JP2598726B2 - 動物細胞培養用添加剤 - Google Patents
動物細胞培養用添加剤Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、動物細胞培養用添加剤
に関し、更に詳細には、基礎的培地に添加することによ
り培養細胞の増殖を促進させ、生細胞数割合の増加、培
養細胞減少の防止、培養期間の短縮、高密度化培養又は
血清等の天然栄養物の添加量の減少効果を示す動物細胞
培養用添加剤に関する。
に関し、更に詳細には、基礎的培地に添加することによ
り培養細胞の増殖を促進させ、生細胞数割合の増加、培
養細胞減少の防止、培養期間の短縮、高密度化培養又は
血清等の天然栄養物の添加量の減少効果を示す動物細胞
培養用添加剤に関する。
【０００２】
【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】従来、
動物細胞の培養に広く使用されている培地としては、基
礎的培地、例えば RPMI 1640培地、ＭＥＭ培地、ダルベ
ッコ改変ＭＥＭ培地、イスコフ培地、ハムのF-12培地、
又はこれらの混合液等に血清を添加したものが挙げられ
る。また、血清としては、ウシ胎児血清、仔ウシ血清、
ウマ血清などが用いられている。
動物細胞の培養に広く使用されている培地としては、基
礎的培地、例えば RPMI 1640培地、ＭＥＭ培地、ダルベ
ッコ改変ＭＥＭ培地、イスコフ培地、ハムのF-12培地、
又はこれらの混合液等に血清を添加したものが挙げられ
る。また、血清としては、ウシ胎児血清、仔ウシ血清、
ウマ血清などが用いられている。
【０００３】しかしながら、この動物細胞の培養に関し
ては、今なお不明な点が多く、必ずしも全ての動物細胞
が培養できるわけではなく、また、培養が可能であって
も増殖の速度が遅いこと、高密度に培養できないことな
どの問題が残されている。
ては、今なお不明な点が多く、必ずしも全ての動物細胞
が培養できるわけではなく、また、培養が可能であって
も増殖の速度が遅いこと、高密度に培養できないことな
どの問題が残されている。
【０００４】これらのうち、特に培地への血清類、殊に
ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum；以下、「ＦＢＳ」
という）の必要性が重要な問題として挙げられる。すな
わち、動物細胞培養時には、多くの場合、多量のＦＢＳ
を必要とするが、ＦＢＳは、資源的に貴重である、高価
である、天然品ゆえにロットごとに差がある、保存安定
性に欠ける、さらに高分子量の不明成分も多く、培養液
中の有用成分との分離が困難であるなどの多くの問題を
有している。これらの問題を解決するため、すでに多く
の研究がなされており、例えば卵黄リポ蛋白（York Lip
oprotein；以下、「ＹＬＰ」という）等の添加物の開発
（日本農芸化学会昭和61年度大会講演要旨集 p.600）
や、無血清培地の開発も進められている。
ウシ胎児血清（Fetal Bovine Serum；以下、「ＦＢＳ」
という）の必要性が重要な問題として挙げられる。すな
わち、動物細胞培養時には、多くの場合、多量のＦＢＳ
を必要とするが、ＦＢＳは、資源的に貴重である、高価
である、天然品ゆえにロットごとに差がある、保存安定
性に欠ける、さらに高分子量の不明成分も多く、培養液
中の有用成分との分離が困難であるなどの多くの問題を
有している。これらの問題を解決するため、すでに多く
の研究がなされており、例えば卵黄リポ蛋白（York Lip
oprotein；以下、「ＹＬＰ」という）等の添加物の開発
（日本農芸化学会昭和61年度大会講演要旨集 p.600）
や、無血清培地の開発も進められている。
【０００５】しかし、これらＦＢＳ代替物は、ＦＢＳと
比較して、必ずしも充分な効果を得ることが困難であ
り、ＦＢＳの代替又はＦＢＳの使用量を減ずることがで
きるような新たな動物細胞培養用添加剤の開発が望まれ
ていた。
比較して、必ずしも充分な効果を得ることが困難であ
り、ＦＢＳの代替又はＦＢＳの使用量を減ずることがで
きるような新たな動物細胞培養用添加剤の開発が望まれ
ていた。
【０００６】
【課題を解決するための手段】かかる実情において、本
発明者らは鋭意研究を行った結果、５−アミノレブリン
酸又はその塩を動物細胞培養液に添加すれば、細胞の増
殖を促進することができることを見出し、本発明を完成
した。
発明者らは鋭意研究を行った結果、５−アミノレブリン
酸又はその塩を動物細胞培養液に添加すれば、細胞の増
殖を促進することができることを見出し、本発明を完成
した。
【０００７】すなわち、本発明は、５−アミノレブリン
酸又はその塩を含有することを特徴とする動物細胞培養
用添加剤を提供するものである。
酸又はその塩を含有することを特徴とする動物細胞培養
用添加剤を提供するものである。
【０００８】本発明の動物細胞培養用添加剤の有効成分
として用いられる５−アミノレブリン酸又はその塩は、
除草剤及び殺虫剤として有用であることが知られており
（特表昭61-502814 号、特開平2-138201号）、また、鉛
中毒患者の血液中や尿中の５−アミノレブリン酸又はそ
の塩の濃度が上昇すること等も、古くから臨床事実とし
て知られているが、培養細胞の増殖促進作用を有するこ
とは全く知られていない。
として用いられる５−アミノレブリン酸又はその塩は、
除草剤及び殺虫剤として有用であることが知られており
（特表昭61-502814 号、特開平2-138201号）、また、鉛
中毒患者の血液中や尿中の５−アミノレブリン酸又はそ
の塩の濃度が上昇すること等も、古くから臨床事実とし
て知られているが、培養細胞の増殖促進作用を有するこ
とは全く知られていない。
【０００９】５−アミノレブリン酸又はその塩は、公知
の化合物であり、化学合成、微生物による生産、酵素に
よる生産のいずれの方法によっても製造することができ
る。微生物又は酵素による生産方法を用いる場合、その
生産物は、動物細胞に対して有害な物質を含まない限
り、分離精製することなくそのまま用いることができ
る。
の化合物であり、化学合成、微生物による生産、酵素に
よる生産のいずれの方法によっても製造することができ
る。微生物又は酵素による生産方法を用いる場合、その
生産物は、動物細胞に対して有害な物質を含まない限
り、分離精製することなくそのまま用いることができ
る。
【００１０】５−アミノレブリン酸の塩としては、例え
ば塩酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピ
オン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸
塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩及びナトリ
ウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩が挙げら
れる。なお、これらの塩は使用時において水溶液として
用いられ、その作用は、５−アミノレブリン酸の場合と
同一である。５−アミノレブリン酸とその塩は、それぞ
れ単独でも、又はこれらの２種以上を混合して用いるこ
ともできる。
ば塩酸塩、リン酸塩、硝酸塩、硫酸塩、酢酸塩、プロピ
オン酸塩、酪酸塩、吉草酸塩、クエン酸塩、フマル酸
塩、マレイン酸塩、リンゴ酸塩等の酸付加塩及びナトリ
ウム塩、カリウム塩、カルシウム塩等の金属塩が挙げら
れる。なお、これらの塩は使用時において水溶液として
用いられ、その作用は、５−アミノレブリン酸の場合と
同一である。５−アミノレブリン酸とその塩は、それぞ
れ単独でも、又はこれらの２種以上を混合して用いるこ
ともできる。
【００１１】本発明の動物細胞培養用添加剤は、５−ア
ミノレブリン酸又はその塩以外に、タンパク、ホルモ
ン、ビタミン、アミノ酸、有機酸、糖類、重金属等を必
要に応じて添加することができる。また、ＦＢＳ、ＹＬ
Ｐ等の他の栄養剤と組み合わせて用いることもでき、組
み合わせによりさらに効果を高めたり、或いは、一定効
果を得るための５−アミノレブリン酸又はその塩の添加
量を減ずることができる。
ミノレブリン酸又はその塩以外に、タンパク、ホルモ
ン、ビタミン、アミノ酸、有機酸、糖類、重金属等を必
要に応じて添加することができる。また、ＦＢＳ、ＹＬ
Ｐ等の他の栄養剤と組み合わせて用いることもでき、組
み合わせによりさらに効果を高めたり、或いは、一定効
果を得るための５−アミノレブリン酸又はその塩の添加
量を減ずることができる。
【００１２】本発明の動物細胞培養用添加剤の剤型とし
ては、粉末、粒剤、液剤等が挙げられるが、これらの剤
型とするには、溶剤、分散媒、増量剤等を動物細胞の増
殖に悪影響のない範囲で用い、常法に従って製造するこ
とができる。
ては、粉末、粒剤、液剤等が挙げられるが、これらの剤
型とするには、溶剤、分散媒、増量剤等を動物細胞の増
殖に悪影響のない範囲で用い、常法に従って製造するこ
とができる。
【００１３】５−アミノレブリン酸及びその塩は、極め
て毒性の低い天然物であり、動物細胞によって速やかに
吸収利用され、通常、動物細胞培養後に残留することは
なく、また、仮に残留しても毒性の問題はない。しか
し、必要な場合には、例えばダウエックス２（ダウ社
製）等のイオン交換樹脂などの吸着剤を用いて、残存す
る５−アミノレブリン酸又はその塩を選択的に除去する
ことができる。
て毒性の低い天然物であり、動物細胞によって速やかに
吸収利用され、通常、動物細胞培養後に残留することは
なく、また、仮に残留しても毒性の問題はない。しか
し、必要な場合には、例えばダウエックス２（ダウ社
製）等のイオン交換樹脂などの吸着剤を用いて、残存す
る５−アミノレブリン酸又はその塩を選択的に除去する
ことができる。
【００１４】本発明の動物細胞培養用添加剤の使用濃度
は、５−アミノレブリン酸換算で培地当たり、0.001 〜
100 μg/ml、好ましくは0.01〜10μg/mlである。特に培
地中の濃度が 100μg/mlを超えると、細胞生育に阻害が
生ずるので好ましくない。
は、５−アミノレブリン酸換算で培地当たり、0.001 〜
100 μg/ml、好ましくは0.01〜10μg/mlである。特に培
地中の濃度が 100μg/mlを超えると、細胞生育に阻害が
生ずるので好ましくない。
【００１５】動物細胞培養は、通常、その培養期間が短
いため、本発明の動物細胞培養用添加剤は、培養初期の
添加で充分な効果が得られるが、大量培養装置等を用い
て長期にわたって培養する場合、連続的に培養する場
合、或いはより大きな効果を得たい場合などには、複数
回の添加や連続的な添加が有効である。この場合、培地
中での濃度が一定量を超えないように管理することが必
要である。
いため、本発明の動物細胞培養用添加剤は、培養初期の
添加で充分な効果が得られるが、大量培養装置等を用い
て長期にわたって培養する場合、連続的に培養する場
合、或いはより大きな効果を得たい場合などには、複数
回の添加や連続的な添加が有効である。この場合、培地
中での濃度が一定量を超えないように管理することが必
要である。
【００１６】なお、本発明の動物細胞培養用添加剤の適
用対象となる動物細胞としては、特に限定されないが、
例えばヒト急性リンパ芽球性白血病（Ｔ細胞）由来細胞
（MOLT-4）、ヒトバーキットリンパ腫由来細胞（Raj
i）、ヒト子宮頸部癌由来細胞（HeLa）、マウス骨髄腫
由来細胞（P3/NSI/1-Ag4-1；P3X63Ag8.653；SP2/0-Ag1
4）等が挙げられる。
用対象となる動物細胞としては、特に限定されないが、
例えばヒト急性リンパ芽球性白血病（Ｔ細胞）由来細胞
（MOLT-4）、ヒトバーキットリンパ腫由来細胞（Raj
i）、ヒト子宮頸部癌由来細胞（HeLa）、マウス骨髄腫
由来細胞（P3/NSI/1-Ag4-1；P3X63Ag8.653；SP2/0-Ag1
4）等が挙げられる。
【００１７】
【発明の効果】本発明の動物細胞培養用添加剤は、動物
細胞の培養時に基礎的培地に添加するだけで極めて簡便
に使用することができ、培養細胞の増殖を促進させ、生
細胞比率の増加、培養細胞減少の防止、培養期間の短
縮、高密度化培養及び添加する血清等の栄養剤の添加量
の減少効果に優れたものである。
細胞の培養時に基礎的培地に添加するだけで極めて簡便
に使用することができ、培養細胞の増殖を促進させ、生
細胞比率の増加、培養細胞減少の防止、培養期間の短
縮、高密度化培養及び添加する血清等の栄養剤の添加量
の減少効果に優れたものである。
【００１８】
【実施例】次に、実施例を挙げて、本発明を更に詳細に
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。 実施例１ シャーレ（35mmφ×10mm）に、基礎的培地である RPMI1
640培地を２ml、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）
を０（無添加）、0.03μg/ml及び 0.1μg/mlとなるよう
に添加し、MOLT-4細胞（ヒト急性リンパ芽球性白血病由
来細胞）を1.3×105 個／mlとなるよう添加した。細胞
添加時の生細胞数の割合は、81.2％であった。これをイ
ンキュベーターにて、５％ CO2−空気、37℃で培養し
た。そして、２日後、３日後及び４日後にサンプリング
し、全細胞数及びトリパンブルー染色法で生細胞数を計
測し、さらにこれらより、生細胞比率（％）を求めた。
結果を表１に示す。
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。 実施例１ シャーレ（35mmφ×10mm）に、基礎的培地である RPMI1
640培地を２ml、５−アミノレブリン酸（５−ＡＬＡ）
を０（無添加）、0.03μg/ml及び 0.1μg/mlとなるよう
に添加し、MOLT-4細胞（ヒト急性リンパ芽球性白血病由
来細胞）を1.3×105 個／mlとなるよう添加した。細胞
添加時の生細胞数の割合は、81.2％であった。これをイ
ンキュベーターにて、５％ CO2−空気、37℃で培養し
た。そして、２日後、３日後及び４日後にサンプリング
し、全細胞数及びトリパンブルー染色法で生細胞数を計
測し、さらにこれらより、生細胞比率（％）を求めた。
結果を表１に示す。
【００１９】
【表１】
【００２０】表１から明らかなように、 RPMI 1640培地
のみでは全細胞数は急速に減少しているが、これに５−
アミノレブリン酸を添加した場合、一部には増殖効果も
見られる等、減少速度が大幅に遅くなっており、生細胞
比率も増加している。このように、本発明の動物細胞培
養用添加剤は、培養細胞に対して良好な効果を示してい
る。
のみでは全細胞数は急速に減少しているが、これに５−
アミノレブリン酸を添加した場合、一部には増殖効果も
見られる等、減少速度が大幅に遅くなっており、生細胞
比率も増加している。このように、本発明の動物細胞培
養用添加剤は、培養細胞に対して良好な効果を示してい
る。
【００２１】実施例２ RPMI 1640培地にＦＢＳを10％添加する以外は実施例１
と同様にして、培養を行った。結果を表２に示す。
と同様にして、培養を行った。結果を表２に示す。
【００２２】
【表２】
【００２３】表２から明らかなように、本発明の動物細
胞培養用添加剤を添加することにより、細胞の増殖効果
が認められ、また、生細胞比率も増加した。５日後の生
細胞数を比較すると、５−ＡＬＡ濃度が0.03μg/ml及び
0.1μg/mlの場合、無添加の場合より35％もの大幅な生
細胞数の増加が見られ、本発明の動物細胞培養用添加剤
の効果が極めて大きいことが認められた。
胞培養用添加剤を添加することにより、細胞の増殖効果
が認められ、また、生細胞比率も増加した。５日後の生
細胞数を比較すると、５−ＡＬＡ濃度が0.03μg/ml及び
0.1μg/mlの場合、無添加の場合より35％もの大幅な生
細胞数の増加が見られ、本発明の動物細胞培養用添加剤
の効果が極めて大きいことが認められた。
【００２４】実施例３ 下記に示すＲＤＦ培地にＦＢＳを10％添加すること及び
マウス骨髄腫由来細胞（P3X63Ag8.653）を用いる以外は
実施例１と同様にして、培養を行った。結果を表３に示
す。 （ＲＤＦ培地の処方） RPMI 1640 培地（粉末）（大日本製薬） 5.46ｇ ＤＭＥＭ培地（粉末）（大日本製薬） 3.5 ｇ ハムのF-12培地（粉末）（大日本製薬） 3.71ｇ ＨＥＰＥＳ（和光純薬） 1.19ｇ 硫酸ストレプトマイシン（森永製菓） 0.1 ｇ力
価 結晶ペニシリンＧ・カリウム（森永製菓） 10万単位 以上を蒸留水に溶かして1000mlとし、孔径0.22μm のフ
ィルターを用いて濾過滅菌して用いる。
マウス骨髄腫由来細胞（P3X63Ag8.653）を用いる以外は
実施例１と同様にして、培養を行った。結果を表３に示
す。 （ＲＤＦ培地の処方） RPMI 1640 培地（粉末）（大日本製薬） 5.46ｇ ＤＭＥＭ培地（粉末）（大日本製薬） 3.5 ｇ ハムのF-12培地（粉末）（大日本製薬） 3.71ｇ ＨＥＰＥＳ（和光純薬） 1.19ｇ 硫酸ストレプトマイシン（森永製菓） 0.1 ｇ力
価 結晶ペニシリンＧ・カリウム（森永製菓） 10万単位 以上を蒸留水に溶かして1000mlとし、孔径0.22μm のフ
ィルターを用いて濾過滅菌して用いる。
【００２５】
【表３】
【００２６】表３から明らかなように、本発明の動物細
胞培養用添加剤を用いることにより、細胞の増殖効果が
認められた。この場合、４日後に細胞数がピークに達し
ており、本剤の使用により、生細胞比率から分かるよう
に、細胞の減少が抑えられている。
胞培養用添加剤を用いることにより、細胞の増殖効果が
認められた。この場合、４日後に細胞数がピークに達し
ており、本剤の使用により、生細胞比率から分かるよう
に、細胞の減少が抑えられている。
Claims (1)
- 【請求項１】 ５−アミノレブリン酸又はその塩を含有
することを特徴とする動物細胞培養用添加剤。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3205918A JP2598726B2 (ja) | 1991-08-16 | 1991-08-16 | 動物細胞培養用添加剤 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3205918A JP2598726B2 (ja) | 1991-08-16 | 1991-08-16 | 動物細胞培養用添加剤 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0549472A JPH0549472A (ja) | 1993-03-02 |
| JP2598726B2 true JP2598726B2 (ja) | 1997-04-09 |
Family
ID=16514904
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3205918A Expired - Fee Related JP2598726B2 (ja) | 1991-08-16 | 1991-08-16 | 動物細胞培養用添加剤 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2598726B2 (ja) |
-
1991
- 1991-08-16 JP JP3205918A patent/JP2598726B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0549472A (ja) | 1993-03-02 |
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