JP2643264B2 - New thermostable alkaline protease and its manufacturing method - Google Patents
New thermostable alkaline protease and its manufacturing methodInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、耐熱性アルカリ性プロテアーゼ及びその製
法に関する。さらに詳しくは、中等度高熱菌バチルス・
ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophil
us)に属する菌株の培養液上清から抽出して得られる耐
熱性の高い耐熱性アルカリ性プロテアーゼ及びその製法
に関する。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a thermostable alkaline protease and a method for producing the same. For more details,
Bacillus stearothermophil
The present invention relates to a thermostable alkaline protease having high thermostability obtained by extracting from a culture supernatant of a strain belonging to us) and a method for producing the same.
[従来の技術] 従来、アルカリ性プロテアーゼとしては枯草菌(Baci
llus subtilis)が生産するズブチリシンが一般的で、
また工業的にも広く利用されている。またズブチリシン
の種類としては、カールスベルグ(Carlsberg),ノボ
(Novo),BPN′などが知られ、分子量26000,活性部位残
基はAsp32番,His64番,Ser221番である。またズブチリシ
ン以外のアルカリ性プロテアーゼとしてはアスペルギル
ス・オリゼー(Aspergillus oryzae)のアスペルギロ
プペチターゼB,C,ソランギウム(Sorangium)のα−リ
ティックプロアテーゼおよびストレプトミセス・グリセ
ウス(Streptomyces griseus)のプロナーゼなどがあ
る。[Prior art] Conventionally, alkaline protease has been used as Bacillus subtilis (Baci
subtilisin produced by llus subtilis)
It is also widely used industrially. Subtilisins are also known as Carlsberg, Novo, BPN ', etc., and have a molecular weight of 26,000 and active site residues Asp32, His64 and Ser221. Examples of alkaline proteases other than subtilisin include Aspergillus oryzae Aspergillopeptidase B, C, Sorangium α-lytic proatase, and Streptomyces griseus pronase.
これらのアルカリ性プロテアーゼは研究用試薬として
のみではなく、洗剤添加用,各種食品加工用として幅広
く使用されている。These alkaline proteases are widely used not only as research reagents but also for detergent addition and various food processing.
[発明が解決しようとする課題] このようにアルカリ性プロテアーゼは工業的にも広く
利用される蛋白質分解酵素であるが、さらに熱に対する
耐熱性が増大すれば高温での使用に耐え、使用範囲は広
がり、常温の使用においても酵素の安定性が増大する。
本発明はこれらの点に着目し、従来のアルカリ性プロテ
アーゼよりも耐熱性の高いアルカリ性プロテアーゼを提
供することを目的とするものである。[Problems to be Solved by the Invention] As described above, alkaline protease is a proteolytic enzyme widely used industrially. However, if the heat resistance to heat is further increased, it can withstand use at high temperatures and the range of use can be expanded. Also, the stability of the enzyme is increased even at room temperature.
The present invention focuses on these points, and an object of the present invention is to provide an alkaline protease having higher heat resistance than conventional alkaline proteases.
[課題を解決するための手段] 本発明者らは、上記課題について鋭意検討した結果、
従来のアルカリ性プロテアーゼよりも著しく耐熱性の向
上したアルカリ性プロテアーゼ(以下、プロテアーゼ
NCA1503とする)を見出し、本発明に至った。[Means for Solving the Problems] As a result of intensive studies on the above problems, the present inventors have found that
Alkaline protease (hereinafter referred to as “protease”) with significantly improved heat resistance compared to conventional alkaline protease
NCA1503), which led to the present invention.
すなわち本発明は下記の酵素化学的性質を有する耐熱
性アルカリ性プロテアーゼである。That is, the present invention is a thermostable alkaline protease having the following enzymatic chemical properties.
a)分子量:約28000(ゲル濾過法,SDS−PAGE) b)pH安定性:37℃,30分の処理後、pH6〜12の範囲で90
%以上の活性を有し、安定である c)至適pH:10.0〜10.5 d)温度安定性:60℃,30分の熱処理後の残存活性:100% 65℃,30分の熱処理後の残存活性:50% e)阻害剤:フェニルメチルスルホニルフルオライド
(PMSF) ジイソプロピルフルオロホスフェート(DF
P) f)紫外線吸収スペクトル:280nm付近 g)基質特異性:カゼイン,アゾカゼイン,アルブミ
ン,インスリン,ポリリジン,などのタンパク質,又は
ペプチドにおけるGln−His,Ser−His,Leu−Tyr,Tyr−Le
u,Phe−Tyrの部分を特に分解する h)アミノ酸配列及び組成: のアミノ酸261個からなる アミノ酸組成 Ala 32,Arg 12,Asp 12,Asn 4,Cys 2,Gln 13,Glu
23,Gly 17,His 11,Ile 14,Leu 22,Lys 19,Met
6,Phe 9,Pro 13,Ser 6,Thr 12,Trp 1,Tyr 15,Val
18 i)構造遺伝子の塩基配列 の783塩基対からなる pH及び温度による失活の条件: pH4.0,37℃,30分間で約50%が失活する。さらにpH10,70
℃,30分間でほぼ完全に失活する。a) Molecular weight: about 28000 (gel filtration method, SDS-PAGE) b) pH stability: After treatment at 37 ° C. for 30 minutes, 90 at pH 6-12.
%) The activity is stable. C) Optimum pH: 10.0 to 10.5 d) Temperature stability: Residual activity after heat treatment at 60 ° C for 30 minutes: 100% Residual activity after heat treatment at 65 ° C for 30 minutes Activity: 50% e) Inhibitor: phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) diisopropyl fluorophosphate (DF
P) f) Ultraviolet absorption spectrum: around 280 nm g) Substrate specificity: Gln-His, Ser-His, Leu-Tyr, Tyr-Le in proteins or peptides such as casein, azocasein, albumin, insulin, polylysine, etc.
specifically degrades the u, Phe-Tyr portion. h) Amino acid sequence and composition: Ala 32, Arg 12, Asp 12, Asn 4, Cys 2, Gln 13, Glu
23, Gly 17, His 11, Ile 14, Leu 22, Lys 19, Met
6, Phe 9, Pro 13, Ser 6, Thr 12, Trp 1, Tyr 15, Val
18 i) Nucleotide sequence of structural gene Conditions for inactivation by pH and temperature consisting of 783 base pairs: pH 4.0, 37 ° C, about 50% inactivation in 30 minutes. Further pH10,70
Deactivates almost completely at ℃ for 30 minutes.
また本発明は、耐熱性アルカリ性プロテアーゼの製法
に関するものであり、バチルス・ステアロサーモフィル
ス(Bacillus stearothermophilus)属に属し、プロテ
アーゼ NCA1503を生産する細菌を培養し、培養上清か
らプロテアーゼ NCA1503を採取することを特徴とする
プロテアーゼ NCA1503の製造方法に関する。The present invention also relates to a method for producing a thermostable alkaline protease, comprising culturing a bacterium belonging to the genus Bacillus stearothermophilus, which produces the protease NCA1503, and collecting the protease NCA1503 from the culture supernatant. And a method for producing the protease NCA1503.
本発明で使用されるプロテアーゼ NCA1503生産微生
物は、プロテアーゼ NCA1503を生産することのできる
バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearo
thermophilus)属に属する全ての菌株、突然変異株、お
よび変種を包含する。中でも特に好ましい菌株は、バチ
ルス・ステアロサーモフィルス NCA1503(Bacillus s
tearothermophilus NCA1503)(微工研菌寄第8978号)
である。The protease NCA1503 producing microorganism used in the present invention is a Bacillus stearothermophilus (Bacillus stearofils) capable of producing the protease NCA1503.
thermophilus), including all strains, mutants and variants belonging to the genus thermophilus. A particularly preferred strain is Bacillus stearothermophilus NCA1503 (Bacillus s.
tearothermophilus NCA1503)
It is.
本発明のプロテアーゼ NCA1503を生産するには、例
えば、上記のバチルス・ステアロサーモフィルス NCA1
503(Bacillus stearothermophilus NCA1503)を炭素
源、窒素源、塩類、その他の物質を含有する培地に摂取
し、適当な温度、例えば約50〜60℃で酵素力価が最高に
達するまでの適当な時間、好気的条件下、例えば、振と
うまたは通気撹拌培養して生産する方法がある。To produce the protease NCA1503 of the present invention, for example, the above Bacillus stearothermophilus NCA1
503 (Bacillus stearothermophilus NCA1503) is ingested into a medium containing a carbon source, a nitrogen source, salts, and other substances, and at an appropriate temperature, for example, about 50 to 60 ° C., for an appropriate time until the enzyme titer reaches its maximum, Under aerobic conditions, for example, there is a method of producing by shaking or aeration and stirring culture.
上記のようにして培養された培養物は、遠心分離、濾
過などの方法で清澄した後、この清澄液に例えば硫酸ア
ンモニウムを加えて目的の酵素を沈澱させ、採取するこ
とができる。またさらにイオン交換法、ゲル濾過法を利
用して上記沈澱物をさらに精製して、極めて高いプロテ
アーゼ NCA1503を得ることもできる。The culture cultured as described above is clarified by a method such as centrifugation or filtration, and then the target enzyme can be precipitated by adding, for example, ammonium sulfate to the clarified liquid and collected. Further, the precipitate can be further purified by using an ion exchange method or a gel filtration method to obtain an extremely high protease NCA1503.
このようにして得られた新規のプロテアーゼ NCA150
3の理化学的性質を以下に示す。The novel protease NCA150 thus obtained
The physicochemical properties of 3 are shown below.
(1)作用 カゼインを基質として使用した37℃での蛋白質分解作
用の好適pHは、図1に示すごとく、pH9〜11であり、至
適pH10〜10.5のアルカリ性プロテアーゼである。(1) Action The preferred pH for proteolytic action at 37 ° C. using casein as a substrate is pH 9 to 11, as shown in FIG. 1, and is an alkaline protease having an optimum pH of 10 to 10.5.
(2)基質特異性 37℃,pH8.5でB鎖を基質として分解させたところ図2
に示すごとくGln−His,Ser−His,Leu−Tyr,Tyr−Leu,Ph
e−Tyrの部分を分解する。(2) Substrate specificity Decomposition of B-chain as a substrate at 37 ° C and pH 8.5 Figure 2
As shown in Gln-His, Ser-His, Leu-Tyr, Tyr-Leu, Ph
Decompose the e-Tyr part.
(3)至適pH カゼインを基質として使用した37℃での蛋白質分解作
用におけるpHの影響を図1に示す。至適pHは10〜10.5で
ある。(3) Optimum pH FIG. 1 shows the effect of pH on the proteolytic action at 37 ° C. using casein as a substrate. The optimum pH is 10-0.5.
(4)pH安定性 カゼインを基質として各種pHで37℃,30分の処理後の
残存活性を図3に示す。pH6〜12の範囲で90%以上の残
存活性を示した。またpH4.0では約50%が失活した。(4) pH stability FIG. 3 shows the residual activity after treatment at 37 ° C. for 30 minutes at various pHs using casein as a substrate. It showed a residual activity of 90% or more in the pH range of 6 to 12. At pH 4.0, about 50% was inactivated.
(5)力価の測定法 1mlの2%カゼイン溶液(50mMトリスー塩酸,pH8.5)
に1mlの各試料を加え、一定時間後に反応停止液(0.33M
酢酸,0.22M酢酸ナトリウム,0.1Mトリクロロ酢酸)を2ml
加え、室温で30分間放置した。これをワットマンNO.1濾
紙で濾過した。これとは別に、カゼイン溶液に反応停止
液をいれ、試料を加え、濾過したものを基準としてA275
nmを測定し、チロシン溶液を基準としたA275の検量線を
作成してプロテアーゼ活性を測定した。1単位は37℃で
1分間に1μgのチロシン相当物質をトリクロロ酢酸可
溶性区分に遊離させる酵素量とした。(5) Method for measuring titer 1 ml of a 2% casein solution (50 mM Tris-HCl, pH 8.5)
1 ml of each sample, and after a certain period of time, stop reaction solution (0.33 M
Acetic acid, 0.22M sodium acetate, 0.1M trichloroacetic acid) 2ml
In addition, it was left at room temperature for 30 minutes. This was filtered through Whatman No. 1 filter paper. Alternatively, put stop solution to casein solution, the sample was added, A 275 as a reference which was filtered
nm was measured and tyrosine solution to create a calibration curve of A 275 relative to the measured protease activity. One unit was defined as the amount of enzyme that releases 1 μg of a tyrosine-equivalent substance to a trichloroacetic acid-soluble fraction per minute at 37 ° C.
(6)至適温度 カゼインを基質として使用したpH8.5での蛋白質分解
作用の温度依存性を図4に示す。本酵素の作用最適温度
は約55℃にある。(6) Optimum temperature FIG. 4 shows the temperature dependence of the proteolytic action at pH 8.5 using casein as a substrate. The optimal temperature of action of this enzyme is about 55 ° C.
(7)温度安定性 カゼインを基質として使用したpH8.5での温度安定性
を図5に示す。本酵素は60℃,30分熱処理後の残存活性
は100%と、アルカリ性プロテアーゼとしては非常に安
定である。また65℃,30分の熱処理後の残存活性は50%
である。70℃,30分の熱処理でほぼ完全に失活する。(7) Temperature stability FIG. 5 shows the temperature stability at pH 8.5 using casein as a substrate. This enzyme has a residual activity of 100% after heat treatment at 60 ° C for 30 minutes, which is very stable as an alkaline protease. 50% residual activity after heat treatment at 65 ° C for 30 minutes
It is. Deactivated almost completely by heat treatment at 70 ℃ for 30 minutes.
(8)阻害剤の影響 阻害剤の影響を表1に示す。(8) Effect of inhibitor Table 1 shows the effect of the inhibitor.
(9)プロテアーゼの精製方法 培養上清から硫安沈澱,透折などして得た粗酵素サン
プルは、例えば次の方法で分離精製することができる。
すなわち粗酵素サンプル約1gを10mlの0.1Mリン酸緩衡液
pH8.0に溶解し、同緩衡液で平衡化した。Toyopearl−HW
50(商品名,東ソー(株)製)を充填したカラム(1.5
×80cm)上部に静かに流し込み、同緩衡液で溶出する。
ここで得た活性画分をさらにTSKgel−G2000SW(商品
名,東ソー(株)製)にかけ、ピークフラクションを分
取する。活性画分は硫酸アンモニウム塩析(70%飽和)
もしくは限外濾過膜(UF−10PS,商品名,東ソー(株)
製)などを用い濃縮し、透析した後、凍結乾燥する。 (9) Protease Purification Method A crude enzyme sample obtained by ammonium sulfate precipitation, filtration, and the like from a culture supernatant can be separated and purified by the following method, for example.
That is, about 1 g of the crude enzyme sample was added to 10 ml of 0.1 M phosphate buffer.
It was dissolved in pH 8.0 and equilibrated with the same buffer. Toyopearl-HW
50 (trade name, manufactured by Tosoh Corporation)
Pour gently into the upper part and elute with the same buffer.
The active fraction obtained here is further applied to TSKgel-G2000SW (trade name, manufactured by Tosoh Corporation) to collect a peak fraction. Active fraction is ammonium sulfate salting out (70% saturation)
Or ultrafiltration membrane (UF-10PS, trade name, Tosoh Corporation)
), Dialysis, and freeze-dried.
(10)分子量 ゲル濾過法,SDS−ポリアクリルアミドゲル電気詠動法
により測定した分子量は約28000,アミノ酸配列からの分
子量は29460である。(10) Molecular weight The molecular weight measured by gel filtration and SDS-polyacrylamide gel electrophoresis is about 28000, and the molecular weight from the amino acid sequence is 29,460.
(11)紫外線吸収スペクトル 図6に示すごとく、吸収極大は約280nm付近にあり、
吸収極小は約245〜255nmにある。(11) Ultraviolet absorption spectrum As shown in FIG. 6, the absorption maximum is around 280 nm.
The absorption minimum is at about 245-255 nm.
(12)アミノ酸組成 [発明が解決しようとする課題]の欄h)アミノ酸配
列及び組成に示すごとく261個のアミノ酸からなる。(12) Amino acid composition As shown in column h) Amino acid sequence and composition of [Problems to be Solved by the Invention] Consist of 261 amino acids.
(13)塩基配列 [発明が解決しようとする課題]の欄i)構造遺伝子
の塩基配列に示すごとく、783塩基対からなる。(13) Nucleotide Sequence As shown in the column i) of the structural gene in [Problems to be Solved by the Invention], the sequence consists of 783 base pairs.
[発明の効果] 本発明によるプロテアーゼ NCA1503は、従来のアル
カリ性プロテアーゼよりも耐熱性が高く、高温での使用
に耐え、使用範囲は広がり、常温の使用においても酵素
の安定性が増大する。またプロテアーゼ NCA1503は、
本発明方法により得ることができる。[Effects of the Invention] The protease NCA1503 according to the present invention has higher heat resistance than conventional alkaline protease, withstands use at high temperatures, has a wide range of use, and has increased enzyme stability even at room temperature. Protease NCA1503 is
It can be obtained by the method of the present invention.
[実施例] 次に実施例を示す。しかし本発明はこれら実施例のみ
に限定されるものではない。Example Next, an example will be described. However, the present invention is not limited to only these examples.
(実施例1) 表2に示す組成の培地500mlを2容の坂口フラスコ
に入れ、120℃,15分滅菌する。同組成の培地で培養した
バチルス・ステアロサーモフィルス NCA1503の前培養
液5mlを加え、50℃,150rpm,24時間振とう培養した。こ
の培養上清を硫酸アンモニウムを70%飽和になるように
加え、酵素活性画分を析出させたのち、遠心分離(1100
00rpm,10分)して集めた。集めた酵素をできるだけ少量
の0.1Mリン酸緩衡液pH8.0に検濁し、透析チューブにつ
め24時間,4℃で透析した。透析後、不容物を遠心分離し
て除き、凍結乾燥し、得られた粉末を粗酵素サンプルと
した。粗酵素サンプル約1gを10mlの0.1Mリン酸緩衡液pH
8.0に溶解し、同緩衡液で平衡化した。Toyopearl−HW50
(商品名,東ソー(株)製)を充填したカラム(1.5×8
0cm)上部に静かに流し込み、同緩衡液で溶出した。こ
こで得た活性画分をさらにTSKgel−G2000SW(商品名,
東ソー(株)製)にかけ、ピークフラクションを分取し
た。活性画分を限外濾過膜(UF−10PS,商品名,東ソー
(株)製)を用い濃縮し、透析した後、凍結乾燥した。
1の培養液から0.05gのプロテアーゼ NCA1503を得
た。(Example 1) 500 ml of a medium having the composition shown in Table 2 is placed in a two-volume Sakaguchi flask and sterilized at 120 ° C. for 15 minutes. 5 ml of a preculture of Bacillus stearothermophilus NCA1503 cultured in a medium having the same composition was added, and the cells were cultured with shaking at 50 ° C., 150 rpm for 24 hours. Ammonium sulfate was added to the culture supernatant to 70% saturation to precipitate an enzyme active fraction, and then centrifuged (1100
(00 rpm, 10 minutes). The collected enzyme was turbidized to a minimum amount of 0.1 M phosphate buffer pH 8.0, packed in a dialysis tube and dialyzed for 24 hours at 4 ° C. After the dialysis, the insoluble matter was removed by centrifugation and freeze-dried, and the obtained powder was used as a crude enzyme sample. About 1 g of the crude enzyme sample is added to 10 ml of 0.1 M phosphate buffer pH
It was dissolved in 8.0 and equilibrated with the same buffer. Toyopearl-HW50
(Trade name, manufactured by Tosoh Corporation)
0 cm), gently poured into the upper part, and eluted with the same buffer. The active fraction obtained here was further subjected to TSKgel-G2000SW (trade name,
Tosoh Corporation) and fractionated the peak fraction. The active fraction was concentrated using an ultrafiltration membrane (UF-10PS, trade name, manufactured by Tosoh Corporation), dialyzed, and lyophilized.
0.05 g of protease NCA1503 was obtained from one culture.
精製した酵素の純度はポリアクリルアミドゲル電気詠
動(12.5%)及び高速液体クロマトグラフィー(カラム
TSKgel G2000SW)で分析した結果、いずれの場合も単
一のタンパク質バンドが検出できた。The purity of the purified enzyme was determined by polyacrylamide gel electrophoresis (12.5%) and high-performance liquid chromatography (column
As a result of analysis using TSKgel G2000SW), a single protein band was detected in each case.
(実施例2) 洗剤などに用いられているズブチリシン・カルスベル
グとプロテアーゼ NCA1503のアルカリ溶液中(ほう酸
−水酸化ナトリウム緩衡液,pH9.0)において各温度にお
ける酵素活性の半減時間の測定を行った。結果を表3に
示す。(Example 2) The half-life of the enzyme activity at each temperature was measured in an alkaline solution (substrate of boric acid-sodium hydroxide, pH 9.0) of subtilisin Calsberg and protease NCA1503 used in detergents and the like. . Table 3 shows the results.
このように従来工業的に使用されているズブチリン・
カールスベルグと比べてアルカリ溶液中においてプロテ
アーゼ NCA1503は60℃までほとんど失活しない。 Thus, subtilin /
Compared with Carlsberg, protease NCA1503 hardly deactivates up to 60 ° C in alkaline solution.
図1はプロテアーゼ NCA1503の至適pHを示す図であ
る。 図2はプロテアーゼ NCA1503の酸化インスリンB鎖の
分解を示し、この酵素の基質特異性を示す図である。 図3はプロテアーゼ NCA1503のpH安定性を示す図であ
る。 図4はプロテアーゼ NCA1503の至適温度を示す図であ
る。 図5はプロテアーゼ NCA1503の温度安定性を示す図で
ある。 図6はプロテアーゼ NCA1503の水溶液中での紫外線吸
収スペクトルを示す図である。FIG. 1 shows the optimum pH of protease NCA1503. FIG. 2 shows the degradation of oxidized insulin B chain of protease NCA1503, and shows the substrate specificity of this enzyme. FIG. 3 is a diagram showing the pH stability of protease NCA1503. FIG. 4 is a diagram showing the optimal temperature of protease NCA1503. FIG. 5 is a diagram showing the temperature stability of protease NCA1503. FIG. 6 shows an ultraviolet absorption spectrum of protease NCA1503 in an aqueous solution.
Claims (3)
カリ性プロテアーゼ。 分子量:約28000(ゲル濾過法,SDS−PAGE) pH安定性:37℃,30分の処理後、pH6〜12の範囲で90%以
上の活性を有し、安定である 至適pH:10.0〜10.5 温度安定性:60℃,30分の熱処理後の残存活性:100% 65℃,30分の熱処理後の残存活性:50% 阻害剤:フェニルメチルスルホニルフルオライド(PMS
F) ジイソプロピルフルオロホスフェート(DFP) 紫外線吸収スペクトル:280nm付近 基質特異性:カゼイン,アゾカゼイン,アルブミン,イ
ンスリン,ポリリジン,などのタンパク質,又はペプチ
ドにおけるGln−His,Ser−His,Leu−Tyr,Tyr−Leu,Phe
−Tyrの部分を特に分解する アミノ酸配列及び組成: のアミノ酸261個からなる アミノ酸組成 Ala 32,Arg 12,Asp 12,Asn 4,Cys 2,Gln 13,Glu
23,Gly 17,His 11,Ile 14,Leu 22,Lys 19,Met
6,Phe 9,Pro 13,Ser 6,Thr 12,Trp 1,Tyr 15,Val
18 構造遺伝子の塩基配列 の783塩基対からなる pH及び温度による失活の条件: pH4.0,37℃,30分間で約50%が失活する。さらにpH10,70
℃,30分間でほぼ完全に失活する。1. A thermostable alkaline protease having the following enzymatic chemical properties. Molecular weight: about 28000 (gel filtration method, SDS-PAGE) pH stability: After treatment at 37 ° C for 30 minutes, it has 90% or more activity in the range of pH 6 to 12, and is stable. 10.5 Temperature stability: Residual activity after heat treatment at 60 ° C for 30 minutes: 100% Residual activity after heat treatment at 65 ° C for 30 minutes: 50% Inhibitor: phenylmethylsulfonyl fluoride (PMS
F) Diisopropylfluorophosphate (DFP) Ultraviolet absorption spectrum: around 280 nm Substrate specificity: Gln-His, Ser-His, Leu-Tyr, Tyr-Leu in proteins or peptides such as casein, azocasein, albumin, insulin, polylysine, etc. , Phe
Amino acid sequence and composition that specifically degrades the Tyr moiety: Ala 32, Arg 12, Asp 12, Asn 4, Cys 2, Gln 13, Glu
23, Gly 17, His 11, Ile 14, Leu 22, Lys 19, Met
6, Phe 9, Pro 13, Ser 6, Thr 12, Trp 1, Tyr 15, Val
18 Structural gene base sequence Conditions for inactivation by pH and temperature consisting of 783 base pairs: pH 4.0, 37 ° C, about 50% inactivation in 30 minutes. Further pH10,70
Deactivates almost completely at ℃ for 30 minutes.
llus stearothermophilus)に属する菌株を培養して、
該培養液より特許請求の範囲第1項記載のプロテアーゼ
を採取することを特徴とするプロテアーゼの製法。2. Bacillus stearothermophilus (Baci)
llus stearothermophilus)
A method for producing a protease, comprising collecting the protease according to claim 1 from the culture solution.
NCA1503(Bacillus stearothermophilus NCA1503)
(微工研菌寄第8978号)である特許請求の範囲第2項記
載の方法。3. The method according to claim 1, wherein the strain is Bacillus stearothermophilus.
NCA1503 (Bacillus stearothermophilus NCA1503)
3. The method according to claim 2, wherein the method is (Pierced Laboratories No. 8978).
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63071887A JP2643264B2 (en) | 1988-03-28 | 1988-03-28 | New thermostable alkaline protease and its manufacturing method |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63071887A JP2643264B2 (en) | 1988-03-28 | 1988-03-28 | New thermostable alkaline protease and its manufacturing method |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
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JPH01247084A JPH01247084A (en) | 1989-10-02 |
JP2643264B2 true JP2643264B2 (en) | 1997-08-20 |
Family
ID=13473495
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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JP2794371B2 (en) * | 1992-12-22 | 1998-09-03 | 花王株式会社 | Alkaline protease K-16H |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS58162291A (en) * | 1982-03-23 | 1983-09-26 | Res Dev Corp Of Japan | Preparation of heat-resistant protease |
-
1988
- 1988-03-28 JP JP63071887A patent/JP2643264B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH01247084A (en) | 1989-10-02 |
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