きる。群Ｃの連鎖球菌の有機体の場合において、約７〜
28日の間隔の２回〜３回の投与は適当である。ストレプ
トコッカス・エクイ（Storeptococcus equi）の場合に
おいて、３週の間隔で３回の投与の養生は、ことに最初
の投与が筋肉内注射であり、そして２回のブースターを
鼻内に投与するとき、とくに適当であることがわかっ
た。

本発明を次の実施例によってさらに説明するが、本発
明はこれらの実施例によって限定されることを意図せ
ず、すべての部および百分率は、特記しないかぎり、重
量による。

実施例 実施例１ トッド・ヘウィットのブロス中で37℃およびpH7.2に
おいて増殖させたストレプトコッカス・エクイ（Storep
tococcus equi）の４時間の培養物から、ワクチンを調
製した。細胞を増殖培地から分離し、0.85重量％のNaCl
の水溶液で洗浄し、そして0.85重量％のNaClの水溶液中
に再懸濁した。この細胞懸濁液を121℃および15psiで15
分間オートクレーブ処理した。引続いて、ポリアリルス
クロールで架橋したポリアクリル酸（Carbopol934Pとし
て商業的に入手可能である）と、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノオレエート、ソルビタンモノラウレート、
綿実油および水の混合物との組み合わせに基づくアジュ
バントを、米国特許第3,919,411号に教示されているよ
うにして、配合物に添加した。

このワクチンを使用して２頭のウマを筋肉内的におよ
び３頭のウマを鼻内的に免疫化した。４週の間隔で2ml
の２回の投与を両者の道筋について使用した。

これらの５頭のウマおよび１頭の対照のウマを、ヴィ
ルレントなストレプトコッカス・エクイ（Storeptococc
us equi）の対教期の培養物（ほぼ10⁸/mlの有機体）の1
0mlで、第２回目のワクチン投与後３週に、鼻内的に対
抗させた。対照のウマに比較して、鼻内にワクチン接種
したウマは臨床的症候の56％の減少を表わし、そして筋
肉内にワクチン接種ウマは46％の臨床的症候の減少を示
した。

両方の道筋でワクチン接種したウマの血清は、ヴィル
レントなストレプトコッカス・エクイ（Storeptococcus
equi）への中和作用を表わした。とくに、それらは、
米国特許第4,529,582号に記載されているように、ワク
チン接種したウマの血清で予備処理したヴィルレント有
機体の種々の希釈物で予備処置したマウスについて、次
のようにLD₅₀の負のlogを減少（または絶対値を増加）
させた。

実施例２ I.ファン・デ・リジン（Van de Rijin）の論文、感染お
よび免疫性（Infection and Immunity）、Vol.27、444
−448（1980）に記載されている化学的に定められた培
地（CDM）中で増殖させたストレプトコッカス・エクイ
（Storeptococcus equi）の４時間の培養物から、ワク
チンを調製した。細胞を増殖培地から分離し、0.85重量
％の塩化ナトリウムの水溶液で洗浄し、そして0.85重量
％の塩化ナトリウムの水溶液中に再懸濁した。この懸濁
液を65℃に60分間加熱した。次いで、一部を十分な量の
実施例１に記載するアジュバントと混合して、アジュバ
ントの10容量％の含量を得た。他の部分を無菌の緩衝化
した水中に約１部の抗原源対25部の水で希釈し、そして
この希釈した配合物を十分な量の実施例１のアジュバン
トと一緒にして、10容量％の最終含量にした。

完全な強度のワクチンで、３頭のウマを筋肉内的に
（IM）ワクチン接種しそして４頭のウマを鼻内的に（I
N）ワクチン接種し、そして希釈したワクチンで４頭の
ウマを筋肉内的にワクチン接種した。筋肉内投与は２回
４週の間隔で実施し、これに対して鼻内投与は最初のワ
クチン接種後３週、４週および７週に４回実施した。両
者の道筋のための投与量は2mlであった。

これらの11頭のウマおよび１頭の対照のウマを、ヴィ
ルレントなストレプトコッカス・エクイ（Streptococcu
s equi）の対数期の培養物（ほぼ10⁸/mlの有機体）の10
mlで、最初おワクチン投与後10週に、鼻内的に対抗させ
た。対照のウマに比較して、完全強度のワクチンを鼻内
および筋肉内に投与したとき、臨床的症候は約40％減少
し、これに対して希釈したワクチンの筋肉内投与は20％
の減少を生じた。

すべてのワクチン接種したウマの血清は、米国特許第
4,529,582号に従ってマウスについてのLD₅₀の減少によ
って測定したとき、ヴィルレントなストレプトコッカス
・エクイ（Storeptococcus equi）への多少の中和作用
を表わした。

これらの処置についてのLD₅₀の負のlogの値は、次の
通りであった： こうして、鼻内投与は未希釈のワクチンの筋肉内投与
と等しい症候的作用を与えるが、血清学的作用は1:25の
希釈の筋肉内投与といっそう密接に一直線になる。これ
は、血清学的作用が保護と直接に相関関係をもたないこ
との多少の証拠である。

実施例３ Ａ、ワクチンの調製 実施例２と同一の化学的に定められた培地中で増殖さ
せたストレプトコッカス・エクイ（Storeptococcus equ
i）の培養物の多量の免疫刺激酵素／アニオン性洗浄剤
の抽出物を、米国特許第4,582,798号の教示に従い調製
した。この物質の効能は、米国特許第4,529,581号の教
示に従い評価し、そして現場の保護と相関関係をもつ範
囲内であることが発見された。とくに、抽出物は37℃に
おいてもとの培養物体積の1mlにつき５単位のムタノリ
ジンで16時間処理し、次いで0.05重量％のドデシル硫酸
ナトリウムで約0.5時間処理して、7.0またはそれより大
きい結合力をもつ調製物を得た。この結合力は、回復期
のウマの抗血清で処置したヴィルレント有機体のマウス
におけるLD₅₀の負のlogとして測定し、前記抗血清はこ
の調製物で予備処置した。この調製物は次の５つの配合
物について基準として使用した： １） 粘度が4500〜6500cpsであるアンヒドログルコー
ス単位の１モルにつき約2.5モルのエチレンオキシドで
エトキシル化されたヒドロキシエチルセルロース（HE
C）の0.5重量％を２重量％の水溶液としておよび２容量
％のサリチル酸メチルを、抽出物調製物に添加した。

２） 0.5重量％の同一のHECおよび5.0容量％のジメチ
ルスルホキシドを、抽出物調製物に添加した。

３） 0.5重量％の同一のHECおよび2.0重量％のグリコ
ール酸ナトリウムを、抽出物調製物に添加した。

４） 実施例１に記載するアジュバントの十分な量を抽
出物調製物に添加して、最終配合物の10容量％を構成し
た。

５） 純粋な抽出物調製物。

Ｂ、動物の選択 ３つの地方の農場に位置する混ざった性および種族の
53頭のウマを試験に使用した。受動マウス保護アッセイ
（Passive mouse Protectin Assay）（米国特許第4,52
8,582号に記載されている）によって、ウマを血清反応
陰性についてスクリーニングした。すべて血清反応陰性
の動物を得ることは不可能であり、そしてウマを２つに
基準に基づくワクチン接種／対抗の試験について６つの
群に割当てた： （１） ウマの６つの群の洗浄の平均力価はほぼ同等で
あるべきである。種々の群の平均力価は、動物の割当て
後、5.9〜6.1の範囲であるべきである。

（２） ウマの６つの群の洗浄は、すべて３つの農場か
らの代表的数の動物を含有すべきである。

ウマは代表的農場でワクチン接種した。対抗の時、す
べての動物を研究農場に移し、ここでそれらにヴィルレ
ントなストレプトコッカス・エクイ（Storeptococcus e
qui）を鼻内に注射した。所有者の要求があったとき、
３つの代表的農場からのウマは対抗後混合しなかった。

Ｃ、ワクチン接種の養生法 ウマ（ｎ＝８〜９）の５つの群を、ストレプトコッカ
ス・エクイ（Storeptococcus equi）のバクテリア抽出
物の鼻内、筋肉内または局所的配合物の2.0mlの投与量
で、２または３回ワクチン接種した。ウマの最後の群は
ワクチン接種しない対照として保持した。種々のワクチ
ンおよびワクチン接種の養生法を表１に要約する。

Ｄ、対抗手順 対抗前２〜３日（ブースター後12〜14日）に、すべて
のウマを対抗のため研究農場に移した。ウマを対数期の
ストレプトコッカス・エクイ（Storeptococcus equi）
の培養物で筋肉内に対抗した。25.4cm（10インチ）の変
更したネコのカテーテルを使用して、ウマの各々にほぼ
10⁷の有機体を投与した。このカテーテルは、約1mmの内
側の孔を有し、その末端が密閉されており、そしてこの
末端付近に４つの半径方向の排出孔を含有した。ウマを
対抗後45日間個々に１日置きに観察した。

Ｅ、対抗に対する応答の評価 上に示したように、観察は個々に対抗したウマについ
て45日間の対抗後の観察期間にわたって実施した。各観
察において、直腸の温度を記録し、血液溶媒を白血球に
決定のために抜出し、そしてウマを臨床的徴候、例え
ば、鼻の排出物、膿瘍の生成、翌鬱および食欲欠乏につ
いて検査した。

対抗に対するウマの応答は、表２の記載する臨床指数
を使用して測定した。毎日の臨床的スコア（Daily Clin
ical Scores）（DSC）は、次の４つの異なるパラメータ
ーについて、各観察日に対抗したウマの各々に割当て
た：膿瘍の生成（DCSa）、鼻の排出物（DCSn）、温度の
応答（DCSt）、および白血球の増加（DCSw）。

対抗後の期間を通じて漸進的に群の応答を分析するた
めに、毎日の群の臨床的指数（Daily Group Clinical I
ndices）（DGCI）を計算した。指数は、45日の観測期間
を通じて個々の日における群の応答を測定する。対抗後
の所定の日についてのDGCIは、ある群におけるすべての
ウマについてのDCSa、DCSn、DCStおよびDOSwを合計し、
そしてその群におけるウマの数で割ることによって得
た： 累積臨床的スコア（Cumulative Clinical Scores）
（CCS）は、４つのパラメーター（CCSa、CCSn、CCSt、C
CSw）の各々に関して個々のウマについて、それぞれの
パラメーターについての毎日の臨床的スコアを対抗後45
日にわたって合計することによって得た。CCS値の計算
についての一般式は、次の通りである： CCSx＝Σ対抗後45日間のDCS （ここでｘ＝ａ、ｎ、ｔまたはｗ） 個々の臨床指数（ICI）は、対抗したウマの各々につい
て、CCSa、CCSn、CCStおよびCCSwを合計することによっ
て得た、 ICI＝CCSa＋CCSn＋CCSt＋CCSw ICIは、対抗後の45日
全体にわたる対抗に対する個々のウマの応答の測度を構
成する。

毎日の臨床的スコアは、また、群に基づくデータを分
析するために使用した。膿瘍の生成（SGCIn）、鼻の排
出物（SGCI）、温度の応答（SGCIn）、および白血球の
増加（SGCIw）についての特別の群の臨床的指数（Speci
fic Group Clinicel Indices）（SGCI）は、ある群にお
けるすべてのウマについてのCCSa、CCSn、CCStまたはCC
Swを合計し、そしてその群におけるウマの数で割ること
によって得た。SGCI値の計算についての一般式は、次の
通りである： 究極的には、ウマの所定の群による対抗に対する全体
の応答を表わす合計の群の臨床的指数（Total Group Cl
inical Index）（TGCI）は、SGCIa、SGCIn、SGCItおよ
びSGCIwを合計することによって得た： TGCI＝SGCIa＋SGCIn＋SGCIt＋SGCIw Ｆ、血清学的試験 血清は、群に割当てる前に、各ワクチン接種前に、お
よび再び対抗前に、研究において使用したすべてのウマ
から得た。血清は、米国特許第4,529,582号に記載され
ている受動マウス保護アッセイに従って試験した。

III、結果 対抗したウマの６つの群についての対抗後の臨床的観
察を、表３および第１図〜第６図に要約する。第１図
は、ウマのワクチン接種群および対照群のすべてのTGCI
を比較する棒グラフである。第２図〜第６図は、個々の
ワクチン接種群の毎日の群の臨床的指数（DGCI）を対照
のウマのそれらと比較する。

表３に示すように、５つのワクチン接種した群のうち
の２つは、ワクチン接種しない対照と比較したとき、合
計の群の臨床的指数の少なくとも70％の減少を示す。２
つのもっとも効能のある処置は、処置Ｂ（DMSOの鼻内ワ
クチン）および処置Ｃ（アジュバント添加したIMワクチ
ンおよび引続くアジュバント不添加抽出物の２回のIN投
与）であった。１つの追加の鼻内処置（経皮的坦体とし
てサリチル酸メチルを使用する処置Ａ）は、TGCIを減少
させた。他の配合物でワクチン接種したウマ、グリコー
ル酸ナトリウムを含有する局所的処置（処置Ｄ）および
筋肉内室温（処置Ｅ、ストレプトコッカス・エクイ（St
oreptococcus equi）抗原およびアジュバントは、対照
のウマより高いTGCIを示した。しかしながら、この後者
の処置（ストレプトコッカス・エクイ（Storeptococcus
equi）およびアジュバント）は、ワクチン接種しない
対照ウマに関連して14〜18日だけ病気の開始を遅延し
た。

表３に記載されている特別の群の臨床的指数（SGCI）
は、膿瘍の生成（リンパ節障害）が保護しないワクチン
群および対照ウマにおいて現われる最も有意の臨床的徴
候であること示している。

第２図〜第６図は、ワクチン接種したウマと対照との
毎日の群の臨床的指数を比較し、効能が低い処置に関し
て処置ＢおよびＣの相対的有効性を示す。これらのグラ
フは、２つの効能が低い処置（ＡおよびＥ）が対照群に
関して病気の開始を遅延するようには思われなかったこ
とを示す。

血清学的試験の結果は表４に示されている。この表
は、群の割当て前、各ワクチン接種前、および再び対抗
前におけるウマの６つの群について得られた平均のマウ
ス受動抗体力価を表わす。この表には、最初のワクチン
接種の時から対抗の時まで抗体力価の正味の変化（△平
均力価）を含む。期待されるように、筋肉内にワクチン
接種したウマの群（群ＣおよびＥ）は、ホルモンの抗体
レベルの比較的大きい変化を示す（受動マウスの抗体力
価における増加はマウスLD₅₀レベルの負のlogの実際の
減少であることに注意すべきである）。群Ｅは平均力価
の増加≧2.0logマウスLD₅₀を示した。処置Ｃを受けるウ
マ（１回の1M投与および引続く２回のIN投与）は、ま
た、ホルモン抗体力価のかなり1.8log増加を示した。対
照的に、鼻内または局所的ワクチンを受けたウマは、多
分試験の変動に起因する、力価のほんのわずかの増加を
示した。ホルモンの抗体力価は最小に保護した群の多く
において最高であったので、これらの力価は実際の保護
との相関関係をほとんどあるいはまったくもたないと推
測できる。

試験の予期されない結果は、群Ｇ、ＤおよびＥにおい
て対抗後４〜６週で、３頭のウマが死亡したことであっ
た。３頭の動物のすべては、個々の動物の直腸の壁に付
着する内部の膿瘍を発生した。純粋のストレプトコッカ
ス・ズーエピデミクス（Storeptococcus zooepidemicu
s）を、３頭のウマのうち２頭における病変から単離し
た。剖検は第３番目のウマが肛門にすぐ近くの内部の直
腸壁に付着した、古い膿瘍を有することを示したが、同
定されないバクテリアの混合物が病変から得られた。剖
検は、また、このウマが貧血でありかつ全体の体の脂肪
が欠乏していることを示した。群Ｂにおける１つの追加
のウマは、また、直腸の膿瘍を発生した。しかしなが
ら、この場合において、この膿瘍を外部から排出し、そ
して動物は生存した。

３頭の死亡したウマのうち１頭のみは、死亡前に対抗
に対してして有意の臨床的応答（すなわち、鼻の排出物
または膿瘍の生成）を示した。データを評価する目的
で、３頭のウマの臨床的徴候をそれらの死亡の日まで群
の分析（DGCI、TGCI）に含めた。死亡はストレプトコッ
カス・エクイ（Storeptococcus equi）感染に直接関係
しない因子から生じたので、追加の臨床的指数の点は割
当てなかった。

IV、評価 この実験の結果が示すように、鼻内に投与したストレ
プトコッカス・エクイ（Storeptococcus equi）バクテ
リア抽出物はウマを実験的対抗から保護することができ
る。DMSO含有配合物を使用する３回の投与のIN処置は、
ワクチン接種しない対照のウマに比較したとき、合計の
臨床的症候を76.9％だけ減少した。また、この実験にお
いて、アジュバント添加ワクチンの１回のIM投与および
引続くアジュバント不添加抗原抽出物の２回のIN投与か
ら成る３回の投与の養生法は、とくに効能があると思わ
れた。

２つの前述の配合物を使用して強く陽性の結果が見ら
れたが、USDAが現在ライセンスを受けた製品STREPGUARD
の2mlを代表する、処置Ｅは予期されざることには劣っ
た結果が見られた。このワクチン配合物は、以前に、59
頭のウマを使用する対抗研究において有効であることが
示されたものである。異なる結果についての１つの理由
は、対抗の方法に関係づけることができる。前の実験に
おいて、対抗は大きく間接的であった（ウマを地方病の
区域にもって行き、そしてヴィルレントなストレプトコ
ッカス・エクイ（Storeptococcus equi）を各動物の鼻
面にのみ適用した）。現在の試験において、ストレプト
コッカス・エクイ（Storeptococcus equi）有機体は鼻
の通路に直接注射した。第２の対抗法は筋肉内生成物を
「圧倒する」ことができることが可能である。処置Ｅが
ワクチン接種したウマにおいて病気の開始を事実遅延し
たという事実は、この結果の間接的支持を提供しうる。
筋肉内ワクチンが非常に局所的分泌の応答を刺激するこ
とは期待されないであろう。実際に、この結果は、鼻内
に投与した生成物が、局所的IgAを刺激しかつより強い
局所的免疫性を提供することが必要であるという証拠を
提供することができる。

マウスの受動抗体試験によって測定して、ホルモンの
抗体力価が、保護に関係しないという事実は、とくに驚
くべきことではない。同様な結果は、ストレプトコッカ
ス・エクイ（Storeptococcus equi）バクテリア抽出物
を使用する早期の対抗実験において見られた。実験的ス
トレプトコッカス・エクイ（Storeptococcus equi）対
抗に対する保護は、鼻粘膜のレベルで働く局所的機構を
包含するように思われる。

本発明を例示の目的で詳細に説明したが、このような
詳細な説明はその目的のみであること、そして種々の変
更は本発明の精神および範囲を逸脱しないで可能である
ことを理解すべきである。

本発明の実施態様および主な特徴は、次の通りであ
る。

１、不活性化した有機体、抗原性抽出物、あるいは侵入
性種の組み換えDNAまたは合成ペプチドの抗原を、ウマ
の鼻粘膜または扁桃組織に適用して微生物の感染に対し
てウマを免疫化するワクチンを製造する方法。

２、抗原性物質を液状担体中に混入し、そして鼻の壁上
に扁桃組織の付近において液体の流れまたは大きい滴と
して噴霧する上記第１項記載の方法。

３、感染性微生物はウマの呼吸器の病気を引き起こすも
のである上記第１項記載の方法。

４、感染性微生物はウマの呼吸器の病気を引き起こすも
のである上記第２項記載の方法。

５、防除すべき微生物は、ストレプトコッカス・エクイ
シミレス（Streptococcus equisimiles）、ストレプト
コッカス・ズーエピデミクス（Streptococcus zooepide
micus）またはストレプトコッカス・エクイ（Streptoco
ccus equi）である上記第３項記載の方法。

６、感染性有機体は、ストレプトコッカス・エクイシミ
リス（Streptococcus equisimilis）、ストレプトコッ
カス・ズーエピデミクス（Streptococcus zooepidemicu
s）またはストレプトコッカス・エクイ（Streptococcus
equi）である上記第３項記載の方法。

７、感染性有機体は、ウマインフルエンザウイルスであ
る上記第１項記載の方法。

８、感染性有機体は、ウマインフルエンザウイルスであ
る上記第２項記載の方法。

９、殺したウマインフルエンザウイルスおよびストレプ
トコッカス・ズーエピデミクス（Streptococcus zooepi
demicus）またはストレプトコッカス・エクイ（Strepto
coccus equi）の抗原性抽出物の組み合わせを扁桃組織
に適用する上記第１項記載の方法。

10、殺したウマインフルエンザウイルスおよびストレプ
トコッカス・ズーエピデミクス（Streptococcus zooepi
demis）またはストレプトコッカス・エクイ（Streptoco
ccus equi）の抗原性抽出物の組み合わせを扁桃組織に
適用する上記第２項記載の方法。

11、液体担体は、また、増粘剤を含有する上記第２項記
載の方法。

12、前記増粘剤はセルロースに基づく上記第11項記載の
方法。

13、前記増粘剤はヒドロキシエチルセルロースである上
記第12項記載の方法。

14、液状担体は、また、経皮性浸透剤を含有する上記第
２項記載の方法。

15、経皮性浸透剤はジメチルスルホキシドまたはサリチ
ル酸メチルである上記第15項記載の方法。

16、液状担体は、また、経皮性浸透剤を含有する上記第
11項記載の方法。

17、ａ）液状担体は水であり、そして ｂ）増粘剤はセルロースに基づく、 上記第16項記載の方法。

18、ａ）経皮性浸透剤はジメチルスルホキシドまたはサ
リチル酸メチルであり、そして ｂ）増粘剤はヒドロキシエチルセルロースである、 上記第17項記載の方法。

19、抗原性物質はストレプトコッカス・エクイ（Strept
ococcus equi）の酵素抽出物である上記第１項記載の方
法。

20、行程： ａ）殺した有機体、抗原性抽出物、あるいは防除すべき
種の組み換えDNAまたは合成ペプチドの抗原に基づくワ
クチンの筋肉内注射、および ｂ）殺した有機体、抗原性抽出物、あるいは防除すべき
種の組み換えDNAまたは合成ペプチドの抗原に基づくワ
クチンの鼻内適用、 を含む呼吸器の微生物感染に対してウマを免疫化する方
法。

21、鼻内に適用したワクチンは液状担体を含み、そして
ウマの鼻の壁の上に扁桃組織の付近において液体の流れ
または大きい滴として噴霧する上記第20項記載の方法。

22、液状担体は無菌の水であり、そして注射したワクチ
ンはアジュバントを含有する上記第21項記載の方法。

23、鼻内ワクチンはアジュバントを含有しない上記第22
項記載の方法。

24、防除すべき微生物はストレプトコッカス・エクイ
（Streptococcus equi）である上記第22項記載の方法。

25、ａ）注射したワクチンはアジュバントを含有し、 ｂ）鼻内ワクチンの担体は水からなり、そしてウマの鼻
の壁の上に扁桃組織の付近において液体の流れまたは大
きい滴として噴霧し、そして ｃ）両者のワクチン中の抗原性物質は酵素抽出物であ
る、 上記第１項記載の方法。

26、行程： ａ）マウスの結合力試験において少なくとも約４の結合
力の値を示す、ストレプトコッカス・エクイ（Streptoc
occus equi）の水含有抗原性酵素および洗浄剤の抽出物
を調製し、 ｂ）合計の配合物に基づいて、約0.25〜１重量％のヒド
ロキシエチルセルロースおよび約2.5〜10重量％のジメ
チルスルホキシドを、前記水含有抽出物に添加し、 ｃ）この配合物の約1ml〜3mlを、ウマの鼻の壁の上に扁
桃組織の付近において液体の流れまたは大きい滴として
噴霧することによって、扁桃組織に適用し、そして ｄ）適用を初期の適用の約１〜４週の間で反復する、 を含んでなるストレプトコッカス・エクイ（Streptococ
cus equi）の呼吸器の侵入に対してウマを免疫化する方
法。

27、配合物は、その末端が密閉されておりかつこの端付
近に円周の穴を有する小さい直径の管を、ウマの鼻内に
扁桃組織の付近において挿入し、そして配合物をこの管
に通すことによって適用する上記第26項記載の方法。

28、ウマの頭を後ろに傾斜させ、そして管を扁桃組織の
開始より遠くに挿入し、こうして適用した配合物が重力
の作用下に鼻の壁に沿って流れることができるようにす
る上記第27項記載の方法。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ヴィルレント有機体による対抗へのウマの症
候的応答を測定する、合計の群の臨床指数への種々のワ
クチン配合物の効果を示す棒グラフである。 第２図は、ワクチン接種しないウマおよび配合物１で鼻
内にワクチン接種したウマについて毎日の群の臨床指数
対対抗後の日数のグラフである。 第３図は、ワクチン接種しないウマおよび配合物２で鼻
内にワクチン接種したウマについて毎日の群の臨床指数
対対抗後の日数のグラフである。 第４図は、ワクチン接種しないウマおよび配合物３で筋
肉内にかつ配合物５で鼻内にワクチン接種したウマにつ
いて毎日の群の臨床指数対対抗後の日数のグラフであ
る。 第５図は、ワクチン接種しないウマおよび配合物４で局
所的にワクチン接種したウマについて毎日の群の臨床指
数対対抗後の日数のグラフである。 第６図は、ワクチン接種しないウマおよび配合物３で筋
肉内にワクチン接種したウマについて毎日の群の臨床指
数対対抗後の日数のグラフである。

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】ストレプトコッカス・エクイ（Streptococ
   cus equi）の不活化有機体、抗原性抽出物または合成ペ
   プチド抗原を、LD₅₀の負のlog値を増大するのに十分な
   用量でウマの鼻粘膜または扁桃組織に適用することを特
   徴とする、ストレプトコッカス・エクイによる感染に対
   するウマの免疫化方法。