JP3819454B2

JP3819454B2 - Novel proline dipeptidase and method for hydrolyzing proteins and peptides using the proline dipeptidase

Info

Publication number: JP3819454B2
Application number: JP14298695A
Authority: JP
Inventors: 幹夫藤井; 由子長岡
Original assignee: Japan Tobacco Inc
Current assignee: Japan Tobacco Inc
Priority date: 1994-07-15
Filing date: 1995-06-09
Publication date: 2006-09-06
Anticipated expiration: 2021-09-06
Also published as: JPH08266276A

Description

【０００１】
【産業上の利用分野】
本発明は新規プロリンジペプチダーゼ、該ペプチダーゼの製造方法、および該ペプチダーゼを利用したタンパク質およびペプチドの加水分解方法に関する。タンパク質の加水分解物は調味料および調味料原料として利用される。
【０００２】
【従来の技術】
タンパク質の加水分解は、通常高濃度の塩酸存在下に加熱することにより行われており、この方法により多くのタンパク質原料から調味料、調味料原料および食品素材が製造されている。しかしながらこれらの食品を取り扱う業界では、消費者の天然物嗜好の増大に伴い、化学薬品である塩酸を使用しない方法が望まれるようになりつつある。塩酸加水分解法に代わる方法として、タンパク質分解酵素を用いる加水分解方法が考えられるが、酵素のコストが塩酸に比べて高価であること、また塩酸を用いて加水分解した場合と同程度に加水分解率を高めることは困難であったことから、これまで実用化された例は少ない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
本発明の課題は、蛋白質の高度加水分解に利用し得る新規ペプチダーゼを見出し、これを用いてタンパク質を高度に加水分解する方法を開発することである。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
酵素による加水分解でタンパク質の加水分解率が低い原因の１つとして、タンパク質中のプロリン残基およびヒドロキシプロリン残基の存在があげられる。プロリンおよびヒドロキシプロリンは環状α−イミノ酸であり、他のアミノ酸とは異なる立体構造をしている。蛋白質またはペプチド中のプロリン残基およびヒドロキシプロリン残基のイミノ基やカルボキシル基が関与するペプチド結合は通常のタンパク質分解酵素による加水分解を受けにくい。すなわち、タンパク質を通常のタンパク質分解酵素で加水分解すると、プロリン残基の部分がジペプチドまたはトリペプチドの状態にまで加水分解された時点で反応が終了してしまうことになる。
【０００５】
プロリン残基を含むジペプチドを加水分解する酵素としては、Ｐｒｏ−Ｘの構造を有するジペプチドを加水分解するプロリルジペプチダーゼ（別名プロリナーゼ）とＸ−Ｐｒｏの構造を有するジペプチドを加水分解するプロリンジペプチダーゼ（別名プロリダーゼ）とが知られている。ここでＸは通常のＬ−アミノ酸を示す。本発明者らは通常のタンパク質分解酵素による加水分解工程と、プロリンジペプチダーゼおよびプロリルジペプチダーゼを含む酵素剤を用いた加水分解工程を組み合わせることによりタンパク質を高度に加水分解できること見出し、プロリン残基部分を効率よく加水分解することがタンパク質の高度分解にとって大切であることを確認し、平成５年日本国特許出願第２６６４６７号にその内容を開示した。
【０００６】
上記方法は多くのタンパク質の酵素による加水分解に適用可能であるが、コラーゲンやゼラチンのようにヒドロキシプロリンを多量に含むタンパク質の加水分解に適用することには問題がある。多くのプロリルジペプチダーゼはＰｒｏ−Ｘのジペプチドの他にプロリンがヒドロキシプロリンに置き換わったＨｙｐ−Ｘを加水分解できる。逆にプロリンジペプチダーゼの多くはＸ−Ｈｙｐのジペプチドを加水分解できない。哺乳類の小腸由来のプロリンジペプチダーゼはＧｌｙ−Ｈｙｐを加水分解することが報告されているものの（Ｓｊｏｅｓｔｒｏｅｍら、”Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙｏｆｐｉｇｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｐｒｏｌｉｄａｓｅ”Ｂｉｏｃｈｉｍ・Ｂｉｏｐｈｙｓａｃｔａ第３２７巻４５７〜４７０頁［１９７３］）、Ｇｌｙ−Ｐｒｏを加水分解する場合と比較してその活性は極端に低く、かつ微生物由来の酵素のように大量培養による酵素の工業的な生産は不可能である。現在までに知られている微生物由来のプロリンジペプチダーゼはＸ−Ｈｙｐを加水分解することができないため、これを加水分解できる微生物由来の酵素が望まれていた。
【０００７】
さらに、コラーゲンやゼラチン中のヒドロキシプロリンの多くはプロリンと結合した状態（Ｐｒｏ−Ｈｙｐの状態）で存在しているが（以下、ＨｙｐはＬ−ヒドロキシプロリンを表す。）、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのジペプチドを加水分解するペプチダーゼはこれまでに報告がないことから、Ｘ−Ｈｙｐを加水分解できるペプチダーゼの中でもＰｒｏ−Ｈｙｐも加水分解できる酵素が特に望まれていた。
【０００８】
そこで本発明者らは鋭意検討を行った結果、オーレオバクテリウム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属する細菌がＰｒｏ−Ｈｙｐの構造を示すジペプチドを加水分解するプロリンジペプチダーゼを生産することを見出し、該ペプチダーゼによる加水分解工程をタンパク質の加水分解に取り入れることによりヒドロキシプロリンを多量に含むタンパク質であっても効率よく加水分解できることを確認し、本発明を完成させるに到った。
すなわち、本発明は、Ｐｒｏ−Ｈｙｐで表されるジペプチドを加水分解するプロリンジペプチダーゼおよびその製造方法、並びに該ペプチダーゼを用いたコラーゲンまたはゼラチンを含むタンパク質およびペプチドの加水分解方法に係わる。
【０００９】
本発明のプロリンジペプチダーゼは以下の特徴を有する。
（１）精製酵素の２８０ｎｍの吸光度単位当たりのＰｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する活性が１４０単位±２０単位である。
（２）Ｐｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する活性がＳｅｒ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏを加水分解する活性の２倍以上である。
（３）加水分解活性がＥＤＴＡによる阻害を受けず、かつＭｎイオンにより活性が賦活されない。
（４）６０℃で３０分の加熱後も９０％以上の活性を保持している。
好ましくは、上記に加え、非変性条件下での分子量が４４０，０００±２０，０００であり、サブユニットの分子量が４０，０００±２，０００であり、等電点が４．６±０．２であり、パラクロロマーキュロ安息香酸およびオルトフェナントロリンにより阻害を受けることを特徴とするプロリンジペプチダーゼである。
【００１０】
また、本発明のピロリンジペプチダーゼは、Ｎ−末端部分のアミノ酸配列が、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌであることが好ましい。
これらの特性は、後述の実施例に記載の方法により測定する。
本発明のプロリンジペプチダーゼの例としては、ＡｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｕｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍＩＦＯ３７５２が生産するペプチダーゼがあげられる。このペプチダーゼの分子量は約４４万であり（図６）、またサブユニットの分子量は約４万である（図７）。約４．６の等電点を示し（図８）、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏ等を加水分解するプロリンジペプチダーゼである。なかでも、Ｐｒｏ−Ｈｙｐ、Ｇｌｙ−ＨｙｐのようにＣ−末端プロリンがヒドロキシプロリンに置き代わったジペプチドに対しても加水分解活性を有し、特にＰｒｏ−Ｈｙｐのジペプチドに対して高い加水分解活性を示す点で新規である（表２）。また微生物由来の既知のプロリンジペプチダーゼが活性の発現にマンガンイオンを要求し、マンガンイオンを添加しない場合には加水分解反応が効率よく進まず、かつＥＤＴＡ等のキレート剤により活性が阻害されるのに対し、本酵素はマンガンイオンの添加を必要とせず、ＥＤＴＡによりその活性が阻害されないことも新規である（表３）。
【００１１】
本発明のプロリンジペプチダーゼは、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのジペプチドを加水分解するペプチダーゼを生産する能力のある微生物を培地に接種し、一定時間培養を行った後、培養液より該酵素を抽出することにより製造することができる。そのような能力のある微生物の例として、オーレオバクテリウムエステラロマティカム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）ＩＦＯ３７５２があげられる。この微生物は財団法人発酵研究所が保存する微生物であり、同所に依頼することにより誰でもこの菌株の分譲を受けることができる。ＡｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍＩＦＯ３７５２の場合には、本菌をグルコース、ペプトン、酵母エキス、コーンスティープリカー（ＣＳＬ）等を含む培地に接種し、２８〜３０℃で１〜３日好気培養することにより該ペプチダーゼが生産される。該ペプチダーゼは培養上清中にも多少蓄積するため、これを濃縮してもよいが、多量の酵素を取得する場合には菌体を遠心分離等により集め、超音波処理、浸透圧ショック処理、リゾチーム処理や界面活性剤処理を行い、菌体内に存在する該ペプチダーゼを抽出することが望ましい。菌体の抽出液より公知の常法、例えば硫安またはアセトンによる分画、疎水クロマトグラフ、イオン交換クロマトグラフ、ゲル濾過クロマトグラフ等を用いることにより、Ｐｒｏ−Ｈｙｐのジペプチドを加水分解する酵素を精製することができる。
【００１２】
本発明のプロリンジペプチダーゼのスクリーニングは、各種微生物の培養液または菌体抽出液をＰｒｏ−Ｈｙｐのジペプチドに作用させ、遊離するプロリンおよびヒドロキシプロリンの量をニンヒドリン反応等により検出することにより行うことが可能である。また別法として、Ｇｌｙ−ＰｒｏやＧｌｙ−Ｈｙｐの様なジペプチドを加水分解することを指標にプロリンジペプチダーゼのスクリーニングを行い、選択されたプロリンジペプチダーゼの中からＰｒｏ−Ｈｙｐにも作用するものを選択しても良い。
【００１３】
本発明のプロリンジペプチダーゼを用いてタンパク質およびペプチドを加水分解する際、必ずしも酵素を精製することは必要ではない。加水分解反応もしくは加水分解物に悪影響を与える因子が混在せず、かつ食品衛生上の問題が無ければ該酵素の粗精製品または培養液からの抽出物をそのまま反応に利用することも可能である。
【００１４】
本発明のプロリンジペプチダーゼを用いたタンパク質およびペプチドを加水分解する方法は公知のペプチダーゼを用いる反応と何等変わりはないが、該ペプチダーゼはアミノ酸数３以上のオリゴペプチドを加水分解することができないため、タンパク質はあらかじめプロテアーゼ等により、該ペプチダーゼが充分作用できる程度に前処理工程により低分子化しておくことが必要である。このようなタンパク質の前処理に用いる酵素の例として、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属またはリゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属由来のプロテアーゼやペプチダーゼがあげられ、既に天野製薬社よりプロテアーゼＡ、プロテアーゼＭ、およびペプチダーゼＲ等の酵素製剤が、また科研製薬社よりアクチナーゼ等がプロテアーゼ製剤が市販されている。
【００１５】
コラーゲンおよびゼラチン等、プロリンやヒドロキシプロリンを多く含むタンパク質を加水分解する場合には、前処理が特に重要であり、より高い加水分解率の達成がこの前処理工程に要求される。すなわち、本発明のプロリンジペプチダーゼによる加水分解は、低分子化工程が終了した時点での加水分解率に強く依存し、この時点での加水分解率が３０％以下（ペプチドの平均アミノ酸数が３以上）では該ペプチダーゼによる加水分解率の増加は僅かであるため、前処理工程終了時点において、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上のペプチド結合が加水分解されていることが望ましい。
【００１６】
このような高い加水分解率は、原料タンパク質を複数のプロテアーゼおよびペプチダーゼで処理することにより達成できるが、異なる複数のプロテアーゼ製剤を同時にまたは連続して使用するよりも、複数のプロテアーゼおよびペプチダーゼを同時に含む単一のプロテアーゼ製剤を用いる方が有利であることは言うまでもない。複数のプロテアーゼおよび公知のペプチダーゼを同時に含むプロテアーゼ製剤の例としてはノボ・ノルディスク社（ＮＯＶＯＮＯＲＤＩＳＫＡ／Ｓ、デンマーク）のフレ−バ−ザイム（Ｆｌａｖｏｕｒｚｙｍｅ）があげられる。該プロテアーゼ製剤にはアスペルギルスオリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ）由来で、分子量がそれぞれ約２３ｋＤ、約２７ｋＤ、約３１ｋＤ、約３２ｋＤ、約３５ｋＤ、約３８ｋＤ、約４２ｋＤ、約４７ｋＤ、約５３ｋＤ、および約１００ｋＤの中から選ばれる少なくとも５種のプロテアーゼおよびペプチダーゼが含まれている。詳細には、上記の５種のプロテアーゼおよびペプチダーゼの分子量はそれぞれ約２３ｋＤ、約３１ｋＤ、約３５ｋＤ、約３８ｋＤ、約５３ｋＤである。このような酵素製剤によりコラーゲンやゼラチン等、プロリンやヒドロキシプロリンを多く含むタンパク質の前処理を行った場合には、単にこの工程での加水分解率が高いのみならず、本発明のペプチダーゼによる加水分解工程において分解率の増加分がより高くなることが見出された。
【００１７】
本発明のプロリンジペプチダーゼによる加水分解工程は、通常のプロテアーゼ製剤による前処理反応の終了後に行えばよい。但し、添加したプロテアーゼ製剤の残存活性により本発明のペプチダーゼが消化され、その活性が失われることも考えられるため、前処理反応が終了した時点で加熱などによりプロテアーゼを失活させておくことことが必要な場合もある。
【００１８】
本発明のプロリンジペプチダーゼによる加水分解は反応液のｐＨが７〜１０、好ましくは８〜９の範囲で、反応温度は３０〜６０℃、好ましくは４０〜５０℃で行うことが必要である。尚、本発明のプロリンジペプチダーゼはコラーゲンやゼラチン中に多く含まれているＧｌｙ−ＰｒｏやＰｒｏ−Ｈｙｐを加水分解できる。特にＰｒｏ−Ｈｙｐに対する特異性が高く、このジペプチドを加水分解する活性は、Ｓｅｒ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、Ｌｅｕ−Ｐｒｏを加水分解する活性の２倍以上である。さらに通常のプロリンジペプチダーゼは活性発現に人体に有害なマンガンイオンを必要とするが、本発明のプロリンジペプチダーゼはマンガンイオンを必要としないことから調味料等の食品素材を生産する場合にも適している。
以下に本発明の実施例を示すが、本発明はこれに限定されるものではない。
【００１９】
【実施例】
以下の実施例で得られた酵素の性質は以下のようにして求めた。
（１）蛋白質量の測定
精製酵素を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で適宜希釈後、同緩衝液をブランクとして２８０ｎｍの吸光度を島津分光光度計ＵＶ−１６０Ａを用いて測定した。蛋白質量は、２８０ｎｍにおける吸光度１の蛋白質溶液１ｍｌ中に含まれる蛋白質を１単位とする吸光度単位で示した。なお、本精製酵素の１吸光度単位は、約１．８ｍｇの蛋白質量に相当した。
（２）Ｐｒｏ−Ｈｙｐの加水分解活性
５ｍＭのＰｒｏ−Ｈｙｐを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）２００μｌに、２８０ｎｍの吸光度既知の酵素液（同上の緩衝液で適宜希釈したもの）を１００μｌ添加し、３７℃で１５分間反応させた。反応液に１Ｍの酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ２．８）７００μｌを添加して反応を停止させ、１０％ニンヒドリンを含む９５％エタノール溶液１００μｌを加えて７０℃で１０分間ニンヒドリン反を行い、プロリンおよびヒドロキシプロリンに由来する４４０ｎｍの吸光度を測定した。標準液として、基質であるＰｒｏ−Ｈｙｐと、その想定加水分解物（プロリンとニンヒドリンとの等モル混合液）とを適宜混合したものにつき、同上のニンヒドリン反応を行って標準曲線を作成し、これをもとにＰｒｏ−Ｈｙｐの加水分解率を求めた。なお、酵素１単位は３７℃、１分間の反応で１μモルのＰｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する酵素量と定義した。
【００２０】
（３）基質特異性
プロリンまたはヒドロキシプロリンを含む各種ペプチドを加水分解する能力について調べた。各種ペプチド５ｍＭを含む１０ｍＭトリス塩酸緩衝液２００μｌに、０．００４〜０．０４単位の酵素活性を含む上記緩衝液１００μｌを加え、３７℃で３０分間反応させた。反応液に１Ｍの酢酸緩衝液（ｐＨ２．８）７００μｌを添加して反応を停止させ、１０％ニンヒドリンを含む９５％エタノール溶液１００μｌを加えて７０℃で１０分間ニンヒドリン反応を行い、プロリンまたはヒドロキシプロリンに由来する４４０ｎｍの吸光度を測定した。一方、プロリン、ヒドロキシプロリンおよびこれらの混合液を用いて作製した標準曲線を基に遊離したプロリンおよびヒドロキシプロリンの量を求め、ペプチド結合の加水分解率を算出し、各種ペプチドに対する加水分解活性を比較した。
【００２１】
（４）阻害剤および金属イオンの影響
阻害剤の酵素に及ぼす効果を以下のように調べた。酵素液に各種阻害剤を一定量添加して１００μｌとし、室温で２０分放置した後、同じ濃度の阻害剤を含む５ｍＭの基質（Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）を２００μｌ添加して３７℃で１時間反応させた。その後上記と同様に酢酸酸性下でニンヒドリン反応を行うことにより遊離プロリン量を測定した。また、酵素反応を各種金属イオンの存在下に行い、金属イオンの影響を調べた。
（５）最適温度および熱安定性
酵素を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を用いて適宜希釈した後、６０℃で一定時間処理し、これらのＰｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する酵素活性を測定することにより熱安定性を求めた。また同上の緩衝液中で各種温度で１０分間反応を行い、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する活性を比較した。
【００２２】
（６）分子量の測定
非変性条件下での分子量の測定は、トーソー（Ｔｏｓｏｈ）社製ＨＰＬＣカラムＧ４０００ＰＷＸＬ（内径７．８ｍｍ×３０ｃｍ）を用いたゲル濾過により行った。０．５ＭのＫＣｌを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）でカラムを平衡化し、精製酵素溶液をアプライした。同緩衝液を１．０ｍｌ／分で流し、溶出液を２８０ｎｍの吸光度でモニターした。次に、分子量マーカーとして、ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製ブル−デキストリン（分子量２、０００、０００）、チログロブリン（分子量６６９、０００）、フェリチン（分子量４４０、０００）、アルドラーゼ（分子量１５８、０００）、アルブミン（分子量６７、０００）につき、同上の条件でゲル濾過を行い、得られた校正曲線より分子量を測定した。
【００２３】
酵素のサブユニットの分子量はファルマシア社製ファストシステム（Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ）を用いたＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動により測定した。ゲルは１０−１５％のグラディエントゲルを使用した。分子量マーカーとして、ファルマシア社製ホスホリラーゼｂ（分子量９４、０００）、アルブミン（分子量６７、０００）、オボアルブミン（分子量４３、０００）、カーボニック・アンヒドラーゼＢ（分子量３０、０００）、トリプシンインヒビター（分子量２０、１００）、α−ラクトアルブミン（分子量１４、４００）を用い、これらの泳動位置から求めた校正曲線より分子量を求めた。
【００２４】
（７）等電点の測定
ファルマシア社製ファストシステム（Ｐｈａｓｔｓｙｓｔｅｍ）を用いた等電点電気泳動により等電点を求めた。ゲルはＩＥＦ４−６．５を使用し、内部標準として用いた等電点マーカーであるファルマシア社製グルコース・オキシダーゼ（等電点４．１５）、トリプシンインヒビタ−（等電点４．５５）、β−ラクトアルブミン（等電点５．２０）、牛カーボニック・アンヒドラーゼ（等電点５．８５）、人カーボニック・アンヒドラーゼ（等電点６．５５）より校正曲線を求め本発明の酵素の等電点を求めた。
（８）最適ｐＨおよびｐＨ安定性
ｐＨ安定性は、酵素を各種ｐＨの緩衝液中で、室温で１時間放置し、その後ｐＨ８．０での活性を測定することにより求めた。その際、ｐＨ３．５〜５．５は５０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液をｐＨ５．５〜７．０は１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液を、ｐＨ７．０〜９．０は１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液をｐＨ９．０〜１０．５は１０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液を用いた。
【００２５】
酵素の最適反応ｐＨは、Ｐｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する反応を上記の緩衝液中で行わせることにより求めた。
（９）Ｎ−末端部分のアミノ酸配列
パーキン・エルマー社製アプライド・バイオシステムズ・プロテインシーケンサーＰＲＯＣＩＳＥ４９２を用いて、精製酵素のエドマン分解とＰＴＨ−アミノ酸の同定を行うことによりＮ−末端部分のアミノ酸配列を決定した。
【００２６】
【実施例１】
オーレオバクテリウムエステラロマティカム（Ａｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍ）ＩＦＯ３７５２を、グルコース０．５％、ポリペプトン２％、酵母エキス０．５％、ＣＳＬ２％、塩化ナトリウム０．３％、リン酸水素二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．１％よりなる培地６リットルを含む１０リットル容ジャ−ファ−メンタ−に接種し、３０℃で２０時間通気・撹拌培養した。培養液より集菌し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄し、８９ｇの湿菌体を得た。これを１０ｍＭのＥＤＴＡを含む同緩衝液４００ｍｌに懸濁させた。これにリゾチームを終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で３時間保温した後、１０％のトリトンＸ−１００水溶液４ｍｌを添加した。これを超音波処理し、１５、０００ｇで１０分間遠心分離して上清３５０ｍｌを回収し、粗酵素抽出液とした。
【００２７】
粗酵素抽出液のアセトン分画を以下のように行った。粗酵素抽出液３５０ｍｌに冷アセトン１７５ｍｌを添加して遠心分離（５、０００ｇ、１０分）を行い、上清に更に冷アセトン４５５ｍｌを添加して同上の条件で遠心分離し、沈澱を回収した。沈澱を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）５０ｍｌに溶かして再度遠心分離（５、０００ｇ、１０分）を行って不溶物を除去した後、マニトールを０．５ｇ添加溶解し、その後凍結乾燥によりアセトン分画粗酵素約１．５ｇを得た。
【００２８】
ファルマシア社製オクチルセファロースＣＬ−４Ｂを充填したカラムを１Ｍの硫安を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した。粗酵素全量を１Ｍ硫安を含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）１００ｍｌに溶解させ、これを上記カラムにアプライし、１→０Ｍの硫安の濃度勾配（総量５００ｍｌ）で酵素を溶出させた。各画分につき２８０ｎｍの吸光度とＰｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する活性について測定した結果を図１に示した。活性画分（フラクション３７乃至５４）を混合し、電気伝導度を指標に硫安濃度を１Ｍに調整した。これを上記オクチルセファロ−スカラムに再度アプライし、１→０Ｍの硫安の濃度勾配（総量２００ｍｌ）で溶出させた。その結果を図２に示した。
【００２９】
活性画分（フラクション１９乃至２５）を１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、これを同緩衝液で平衡化したファルマシア社製ＤＥＡＥセファロースＣＬ−６Ｂカラムにアプライし、０→１Ｍの塩化カリウムの濃度勾配（総量２００ｍｌ）により酵素を溶出させた（図３）。活性画分（フラクション２２乃至２５）を集め、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に対して透析し、これを同緩衝液で平衡化したファルマシア社製Ｑ−セファロ−スＦＦカラムにアプライし、０→１Ｍの塩化カリウムの濃度勾配（総量２００ｍｌ）により酵素を溶出させた（図４）活性画分であるフラクション１４および１５をそれぞれアミコン社製セントリフローＣＦ２５（分画分子量２５、０００）で濃縮した。フラクション１４の濃縮液をファルマシア社製スーパーロース１２ＨＲ１０／３０カラムを用い、０．５Ｍの塩化カリウムを含む１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）を流してゲル濾過を行った（図５Ａ）。またＱ−セファロースフラクション１５の濃縮液も同様にゲル濾過を行った（図５Ｂ）。図５Ａのフラクション３１、３２および図５Ｂのフラクション３０、３１を混合し、セントリフローにて濃縮・脱塩を行って精製酵素液を得た。
本酵素精製のプロフィールを表１に示した。
【００３０】
【表１】

【００３１】
精製酵素を１０〜１５％のポリアクリルアミドゲル電気泳動（ファルマシア社製ファストシステム）にて解析した結果、純度は９５％以上であることを確認した。精製酵素のＰｒｏ−Ｈｙｐを加水分解する比活性は２８０ｎｍの吸光度単位当たり１４０単位であった。
得られた酵素の分子量は４４０，０００±２０，０００、（図６）、またサブユニットの分子量は４０，０００±２，０００（図７）と推定された。また本酵素の等電点は４．６±０．２と推定された（図８）。
【００３２】
精製酵素を用いて基質特異性を調べた結果を表２に示す。本酵素はＳｅｒ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｐｒｏ，Ｌｅｕ−Ｐｒｏ等を加水分解するプロリンジペプチダーゼであった。また本酵素はＰｒｏ−Ｐｒｏに対しても比較的強い加水分解活性を示したが、プロリルジペプチダーゼの基質にであるＰｒｏ−ＧｌｙやアミノペプチダーゼＰの基質であるオリゴプロリンには作用しなかった。またＮ−末端修飾ペプチドに対する活性も認められなかった。本酵素はＰｒｏ−Ｈｙｐに対する加水分解活性が特に強く、既知のプロリンジペプチダーゼに基質として知られているＳｅｒ−Ｐｒｏ、Ｔｈｒ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｐｒｏ，Ｌｅｕ−Ｐｒｏ等のジペプチドを加水分解する活性の２倍以上であった。さらにＧｌｙ−Ｈｙｐに対しても加水分解活性を示し、Ｇｌｙ−Ｐｒｏに対する活性と同等もしくはそれ以上であった。
【００３３】
【表２】

【００３４】
本プロリンジペプチダーゼに対する各種阻害剤および金属イオンの影響を調べた結果を表３に示す。通常のプロリンジペプチダーゼはマンガンを活性中心に持つ金属酵素であり、キレート剤であるＥＤＴＡによりその活性が阻害されること、およびマンガンイオンにより活性が賦活されることが特徴である。一方、本発明のプロリンジペプチダーゼはＥＤＴＡでは全く阻害を受けず、かつ、マンガンによる賦活もないことから、既知のプロリンジペプチダーゼとはその特徴が大きく異なる酵素である。さらに、本酵素はＰＣＭＢ（パラクロロマーキュロ安息香酸）により強く阻害されることから、ＳＨ基を活性中心に持つ酵素であると考えられた。
【００３５】
【表３】

【００３６】
本酵素はｐＨ４乃至１０の範囲で安定であり（図９）、反応の最適ｐＨは９．０であった（図１０）。また本酵素は熱に対しても安定であり、６０℃、３０分の加熱後も９０％以上の活性が保持されていた（図１１）。最適作用温度は４５℃であった（図１２）。
本酵素のＮ−末端部分のアミノ酸配列は、Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｖａｌであった。
【００３７】
【実施例２】
ＡｕｒｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｅｓｔｅｒａｒｏｍａｔｉｃｕｍＩＦＯ３７５２を、グルコース０．５％、ポリペプトン１％、酵母エキス０．５％、脱脂綿実粉０．３％、塩化ナトリウム０．３％リン酸水素二カリウム０．２％、硫酸マグネシウム・７水和物０．１％よりなる培地１リットルに接種し、２８℃で３日間振盪培養した。培養液より集菌し、１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）で２回洗浄後、１０ｍＭのＥＤＴＡを含む同緩衝液２００ｍｌに懸濁させた。これにリゾチームを終濃度０．５ｍｇ／ｍｌとなるように添加し、３７℃で１時間保温した。これを超音波処理し、１５、０００ｇで１０分間遠心分離して上清１５０ｍｌを回収し、粗酵素抽出液とした。
【００３８】
ゼラチンの１０％水溶液５００ｍｌに天野製薬社製プロテアーゼＭを１ｇ添加し、ｐＨ５．５、５０℃で２４時間加水分解させた。加水分解液を８５℃で３０分加熱することにより酵素を失活させた後、水酸化ナトリウムでｐＨを８．０に調整した（反応液Ａ）。
２００ｍｌの反応液Ａに上記の粗酵素抽出液２０ｍｌを添加し、５０℃で２４時間加水分解させた（反応液Ｂ）。
反応液ＡおよびＢにつきケルダール法による全窒素（Ｔ−Ｎ）の分析とホルモール滴定法によるホルモール窒素（Ｆ−Ｎ）の分析を行い、両者の比より加水分解率を計算した。その結果、反応液Ｂは反応液Ａに比べて約２０％高い加水分解率を示した（表４）。
【００３９】
【表４】

【００４０】
【実施例３】
ゼラチンの１０％水溶液５００ｍｌに天野製薬社製プロテアーゼＭを１ｇ添加し、ｐＨ５．５、５０℃で２４時間加水分解させた。加水分解液を８５℃で３０分加熱することにより酵素を失活させた後、水酸化ナトリウムでｐＨを８．０に調整した（反応液Ｃ）。
２００ｍｌの反応液Ｃに、実施例２で得られた粗酵素抽出液５ｍｌを添加し、４０℃で２４時間加水分解させた（反応液Ｄ）。
反応液ＣおよびＤにつきケルダール法による全窒素（Ｔ−Ｎ）の分析とホルモール滴定法によるホルモール窒素（Ｆ−Ｎ）の分析を行い、両者の比より加水分解率を計算した。表４に結果を示した通り、反応液Ｄは反応液Ｃに比べて約１０％高い加水分解率を示した。
【００４１】
【実施例４】
ゼラチンの１０％水溶液５００ｍｌをｐＨ７．０に調整し、ノボ・ノルディスク社製フレーバーザイムを１ｇ添加して５０℃で２４時間加水分解させた。加水分解液を８５℃で３０分加熱することにより酵素を失活させた後、水酸化ナトリウムでｐＨを８．０に調整した（反応液Ｅ）。
２００ｍｌの反応液Ｅに、実施例２で得られた粗酵素抽出液５ｍｌを添加し、４０℃で２４時間加水分解させた（反応液Ｆ）。
反応液ＥおよびＦにつきケルダール法による全窒素（Ｔ−Ｎ）の分析とホルモール滴定法によるホルモール窒素（Ｆ−Ｎ）の分析を行い、両者の比より加水分解率を計算した。その結果、反応液Ｆは反応液Ｅに比べて約２０％高い加水分解率を示した（表４）。
【００４２】
【発明の効果】
Ｐｒｏ−Ｈｙｐのジペプチドを効率的に加水分解するプロリンジペプチダーゼが新たに見出され、これを用いることによりヒドロキシプロリンを含むタンパク質を高度に加水分解できる。
【００４３】
【図面の簡単な説明】
【図１】オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂクロマトグラフィーによるプロリンジペプチダーゼの分画パターンである。
【図２】オクチル−セファロースＣＬ−４Ｂクロマトグラフィーによるプロリンジペプチダーゼのリクロマトグラフのパターンである。
【図３】ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂクロマトグラフィーによるプロリンジペプチダーゼの分画パターンである。
【図４】Ｑ−セファロースＦＦクロマトグラフィーによるプロリンジペプチダーゼの分画パターンである。
【図５】スーパーロース１２１０／３０カラムによるゲル濾過クロマトグラフィーによるプロリンジペプチダーゼの分画パターンである。
【図６】ゲル濾過ＨＰＬＣにより求めたプロリンジペプチダーゼの分子量を示す。
【図７】ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により求めたプロリンジペプチダーゼサブユニットの分子量を示す。
【図８】等電点電気泳動により求めたプロリンジペプチダーゼの等電点を示す。
【図９】プロリンジペプチダーゼのｐＨ安定性を示す。
【図１０】プロリンジペプチダーゼのｐＨ特性を示す。
【図１１】プロリンジペプチダーゼの６０℃での熱失活曲線を示す。
【図１２】プロリンジペプチダーゼの温度特性を示す。[0001]
[Industrial application fields]
The present invention relates to a novel proline dipeptidase, a method for producing the peptidase, and a method for hydrolyzing proteins and peptides using the peptidase. The protein hydrolyzate is used as a seasoning and a seasoning raw material.
[0002]
[Prior art]
Protein hydrolysis is usually carried out by heating in the presence of high-concentration hydrochloric acid. By this method, seasonings, seasoning materials and food materials are produced from many protein materials. However, in the industry that handles these foods, with the increase in consumers' preference for natural products, a method that does not use hydrochloric acid as a chemical is becoming desirable. As an alternative to the hydrochloric acid hydrolysis method, a hydrolysis method using a proteolytic enzyme can be considered, but the cost of the enzyme is higher than that of hydrochloric acid, and the hydrolysis is performed to the same extent as when hydrolyzing with hydrochloric acid. Since it was difficult to increase the rate, there have been few examples that have been put to practical use so far.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
An object of the present invention is to find a novel peptidase that can be used for advanced hydrolysis of proteins, and to develop a method for highly hydrolyzing proteins using the same.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
One of the causes of the low hydrolysis rate of proteins due to enzymatic hydrolysis is the presence of proline and hydroxyproline residues in the protein. Proline and hydroxyproline are cyclic α-imino acids and have a three-dimensional structure different from other amino acids. Peptide bonds involving the imino and carboxyl groups of proline and hydroxyproline residues in proteins or peptides are less susceptible to hydrolysis by normal proteolytic enzymes. That is, when a protein is hydrolyzed with a normal proteolytic enzyme, the reaction ends when the proline residue part is hydrolyzed to a dipeptide or tripeptide state.
[0005]
As an enzyme that hydrolyzes a dipeptide containing a proline residue, a prolyl dipeptidase (also known as prolinase) that hydrolyzes a dipeptide having a Pro-X structure and a proline dipeptidase that hydrolyzes a dipeptide having an X-Pro structure (Also known as prolidase). Here, X represents a normal L-amino acid. The present inventors have found that a protein can be highly hydrolyzed by combining a hydrolysis process using a normal proteolytic enzyme and a hydrolysis process using an enzyme agent containing proline dipeptidase and prolyl dipeptidase, and a proline residue It was confirmed that efficient hydrolysis of the portion was important for advanced protein degradation, and its contents were disclosed in Japanese Patent Application No. 266467 in 1993.
[0006]
Although the above method can be applied to the hydrolysis of many proteins by enzymes, there is a problem in applying it to the hydrolysis of proteins containing a large amount of hydroxyproline such as collagen and gelatin. Many prolyl dipeptidases can hydrolyze Hyp-X in which proline is replaced by hydroxyproline in addition to the Pro-X dipeptide. Conversely, many proline dipeptidases cannot hydrolyze X-Hyp dipeptides. Although proline dipeptidase from the mammalian small intestine has been reported to hydrolyze Gly-Hyp (Sjoestroem et al., "Purification and specificity of pig intestinal prodise", Biochim, Biophysacta, Vol. 73-45). The activity of Gly-Pro is extremely low as compared with the case of hydrolyzing Gly-Pro, and the industrial production of large-scale enzymes such as microorganism-derived enzymes is impossible. Since proline dipeptidase derived from microorganisms known so far cannot hydrolyze X-Hyp, an enzyme derived from microorganisms capable of hydrolyzing X-Hyp has been desired.
[0007]
Further, most of hydroxyproline in collagen and gelatin is present in a state of binding to proline (Pro-Hyp state) (hereinafter, Hyp represents L-hydroxyproline), but a Pro-Hyp dipeptide is present. Since no peptidase that hydrolyzes has been reported so far, among peptidases that can hydrolyze X-Hyp, an enzyme that can also hydrolyze Pro-Hyp has been particularly desired.
[0008]
Thus, as a result of intensive studies, the present inventors have found that bacteria belonging to the genus Aureobacterium produce a proline dipeptidase that hydrolyzes a dipeptide having the structure of Pro-Hyp. By incorporating the hydrolysis step into the hydrolysis of the protein, it was confirmed that even a protein containing a large amount of hydroxyproline can be efficiently hydrolyzed, and the present invention has been completed.
That is, the present invention relates to a proline dipeptidase that hydrolyzes a dipeptide represented by Pro-Hyp and a method for producing the same, and a method for hydrolyzing proteins and peptides including collagen or gelatin using the peptidase.
[0009]
The proline dipeptidase of the present invention has the following characteristics.
(1) The activity of hydrolyzing Pro-Hyp per absorbance unit at 280 nm of the purified enzyme is 140 units ± 20 units.
(2) The activity of hydrolyzing Pro-Hyp is at least twice the activity of hydrolyzing Ser-Pro, Thr-Pro, Pro-Gly-Pro, Ala-Pro and Leu-Pro.
(3) The hydrolysis activity is not inhibited by EDTA, and the activity is not activated by Mn ions.
(4) Retains 90% or more of activity after heating at 60 ° C. for 30 minutes.
Preferably, in addition to the above, the molecular weight under non-denaturing conditions is 440,000 ± 20,000, and the subunit molecular weight is 40,000 ± 2,000 And the isoelectric point is 4.6 ± 0.2. Chloro It is a proline dipeptidase characterized by being inhibited by mercurobenzoic acid and orthophenanthroline.
[0010]
In the pyrroline dipeptidase of the present invention, the amino acid sequence of the N-terminal portion is preferably Met-Arg-Thr-Ala-Ser-Ile-Thr-Ile-Thr-Gly-Ala-Gln-Val.
These characteristics are measured by the method described in Examples described later.
An example of the proline dipeptidase of the present invention is a peptidase produced by Aureobacterium esteraromaticum IFO 3752. The molecular weight of this peptidase is about 440,000 (FIG. 6), and the molecular weight of the subunit is about 40,000 (FIG. 7). It is a proline dipeptidase that exhibits an isoelectric point of about 4.6 (FIG. 8) and hydrolyzes Ser-Pro, Leu-Pro and the like. In particular, it has hydrolytic activity also for dipeptides in which the C-terminal proline is replaced by hydroxyproline such as Pro-Hyp and Gly-Hyp, and in particular, it has high hydrolytic activity for Pro-Hyp dipeptides. It is novel in the point shown (Table 2). In addition, known proline dipeptidase derived from microorganisms requires manganese ions for the expression of the activity, and when no manganese ions are added, the hydrolysis reaction does not proceed efficiently and the activity is inhibited by a chelating agent such as EDTA. On the other hand, this enzyme does not require the addition of manganese ions, and it is also novel that its activity is not inhibited by EDTA (Table 3).
[0011]
The proline dipeptidase of the present invention is produced by inoculating a medium with a microorganism capable of producing a peptidase that hydrolyzes a Pro-Hyp dipeptide, culturing for a certain period of time, and then extracting the enzyme from the culture solution. can do. An example of such a competent microorganism is Aureobacterium esteromamaticum IFO 3752. This microorganism is a microorganism preserved by the Fermentation Research Institute, and anyone can receive the sale of this strain by requesting the same place. In the case of Aureobacterium esteraromaticum IFO 3752, the peptidase is inoculated by inoculating this bacterium into a medium containing glucose, peptone, yeast extract, corn steep liquor (CSL), etc., and aerobically cultivating at 28-30 ° C. for 1-3 days. Is produced. The peptidase accumulates somewhat in the culture supernatant, so it may be concentrated. However, when obtaining a large amount of enzyme, the bacterial cells are collected by centrifugation or the like, and subjected to ultrasonic treatment, osmotic shock treatment, It is desirable to extract the peptidase present in the cells by lysozyme treatment or surfactant treatment. Purification of enzymes that hydrolyze Pro-Hyp dipeptides from bacterial cell extracts using known methods such as fractionation with ammonium sulfate or acetone, hydrophobic chromatography, ion exchange chromatography, gel filtration chromatography, etc. can do.
[0012]
Screening for the proline dipeptidase of the present invention can be carried out by allowing a culture solution or cell extract of various microorganisms to act on a Pro-Hyp dipeptide and detecting the amount of proline and hydroxyproline released by the ninhydrin reaction or the like. Is possible. As another method, proline dipeptidase is screened using the hydrolysis of dipeptides such as Gly-Pro and Gly-Hyp as an index, and those that also act on Pro-Hyp out of the selected proline dipeptidases. You may choose.
[0013]
When hydrolyzing proteins and peptides using the proline dipeptidase of the present invention, it is not always necessary to purify the enzyme. If there are no factors that adversely affect the hydrolysis reaction or hydrolyzate and there is no problem with food hygiene, it is possible to use the crude product of the enzyme or the extract from the culture solution as it is for the reaction. .
[0014]
Although the method for hydrolyzing proteins and peptides using the proline dipeptidase of the present invention is not different from the reaction using known peptidases, the peptidase cannot hydrolyze oligopeptides having 3 or more amino acids. It is necessary to reduce the molecular weight of the protein in advance by a pretreatment step with a protease or the like so that the peptidase can sufficiently act. Examples of enzymes used for the pretreatment of such proteins include proteases and peptidases derived from the genus Aspergillus or Rhizopus, and Amano Pharmaceutical already has protease A, protease M, peptidase R and the like. Enzyme preparations and protease preparations such as actinase from Kaken Pharmaceutical are commercially available.
[0015]
When hydrolyzing proteins containing a large amount of proline and hydroxyproline such as collagen and gelatin, pretreatment is particularly important, and achievement of a higher hydrolysis rate is required for this pretreatment step. That is, the hydrolysis by the proline dipeptidase of the present invention strongly depends on the hydrolysis rate at the time when the molecular weight reduction step is completed, and the hydrolysis rate at this point is 30% or less (the average number of amino acids of the peptide is 3 In the above, since the increase in the hydrolysis rate by the peptidase is slight, it is preferable that 40% or more, more preferably 50% or more of peptide bonds are hydrolyzed at the end of the pretreatment step.
[0016]
Such a high hydrolysis rate can be achieved by treating the raw protein with multiple proteases and peptidases, but contains multiple proteases and peptidases simultaneously rather than using different protease formulations simultaneously or sequentially. Of course, it is advantageous to use a single protease preparation. An example of a protease preparation containing a plurality of proteases and a known peptidase simultaneously is Flavorzyme from NOVO NORDISK A / S (Denmark). The protease preparation is derived from Aspergillus oryzae and has a molecular weight of about 23 kD, about 27 kD, about 31 kD, about 32 kD, about 35 kD, about 38 kD, about 42 kD, about 47 kD, about 53 kD, and about 100 kD, respectively. At least five selected proteases and peptidases are included. Specifically, the molecular weights of the five proteases and peptidases are about 23 kD, about 31 kD, about 35 kD, about 38 kD, and about 53 kD, respectively. When pretreatment of proteins containing a large amount of proline and hydroxyproline, such as collagen and gelatin, is performed not only with a high hydrolysis rate in this step but also with the peptidase of the present invention. It has been found that the increase in decomposition rate is higher in the process.
[0017]
The hydrolysis step with the proline dipeptidase of the present invention may be performed after completion of the pretreatment reaction with a normal protease preparation. However, since the peptidase of the present invention is digested by the residual activity of the added protease preparation and its activity may be lost, it is possible to deactivate the protease by heating or the like when the pretreatment reaction is completed. It may be necessary.
[0018]
The hydrolysis with the proline dipeptidase of the present invention needs to be carried out at a reaction solution pH of 7 to 10, preferably 8 to 9, and a reaction temperature of 30 to 60 ° C, preferably 40 to 50 ° C. The proline dipeptidase of the present invention can hydrolyze Gly-Pro and Pro-Hyp, which are contained in a large amount in collagen and gelatin. The specificity to Pro-Hyp is particularly high, and the activity to hydrolyze this dipeptide is more than twice the activity to hydrolyze Ser-Pro, Thr-pro, Gly-Pro, Ala-Pro and Leu-Pro. Furthermore, normal proline dipeptidase requires manganese ions that are harmful to the human body for the expression of activity, but the proline dipeptidase of the present invention does not require manganese ions, so it is also suitable for producing food ingredients such as seasonings. ing.
Examples of the present invention are shown below, but the present invention is not limited thereto.
[0019]
【Example】
The properties of the enzymes obtained in the following examples were determined as follows.
(1) Measurement of protein mass
The purified enzyme was appropriately diluted with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and the absorbance at 280 nm was measured using a Shimadzu spectrophotometer UV-160A using the same buffer as a blank. The amount of protein was expressed in units of absorbance with 1 unit of protein contained in 1 ml of protein solution having an absorbance of 1 at 280 nm. One absorbance unit of the purified enzyme was equivalent to a protein mass of about 1.8 mg.
(2) Pro-Hyp hydrolysis activity
To 200 μl of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 5 mM Pro-Hyp, 100 μl of an enzyme solution with known absorbance at 280 nm (appropriately diluted with the same buffer as above) was added and reacted at 37 ° C. for 15 minutes. I let you. The reaction was stopped by adding 700 μl of 1M sodium acetate buffer (pH 2.8), 100 μl of 95% ethanol solution containing 10% ninhydrin was added, and ninhydrin reaction was carried out at 70 ° C. for 10 minutes to produce proline and hydroxy. Absorbance at 440 nm derived from proline was measured. As a standard solution, Pro-Hyp, which is a substrate, and an assumed hydrolyzate (an equimolar mixture of proline and ninhydrin) are appropriately mixed, and the above standard ninhydrin reaction is performed to create a standard curve. Based on the above, the hydrolysis rate of Pro-Hyp was determined. One unit of enzyme was defined as the amount of enzyme that hydrolyzes 1 μmol of Pro-Hyp in a reaction at 37 ° C. for 1 minute.
[0020]
(3) Substrate specificity
The ability to hydrolyze various peptides containing proline or hydroxyproline was examined. 100 μl of the above buffer containing 0.004 to 0.04 units of enzyme activity was added to 200 μl of 10 mM Tris-HCl buffer containing 5 mM of various peptides, and reacted at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction was stopped by adding 700 μl of 1 M acetate buffer (pH 2.8), 100 μl of 95% ethanol solution containing 10% ninhydrin was added, and the ninhydrin reaction was performed at 70 ° C. for 10 minutes to produce proline or hydroxyproline. The absorbance at 440 nm derived from was measured. On the other hand, the amount of proline and hydroxyproline released based on a standard curve prepared using proline, hydroxyproline, and a mixture of these was calculated, the hydrolysis rate of peptide bonds was calculated, and the hydrolysis activity against various peptides was compared. did.
[0021]
(4) Effects of inhibitors and metal ions
The effect of the inhibitor on the enzyme was examined as follows. Add a certain amount of various inhibitors to the enzyme solution to make 100 μl, let stand at room temperature for 20 minutes, add 200 μl of 5 mM substrate (Gly-Pro) containing the same concentration of inhibitor and react at 37 ° C. for 1 hour. It was. Thereafter, the amount of free proline was measured by carrying out a ninhydrin reaction under the acidity of acetic acid as described above. In addition, the enzymatic reaction was carried out in the presence of various metal ions, and the influence of metal ions was investigated.
(5) Optimum temperature and thermal stability
The enzyme is appropriately diluted with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), then treated at 60 ° C. for a certain period of time, and the enzyme activity to hydrolyze these Pro-Hyp is measured to determine thermal stability. It was. Moreover, it reacted for 10 minutes at various temperatures in the same buffer solution, and compared the activity which hydrolyzes Pro-Hyp.
[0022]
(6) Measurement of molecular weight
The molecular weight under non-denaturing conditions was measured by gel filtration using a Tosoh HPLC column G4000PWXL (inner diameter 7.8 mm × 30 cm). The column was equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 0.5 M KCl, and the purified enzyme solution was applied. The same buffer was flowed at 1.0 ml / min, and the eluate was monitored by absorbance at 280 nm. Next, as a molecular weight marker, Pharmacia Blue-dextrin (molecular weight 2,000,000), thyroglobulin (molecular weight 669,000), ferritin (molecular weight 440,000), aldolase (molecular weight 158,000), Gel filtration was performed on albumin (molecular weight 67,000) under the same conditions as above, and the molecular weight was measured from the obtained calibration curve.
[0023]
The molecular weight of the subunit of the enzyme was measured by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis using a fast system manufactured by Pharmacia. The gel used was a 10-15% gradient gel. As molecular weight markers, Pharmacia phosphorylase b (molecular weight 94,000), albumin (molecular weight 67,000), ovalbumin (molecular weight 43,000), carbonic anhydrase B (molecular weight 30,000), trypsin inhibitor (molecular weight 20) 100), α-lactalbumin (molecular weight 14,400), and the molecular weight was determined from a calibration curve determined from these migration positions.
[0024]
(7) Measurement of isoelectric point
The isoelectric point was determined by isoelectric focusing using a Pharmacia fast system. The gel uses IEF4-6.5 and is a glucose oxidase (isoelectric point 4.15), trypsin inhibitor (isoelectric point 4.55) manufactured by Pharmacia, which is an isoelectric point marker used as an internal standard, β -A calibration curve is obtained from lactalbumin (isoelectric point 5.20), bovine carbonic anhydrase (isoelectric point 5.85), human carbonic anhydrase (isoelectric point 6.55), etc. The electric point was obtained.
(8) Optimum pH and pH stability
The pH stability was determined by allowing the enzyme to stand at room temperature for 1 hour in various pH buffers, and then measuring the activity at pH 8.0. At that time, pH 3.5-5.5 is 50 mM sodium acetate buffer, pH 5.5-7.0 is 10 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0-9.0 is 10 mM Tris-HCl buffer, pH 9 1.0 to 10.5 used 10 mM sodium carbonate buffer.
[0025]
The optimum reaction pH of the enzyme was determined by allowing the reaction of hydrolyzing Pro-Hyp to be performed in the above buffer solution.
(9) N-terminal amino acid sequence
The amino acid sequence of the N-terminal portion was determined by Edman degradation of the purified enzyme and identification of PTH-amino acid using Perkin Elmer Applied Biosystems Protein Sequencer PROCISE492.
[0026]
[Example 1]
Aureobacterium estearomaticum IFO 3752 with 0.5% glucose, 2% polypeptone, 0.5% yeast extract, 2% CSL, 0.3% sodium chloride, dipotassium hydrogen phosphate A 10 liter jar fermenter containing 6 liters of a medium consisting of 2% magnesium sulfate heptahydrate 0.1% was inoculated and cultured at 30 ° C. for 20 hours with aeration and stirring. Bacteria were collected from the culture and washed twice with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) to obtain 89 g of wet cells. This was suspended in 400 ml of the same buffer containing 10 mM EDTA. To this was added lysozyme to a final concentration of 0.5 mg / ml, and the mixture was kept at 37 ° C. for 3 hours, and then 4 ml of 10% Triton X-100 aqueous solution was added. This was sonicated, centrifuged at 15,000 g for 10 minutes, and 350 ml of the supernatant was collected to obtain a crude enzyme extract.
[0027]
Acetone fractionation of the crude enzyme extract was performed as follows. To 350 ml of the crude enzyme extract, 175 ml of cold acetone was added and centrifuged (5,000 g, 10 minutes), and 455 ml of cold acetone was further added to the supernatant and centrifuged under the same conditions as above to collect the precipitate. The precipitate was dissolved in 50 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), centrifuged again (5,000 g, 10 minutes) to remove insoluble matters, 0.5 g of mannitol was added and dissolved, and then lyophilized. As a result, about 1.5 g of acetone fraction crude enzyme was obtained.
[0028]
A column packed with Pharmacia Octyl Sepharose CL-4B was equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 M ammonium sulfate. The total amount of the crude enzyme was dissolved in 100 ml of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing 1 M ammonium sulfate, and this was applied to the above column, and the enzyme was eluted with a concentration gradient of 1 → 0 M ammonium sulfate (total amount 500 ml). . The results of measuring the absorbance at 280 nm and the activity of hydrolyzing Pro-Hyp for each fraction are shown in FIG. The active fractions (fractions 37 to 54) were mixed, and the ammonium sulfate concentration was adjusted to 1 M using the electric conductivity as an index. This was applied again to the octyl sepharose column and eluted with a 1 → 0M ammonium sulfate concentration gradient (total volume 200 ml). The results are shown in FIG.
[0029]
The active fraction (fractions 19 to 25) was dialyzed against 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and applied to a DEAE Sepharose CL-6B column manufactured by Pharmacia equilibrated with the same buffer. → The enzyme was eluted with a concentration gradient of 1 M potassium chloride (total amount 200 ml) (FIG. 3). The active fractions (fractions 22 to 25) were collected, dialyzed against 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and applied to a Q-Sepharose FF column manufactured by Pharmacia that had been equilibrated with the same buffer. Then, the enzyme was eluted with a concentration gradient of 0 to 1 M potassium chloride (total amount 200 ml) (FIG. 4). Fraction 14 and 15 as active fractions were respectively sent from Amicon Co., Ltd. Centriflow CF25 (fraction molecular weight 25,000). Concentrated with. The concentrated solution of the fraction 14 was subjected to gel filtration using a Superose 12 HR10 / 30 column manufactured by Pharmacia and flowing a 10 mM Tris-HCl buffer solution (pH 8.0) containing 0.5 M potassium chloride (FIG. 5A). . The concentrated solution of Q-Sepharose fraction 15 was similarly subjected to gel filtration (FIG. 5B). Fractions 31 and 32 in FIG. 5A and fractions 30 and 31 in FIG. 5B were mixed, and concentrated and desalted by centriflow to obtain a purified enzyme solution.
The enzyme purification profile is shown in Table 1.
[0030]
[Table 1]

[0031]
As a result of analyzing the purified enzyme by 10-15% polyacrylamide gel electrophoresis (Pharmacia Fast System), it was confirmed that the purity was 95% or more. The specific activity of hydrolyzing Pro-Hyp of the purified enzyme was 140 units per absorbance unit at 280 nm.
The molecular weight of the obtained enzyme was estimated to be 440,000 ± 20,000 (FIG. 6), and the molecular weight of the subunit was estimated to be 40,000 ± 2,000 (FIG. 7). The isoelectric point of this enzyme was estimated to be 4.6 ± 0.2 (FIG. 8).
[0032]
Table 2 shows the results of examining the substrate specificity using the purified enzyme. This enzyme was a proline dipeptidase that hydrolyzes Ser-Pro, Thr-Pro, Gly-Pro, Ala-Pro, Leu-Pro and the like. This enzyme also showed a relatively strong hydrolysis activity against Pro-Pro, but did not act on Pro-Gly, which is a substrate for prolyl dipeptidase, or oligoproline, which is a substrate for aminopeptidase P. . Moreover, the activity with respect to N-terminal modification peptide was not recognized. This enzyme has a particularly strong hydrolysis activity for Pro-Hyp, and hydrolyses dipeptides such as Ser-Pro, Thr-Pro, Gly-Pro, Ala-Pro, and Leu-Pro, which are known substrates for known proline dipeptidases. More than twice the activity of decomposing. Furthermore, it also showed hydrolytic activity against Gly-Hyp, which was equal to or higher than the activity against Gly-Pro.
[0033]
[Table 2]

[0034]
Table 3 shows the results of examining the effects of various inhibitors and metal ions on this proline dipeptidase. Ordinary proline dipeptidase is a metalloenzyme having manganese as an active center, and is characterized in that its activity is inhibited by EDTA, which is a chelating agent, and its activity is activated by manganese ions. On the other hand, since the proline dipeptidase of the present invention is not inhibited at all by EDTA and is not activated by manganese, it is an enzyme whose characteristics are greatly different from those of known proline dipeptidases. Furthermore, this enzyme is PCMB (Parachloromercurobenzoic acid) It was considered that the enzyme has an SH group at the active center.
[0035]
[Table 3]

[0036]
This enzyme was stable in the range of pH 4 to 10 (FIG. 9), and the optimum pH for the reaction was 9.0 (FIG. 10). Further, the enzyme was stable against heat and retained 90% or more of activity after heating at 60 ° C. for 30 minutes (FIG. 11). The optimum working temperature was 45 ° C. (FIG. 12).
The amino acid sequence of the N-terminal part of this enzyme was Met-Arg-Thr-Ala-Ser-Ile-Thr-Ile-Thr-Gly-Ala-Gln-Val.
[0037]
[Example 2]
Aureobacterium esteraromaticum IFO 3752, 0.5% glucose, 1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.3% non-fat cottonseed flour, 0.2% sodium chloride 0.3% dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate One liter of a medium consisting of 0.1% heptahydrate was inoculated and cultured at 28 ° C for 3 days with shaking. The cells were collected from the culture, washed twice with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.0), and suspended in 200 ml of the same buffer containing 10 mM EDTA. Lysozyme was added to this so as to have a final concentration of 0.5 mg / ml, and kept at 37 ° C. for 1 hour. This was sonicated and centrifuged at 15,000 g for 10 minutes to recover 150 ml of the supernatant, which was used as a crude enzyme extract.
[0038]
1 g of protease M manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd. was added to 500 ml of a 10% gelatin aqueous solution and hydrolyzed at pH 5.5 at 50 ° C. for 24 hours. The enzyme was inactivated by heating the hydrolyzed solution at 85 ° C. for 30 minutes, and then the pH was adjusted to 8.0 with sodium hydroxide (reaction solution A).
20 ml of the above crude enzyme extract was added to 200 ml of reaction solution A, and hydrolyzed at 50 ° C. for 24 hours (reaction solution B).
The reaction liquids A and B were analyzed for total nitrogen (TN) by the Kjeldahl method and formol nitrogen (FN) by the formol titration method, and the hydrolysis rate was calculated from the ratio of the two. As a result, the reaction solution B showed about 20% higher hydrolysis rate than the reaction solution A (Table 4).
[0039]
[Table 4]

[0040]
[Example 3]
1 g of protease M manufactured by Amano Pharmaceutical Co., Ltd. was added to 500 ml of a 10% gelatin aqueous solution and hydrolyzed at pH 5.5 at 50 ° C. for 24 hours. The enzyme was inactivated by heating the hydrolyzed solution at 85 ° C. for 30 minutes, and then the pH was adjusted to 8.0 with sodium hydroxide (reaction solution C).
To 200 ml of reaction solution C, 5 ml of the crude enzyme extract obtained in Example 2 was added and hydrolyzed at 40 ° C. for 24 hours (reaction solution D).
The reaction liquids C and D were analyzed for total nitrogen (TN) by the Kjeldahl method and formol nitrogen (FN) by the formol titration method, and the hydrolysis rate was calculated from the ratio of the two. As shown in Table 4, the reaction solution D showed a hydrolysis rate about 10% higher than that of the reaction solution C.
[0041]
[Example 4]
500 ml of a 10% aqueous solution of gelatin was adjusted to pH 7.0, 1 g of flavorzyme manufactured by Novo Nordisk was added and hydrolyzed at 50 ° C. for 24 hours. The enzyme was deactivated by heating the hydrolyzed solution at 85 ° C. for 30 minutes, and then the pH was adjusted to 8.0 with sodium hydroxide (reaction solution E).
To 200 ml of reaction solution E, 5 ml of the crude enzyme extract obtained in Example 2 was added and hydrolyzed at 40 ° C. for 24 hours (reaction solution F).
The reaction liquids E and F were analyzed for total nitrogen (TN) by the Kjeldahl method and formol nitrogen (FN) by the formol titration method, and the hydrolysis rate was calculated from the ratio of the two. As a result, the reaction solution F showed about 20% higher hydrolysis rate than the reaction solution E (Table 4).
[0042]
【The invention's effect】
A new proline dipeptidase that efficiently hydrolyzes the dipeptide of Pro-Hyp has been found, and by using this, a protein containing hydroxyproline can be highly hydrolyzed.
[0043]
[Brief description of the drawings]
FIG. 1 is a fractionation pattern of proline dipeptidase by octyl-Sepharose CL-4B chromatography.
FIG. 2 is a rechromatographic pattern of proline dipeptidase by octyl-Sepharose CL-4B chromatography.
FIG. 3 is a fractionation pattern of proline dipeptidase by DEAE-Sepharose CL-6B chromatography.
FIG. 4 is a fractionation pattern of proline dipeptidase by Q-Sepharose FF chromatography.
FIG. 5 is a fractionation pattern of proline dipeptidase by gel filtration chromatography using Superose 12 10/30 column.
FIG. 6 shows the molecular weight of proline dipeptidase determined by gel filtration HPLC.
FIG. 7 shows the molecular weight of proline dipeptidase subunit determined by SDS polyacrylamide gel electrophoresis.
FIG. 8 shows the isoelectric point of proline dipeptidase determined by isoelectric focusing.
FIG. 9 shows the pH stability of proline dipeptidase.
FIG. 10 shows the pH characteristics of proline dipeptidase.
FIG. 11 shows a heat inactivation curve of proline dipeptidase at 60 ° C.
FIG. 12 shows the temperature characteristics of proline dipeptidase.

Claims

A proline dipeptidase having the following characteristics.
(1) The activity of hydrolyzing Pro-Hyp per absorbance unit at 280 nm of the purified enzyme is 140 units ± 20 units.
(2) The activity of hydrolyzing Pro-Hyp is at least twice the activity of hydrolyzing Ser-Pro, Thr-Pro, Pro-Gly-Pro, Ala-Pro and Leu-Pro. However, Hyp is L-hydroxyproline.
(3) The hydrolysis activity is not inhibited by EDTA, and the activity is not activated by Mn ions.
(4) Retains 90% or more of activity after heating at 60 ° C. for 30 minutes.
(5) Stable at pH 4-10.
(6) The molecular weight under non-denaturing conditions is 440,000 ± 20,000, and the molecular weight of the subunit is 40,000 ± 2,000.
(7) The isoelectric point is 4.6 ± 0.2.

Proline dipeptidase as claimed in claim 1, wherein the receiving the inhibition by para-chloro Makyuro acid and ortho-phenanthroline.

The prolineage according to claim 1 or 2, wherein the amino acid sequence of the N-terminal part is Met-Arg-Thr-Ala-Ser-Ile-Thr-Ile-Thr-Gly-Ala-Gln-Val. Peptidase.

The proline dipeptidase according to any one of claims 1 to 3 , which is produced from a bacterium belonging to the genus Aureobacterium.

The proline dipeptidase according to claim 4, wherein the bacterium belonging to the genus Aureobacterium is Aureobacterium estellaromaticum.

A proline dipeptidase having the ability to produce the proline dipeptidase according to claim 1 and inoculating a culture with a microorganism belonging to the genus Aureobacterium, and recovering the proline dipeptidase from the culture Manufacturing method.

A method for hydrolyzing proteins and peptides containing collagen or gelatin, comprising a hydrolysis step using the proline dipeptidase according to claim 1.

The hydrolysis method according to claim 7 , further comprising a hydrolysis step using Flavorzyme (trademark) as a pretreatment step and / or a posttreatment step of the hydrolysis step using proline dipeptidase.

8. The hydrolysis according to claim 7, wherein a step of preliminarily deproteinizing the protein using protease and / or peptidase is performed as a pretreatment step and / or a posttreatment step of the hydrolysis step using proline dipeptidase. Disassembly method.