JP2611193B2 - Atp再生産生物反応器 - Google Patents

Atp再生産生物反応器

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JP2611193B2 JP24680484A JP24680484A JP2611193B2 JP 2611193 B2 JP2611193 B2 JP 2611193B2 JP 24680484 A JP24680484 A JP 24680484A JP 24680484 A JP24680484 A JP 24680484A JP 2611193 B2 JP2611193 B2 JP 2611193B2
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  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
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Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は、生体反応に必須な高エネルギーリン酸化合
物であるアデノシン3リン酸(ATP)を再生産する生物
反応器に関する。
[従来の技術] 従来から、ATPの再生産には酵素法、菌体法などが採
用されている。
たとえば酵素法においては、ATP再生酵素として式
(1)を触媒とするアデニル酸キナーゼと、式(2)を
触媒とする酢酸キナーゼが一般に使用されている。
AMP+ATP2ADP (1) ADP+アセチルリン酸ATP+酢酸 (2) 第2図に酵素法を用いたATP再生産生物反応器のブロ
ック図を示す。図において(1)はリアクター本体、
(2)および(3)はそれぞれ固定化されたアデニル酸
キナーゼおよび酢酸キナーゼ、(4)は原料であるアセ
チルリン酸とアデノシンモノリン酸(AMP)とアデノシ
ンジリン酸(ADP)とを入れたリザーバー、(5)はポ
ンプ、(6)は生成物であるATPを酢酸から分解するセ
パレーター、(7)は再生産されたATP用のリザーバー
である。
つぎに実際の動作について説明する。
ATPの再生産はAMPに2個のリン酸を導入するか、ADP
にリン酸を1個導入することによりなされる。リアクタ
ー内ではAMPは式(1)に従い、ATPによりADPになり、
さらにADPはアセチルリン酸によりリン酸化され、ATPが
再生される。
第2図にもとづいて説明すると、リザーバー(4)中
のADP、AMP、アセチルリン酸は、ポンプ(5)によって
リアクター(1)に導入され、固定化アデニル酸キナー
ゼ(2)および固定化酢酸キナーゼ(3)の両固定化酵
素によって、ATPと酢酸とに変換される。ATPはセパレー
ター(6)によって酢酸と分離され、リザーバー(7)
に蓄えられる。
一方、菌体法においては、イースト菌を乾燥させた粉
末にグルコースなどを与え、粉末中に残存する解糖系酵
素の働きによりグルコースを酸化し、そのエネルギーを
利用してAMP、ADPよりATPを生産する。一般にバッチ式
のリアクターが用いられる。
[発明が解決しようとする問題点] 従来の酵素法によるATP再生産生物反応器は以上の様
な構成になっているため、ATP再生産には、原料として
アセチルリン酸を代表とするリン酸化合物を投入する必
要がある。しかし、アセチルリン酸は不安定であり、し
かも価格が高価であるなどの問題がある。
また菌体法によるばあいも同様に原料のグルコースが
高価であり、さらに生成物中からATPを回収したり、精
製したりするのにコストや時間がかかり、またバッチ式
であるため制御が困難であるなどの問題がある。
本発明は上記のような従来の装置の欠点を解決するた
めになされたものである。
[課題を解決するための手段] 本発明は、ATP再生酵素としてATP合成酵素(Adenosin
etriphosphatase:ATPase)を用い、この酵素を平面脂質
2重層膜に導入して形成した平面膜を積層してリアクタ
ー内に構築し、さらにATPを再生するエネルギーとして
外部からの物理エネルギーを用いることを特徴とするAT
P再生産生物反応器に関し、生体膜に局在するATPaseを
導入した平面脂質2重層膜をリアクター内で積層し、AT
P再生のエネルギーとして外部から物理エネルギーを加
え、それぞれの膜の両側にプロトン勾配や膜電位を発生
させることによってADPとリン酸とからATPを再生産する
ATP再生産生物反応器であり、従来のATP再生産生物反応
器にかわる新しい概念のATP再生産生物反応器を提供す
るものである。
[実施例] 本発明の生物反応器の原理を説明する。
ATPは生体内で解糖系と酸化的リン酸化を代表とする
エネルギー代謝系によって、ADPまたはAMPから再生産さ
れるが、グルコースあたりのATP生成量で比較すると、
酸化的リン酸化の方が解糖系よりも高効率である。この
酸化的リン酸化で、ATPを直接ADPとリン酸から生成する
酵素がATPaseである。このATPaseは、生体の細胞膜に局
在しており、ATPの合成だけではなく、逆にATPを加水分
解することによって、イオン、基質の能動輸送のための
エネルギーなどを供給することもできる。
ATPを合成するエネルギーとしては、膜の内側と外側
でのプロトンイオンの差(ΔpH)または電位差(膜電
位)が必要である。生きた細胞中では、ΔpHや膜電位は
有機物の酸化、光反応によるH2Oの分解、電子伝達系な
どによって供給されるが、人工的にΔpHや膜電位を生き
た細胞膜に与えてもATPが生成することが観察されてい
る(香川端雄:生体膜と生体エネルギー、東大出版
会)。
本発明はこの様な原理を応用したものであり、生体膜
のかわりに、ATPaseを導入、再構成した脂質2重層膜を
用いる。ATPの再生効率を上げ、強度を与えるため多孔
性高分子シートを担体として、脂質2重層膜を平面的に
構築し、この平面膜をリアクター内に積層して用いる。
このようにすることにより、電界などによる外部エネル
ギーが生体膜やリポソームと比較して、さらに効率よく
それぞれの膜に加わり、ATP再生量が増大し、かつ固定
式であるため連続的なATPの再生が可能になる。
つぎに本発明の生物反応器の一実施態様をブロック図
(第1図)にもとづき説明する。
第1図において(1)はリアクター、(8)はATPase
を導入した平面脂質2重層膜と、この膜を保持する多孔
性高分子シートからなる平面膜、(9)は電界をかける
ための電極、(10)はその電源、(4)は原料であるAD
Pおよびリン酸のリザーバー、(5)は原料をリアクタ
ー内に導くポンプ、(7)はATPを蓄えるリザーバーで
ある。
第3図はATPaseを導入した平面膜(8)のミクロな模
式図であり、(11)は平面脂質2重層膜、(12)はATPa
se、(13)は平面膜を保持する多孔性高分子シートであ
る。
本発明に用いる平面脂質2重層膜とは、天然脂質また
は合成脂質などの脂質から形成された2重層膜であり、
通常2重層膜としての厚さが1〜50nm程度のものであ
る。その平面脂質2重層膜はATPaseを保持し、ATP合成
に必要なプロトン勾配や膜電位を形成する働きをする。
ATPaseは、ミトコンドリア、細菌膜、葉緑体などいず
れから抽出したものでもよいが、安定性は好熱性生物由
来のATPaseが最も高い。
前記平面脂質2重層膜を保持するための多孔性高分子
シートの材質としては、テフロンなどのフッ素系樹脂シ
ートが用いられるが、これらに限定されるものではな
い。該シートの厚さとしては10〜1000μm程度のものが
用いられ、また該シートには平面脂質2重層膜を保持す
るために、孔径が0.01〜5.0mm程度の孔が0.01〜0.8m2/m
2程度設けられている。前記説明においては多孔性高分
子シートを用いたばあいについて説明したが、第4図に
示すような多孔性マイクロカプセルに平面脂質2重層膜
を保持させてもよく、このようにするとリポソームの同
様な動作で、より安定にATPを再生することができる。
なお第4図において(14)はATPaseを導入した平面脂質
2重層膜、(15)はマイクロカプセル本体である。
本発明においては、前記のごとき多孔性高分子シート
(13)とATPase(12)の導入された平面脂質2重層膜
(11)とから平面膜(8)が形成されてもよく、このよ
うにして形成された平面膜(8)は通常リアクター内に
平面膜間の間隔が0.1〜5mm程度になるように、2〜数百
層程度積層されATPase再生産生物反応器が作製される。
つぎに本発明の生物反応器の動作を説明する。
ATPase(12)が組み込まれた平面膜(8)は、リアク
ター(1)中に積層され、それぞれの平面膜の両側にAT
P合成に最適な膜電位(およそ200〜250mV)が発生する
様に、外部の電源(10)から電極(9)に電圧(DCパル
スまたはDC)がかけられる。ADPとリン酸はリザーバー
(4)よりポンプ(5)でリアクター(1)に導入さ
れ、平面膜質2重層膜(11)に発生した膜電位にもとづ
いてATPが積層している平面膜(8)間に生成される。
反応は連続的に進行し、ATPを消費するメインリアクタ
ーを組み合わせることによって、連続的なATP再生産が
できる。
上記説明では脂質2重層膜を用いて平面膜を形成した
ものについて説明したが、平面膜に限ることはなく、リ
ポソーム(閉鎖小胞)を用いてもよいことは当然であ
る。第5図は、ATPase(12)を組み込んだ脂質2重層膜
リポソーム(16)を模式的に示したものであり、動作は
平面膜と同様である。
また重合性の脂質を用いて脂質2重層膜を形成し、脂
質2重層膜を高分子化すれば、形成された平面膜やリポ
ソームをさらに安定化することができる。第6図は高分
子化した脂質2重層膜リポソームの形成を模式的に示し
たもので、ビニル基重合性の官能基が導入された脂質
(17)から形成された脂質2重層膜が紫外線などによっ
て重合せしめられ、高分子化した脂質2重層膜リポソー
ム(18)が形成される。高分子脂質2重層膜の性質は安
定性が向上する他は脂質2重層膜と同様である。
前記説明ではATPを合成するエネルギーとして、電界
によるエネルギーを用いたが、電界によるエネルギーに
限られるわけではなく、他の物理エネルギー(光など)
も利用することができる。
脂質2重層膜に高度好塩菌から抽出したバクテリオロ
ドプシンを加えれば、光照射によって膜の両側にプロト
ン勾配(ΔpH)が形成され、同様にATPが再生される。
第7図にATPase(12)とバクテリオロドプシン(19)
とを組み込んだ、平面脂質2重層膜(11)の模式図を示
す。この膜に光が照射されるとバクテリオロドブシンが
光プロトンポンプの役割を果たし、膜の片側にプロトン
を押し出し、膜を介してプロトン勾配(ΔpH)が形成さ
れる。プロトン勾配が形成されたのちの動作は、電界を
加えたばあいと同様である。
また式(3)に示される反応を触媒とする酵素である
ヒドロゲナーゼ(H2ase)とその電子伝達系を用いれ
ば、水素を基点としてΔpHが形成され、ATPが合成され
る。
H22H++2e (3) 第8図にATPase(12)、H2ase(20)および電子伝達
系(21)を組み込んだ平面脂質2重層膜(11)の模式図
を示す。この膜を用いると水素分子がH2ase(20)によ
ってプロトン(H+)とエレクトロン(e)に分離し、電
子伝達系(21)によって膜の両側に別れて伝達され、そ
の結果、膜の両側に、プロトン勾配(ΔpH)が形成され
る。ΔpHが形成されたのちの動作は、電解を加えたばあ
いと同様である。
本発明の生物反応器に関する実施態様について説明し
たが、再生したATPを利用する生物反応器であってもよ
く、生体内の色々な酵素系とATPaseと組み合わせた、よ
り高度な生物反応器の創造に用いてもよい。
つぎに本発明の生物反応器を実施例にもとづいて説明
する。
実施例1 厚さ0.5mmのテフロンシートに、直径1mmの孔を50%の
多孔度であけ、2cm×2cmに切って2分子膜用の支持体と
した。好熱性細菌より抽出したATPase(Method in Enzy
molgyに記載の方法で調製)を、H.schindlerらの方法
(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,78 2302(1980))によって
上述のテフロンシートの支持体に2分子膜として形成
し、ATPaseを組み込んだ平面脂質2重層膜をえた。
H.schindlerらの方法の概要は、ATPaseを含む細菌の
リン脂質で形成された小胞体を水面で表面張力によって
破壊し、その結果えられた水面上の単分子層膜をテフロ
ンシートのピンホール中で両側から合わせて形成するも
ので、操作はすべて水中で行った。
このようにしてえられた平面脂質2重層膜を導入した
テフロンシートを、あらかじめ水中に置かれたリアクタ
ー内に積層した。積層間隔は1mmで10枚積層した。リア
クターはガラスまたはテフロン樹脂で構成し、積層した
テフロンシートの間に基質が均一に流れるように、ポン
プからの水路を形成した。上部と下部にはテフロンシー
トと同面積の白金電極を装着した。
第9図は以上のようにしてえられたリアクターの断面
説明図である。
ATP再生は、以下の条件で行った。
リザーバーには、50mMトリス(ヒドロキシメチルアミ
ノメタン)塩酸(pH7.5)、10mM MgCl2、10mM ADP、50m
Mリン酸ナトリウム(pH7.5)の基質を蓄え、せんどうポ
ンプで50ml/hrの流速でリアクターに送液した。リアク
ター上下の電極には各平面2重層膜に200〜250mVの膜電
位が加わるように、1000〜2000Vの直流電圧を30secおき
に加えた(30sec ON,30sec OFF)。
このような条件でATPの再生を行った結果、ADPからの
変換率80%以上でATPがADPとリン酸より再生された。
[発明の効果] 本発明の生物反応器を用いると、ATP再生のための外
部からの供給エネルギー源として、電界、光、H2などを
ATPaseを導入した平面脂質2重層膜に与えることによ
り、直接ADPとリン酸とからATPが再生される。従って、
連続性、操作性、原料コストなどの点で優れたATP再生
産生物反応器がえられる。さらに酢酸などの副生成物も
なく、ATPを分離するセパレーターも不要であり、また
超小型化や精密制御が可能であり、生体内埋込み型の装
置としても利用できる。
【図面の簡単な説明】
第1図は本発明の生物反応器の一実施態様によるATP再
生産生物反応器のブロック図、第2図は従来の酵素法に
よるATP再生産生物反応器のブロック図、第3図はATPas
eを導入した平面脂質2重層膜を多孔性高分子シートに
組み込んだ平面膜の模式図、第4図はマイクロカプセル
に導入された平面脂質2重層膜の模式図、第5図はATPa
seを組み込んだ脂質2重層膜リポソームの模式図、第6
図は高分子化した脂質2重層膜をリポソームを形成する
ばあいの説明図、第7図はATPaseとバクテリオロドプシ
ンとを組み込んだ平面脂質2重層膜の模式図、第8図は
ATPase、H2ase、電子伝達系を組み込んだ平面脂質2重
層膜の模式図、第9図は実施例1で用いた生物反応器に
関する断面説明図である。 図中の(1)はリアクター、(8)は平面膜、(9)は
電極、(11)は平面脂質2重層膜、(12)はATPase、
(14)はATPaseを導入した平面脂質2重層膜、(16)は
脂質2重層膜リポソーム、(17)は重合性の脂質、(1
8)は高分子化した脂質2重層膜リポソーム、(19)は
バクテリオロドプシン、(20)はH2ase、(21)は電子
伝達系である。なお、各図面中の同一符号は同一または
相当部分を示す。

Claims (5)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】ATP再生酵素としてATP合成酵素(Adenosin
    etriphosphatase:ATPase)を用い、この酵素を平面脂質
    2重層膜中に導入して形成した平面膜を積層してリアク
    ター内に構築し、さらにATPを再生するエネルギーとし
    て外部からの物理エネルギーを用いることを特徴とする
    ATP再生産生物反応器。
  2. 【請求項2】平面脂質2重層膜を多孔性高分子シートの
    孔に形成することを特徴とする特許請求の範囲第(1)
    項記載のATP再生産生物反応器。
  3. 【請求項3】外部からの物理エネルギーとして、電界に
    よるエネルギーを用いることを特徴とする特許請求の範
    囲第(1)項記載のATP再生産生物反応器。
  4. 【請求項4】外部からの物理エネルギーとして、光エネ
    ルギーを用い、光プロトンポンプとしてバクテリオロド
    プシンを用いることを特徴とする特許請求の範囲第
    (1)項記載のATP再生産生物反応器。
  5. 【請求項5】外部からの物理エネルギーとして、水素を
    プロトン(H+)とエレクトロン(e)とに分離する酵素
    ヒドロゲナーゼとその電子伝達系とを、ATPaseと一緒に
    平面脂質2重層膜に組み込んで用いることを特徴とする
    特許請求の範囲第(1)項記載のATP再生産生物反応
    器。
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