JP2619911B2

JP2619911B2 - 網状赤血球測定装置用標準血液

Info

Publication number: JP2619911B2
Application number: JP63086915A
Authority: JP
Inventors: 知之黒田
Original assignee: 東亜医用電子株式会社
Priority date: 1988-04-08
Filing date: 1988-04-08
Publication date: 1997-06-11
Anticipated expiration: 2012-06-11
Also published as: JPH01259261A

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は血液の前処理（希釈・染色・反応処理等）機
能も有する網状赤血球測定装置の精度管理や感度校正等
に使用される標準血液に関する。

（従来の技術）血液中の未成熟の赤血球は網状赤血球（レチクロサイ
ト,Reticulocyte）と呼ばれ、全赤血球数中に通常0.7〜
2.2％含まれる。網状赤血球数を測定することは急性内
出血、溶血性貧血、再生不良性貧血その他の疾病の診断
を裏付けること、あるいは薬剤投与後の経過を監視する
こと等に役立ち、臨床検査分野において重要視されてい
る。

この網状赤血球係数を自動化する方法もいくつか提案
されており、たとえば、特開昭61−280565号公報および
特開昭62−34058号公報には、オーラミンＯ（Auramin
O）を含有する蛍光染色試薬を用いてフローサイトメト
リーにより網状赤血球を計数する技術が示されている。

上記フローサイトメトリーによる測定において常に正
確な計数結果を得るためには、種々の測定条件を常に安
定に保つ必要がある。フローサイトメトリーの測定結果
に影響を与える変動要因としては、測定用試料の保存時
の変化、測定用試薬の性能変化、反応温度等の反応条件
の変動、測定用光源の出力変動、流体部品や光学部品の
汚れ等々がある。

これらの条件が安定に保たれているかを確認するため
に、また必要であれば正常な測定信号強度を得るために
装置の感度調整をやり直すために、標準物質を測定する
ことも良く行われる。フローサイトメトリーにおける精
度管理用あるいは感度調整用の標準物質としては蛍光ラ
テックスビーズが一般に用いられている。しかし、蛍光
ラテックスビーズは予めラテックスビーズの表面に蛍光
物質を付着させたものであり、装置の光学系および信号
処理系から所定の蛍光信号強度の出力が得られるかを確
認するのには適当であるが、装置の蛍光染色系が正常に
機能しているか否かを確認する目的には使用できない。
たとえば染色試薬の劣化等が起こっていても、それを検
出することは不可能である。

（発明が解決しようとする課題）上記問題を解決するためには、測定対象の細胞と同様
に蛍光染色され、蛍光信号が検出され得る、安定な物質
が必要である。測定対象が血球の場合には、血球を固定
したものが標準物質の候補としてあげられる。しかし、
市販の血球計数装置用コントロール血液などの従来開発
された固定血球は全て、測定対象とする血球たとえば網
状赤血球のみが特異的に染色されるのでは無く、他の血
球も非特異的に染色されるので、フローサイトメトリー
用の標準物質としては使用できなかった。

本発明は基本的には網状赤血球のみが特異的に染色さ
れ、フローサイトメトリー用の標準物質として使用し得
る標準血液を提供することを目的とする。

（課題を解決するための手段）本発明は上記課題を解決するために下記標準血液を提
供する。

（１）多官能基性アルデヒドで血球の固定操作を行っ
た後、式RNH₂（ここでＲは水素または炭素数１〜10のア
ルキルである）のアミンの溶液で洗浄することにより作
製されることを特徴とする網状赤血球測定装置用標準血
液。

（２）Ｒが水素である第１項に記載の標準血液。

（３）Ｒが炭素数１〜10のアルキル基である第１項に
記載の標準血液。

（４）該アミン溶液の濃度が0.01〜0.05Mである第１
項ないし第３項のいずれかに記載の標準血液。

（５）多官能基性アルデヒドが下式で表されるもので
ある第１項ないし第４項のいずれかに記載の標準血液。

HOC−（CH₂）ｎ−CHO （ただし、ｎ＝０〜６である。）ここで、ｎが７以上の上記式のアルデヒドは水に対す
る溶解度が低下するので使用できない。

（６）多官能基性アルデヒドが下式で表されるもので
ある第１項ないし第４項のいずれかに記載の標準血液。

CH₂＝CH−CHO （７）多官能基性アルデヒドが、精製され、重合等に
よる変性を抑制されたものである第１項ないし第６項の
いずれかに記載の標準血液。

本明細書に使用される多官能基性アルデヒドとは、少
なくとも１つのホルミル基（−CHO）を有し、さらにア
ミノ基等の水素を官能基と反応（結合）する１つ以上の
官能基を有する化合物をいう。

（作用）以下、本発明における血球の固定反応を第１図〜第８
図に示す模式図を参照して説明する。図中における各記
号の意味を表１に示す。

なお、表１中の多官能基性アルデヒドとしては、例え
ば、２価アルデヒドであるジアルデヒド（CHO−（CH₂）
ｎ−CHO,n＝０〜６）、およびアルデヒドとしては一価
のアクロレイン、ホルムアルデヒドであげられる。アク
ロレインはCH₂＝CH−CHOで表わされる一価アルデヒドで
あるが、アミノ基とマイケル付加を行うという意味で架
橋剤（固定剤）としてはジアルデヒドと等価に扱われて
いる。

ホルムアルデヒドはＨ−CHOで表わされる一価アルデ
ヒドであるが、実際の溶液は重合体の混合物であり、ポ
リオキシエチレン−CH₂O−CH₂O−CH₂O−、ポリヒドロキ
シアルデヒド−CHOH−COHO−CHOH−及び環状重合体等の
混合物となり、固定剤として見た場合多官能性である。

第１図は固定処理前の血球の膜蛋白の様子を示す模式
図である。上記血球を固定処理せぬまま染色処理を行っ
た結果を第２図の模式図に示す。染料はカチオン部位を
有しているため、膜蛋白のアニオン部位と結合する。こ
の場合の染料の状態を［Ｆ］−で表わす。蛍光発光部
位は図中の記号を○で囲って示されている（以下の図も
同様）。細胞内にRNAが存在している場合には、染料はR
NAに結合する。これが本発明で本来目的とする染色であ
り、特異染色と呼ぶ。その蛍光発光部位を第２図におい
ては特に◎で囲って示している。本発明で対象とする網
状赤血球測定用染料は細胞内のRNAと結合して網状赤血
球を特異的に染色し、蛍光を特異的に発光させるもので
ある。その蛍光の信号強度を検出することにより、網状
赤血球は基本的には他の血球から識別される。ところ
が、上記のように血球の膜蛋白が染色されると網状赤血
球以外からも蛍光が発光され、網状赤血球の識別に悪影
響を与える。このように特異的な染色部位以外の細胞部
位が染色されることを非特異染色と呼ぶ。実際の染色処
理においては、こ非特異染色を極力抑えるように、染色
液のpHを最適に調節する。なお、上記カチオン部位とア
ニオン部位との結合による特異染色及び非特異染色は、
以下に記述する固定処理を行った場合にも常に起こって
いるが、第３図〜第８図においてはその部分の記載を省
略している。

次に、精製したグルタルアルデヒド（またはアクロレ
イン）を用いて血球を固定処理した結果を第３図の模式
図に示す。グルタルアルデヒドの架橋剤としての作用に
より蛋白分子が結合され強固な構造となっている。これ
により、血球の長期保存、形態保持が可能となってい
る。一方、架橋に用いられなかったアミノ基は、全てグルタルアムデヒドのホルミル基→に置き換え
られる。その結果、シッフ反応を起こすと蛍光性を示す
血球内の蛋白との縮合反応すなわちシッフ（Schiff）反応が起こり、
蛍光性物質を生成してしまう。これによる蛍光は自家蛍
光（蛍光染色によらないという意味での自家蛍光）と呼
ばれるものの一種であり、網状赤血球測定に悪影響を与
える。上記固定処理後、染色処理を行った結果を第４図
の模式図に示す。ほとんどの染料はアミノ基を有するの
で、ホルミル基と染料によるシッフ反応が起こり、非特
異の蛍光が発光されてしまう。なお、前述の染料オーラ
ミンＯはアミノ基を持たないが、反応途中の中間生成体
がシッフ反応をすることが知られている。

次に、精製しないクルタルアルデヒド（または、その
他の二価アルデヒド、アクロレイン、ホルムアルデヒ
ド）を用いて血球を固定処理した結果を第５図の模式図
に示す。固定のための架橋は精製したものによる場合と
同様に起こるが、分子が長いため架橋部位が異なる。ま
た、実際に架橋を行う重合体の一分子当りではホルミル
基の量が増加しているため、自家蛍光の原因となる血球
内蛋白との結合が増加している。上記固定処理後、染色
処理を行った結果を第６図の模式図に示す。架橋に用い
られた分子当りのホルミル基が多いためシッフ反応によ
る非特異蛍光が増加する。

次に、精製したグルタルアルデヒド（またはアクロレ
イン）を用いて血球を固定処理した後、アミン溶液で洗
浄した結果を第７図の模式図に示す。ホルミル基とアミ
ンとによるシッフ反応が起こっている。この状態で染料
を加えても、染料とのシッフ反応は起こらないので、シ
ッフ反応による非特異染色は起こらず、第７図の状態は
変わらない。

次に、精製しないグルタルアルデヒドを用いて血球を
固定処理した後、アミン溶液で洗浄した結果を第８図の
模式図に示す。ホルミル基とアミンとによるシッフ反応
が第７図と同様に起こっている。この状態で染料を加え
ても、染料とのシッフ反応は起こらないので、精製した
グルタルアルデヒドを用いた場合と同様にシッフ反応に
よる非特異染色は起こらず、第８図の状態は変わらな
い。ところが、前述のように精製したグルタルアルデヒ
ドを用いた場合と比べて、精製しないグルタルアルデヒ
ドを用いた場合の方がホルミル基の量が多く、アミン洗
浄を行っても、洗浄前に起こる自家蛍光の原因となる細
胞内蛋白との結合は阻止できないので、自家蛍光が増大
する。

以上を整理して述べる。グルタルアルデヒドで血球を
固定処理した後、アミン溶液で洗浄すると、膜蛋白にお
けるシッフ反応による染料非特異染色が阻止される。そ
の際、精製したグルタルアルデヒドを用いた方が、シッ
フ反応を起こすと蛍光性を示す血球内蛋白との結合が少
なくなり、自家蛍光が減少する。上記の結果、血球から
の自家蛍光および非特異蛍光が抑えられ、網状赤血球内
のRNAのみが特異染色されて、蛍光側光による網状赤血
球の識別が可能となる。

このようにして、網状赤血球のみが染料によって特異
的に蛍光染色される血液が得られ、網状赤血球測定装置
の精度管理や感度調整用として適当な標準物質が実現さ
れる。

なお、洗浄に用いるアミン水溶液としては式RNH₂（こ
こでＲは水素または炭素数１〜10のアルキル基である）
のアミンの水溶液が使用可能である。１級アミンのうち
分子量の小さいものは揮発性があり使用しにくいが、水
溶液としては使用できる。このアミンの濃度は、通常１
％程度の濃度で用いるグルタルアルデヒド（0.1M）を中
和するのであるから、0.01〜0.05M程度のもので充分で
ある。また、酸性条件下でアンモニウム化した場合、赤
血球を溶血する恐れがあるので、アミン溶液は中性以上
のpHで低濃度で使用することが望ましい。ちなみに芳香
族アミンは水に対する溶解度の点から、使用しにくい
（ただし、芳香族アミンもアンモニウム化されると良く
溶ける）。また、芳香族アミンはシッフ反応後蛍光性物
質を生成し易い。例えばアニリンとホルムアルデヒドと
を反応させると次式の如く蛍光性物質が沈澱する。

従って、実際には使用不可能である。脂肪族アミンを
アルキル鎖が長くなる程、溶けにくくなる。以上を総合
すると、0.01〜0.05M程度の濃度でＲが炭素数１〜10の
脂肪族アミンを使用するのが好ましいと言える。

（実施例）以下の実施例により本発明は詳しく説明されるが、こ
れらに限定されるものではない。

参考例1. 未精製グルタルアルデヒドによる血球の固定（従来
法）を以下の手順で行った。

A.pH7.4の等張リン酸緩衝液100mlにEDTA抗凝固ヒト新鮮
血1mlを加え、４℃に冷却する。

B.市販一級グルタルアルデヒド（25％水溶液:2.5Mol/
）4mlにpH7.4の等張リン酸緩衝液96mlを加え、0.1Mol
/mlのグルタルアルデヒド溶液とする。

C.Aで調製した希釈血液を４℃で（マグネチックスター
ラーを用い）ゆるやかに撹拌しながら、Ｂで調製した固
定液40mlを滴下漏斗を用い約90分かけて加える。

D.4℃で２時間さらに撹拌を続け固定反応を行なわせ
る。

E.この希釈固定血球を1600rpmで５分間遠心分離機にか
け、約140mlの上清を捨てる。

F.沈澱した血球に約140mlのpH7.4の等張リン酸緩衝液を
加え、ボルテックス・ミキサーで血球を再浮遊させる。

G.E.Fの操作をさらに１回繰り返し、さらにＥの操作を
行ない、約1mlの固定血球を得た。

H.この固定血球を全自動網赤血球測定装置（型名Ｒ−10
00^TM:東亜医用電子（株）製）により測定した。測定結
果を図９に示した。図中横軸は蛍光相対強度であり、縦
軸は前方散乱光相対強度であり図中の各点が細胞１個に
対応する。（図10ないし12においても同様である。）実施例1. 精製グルタルアルデヒドによる固定を次の手順で行っ
た。

A.グルタルアルデヒドの精製グルタルアルデヒドの精製は常法により、下記の如く
行なった。

市販一級グルタルアルデヒド（25％）500mlに活性炭
微粉末10gを加え、よく振とうし、30分放置し、酸性不
純物を活性炭に吸着させた後、過により活性炭を除去
した。

このグルタルアルデヒドを精留塔を付した丸底フラス
コに取り、窒素気流下で減圧蒸留し、bp71〜72℃/10mmH
gの留分80mlを得た。

この精製グルタルアルデヒドは密栓し４℃に冷蔵保存
し、使用直前に0.22μのフィルターで過したものを用
いた。

B.血球の固定参考例１と同様に行なった。

C.この固定血球の測定結果を図10に示した。

実施例2. A.上記実施例１で得られる固定血球1mlに0.26％オクチ
ルアミン水溶液（0.02Mol/）10mlを加え、４℃で30分
間（マグネチックスターラで）ゆるやかに撹拌した。

B.この希釈固定血球を1600rpmで５分間遠心分離機にか
け、約10mlの上清を捨てる。

C.沈降した血球に約100mlのpH7.4の等張リン酸緩衝液を
加え、ボルテックス・ミキサー（Voltex・Mixer）で血
球を再浮遊させる。1600rpmで５分間遠心分離機にか
け、約100mlの上清を捨てる。

D.Cの操作をさらに１回繰り返えし、血球をボルテック
ス・ミキサーで再浮遊し、固定血球を得た。

E.この固定血球の測定結果を図11に示した。

なお、第12図に未固定の新鮮血の測定結果を参考とし
て示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は固定処理前の血球の膜蛋白の様子を示す模式図
である。第２図は血球を固定処理せぬまま染色処理を行なった場
合の血球の細胞膜とその内外の様子を示す模式図であ
る。第３図は精製したグルタルアルデヒド（またはアクロレ
イン）を用いて血球を固定処理した場合の血球の細胞膜
とその内外の様子を示す模式図である。第４図は血球を固定処理後染色処理した場合の様子を示
す模式図である。第５図は精製しないグルタルアルデヒド（または、その
他の二価アルデヒド、アクロレイン、ホルムアルデヒ
ド）を用いて血球を固定処理した結果を示す模式図であ
る。第６図は上記固定処理後、染色処理を行った結果を示す
模式図である。第７図は精製したグルタルアルデヒド（またはアクロレ
イン）を用いて血球を固定処理した後、アミン溶液で洗
浄した結果を示す模式図である。第８図は精製しないグルタルアルデヒドを用いて血球を
固定処理した後、アミン溶液で洗浄した結果を示す模式
図である。第９図は参考例１において測定した未精製グルタルアル
デヒドによる固定血球の蛍光相対強度及び前方散乱光相
対強度を示す分布図である。第９図において向って左下
の集団は血小板を示し、右上の集団は成熟赤血球と網状
赤血球との集団を示す。第10図は実施例１において測定した精製グルタルアルデ
ヒドによる固定血球の蛍光相対強度及び前方散乱光相対
強度を示す分布図である。図中ａの領域は成熟赤血球を示し、ｂの領域は網状赤血
球を示し、ｃの領域は血小板を示す。第11図は実施例２において測定されたアミン洗浄を施し
た固定血球の分布図である。図中a,bおよびｃは上記定
義どおりである。第12図は新鮮血（未固定）の分布図である。図中左側上
方の集団は赤血球であり、図中a,bおよびｃは上記定義
のとおりである。ｂ領域は特異蛍光領域を示す。

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】多官能基性アルデヒドで血球の固定操作を
行った後、式RNH₂（ここでＲは水素または炭素数１〜10
のアルキルである）のアミンの溶液で洗浄することによ
り作製されることを特徴とする網状赤血球測定装置用標
準血液。
【請求項２】Ｒが水素である第１項に記載の標準血液。
【請求項３】Ｒが炭素数１〜10のアルキル基である第１
項に記載の標準血液。
【請求項４】該アミン溶液の濃度が0.01〜0.05Mである
第１項ないし第３項のいずれかに記載の標準血液。
【請求項５】多官能基性アルデヒドが下式で表されるも
のである第１項ないし第４項のいずれかに記載の標準血
液。 HOC−（CH₂）ｎ−CHO ただし、ｎ＝０〜６
【請求項６】多官能基性アルデヒドが下式で表されるも
のである第１項ないし第４項のいずれかに記載の標準血
液。 CH₂＝CH−CHO
【請求項７】多官能性アルデヒドが、精製され、重合等
による変性を抑制されたものである第１項ないし第６項
のいずれかに記載の標準血液。