JP2593498B2 - Method for producing L-sorbose and apparatus for culturing microorganisms - Google Patents
Method for producing L-sorbose and apparatus for culturing microorganismsInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は微生物によるＬ−ソルボースの製造法および
上記微生物の培養装置に関するものである。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for producing L-sorbose by microorganisms and an apparatus for culturing the microorganisms.
従来の技術 Ｌ−ソルボースは、ナナカマドなどの果汁に含まれる
天然ケトヘキソースの１つで、従来からビタミンＣ合成
の原料として重要な物質であり、該Ｌ−ソルボースはＤ
−ソルビットを微生物、例えばグルコノバクター属菌に
より酸化する醗酵生産法により製造されている。2. Description of the Related Art L-sorbose is one of the natural ketohexoses contained in fruit juices such as rowan and has been an important substance as a raw material for vitamin C synthesis.
-It is produced by a fermentation production method in which sorbitol is oxidized by a microorganism such as Gluconobacter.
従来のＬ−ソルボースの醗酵生産法によると、原料で
あるＤ−ソルビットをＬ−ソルボースへ変換する収率は
約93％程度までであり、５−ケトフラクトース、Ｄ−フ
ラクトースあるいは２−ケトグルコン酸等がかなり副生
する。ビタミンＣの原料コスト低減のためには、その中
間製造工程におけるＤ−ソルビットのＬ−ソルボースへ
の変換収率を従来以上に増大させ、上記副生物の生成を
出来るだけ抑制することが要望されている。According to the conventional L-sorbose fermentation production method, the yield of converting D-sorbitol, which is a raw material, to L-sorbose is up to about 93%, such as 5-ketofructose, D-fructose or 2-ketogluconic acid. Is quite a by-product. In order to reduce the raw material cost of vitamin C, it is desired to increase the conversion yield of D-sorbitol to L-sorbose in the intermediate production process more than before and suppress the generation of the by-products as much as possible. I have.
また、微生物の増殖期以降においては、培地中のＤ−
ソルビットの濃度が約５％を越えると基質（Ｄ−ソルビ
ット）と生産物（Ｌ−ソルボース）の両方の濃度による
阻害を受けるため酸化速度が遅延する。従って、Ｄ−ソ
ルビット濃度を約５％以下に制御する必要はあるが、基
質濃度を律速にすると副生物（フラクトース、２−ケト
グルコン酸など）の生成量が増加するという問題があ
る。After the growth phase of the microorganism, the D-
If the concentration of sorbite exceeds about 5%, the oxidation rate is slowed down due to inhibition by both the substrate (D-sorbitol) and product (L-sorbose) concentrations. Therefore, although it is necessary to control the D-sorbite concentration to about 5% or less, there is a problem that when the substrate concentration is controlled, the amount of by-products (fructose, 2-ketogluconic acid, etc.) increases.
さらに、この種の製造法において、高濃度酸素を含有
する培養排気ガスをコンプレッサーで回収し、培養液中
に循環させて再使用し、省資源による経済性を図る場合
がある。この場合、微生物の呼吸により発生する炭酸ガ
スが排気ガス中に蓄積し、炭酸ガス濃度が10％を越える
と微生物の増殖速度および酸化速度に対して強い阻害を
受けるため、従来はか性ソーダや活性炭などの吸着剤を
使用して炭酸ガスを除去する手段が用いられている。し
かしながら、該手段によると吸着塔および吸着剤等が必
要でコストがかかると共に、保守点検も必要となる等問
題点が多い。Furthermore, in this type of production method, the culture exhaust gas containing high-concentration oxygen may be recovered by a compressor, circulated and reused in the culture solution, and the economy may be improved by saving resources. In this case, carbon dioxide gas generated by the respiration of microorganisms accumulates in the exhaust gas, and if the carbon dioxide gas concentration exceeds 10%, the growth rate and oxidation rate of microorganisms are strongly inhibited. Means for removing carbon dioxide using an adsorbent such as activated carbon has been used. However, according to this means, there are many problems such as the necessity of an adsorption tower and an adsorbent, which increases costs and also requires maintenance and inspection.
発明の目的 本発明は上記した問題に鑑みてなされたもので、Ｄ−
ソルビットからＬ−ソルボースへの変換率の向上を図る
と共に、増殖期以降におけるＤ−ソルビット濃度を適性
に制御することにより高濃度のＤ−ソルビットを短時間
にＬ−ソルボースへ酸化させ、よって、バッチ当たりの
収量向上を目指すものである。さらに、本発明では、再
使用する排気ガスの炭酸ガスを吸着剤を使用せずに除去
して炭酸ガス分圧を適性の制御し、よって、設備および
保守点検を簡単として、コスト低下を目差すものであ
る。Objects of the invention The present invention has been made in view of the above-mentioned problems,
The aim is to improve the conversion rate from sorbitol to L-sorbose, and to oxidize high-concentration D-sorbitol to L-sorbose in a short time by appropriately controlling the concentration of D-sorbitol after the growth phase. The aim is to improve the yield per hit. Further, in the present invention, the carbon dioxide gas of the exhaust gas to be reused is removed without using an adsorbent to appropriately control the partial pressure of the carbon dioxide gas, thereby simplifying equipment and maintenance and reducing costs. It is.
発明の構成 上記した目的を達成するため、本発明は、Ｄ−ソルビ
ットを微生物学的に酸化してＬ−ソルボースを製造する
に際して、利用する微生物の増殖期以降の培養におい
て、 Ｄ−ソルビットの培養液中の濃度が約５％を越えない
ように添加しつつ、 培養液に酸化ガスを富化して酸素分圧の高められた培
養排気ガスを循環通気させて溶存酸素濃度を制御し、 かつ、上記培養排気ガスの一部を系外に排出させて循
環ガス中の炭酸ガス分圧を制御しながら培養することを
特徴とするＬ−ソルボースの製造法を提供するものであ
る。In order to achieve the above-mentioned object, the present invention provides a method for producing L-sorbose by microbiologically oxidizing D-sorbitol. While adding so that the concentration in the solution does not exceed about 5%, the culture solution is enriched with oxidizing gas, and the culture exhaust gas with an increased oxygen partial pressure is circulated and aerated to control the dissolved oxygen concentration. An object of the present invention is to provide a method for producing L-sorbose, wherein a part of the culture exhaust gas is discharged to the outside of the system and the culture is performed while controlling the partial pressure of carbon dioxide in the circulating gas.
本発明製造法では、Ｄ−ソルビットを酸化してＬ−ソ
ルボースを生成せしめる能力を有する微生物であればい
ずれも用いることが出来る。その例としてはグルコノバ
クター属に属する微生物、例えばグルコノバクター・サ
ブオキシダンスあるいはグルコノバクター・オキシダン
スの種菌が挙げられる。具体的な菌株例としては、たと
えば、グルコノバクター・サブオキシダンス IFO 325
4、IFO 3257、IFO 12528、IFO 3255、IFO 3256、IFO 32
58あるいはIFO 3291や、さらにはグルコノバクター・オ
キシダンスIFO 3189などが挙げられる。これら微生物は
好気性で、グラム陰性桿菌で運動性を有し、酸性PHで生
育し、エタノールから酢酸を生成するものである。In the production method of the present invention, any microorganism capable of oxidizing D-sorbitol to produce L-sorbose can be used. Examples thereof include microorganisms belonging to the genus Gluconobacter, such as Gluconobacter suboxydans or Gluconobacter oxydans. Specific strains include, for example, Gluconobacter suboxydans IFO 325
4, IFO 3257, IFO 12528, IFO 3255, IFO 3256, IFO 32
58 or IFO 3291, and also Gluconobacter oxydans IFO 3189. These microorganisms are aerobic, gram-negative bacilli, have motility, grow on acidic PH, and produce acetic acid from ethanol.
また、グルコノバクター・オキシダンスBL−９株およ
びBL−115株を用いると良好な結果が得られることが判
明した。両方の株は共に、昭和61年（1986年）１月21日
に財団法人発酵研究所（IFO）に、また、昭和61年（198
6年）２月１日に通商産業省工業技術院微生物工業技術
研究所（FRI）に寄託しており、FRIでの寄託は同年12月
22日に国際寄託に変更した。両株の受託番号はつぎのと
おりである。It was also found that good results were obtained when using Gluconobacter oxydans strains BL-9 and BL-115. Both strains were transferred to the Fermentation Research Institute (IFO) on January 21, 1986, and
6) Deposited on February 1 with the Research Institute of Microbial Industry and Technology (FRI) of the Ministry of International Trade and Industry of Japan.
Changed to international deposit on 22nd. The accession numbers for both strains are as follows.
株 IFO受託番号 FRI受託番号 BL−９ IFO 14489 FERM BP−1241 BL−115 IFO 14490 FERM BP−1240 本発明でいう上記微生物の増殖期とは、利用する微生
物を培養する際における誘導期および増殖対数期が終わ
るまでの培養期間をいう。増殖期間は利用する微生物の
種類や培養条件によって異なるが、常法により増殖曲線
を求めることにより容易に知ることが出来る。一般に
は、培地中の窒素源が消費されるまでの培養期間で、例
えば培養開始後約９時間までがこの増殖期に相当するこ
とが多い。Strain IFO Accession No.FRI Accession No. The culture period until the end of the period. The growth period depends on the type of microorganism used and the culture conditions, but can be easily known by obtaining a growth curve by a conventional method. In general, the culturing period until the nitrogen source in the medium is consumed, for example, up to about 9 hours after the start of culturing, often corresponds to this growth phase.
本発明では、Ｄ−ソルビットの初発仕込濃度は最適な
８〜25％として生育速度を高めており、残量のＤ−ソル
ビットを、上記に記載したように、増殖期以降におい
て、培養液中の濃度が約５％をこえないように連続的又
は間欠的に添加しつつ、最終仕込濃度を40〜60％として
いる。In the present invention, the initial growth concentration of D-sorbitol is set to an optimum of 8 to 25% to increase the growth rate, and the remaining amount of D-sorbitol is increased in the culture solution after the growth phase as described above. The concentration is continuously or intermittently added so that the concentration does not exceed about 5%, and the final charged concentration is 40 to 60%.
Ｄ−ソルビットの初発仕込濃度を８〜25％としている
のは、比増殖速度への初発Ｄ−ソルビット濃度の影響お
よび、Ｌ−ソルボース生成速度へのＤ−ソルビット濃度
の影響が第１図および第２図に示す通りで、比増殖速度
およびＬ−ソルボース比生成速度はＤ−ソルビット濃度
を８〜25％、とりわけ８〜20％とすると高められること
による。The initial charge concentration of D-sorbit is set to 8 to 25% because the influence of the initial D-sorbit concentration on the specific growth rate and the effect of the D-sorbit concentration on the L-sorbose formation rate are shown in FIGS. As shown in FIG. 2, the specific growth rate and the L-sorbose specific production rate can be enhanced by increasing the D-sorbitol concentration to 8 to 25%, particularly 8 to 20%.
増殖期以降においては、Ｌ−ソルボースへの酸化が効
率的に進行するように、上記の如く、Ｄ−ソルビットの
仕込濃度を約５％以下に維持している。これに対して、
５％を越えるとを、生産菌が基質阻害を受けやすくなり
Ｌ−ソルボースへの転換が遅れ、培養時間が長くなる。After the growth phase, the charged concentration of D-sorbitol is maintained at about 5% or less as described above so that oxidation to L-sorbose proceeds efficiently. On the contrary,
If it exceeds 5%, the production bacteria will be susceptible to substrate inhibition, conversion to L-sorbose will be delayed, and the culture time will be prolonged.
従来の方法では、Ｄ−ソルビットを培養初期から一度
に仕込んで培養を開始するため、基質阻害が大きく培養
に長時間を要したが、本発明のようなＤ−ソルビット添
加法を採用すると、培養時間が短縮される。この点につ
き、従来法（一括仕込）と比較したデータは下記の第１
表に示す通りである。In the conventional method, D-sorbit is charged all at once from the initial stage of culture and culture is started. Therefore, substrate inhibition is large and cultivation takes a long time. Time is reduced. Regarding this point, the data compared with the conventional method (batch preparation) is as follows.
It is as shown in the table.
上記表より明らかなように、50％仕込での培養時間は
従来法では47hrであるのに対して、本発明法では20hrで
よいこととなる。 As is clear from the above table, the cultivation time at 50% preparation is 47 hours in the conventional method, but 20 hours in the method of the present invention.
上記培地中のＤ−ソルビット濃度の制御は、これをＬ
−ソルボースに酸化するに必要な理論量の酸素量から計
算して行う。即ち、Ｄ−ソルビット量は直接に定量せ
ず、培地に定量（８〜25％）のＤ−ソルビットを仕込
み、この量が５％以下になるように理論量の酸素を供給
しながら培養し、以下、酸素の供給量に対応させてＤ−
ソルビット濃度が５％を越えないように添加を続けなが
ら培養する。The control of the D-sorbitol concentration in the medium is
Calculated from the stoichiometric amount of oxygen required to oxidize to sorbose. That is, the amount of D-sorbit is not directly determined, but a fixed amount (8 to 25%) of D-sorbit is charged into the medium, and the culture is performed while supplying a theoretical amount of oxygen so that the amount becomes 5% or less. Hereinafter, D-
Cultivate while continuing the addition so that the sorbite concentration does not exceed 5%.
本発明では、上記に記載したように、培養初期は空
気からの酸素供給だけで微生物の酸素要求量は補える
が、増殖期以降において微生物濃度が高まり、微生物の
酸素要求量が高まると不足する酸素を補うため、培養液
に酸素ガスで酸素分圧の高められた培養排気ガス、例え
ば酸素分圧が21％以上、好ましくは21〜50％に高められ
た酸素富化ガスを循環通気させて、培地中の溶存酸素濃
度を0.7ppm以上、好ましくは１〜4ppmに制御している。In the present invention, as described above, in the initial stage of culturing, the supply of oxygen from the air alone can supplement the oxygen demand of microorganisms, but after the growth phase, the concentration of microorganisms increases, and when the oxygen demand of microorganisms increases, the oxygen demand becomes insufficient. In order to supplement the culture solution, a culture exhaust gas having an increased oxygen partial pressure with oxygen gas, for example, an oxygen-enriched gas having an oxygen partial pressure of 21% or more, preferably 21 to 50%, is circulated and aerated in the culture solution, The concentration of dissolved oxygen in the medium is controlled to 0.7 ppm or more, preferably 1 to 4 ppm.
上記酸素の供給量は上記Ｄ−ソルビットに対応して化
学量論的に定まる。本培養において、反応に利用されな
い過剰の溶存酸素が培地中に存在しても原則的にはＬ−
ソルボースの生産には影響がない。しかし、過不足のな
い状態で酸素を供給することが経済的であり、かつ、培
養タンク中の溶存酸素濃度に多少のムラが存することも
考えて、上記したように、実用上は0.7ppm以上に、好ま
しくは１〜4ppmに制御している。The supply amount of the oxygen is stoichiometrically determined according to the D-sorbit. In the main culture, even if excess dissolved oxygen not used in the reaction is present in the medium, L-
There is no effect on sorbose production. However, it is economical to supply oxygen with no excess or deficiency, and considering that there is some unevenness in the dissolved oxygen concentration in the culture tank, as described above, practically 0.7 ppm or more , Preferably controlled to 1 to 4 ppm.
本発明では、上記のように酸素分圧の高められた培養
排気ガスを、微生物の増殖期以降において、培養液中で
循環させ経済化を図っている。しかしながら、循環して
再使用した場合、微生物の呼吸によって発生する炭酸ガ
スが蓄積し、微生物の生育および酸化活性を阻害するこ
とが知られている。即ち、炭酸ガス分圧の比増殖速度へ
の影響およびＬ−ソルボース生成速度への影響は第３図
および第４図に示す通りであり、比増殖速度に対しては
５％を越えると強い阻害を示し、Ｌ−ソルボース生成速
度（酸化速度）に対しては比増殖速度ほど強い阻害に認
められないが、５％を越えると若干阻害を受け、10％を
越えると強い阻害を受ける。そのため、本発明では循環
排気ガスの一部（５〜10％）を大気に放出し、この放出
量と微生物に消費される酸素量に見合う量を酸素ガスで
補充して、炭酸ガス濃度を希釈し、循環ガス中の炭酸ガ
ス分圧を阻害を受けない10％以下に制御している。上記
本発明方法によると、従来使用している吸着剤を必要と
せず、保守上および経済上の有利性が得られる。また、
酸素分圧を高めた排気ガスを再使用することによって、
使用酸素量は、この大気放出を行った場合でも60％削減
され、大幅な経済的効果を生じる。In the present invention, the culture exhaust gas having the increased oxygen partial pressure as described above is circulated in the culture solution after the microorganism growth period to achieve economical efficiency. However, it is known that when recycled and reused, carbon dioxide gas generated by respiration of microorganisms accumulates and inhibits the growth and oxidative activity of microorganisms. That is, the influence of the partial pressure of carbon dioxide on the specific growth rate and the L-sorbose production rate are as shown in FIGS. 3 and 4, and the specific growth rate is strongly inhibited when it exceeds 5%. The rate of L-sorbose formation (oxidation rate) is not observed to be as strong as the specific growth rate, but it is slightly inhibited when it exceeds 5%, and strongly inhibited when it exceeds 10%. Therefore, in the present invention, a part (5 to 10%) of the circulating exhaust gas is released to the atmosphere, and an amount corresponding to the amount of the released gas and the amount of oxygen consumed by microorganisms is supplemented with oxygen gas to dilute the carbon dioxide concentration. However, the partial pressure of carbon dioxide in the circulating gas is controlled to 10% or less, which is not hindered. According to the above-mentioned method of the present invention, the conventionally used adsorbent is not required, and maintenance and economic advantages are obtained. Also,
By reusing exhaust gas with increased oxygen partial pressure,
The amount of oxygen used is reduced by 60% even if this atmospheric release is performed, resulting in a significant economic effect.
また、本発明方法では、生産培地として、合成培地あ
るいは半合成培地という成分の明らかな培地原料を使用
しており、よって、培地の安定化と原料費の経済化を図
っている。即ち、本発明方法では、生産培地中の炭素源
としては、主原料としてＤ−ソルビットを用い、他にＤ
−グルコース、Ｄ−フラクトース、Ｄ−マンニトール、
エタノール、糖蜜澱粉、澱粉加水分解物などが添加され
る。また、窒素源としては、硫酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、酢酸アンモニウム、塩化アンモニウム水、
リン酸アンモニウム、アンモニウム水、アンモニウムガ
ス等の無機窒素化合物の他、アミノ酸、尿素などの有機
窒素化合物が使用される。さらにまた、上記炭素源や窒
素源の他に、培地には、用いる微生物の生育に必要な種
々の金属、ビタミン、アミノ酸、核酸、キノン類などが
適宜添加される。Further, in the method of the present invention, a synthetic medium or a semi-synthetic medium is used as the production medium, which is a medium material with a clear component, thereby stabilizing the medium and reducing the cost of the material. That is, in the method of the present invention, D-sorbitol is used as a main material as a carbon source in the production medium,
-Glucose, D-fructose, D-mannitol,
Ethanol, molasses starch, starch hydrolyzate and the like are added. In addition, as a nitrogen source, ammonium sulfate, ammonium nitrate, ammonium acetate, aqueous ammonium chloride,
In addition to inorganic nitrogen compounds such as ammonium phosphate, ammonium water and ammonium gas, organic nitrogen compounds such as amino acids and urea are used. Furthermore, in addition to the above-mentioned carbon source and nitrogen source, various metals, vitamins, amino acids, nucleic acids, quinones, etc. necessary for the growth of the microorganism to be used are appropriately added to the medium.
特に、本発明では、培地成分として微生物の酸化能力
を増強させるために、糖源アミノ酸を0.04〜0.07％を添
加している。培地中に種々のアミノ酸を添加した場合に
おける生菌数と酸化速度の関係と、これらのアミノ酸を
添加してＤ−ソルビットを50％仕込培養を行った場合の
醗酵終了時間を下記の第２表に示す。Particularly, in the present invention, 0.04 to 0.07% of a sugar source amino acid is added as a medium component to enhance the oxidizing ability of the microorganism. Table 2 below shows the relationship between the viable cell count and the oxidation rate when various amino acids were added to the medium, and the fermentation end time when 50% D-sorbitol was added to these amino acids and cultured. Shown in
上記第２表に示す如く、グルタミン酸、グルタミン、
アラニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、アスパ
ラギン酸等の糖源アミノ酸を添加することにより、生菌
数当たりの酸化速度を低下させることなく生菌数を高め
る効果があり、50％仕込培養でもこれらのアミノ酸を添
加した場合、発酵終了時間を短縮出来ることが認められ
た。 As shown in Table 2 above, glutamic acid, glutamine,
The addition of sugar-source amino acids such as alanine, serine, threonine, asparagine, and aspartic acid has the effect of increasing the number of viable cells without reducing the oxidation rate per viable cell number. It was found that when was added, the fermentation end time could be shortened.
本発明において、上記以外の培養条件は特に限定され
ない。即ち、培養温度は一般的には15℃ないし45℃であ
り、さらに好ましくは25℃ないし40℃である。培地のpH
は一般的には3.0ないし8.0であり、さらに好ましく3.5
ないし6.5である。培養時間は一般的には10ないし100時
間であり、さらに好ましくは15ないし40時間である。In the present invention, culture conditions other than those described above are not particularly limited. That is, the culture temperature is generally 15 ° C to 45 ° C, more preferably 25 ° C to 40 ° C. Medium pH
Is generally 3.0 to 8.0, more preferably 3.5
Or 6.5. The culture time is generally 10 to 100 hours, more preferably 15 to 40 hours.
本発明は、さらに、上記したＬ−ソルボースの製造法
を実施するために必要な微生物の培養装置を提供するも
のである。The present invention further provides an apparatus for culturing microorganisms necessary for performing the above-described method for producing L-sorbose.
即ち、本発明は、攪拌機を備え下部にガス供給口を有
すると共に上部にガス排出口を有する微生物の培養槽
と、上記培養槽に培養基質（Ｄ−ソルビット）を添加す
るための基質供給装置と、上記培養槽に酸素ガスで富化
した培養排気ガスを循環して供給するための液体酸素貯
槽と蒸発機からなる酸素ガス供給装置と、上記培養槽内
の培養液中の溶存酸素濃度を検出して溶存酸素濃度信号
を出力する溶存酸素濃度検出器と、上記溶存酸素濃度信
号を感知して溶存酸素の供給を調節する溶存酸素コント
ローラと、上記培養槽のガス排出管に設置された培養排
ガス中の炭酸ガス分圧を測定する炭酸ガス分圧測定器
と、上記炭酸ガスの分圧を感知して培養排ガスの一部を
系外に排出させる排気ガス放出装置と、上記排気ガスの
残部を培養槽のガス供給口に帰還させる導管と、上記培
養槽に空気を供給する空気送入装置とを備えたことを特
徴とする微生物の培養装置を提供するものである。That is, the present invention relates to a microorganism culturing tank having a stirrer and having a gas supply port at a lower part and a gas outlet at an upper part, and a substrate supply device for adding a culture substrate (D-sorbit) to the culture tank. An oxygen gas supply device comprising a liquid oxygen storage tank and an evaporator for circulating and supplying culture exhaust gas enriched with oxygen gas to the culture tank, and detecting a dissolved oxygen concentration in a culture solution in the culture tank A dissolved oxygen concentration detector that outputs a dissolved oxygen concentration signal; a dissolved oxygen controller that senses the dissolved oxygen concentration signal to adjust the supply of dissolved oxygen; and a culture exhaust gas installed in a gas discharge pipe of the culture tank. A carbon dioxide partial pressure measuring device that measures the carbon dioxide partial pressure in the inside, an exhaust gas discharge device that senses the partial pressure of the carbon dioxide and discharges a part of the culture exhaust gas out of the system, and a remaining part of the exhaust gas. Culture tank gas supply A conduit for feeding back to and provides a culture device of a microorganism is characterized in that an air delivery device for supplying air to the culture tank.
本発明の培養装置においては、培養槽内の培養液中の
溶存酸素濃度検出器としてガルバニ式酸素電極等からな
る溶存酸素センサーを用いており、該溶存酸素センサー
から検出信号を受ける溶存酸素コントローラを介して、
溶存酸素濃度信号に応じて空気流量弁または酸素ガス制
御弁の開度を調節し、よって、培養液中の溶存酸素濃度
を過不足のない状態、即ち、0.7ppm以上、好ましくは１
〜4ppmに制御している。In the culture device of the present invention, a dissolved oxygen sensor comprising a galvanic oxygen electrode or the like is used as a dissolved oxygen concentration detector in a culture solution in a culture tank, and a dissolved oxygen controller receiving a detection signal from the dissolved oxygen sensor is used. Through,
The degree of opening of the air flow valve or the oxygen gas control valve is adjusted in accordance with the dissolved oxygen concentration signal, so that the concentration of dissolved oxygen in the culture solution is not too high or low, that is, 0.7 ppm or more, preferably 1 ppm or more.
It is controlled to ~ 4ppm.
また、上記培養槽への培養基質（Ｄ−ソルビット）の
供給は、培養槽への酸素の供給量に対応させて、微生物
の増殖期以降において、培養液中のＤ−ソルビットの濃
度が５％を越えないように連続的または間欠的に添加
し、高濃度のＤ−ソルビットを短時間でＬ−ソルボース
へ酸化させるようにしている。In addition, the supply of the culture substrate (D-sorbit) to the culture tank corresponds to the supply amount of oxygen to the culture tank, and the concentration of D-sorbitol in the culture solution is 5% after the microorganism growth phase. Is added continuously or intermittently so as not to exceed the maximum concentration, so that high-concentration D-sorbitol is oxidized to L-sorbose in a short time.
また、本装置では、酸素分圧の高められた排気ガスを
コンプレッサーで回収して循環再使用することによって
省資源による経済化を図っており、この循環再使用する
排気ガス中の炭酸ガス分圧を適性化するために、排気ガ
ス系路に排気ガス中の炭酸ガス分圧を測定する赤外線吸
収式分析計等の炭酸ガス分圧測定器を設置し、該測定器
によって測定した炭酸ガス分圧に応じて系路に設けた大
気放出弁の開度を調節して適正量の排気ガスを放出し、
よって、培養槽へ帰還させる排気ガスの炭酸ガス分圧を
適性値（10％以下）に制御している。このように、炭酸
ガスを除去するために吸着剤を用いていた従来の装置に
代えて、本発明では排気ガスの一部を大気放出する構成
とすることにより、装置および保守点検を容易としてい
る。In this system, the exhaust gas with a high oxygen partial pressure is collected by a compressor and recycled for reuse to save resources and save money, and the carbon dioxide partial pressure in the exhaust gas to be recycled is reused. In order to optimize the partial pressure of carbon dioxide, install a carbon dioxide partial pressure measuring device such as an infrared absorption analyzer that measures the carbon dioxide partial pressure in the exhaust gas in the exhaust gas passage, and measure the carbon dioxide partial pressure measured by the measuring device. Adjust the opening of the atmospheric release valve provided in the system according to the and release the appropriate amount of exhaust gas,
Therefore, the carbon dioxide partial pressure of the exhaust gas returned to the culture tank is controlled to an appropriate value (10% or less). As described above, in place of the conventional apparatus using an adsorbent to remove carbon dioxide, the present invention adopts a configuration in which a part of exhaust gas is released to the atmosphere, thereby facilitating the apparatus and maintenance and inspection. .
さらに、本発明装置では、排気ガス中の酸素ガス分圧
をジルコニア式分析計等からなる酸素ガス分圧測定器で
測定する一方、培養槽への通気入口の酸素分圧を循環流
量と新鮮通気量とから算出して、酸素量消費量を求め、
該酸素消費量から基質の酸化量を推算しているものであ
る。Further, in the apparatus of the present invention, the oxygen gas partial pressure in the exhaust gas is measured by an oxygen gas partial pressure measuring device such as a zirconia analyzer, and the oxygen partial pressure at the ventilation inlet of the culture tank is measured by the circulation flow rate and fresh aeration. To calculate the oxygen consumption,
The oxidation amount of the substrate is estimated from the oxygen consumption amount.
実施例 以下、本発明を第５図に示す培養装置の実施例および
該培養装置によりＬ−ソルボースを製造する実施例につ
いて詳細に説明する。Example Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to an example of a culture apparatus shown in FIG. 5 and an example of producing L-sorbose by the culture apparatus.
図中、１は微生物の培養槽、２は培養槽１に培養基質
（Ｄ−ソルビット）を添加するための基質供給装置、３
は培養槽１へ培養排気ガスと混合して酸素ガスを供給す
る酸素ガス供給装置、４は培養槽１へ空気を供給するた
めの空気送入装置、５は培養槽１の排気ガスの一部を系
外へ排出させるガス放出装置、６は排気ガスを培養槽１
へ循環させるコンプレッサーである。In the figure, 1 is a microorganism culture tank, 2 is a substrate supply device for adding a culture substrate (D-sorbit) to the culture tank 1, 3
Is an oxygen gas supply device for supplying oxygen gas by mixing with the culture exhaust gas to the culture tank 1, 4 is an air supply device for supplying air to the culture tank 1, and 5 is a part of the exhaust gas of the culture tank 1 Gas discharge device for discharging exhaust gas out of the system.
It is a compressor that circulates to
上記培養槽１の内部にはモータで回転駆動される攪拌
機７を備え、下部にガス供給管８の供給口8aを連通し、
また、上部には排気ガス管９の排出口9aを連通すると共
に、基質供給装置２と導管10を介して連通している。A stirrer 7 driven by a motor is provided inside the culture tank 1, and a supply port 8 a of a gas supply pipe 8 communicates with a lower part of the culture tank 1.
The upper part is connected to the outlet 9a of the exhaust gas pipe 9 and to the substrate supply device 2 via a conduit 10.
基質供給装置２は基質タンク11、基質供給弁12、基質
供給ポンプ13とよりなり、基質タンク11より基質供給弁
12、基質供給ポンプ13を介して導管10を経て、培養槽１
へ培養基質（Ｄ−ソルビット）を供給するようにしてい
る。該Ｄ−ソルビットの供給は、培養槽１内における微
生物の増殖期以降において、培養液中のＤ−ソルビット
の濃度が約５％を越えないように連続的あるいは間欠的
に添加している。The substrate supply device 2 includes a substrate tank 11, a substrate supply valve 12, and a substrate supply pump 13.
12, the culture tank 1 via the conduit 10 via the substrate supply pump 13
The culture substrate (D-Sorbit) is supplied to the substrate. The supply of D-sorbitol is continuously or intermittently added so that the concentration of D-sorbite in the culture solution does not exceed about 5% after the growth period of the microorganisms in the culture tank 1.
上記ガス供給管８は、液体酸素貯槽14、緊急遮断弁1
5、蒸発器16とよりなる酸素ガス供給装置３と導管17を
介して連通しており、液体酸素を蒸発器16で気化させた
酸素ガスを導管17に介設した酸素ガス制御弁18により供
給量を調節しながら培養槽１へ供給するようにしてい
る。同様に、ガス供給管８を導管20を介して空気送入装
置４と連通し、該導管20に介設した空気流量制御弁21に
より培養槽１へ空気を供給するようにしている。The gas supply pipe 8 includes a liquid oxygen storage tank 14, an emergency shutoff valve 1
5. Oxygen gas supply device 3 comprising evaporator 16 is in communication with conduit 17 via conduit 17, and oxygen gas obtained by evaporating liquid oxygen in evaporator 16 is supplied by oxygen gas control valve 18 disposed in conduit 17. The amount is supplied to the culture tank 1 while adjusting the amount. Similarly, the gas supply pipe 8 is connected to the air feeding device 4 via a conduit 20, and air is supplied to the culture tank 1 by an air flow control valve 21 provided in the conduit 20.
上記酸素ガスおよび空気の供給量を調節する酸素ガス
制御弁18および空気流量制御弁21は、培養槽１内に設置
した溶存酸素検出器22から検出信号を受ける溶存酸素コ
ントローラ23により制御している。上記溶存酸素検出器
は、例えばガルバニ式酸素電極からなり、培養槽内の培
養液中の溶存酸素濃度を検出して溶存酸素コントローラ
23に溶存酸素濃度信号を出力するもので、該信号を感知
した溶存酸素コントローラ23により酸素ガス制御弁18お
よび空気流量制御弁21の開度を制御している。The oxygen gas control valve 18 and the air flow rate control valve 21 for adjusting the supply amounts of the oxygen gas and the air are controlled by a dissolved oxygen controller 23 which receives a detection signal from a dissolved oxygen detector 22 installed in the culture tank 1. . The dissolved oxygen detector includes, for example, a galvanic oxygen electrode, and detects a dissolved oxygen concentration in a culture solution in a culture tank to control a dissolved oxygen.
A dissolved oxygen concentration signal is output to 23, and the dissolved oxygen controller 23 that senses the signal controls the degree of opening of the oxygen gas control valve 18 and the air flow control valve 21.
上記空気送入装置４から培養槽１への空気の供給は、
微生物の増殖期まで溶存酸素濃度が一定レベルになるよ
うに行っており、微生物の増殖期以降は空気の供給を停
止して酸素ガス供給装置３から酸素ガスを培養槽１へ供
給し、溶存酸素濃度が0.7ppm以上、好ましく１〜4ppmと
なるように制御している。The supply of air from the air supply device 4 to the culture tank 1 is as follows:
The dissolved oxygen concentration is maintained at a constant level until the microorganism growth period. After the microorganism growth period, the supply of air is stopped, oxygen gas is supplied from the oxygen gas supply device 3 to the culture tank 1, and the dissolved oxygen concentration is increased. The concentration is controlled so as to be 0.7 ppm or more, preferably 1 to 4 ppm.
上記排気ガス管９はミストセバレータ24を介して前記
排気ガス放出装置５と導管25により連通すると共に、コ
ンプレッサー６と導管26により連通している。上記導管
25にはジルコニア式分析計などからなる酸素分圧測定器
27と、赤外線吸収式分析計などならなる炭酸ガス分圧測
定器28を取り付けている。上記炭酸ガス分圧測定器28に
より排気ガス中の炭酸ガスの分圧を検出し、該検出値の
信号を炭酸ガス分圧コントローラ29に出力し、該コント
ローラ29により排気ガス放出装置５の大気放出弁30の開
度を制御し、培養排気ガスの一部を系外に放出するよう
にしている。The exhaust gas pipe 9 communicates with the exhaust gas discharge device 5 via a mist separator 24 via a conduit 25, and communicates with the compressor 6 via a conduit 26. The above conduit
25 is an oxygen partial pressure measurement device consisting of a zirconia analyzer
27 and a carbon dioxide partial pressure measuring device 28 such as an infrared absorption analyzer. The partial pressure of carbon dioxide in the exhaust gas is detected by the carbon dioxide partial pressure measuring device 28, and a signal of the detected value is output to a carbon dioxide partial pressure controller 29. The opening of the valve 30 is controlled so that part of the culture exhaust gas is released to the outside of the system.
一方、上記コンプレッサー６は、通気循環弁31を設け
た循環用導管32を介して前記ガス供給管８と連通し、排
気ガス放出装置５より放出されなかった排気ガスの残部
をコンプレッサー６により循環させ、通気循環弁31によ
り流量を調整しながらガス供給管８を経て培養槽１へ帰
還させるようにしている。この排気ガスの循環再利用は
微生物の増殖期以降に酸素ガスの供給と併用して行い、
排気ガスに酸素ガスを混合した酸素富化ガスを培養槽１
に循環している。On the other hand, the compressor 6 communicates with the gas supply pipe 8 through a circulation conduit 32 provided with a ventilation circulation valve 31, and circulates the remainder of the exhaust gas not discharged from the exhaust gas discharge device 5 by the compressor 6. The gas is returned to the culture tank 1 through the gas supply pipe 8 while adjusting the flow rate by the ventilation circulation valve 31. This recycling of exhaust gas is carried out in combination with the supply of oxygen gas after the growth phase of microorganisms,
Oxygen-enriched gas obtained by mixing oxygen gas with exhaust gas
Is circulating.
次に、上記装置の作動を順次説明すると、 培養槽１の培養液中の溶存酸素濃度が所定の一定レベ
ルとなるように、溶存酸素コントローラ23により空気流
量制御弁21の開度を調節しながら空気送入装置４から培
養槽１へ空気を供給する。その際、例えば、初発仕込基
質濃度を20％とする場合、溶存酸素濃度を2ppmになるよ
うに空気を供給している。Next, the operation of the above-described apparatus will be sequentially described. The dissolved oxygen controller 23 adjusts the opening of the air flow control valve 21 by the dissolved oxygen controller 23 so that the concentration of dissolved oxygen in the culture solution in the culture tank 1 becomes a predetermined constant level. Air is supplied from the air supply device 4 to the culture tank 1. At this time, for example, when the initial charge substrate concentration is 20%, the air is supplied so that the dissolved oxygen concentration becomes 2 ppm.
基質濃度15％を酸化するに相当する酸素消費量を酸素
分圧測定器27によって算出すると、その時点から基質タ
ンク11から培養槽１への基質供給を開始する。When the oxygen consumption corresponding to oxidizing the substrate concentration of 15% is calculated by the oxygen partial pressure measuring device 27, the supply of the substrate from the substrate tank 11 to the culture tank 1 is started from that time.
空気送入装置４から培養槽１への空気流量が最大とな
り、かつ、溶存酸素濃度を所定レベルに保持できなくな
った時、溶存酸素コントローラ23により酸素ガス制御弁
18を開いて酸素ガスを培養槽１へ供給する。When the flow rate of air from the air supply device 4 to the culture tank 1 becomes maximum and the dissolved oxygen concentration cannot be maintained at a predetermined level, the dissolved oxygen controller 23 controls the oxygen gas control valve.
Open 18 to supply oxygen gas to the culture tank 1.
酸素ガスによる溶存酸素濃度の制御を開始した直後、
通気循環弁31を開くと共にコンプレッサー６を始動し、
排気ガスの培養槽１への循環を開始する一方、空気流量
制御弁21を閉じ、以後、溶存酸素濃度の維持を酸素ガス
にのみ依存して行う。Immediately after starting the control of dissolved oxygen concentration with oxygen gas,
Open the ventilation circulation valve 31 and start the compressor 6,
While the circulation of the exhaust gas to the culture tank 1 is started, the air flow control valve 21 is closed, and thereafter, the concentration of the dissolved oxygen is maintained only depending on the oxygen gas.
排気ガスの循環の開始すると、通気中に炭酸ガスが蓄
積する。よって、排気ガス中の炭酸ガス分圧を測定器28
で測定し、炭酸ガス分圧コントローラ29により大気放出
弁30を開き、排気ガスの一部を大気に放出し、通気中の
炭酸ガス分圧を一定値（10％）以下に保持する。When the circulation of the exhaust gas starts, carbon dioxide gas accumulates during the ventilation. Therefore, the partial pressure of carbon dioxide in the exhaust gas
The atmospheric pressure release valve 30 is opened by the carbon dioxide gas partial pressure controller 29, a part of the exhaust gas is released to the atmosphere, and the carbon dioxide gas partial pressure during ventilation is kept at a constant value (10%) or less.
培養槽１に基質を所定量供給すると、供給を停止す
る。When a predetermined amount of the substrate is supplied to the culture tank 1, the supply is stopped.
培養槽１内で醗酵が進行し、終了に近付くと、必要酸
素量が低下するため、酸素ガスの培養槽１への流入を停
止し、かつ、コンプレッサー６を停止すると共に通気循
環弁31を閉じて排気ガスの培養槽１への流入も停止し、
空気送入装置４からの空気の供給を再開する。As the fermentation progresses in the culture tank 1 and approaches the end, the required amount of oxygen decreases. Therefore, the flow of oxygen gas into the culture tank 1 is stopped, the compressor 6 is stopped, and the ventilation circulation valve 31 is closed. To stop the flow of exhaust gas into the culture tank 1,
The supply of air from the air supply device 4 is restarted.
上記空気通気により培養槽１内の溶存酸素濃度は急上
昇し、酸素分圧も上昇する。排気ガス中の酸素分圧が所
定値（20％）に達した時点をもって醗酵が終了する。Due to the air ventilation, the dissolved oxygen concentration in the culture tank 1 rises rapidly, and the oxygen partial pressure also rises. The fermentation ends when the oxygen partial pressure in the exhaust gas reaches a predetermined value (20%).
次に、上記培養装置を用いて、Ｌ−ソルボースを製造
した実施例を記載する。Next, an example in which L-sorbose was produced using the above-described culture apparatus will be described.
《実施例１》 グルコノバクター・サブオキシダンスIFO 3254をＤ−
ソルビット20％、グルタミン酸ナトリウム0.2％、炭酸
カルシウム0.018％、ニコチン酸アミド0.003％、パント
テン酸カルシウム0.0003％、ビタミンB20.0001％、パラ
アミノ安息香酸0.0001％、リン酸−カリウム0.047％、
酵母エキス0.03％、硫酸マグネシウム0.01％、硫酸第１
鉄0.00015％、硫酸マンガン0.00001％、アクトコール0.
0005％からなる培地10に接種し、30℃、24時間培養
し、これを種としてＤ−ソルビット20％、酢酸アンモニ
ウム0.06％、グルタミン酸ナトリウム0.102％、炭酸カ
ルシウム0.06％、ニコチン酸アミド0.006％、パントテ
ン酸カルシウム0.0005％、ビタミンB20.0002％、パラア
ミノ安息香酸0.00002％、リン酸−カリウム0.04％、硫
酸マグネシウム0.02％、硫酸第１鉄0.0003％、硫酸マン
ガン0.00002％からなる培地49に移植した。Example 1 Gluconobacter suboxydans IFO 3254 was D-
Sorbitol 20%, sodium glutamate 0.2%, 0.018% calcium carbonate, 0.003% nicotinamide, 0.0003% of calcium pantothenate, Vitamin B 2 0.0001% 0.0001% para-aminobenzoic acid, phosphoric acid - potassium 0.047%,
Yeast extract 0.03%, magnesium sulfate 0.01%, sulfuric acid first
0.00015% of iron, 0.00001% of manganese sulfate, Actol 0.
0005%, inoculated in a medium 10 and cultured at 30 ° C. for 24 hours. Using this as a seed, D-sorbitol 20%, ammonium acetate 0.06%, sodium glutamate 0.102%, calcium carbonate 0.06%, nicotinamide 0.006%, pantothene 0.0005% calcium, vitamin B 2 0.0002%, 0.00002 para-aminobenzoic acid% phosphoric acid - 0.04% potassium, 0.02% magnesium sulfate, ferrous 0.0003% sulfuric acid, were transplanted to the medium 49 consisting of 0.00002% of manganese sulfate.
これを30℃で培養し、培養開始後、溶存酸素濃度を2.
5±0.5ppmになるように空気送入装置４からの通気量を
0.1〜0.6vvmおよび培養槽の内圧0.1〜1.8Kg/cm2Gの範囲
で調整し、最大通気条件0.6vvm、内圧1.8Kg/cm2Gに到達
後は、溶存酸素濃度を2.5±0.5ppmになるように酸素ガ
ス供給装置３より液体酸素を気化させた酸素ガスをガス
供給管８に導入して培養槽１に通気し、同時に空気通気
を停止し、コンプレッサー６を始動させて排気を回収し
て培養槽１へ循環した。以後、循環空気の一部（0.03vv
m）を排気ガス放出装置５で大気に放出し、炭酸ガスの
蓄積を防ぎ、酸素ガスを通気して溶存酸素濃度を維持
し、内圧維持のために不足する空気量は保圧からの空気
により補った。This was cultured at 30 ° C, and after the start of the culture, the dissolved oxygen concentration was increased to 2.
Ventilation volume from the air supply device 4 should be 5 ± 0.5ppm
Adjust the 0.1~0.6vvm and scope of the internal pressure 0.1~1.8Kg / cm 2 G of the culture tank, the maximum aeration conditions 0.6Vvm, after reaching the inner pressure 1.8 kg / cm 2 G, the dissolved oxygen concentration to 2.5 ± 0.5 ppm The oxygen gas obtained by evaporating liquid oxygen from the oxygen gas supply device 3 is introduced into the gas supply pipe 8 and ventilated into the culture tank 1, and at the same time, the air ventilation is stopped, and the compressor 6 is started to collect the exhaust gas. And circulated to the culture tank 1. Thereafter, part of the circulating air (0.03vv
m) is discharged to the atmosphere by the exhaust gas discharge device 5 to prevent the accumulation of carbon dioxide gas, maintain the dissolved oxygen concentration by passing oxygen gas, and reduce the amount of air required for maintaining the internal pressure by air from the holding pressure. Supplemented.
一方、培養の進行と共に酸化されるＤ−ソルビットは
培養液中の濃度が５％になった時点から基質供給装置２
より培養槽１へ添加を開始し、60W/W％Ｄ−ソルビット
水溶液を51添加して培養し、合計20時間培養した。On the other hand, D-sorbitol, which is oxidized as the cultivation progresses, starts from the point in time when the concentration in the culture solution becomes 5%.
Then, the addition to the culture tank 1 was started, 51 aqueous solutions of 60 W / W% D-sorbite were added, and the cells were cultured for a total of 20 hours.
上記培養法によりバッチ当たりの仕込みＤ−ソルビッ
ト濃度50W/V％の培養が20時間で可能となり、Ｌ−ソル
ボースが対Ｄ−ソルビット収率95％で蓄積された。The above culture method enabled a culture with a charged D-sorbitol concentration of 50 W / V% per batch in 20 hours, and L-sorbose was accumulated at a yield of 95% based on D-sorbitol.
《実施例２》 グルコノバクター・サブオキシダンスIFO 3254をＤ−
ソルビット20％、グルタミン酸ナトリウム0.2％、炭酸
カルシウム0.018％、ニコチン酸アミド0.003％、パント
テン酸カルシウム0.0003％、ビタミンB20.0001％、パラ
アミノ安息香酸0.0001％、リン酸−カリウム0.047％、
酵母エキス0.03％、硫酸マグネシウム0.01％、硫酸第１
鉄0.00015％、硫酸マンガン0.00001％、アクトコール0.
0005％からなる培地10に接種し、30℃、24時間培養
し、これを種としてＤ−ソルビット25％、酢酸アンモニ
ウム0.08％、アラニン0.067％、炭酸カルシウム0.06
％、ニコチン酸アミド0.006％、パントテン酸カルシウ
ム0.0005％、ビタミンB20.0002％、パラアミノ安息香酸
0.00002％、リン酸−カリウム0.04％、硫酸マグネシウ
ム0.02％、硫酸第１鉄0.0003％、硫酸マンガン0.00002
％からなる培地54に移植した。Example 2 Gluconobacter suboxydans IFO 3254 was added to D-
Sorbitol 20%, sodium glutamate 0.2%, 0.018% calcium carbonate, 0.003% nicotinamide, 0.0003% of calcium pantothenate, Vitamin B 2 0.0001% 0.0001% para-aminobenzoic acid, phosphoric acid - potassium 0.047%,
Yeast extract 0.03%, magnesium sulfate 0.01%, sulfuric acid first
0.00015% of iron, 0.00001% of manganese sulfate, Actol 0.
0005%, and inoculated at 30 ° C. for 24 hours. The seeds were used as seeds for D-sorbit 25%, ammonium acetate 0.08%, alanine 0.067%, calcium carbonate 0.06%.
%, Nicotinamide 0.006%, calcium pantothenate 0.0005%, vitamin B 2 0.0002%, para-aminobenzoic acid
0.00002%, potassium-phosphate 0.04%, magnesium sulfate 0.02%, ferrous sulfate 0.0003%, manganese sulfate 0.00002
% Of medium 54.
これを30℃で培養し、培養開始後、溶存酸素濃度を2.
5±0.5ppmになるように空気送入装置４からの通気量を
0.1〜0.6vvmおよび培養槽の内圧0.1〜1.8Kg/cm2Gの範囲
で調整し、最大通気条件0.6vvm、内圧1.8Kg/cm2Gに到達
後は、溶存酸素濃度を2.5±0.5ppmになるように酸素ガ
ス供給装置３より液体酸素を気化させた酸素ガスをガス
供給管８に導入して培養槽１に通気し、同時に空気通気
を停止し、コンプレッサー６を始動させて排気を回収し
て培養槽１へ循環した。以後、循環空気の一部（0.03vv
m）を排気ガス放出装置５で大気に放出し、炭酸ガスの
蓄積を防ぎ、酸素ガスを通気して溶存酸素濃度を維持
し、内圧維持のために不足する空気量は保圧からの空気
により補った。This was cultured at 30 ° C, and after the start of the culture, the dissolved oxygen concentration was increased to 2.
Ventilation volume from the air supply device 4 should be 5 ± 0.5ppm
Adjust the 0.1~0.6vvm and scope of the internal pressure 0.1~1.8Kg / cm 2 G of the culture tank, the maximum aeration conditions 0.6Vvm, after reaching the inner pressure 1.8 kg / cm 2 G, the dissolved oxygen concentration to 2.5 ± 0.5 ppm The oxygen gas obtained by evaporating liquid oxygen from the oxygen gas supply device 3 is introduced into the gas supply pipe 8 and ventilated into the culture tank 1, and at the same time, the ventilation is stopped and the compressor 6 is started to collect the exhaust gas. And circulated to the culture tank 1. Thereafter, part of the circulating air (0.03vv
m) is discharged to the atmosphere by the exhaust gas discharge device 5 to prevent the accumulation of carbon dioxide gas, maintain the dissolved oxygen concentration by passing oxygen gas, and reduce the amount of air shortage for maintaining the internal pressure by air from the holding pressure. Supplemented.
一方、培養の進行と共に酸化されるＤ−ソルビットは
培養液中の濃度が５％になった時点から基質供給装置２
より培養槽１へ添加を開始し、60W/W％Ｄ−ソルビット
水溶液を51添加して培養し、合計20時間培養した。On the other hand, D-sorbitol, which is oxidized as the cultivation progresses, starts from the point in time when the concentration in the culture solution becomes 5%.
Then, the addition to the culture tank 1 was started, 51 aqueous solutions of 60 W / W% D-sorbite were added, and the cells were cultured for a total of 20 hours.
上記培養法によりバッチ当たりの仕込みＤ−ソルビッ
ト濃度50W/V％の培養が20時間で可能となり、Ｌ−ソル
ボースが対Ｄ−ソルビット収率95％で蓄積された。The above culture method enabled a culture with a charged D-sorbitol concentration of 50 W / V% per batch in 20 hours, and L-sorbose was accumulated at a yield of 95% based on D-sorbitol.
《実施例３》 グルコノバクター・サブオキシダンスBL−９（IFO 14
889、FERM BP−1241）をＤ−ソルビット20％、グリセ
リン0.3％、グルタミン酸ナトリウム0.2％、炭酸カルシ
ウム0.018％、ニコチン酸アミド0.003％、パントテン酸
カルシウム0.0003％、ビタミンB20.0001％、パラアミノ
安息香酸0.0001％、リン酸−カリウム0.047％、硫酸マ
グネシウム0.01％、硫酸第１鉄0.00015％、硫酸マンガ
ン0.00001％、アクトコール0.0005％からなる培地10
に接種し、30℃、24時間培養し、これを種としてＤ−ソ
ルビット20％、グルタミン酸0.05％、酢酸アンモニウム
0.06％、グルタミン酸ナトリウム0.102％、炭酸カルシ
ウム0.06％、ニコチン酸アミド0.006％、パントテン酸
カルシウム0.0005％、ビタミンB20.0002％、パラアミノ
安息香酸0.00002％、リン酸−カリウム0.04％、硫酸マ
グネシウム0.02％、硫酸第１鉄0.0003％、硫酸マンガン
0.00002％からなる培地49に移植した。<< Example 3 >> Gluconobacter suboxydans BL-9 (IFO 14
889, FERM BP-1241) from D-sorbitol 20%, glycerin 0.3%, sodium glutamate 0.2%, calcium carbonate 0.018%, nicotinamide 0.003%, calcium pantothenate 0.0003%, vitamin B 2 0.0001%, paraaminobenzoic acid 0.0001% %, Potassium phosphate-0.047%, magnesium sulfate 0.01%, ferrous sulfate 0.00015%, manganese sulfate 0.00001%, and ACTOCOL 0.0005%.
And cultured at 30 ° C. for 24 hours. The seeds are used as seeds for D-sorbitol 20%, glutamic acid 0.05%, ammonium acetate
0.06%, 0.102% sodium glutamate, 0.06% calcium carbonate, nicotinamide 0.006% or, calcium pantothenate 0.0005%, vitamin B 2 0.0002% 0.00002% para-aminobenzoic acid, phosphoric acid - 0.04% potassium, 0.02% magnesium sulfate, 0.0003% ferrous iron, manganese sulfate
The cells were transplanted to a medium 49 consisting of 0.00002%.
これを30℃で培養し、培養開始後、溶存酸素濃度を2.
5±0.5ppmになるように空気送入装置４からの通気量を
0.1〜0.6vvmおよび培養槽の内圧0.1〜1.8Kg/cm2Gの範囲
で調整し、最大通気条件0.6vvm、内圧1.8Kg/cm2Gに到達
後は、溶存酸素濃度を2.5±0.5ppmになるように酸素ガ
ス供給装置３より液体酸素を気化させた酸素ガスをガス
供給管８に導入し培養槽１に通気し、同時に空気通気を
停止し、コンプレッサー６を始動させて排気を回収して
培養槽１へ循環した。以後、循環空気の一部（0.03vv
m）を排気ガス放出装置５で大気に放出し、炭酸ガスの
蓄積を防ぎ、酸素ガスを通気して溶存酸素濃度を維持
し、内圧維持のために不足する空気量は保圧からの空気
により補った。This was cultured at 30 ° C, and after the start of the culture, the dissolved oxygen concentration was increased to 2.
Ventilation volume from the air supply device 4 should be 5 ± 0.5ppm
Adjust the 0.1~0.6vvm and scope of the internal pressure 0.1~1.8Kg / cm 2 G of the culture tank, the maximum aeration conditions 0.6Vvm, after reaching the inner pressure 1.8 kg / cm 2 G, the dissolved oxygen concentration to 2.5 ± 0.5 ppm The oxygen gas obtained by evaporating liquid oxygen from the oxygen gas supply device 3 is introduced into the gas supply pipe 8 and ventilated into the culture tank 1, and at the same time, the air ventilation is stopped and the compressor 6 is started to collect the exhaust gas. It circulated to the culture tank 1. Thereafter, part of the circulating air (0.03vv
m) is discharged to the atmosphere by the exhaust gas discharge device 5 to prevent the accumulation of carbon dioxide gas, maintain the dissolved oxygen concentration by passing oxygen gas, and reduce the amount of air shortage for maintaining the internal pressure by air from the holding pressure. Supplemented.
一方、培養の進行と共に酸化されるＤ−ソルビットは
培養液中の濃度が５％になった時点から基質供給装置２
より培養槽１へ添加を開始し、60W/W％Ｄ−ソルビット
水溶液を51添加して培養し、合計20時間培養した。On the other hand, D-sorbitol, which is oxidized as the cultivation progresses, starts from the point in time when the concentration in the culture solution becomes 5%.
Then, the addition to the culture tank 1 was started, 51 aqueous solutions of 60 W / W% D-sorbite were added, and the cells were cultured for a total of 20 hours.
上記培養法によりバッチ当たりの仕込みＤ−ソルビッ
ト濃度50W/V％の培養が20時間で可能となり、Ｌ−ソル
ボースが対Ｄ−ソルビット収率97.5％で蓄積された。The above culture method enabled a culture with a charged D-sorbitol concentration of 50 W / V% per batch in 20 hours, and L-sorbose was accumulated at a yield of 97.5% based on D-sorbitol.
《実施例４》 グルコノバクター・サブオキシダンスBL−115（IFO 1
4490、FERM BP−1240）をＤ−ソルビット20％、グリセ
リン0.3％、グルタミン酸ナトリウム0.2％、炭酸カルシ
ウム0.018％、ニコチン酸アミド0.003％、パントテン酸
カルシウム0.0003％、ビタミンB20.0001％、パラアミノ
安息香酸0.0001％、リン酸−カリウム0.047％、硫酸マ
グネシウム0.01％、硫酸第１鉄0.00015％、硫酸マンガ
ン0.00001％、アクトコール0.0005％からなる培地10
に接種し、30℃、24時間培養し、これを種としてＤ−ソ
ルビット25％、グリセリン0.05％、酢酸アンモニウム0.
08％、アラニン0.067％、炭酸カルシウム0.06％、ニコ
チン酸アミド0.006％、パントテン酸カルシウム0.0005
％、ビタミンB20.0002％、パラアミノ安息香酸0.00002
％、リン酸−カリウム0.04％、硫酸マグネシウム0.02
％、硫酸第１鉄0.0003％、硫酸マンガン0.00002％から
なる培地54に移植した。Example 4 Gluconobacter suboxydans BL-115 (IFO 1
4490, FERM BP-1240) D-sorbitol 20%, glycerin 0.3%, sodium glutamate 0.2%, calcium carbonate 0.018%, nicotinamide 0.003%, calcium pantothenate 0.0003%, vitamin B 2 0.0001%, paraaminobenzoic acid 0.0001% %, Potassium phosphate-0.047%, magnesium sulfate 0.01%, ferrous sulfate 0.00015%, manganese sulfate 0.00001%, and ACTOCOL 0.0005%.
, And cultured at 30 ° C. for 24 hours. Using this as a seed, D-sorbit 25%, glycerin 0.05%, ammonium acetate 0.1% were used.
08%, alanine 0.067%, calcium carbonate 0.06%, nicotinamide 0.006%, calcium pantothenate 0.0005
%, Vitamin B 2 0.0002%, paraaminobenzoic acid 0.00002
%, Phosphoric acid-potassium 0.04%, magnesium sulfate 0.02%
%, Ferrous sulfate 0.0003%, and manganese sulfate 0.00002%.
これを30℃で培養し、培養開始後、溶存酸素濃度を2.
5±0.5ppmになるように空気送入装置４からの通気量を
0.1〜0.6vvmおよび培養槽の内圧0.1〜1.8Kg/cm2Gの範囲
で調整し、最大通気条件0.6vvm、内圧1.8Kg/cm2Gに到達
後は、溶存酸素濃度を2.5±0.5ppmになるように酸素ガ
ス供給装置３より液体酸素を気化させた酸素ガスをガス
供給管８に導入して培養槽１に通気し、同時に空気通気
を停止し、コンプレッサー６を始動させて排気を回収し
て培養槽１へ循環した。以後、循環空気の一部（0.03vv
m）を排気ガス放出装置５で大気に放出し、炭酸ガスの
蓄積を防ぎ、酸素ガスを通気して溶存酸素濃度を維持
し、内圧維持のために不足する空気量は保圧からの空気
により補った。This was cultured at 30 ° C, and after the start of the culture, the dissolved oxygen concentration was increased to 2.
Ventilation volume from the air supply device 4 should be 5 ± 0.5ppm
Adjust the 0.1~0.6vvm and scope of the internal pressure 0.1~1.8Kg / cm 2 G of the culture tank, the maximum aeration conditions 0.6Vvm, after reaching the inner pressure 1.8 kg / cm 2 G, the dissolved oxygen concentration to 2.5 ± 0.5 ppm The oxygen gas obtained by evaporating liquid oxygen from the oxygen gas supply device 3 is introduced into the gas supply pipe 8 and ventilated into the culture tank 1, and at the same time, the ventilation is stopped and the compressor 6 is started to collect the exhaust gas. And circulated to the culture tank 1. Thereafter, part of the circulating air (0.03vv
m) is discharged to the atmosphere by the exhaust gas discharge device 5 to prevent the accumulation of carbon dioxide gas, maintain the dissolved oxygen concentration by passing oxygen gas, and reduce the amount of air shortage for maintaining the internal pressure by air from the holding pressure. Supplemented.
一方、培養の進行と共に酸化されるＤ−ソルビットは
培養液中の濃度が５％になった時点から基質供給装置２
より培養槽１へ添加を開始し、60W/W％Ｄ−ソルビット
水溶液を51添加して培養し、合計20時間培養した。On the other hand, D-sorbitol, which is oxidized as the cultivation progresses, starts from the point in time when the concentration in the culture solution becomes 5%.
Then, the addition to the culture tank 1 was started, 51 aqueous solutions of 60 W / W% D-sorbite were added, and the cells were cultured for a total of 20 hours.
上記培養法によりバッチ当たりの仕込みＤ−ソルビッ
ト濃度50W/V％の培養が20時間で可能となり、Ｌ−ソル
ボースが対Ｄ−ソルビット収率97.3％で蓄積された。The above culture method enabled a culture with a charged D-sorbitol concentration of 50 W / V% per batch in 20 hours, and L-sorbose was accumulated at a yield of 97.3% relative to D-sorbitol.
発明の効果 以上の説明より明らかなように、本発明によると、Ｄ
−ソルビットを微生物学的に酸化してＬ−ソルボースを
製造する方法において、従来法に比較して、Ｌ−ソルボ
ースの収率を増大させることが出来る。即ち、従来法で
はＤ−ソルビットに対するＬ−ソルボースの収率は高く
ても約93％までであったが、本発明によると従来法より
も２〜３％以上収率をあげることができ、しかも、Ｄ−
フラクトース、２−ケトグルコン酸、５−ケトフラクト
ース等の副生物の生成を少なくすることが出来る。ま
た、本発明によると、増殖期以降において、培地中にお
いけるＤ−ソルビットの濃度を５％を越えないようにし
ているため、高濃度のＤ−ソルビットを短時間でＬ−ソ
ルボースへ酸化させることが出来、バッチ当たりの収量
向上を図ることが出来る。Effect of the Invention As is clear from the above description, according to the present invention, D
In the method for producing L-sorbose by microbiologically oxidizing sorbitol, the yield of L-sorbose can be increased as compared with the conventional method. That is, in the conventional method, the yield of L-sorbose relative to D-sorbitol was at most about 93%, but according to the present invention, the yield could be 2-3% or more than the conventional method, and , D-
The generation of by-products such as fructose, 2-ketogluconic acid, and 5-ketofructose can be reduced. Further, according to the present invention, since the concentration of D-sorbitol in the medium does not exceed 5% after the growth phase, high-concentration D-sorbitol is oxidized to L-sorbose in a short time. And the yield per batch can be improved.
さらに、本発明の培養装置では、排気ガスを再利用し
て省資源化による経済性効果を高めることが出来ると共
に、排気ガス中の炭酸ガス希釈するため、従来の吸着剤
を用いる方法に代えて、排気ガスの一部を系外に放出す
る方式を用いているため、装置が簡単となり、かつ、保
守上も有利となる。Further, in the culturing apparatus of the present invention, the exhaust gas can be reused to improve the economic effect by saving resources, and the carbon dioxide gas in the exhaust gas is diluted, so that the conventional method using an adsorbent is used instead. Since the method of discharging a part of the exhaust gas to the outside of the system is used, the apparatus is simplified and the maintenance is advantageous.
上記した種々の効果より、ビタミンＣ製造における原
料コスト中、その占める割合の極めて高いＬ−ソルボー
スを従来よりも安価に供給することができ、よって、医
薬、食品等において幅広い用途を有するビタミンＣの製
造コストが低減される。From the various effects described above, L-sorbose, which accounts for an extremely high proportion of the raw material cost in the production of vitamin C, can be supplied at a lower cost than before, and therefore, vitamin C having a wide range of uses in medicine, food, and the like. Manufacturing costs are reduced.
【図面の簡単な説明】 第１図は初発Ｄ−ソルビット濃度と比増殖速度の関係を
示す線図、第２図はＤ−ソルビット濃度とＬ−ソルボー
ス生成速度の関係を示す線図、第３図は炭酸ガス分圧と
比増殖速度の関係を示す線図、第４図は炭酸ガス分圧と
Ｌ−ソルボース生成速度の関係を示す線図、第５図は本
発明の培養装置の実施例をしめす全体図である。 １……培養槽、２……基質供給装置 ３……酸素ガス供給装置 ４……空気送入装置、５……排気ガス放出装置 ６……コンプレッサー ７……攪拌機、８……ガス供給管 ９……ガス排気管、11……基質タンク 14……液体酸素貯槽 16……蒸発器、22……溶存酸素検出器 23……溶存酸素コントローラ 27……酸素分圧測定器 28……炭酸ガス分圧測定器 29……炭酸ガス分圧コントローラ 30……大気放出弁、32……循環用導管BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a diagram showing the relationship between the initial D-sorbitol concentration and the specific growth rate, FIG. 2 is a diagram showing the relationship between the D-sorbitol concentration and the L-sorbose generation speed, and FIG. The figure shows a diagram showing the relationship between the partial pressure of carbon dioxide and the specific growth rate, FIG. 4 shows a diagram showing the relationship between the partial pressure of carbon dioxide and the production rate of L-sorbose, and FIG. 5 shows an embodiment of the culture apparatus of the present invention. FIG. DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 ... Culture tank, 2 ... Substrate supply device 3 ... Oxygen gas supply device 4 ... Air supply device, 5 ... Exhaust gas discharge device 6 ... Compressor 7 ... Agitator, 8 ... Gas supply pipe 9 ... gas exhaust pipe, 11 ... substrate tank 14 ... liquid oxygen storage tank 16 ... evaporator, 22 ... dissolved oxygen detector 23 ... dissolved oxygen controller 27 ... oxygen partial pressure measuring instrument 28 ... carbon dioxide Pressure measuring device 29: CO2 partial pressure controller 30 ... Atmospheric release valve, 32 ... Circulation conduit
Claims (5)
−ソルボースを製造するに際して、利用する微生物の増
殖期以降の培養において、 Ｄ−ソルビットを培養液中の濃度が約５％を越えないよ
うに添加しつつ、酸素ガスで富化した培養排気ガスを循
環して培地中の溶存酸素濃度を制御し、かつ、上記排気
ガスの一部を系外に排出させて、循環ガス中の炭酸ガス
分圧を制御しながら培養することを特徴とするＬ−ソル
ボースの製造法。1. The method of claim 1 wherein D-sorbitol is oxidized microbiologically to
-In producing sorbose, in the culture after the growth phase of the microorganism to be used, the culture exhaust gas enriched with oxygen gas is added while adding D-sorbite so that the concentration in the culture solution does not exceed about 5%. Culturing while controlling the concentration of dissolved oxygen in the culture medium and discharging a part of the exhaust gas out of the system to control the partial pressure of carbon dioxide in the circulating gas. Sorbose manufacturing method.
て、Ｄ−ソルビットの初発仕込濃度を８〜25％とすると
共に増殖期以降は５％を越えないように添加して最終仕
込濃度を40〜60％とし、また、増殖期以降に酸素ガスで
富加した培養排気ガスを循環することにより培地中の溶
存酸素濃度を0.5ppm以上に制御し、かつ、循環排気ガス
の一部を放出して通気ガス中の炭酸ガス分圧を10％以下
に制御することを特徴とするＬ−ソルボースの製造法。2. The method according to claim 1, wherein the initial charge concentration of D-sorbit is 8 to 25%, and is added so as not to exceed 5% after the growth phase. 40-60% and circulating culture exhaust gas enriched with oxygen gas after the growth phase to control the dissolved oxygen concentration in the culture medium to 0.5 ppm or more and release part of the circulating exhaust gas Controlling the partial pressure of carbon dioxide in the ventilation gas to 10% or less.
て、培地中の成分として糖源アミノ酸を0.04〜0.07％を
添加することを特徴とするＬ−ソルボースの製造法。3. The method for producing L-sorbose according to claim 1, wherein 0.04 to 0.07% of a sugar source amino acid is added as a component in the medium.
と共に上部にガス排出口を有する微生物の培養槽と、上
記培養槽に培養基質を添加するための基質供給装置と、 上記培養槽に酸素ガスで富化した培養排気ガスを供給す
るための液体酸素貯槽と蒸発機からなる酸素ガス供給装
置と、 上記培養槽内の培養液中の溶存酸素濃度を検出して溶存
酸素濃度信号を出力する溶存酸素濃度検出器と、 上記溶存酸素濃度信号を感知して溶存酸素の供給を調節
する溶存酸素コントローラと、 上記培養槽からの排気ガス管に設置され、培養排気ガス
中の炭酸ガス分圧を測定する炭酸ガス測定器と、 上記炭酸ガスの分圧を感知して培養排ガスの一部を系外
に放出させる排気ガス放出装置と、 上記培養排気ガスの残部を培養槽のガス供給口に循環さ
せる導管と、 上記培養槽へ空気を供給する空気送入装置と を備えたことを特徴とするＬ−ソルボース生産能を有す
る微生物の培養装置。4. A microorganism culture tank having a stirrer, having a gas supply port at a lower part and a gas discharge port at an upper part, a substrate supply device for adding a culture substrate to the culture tank, An oxygen gas supply device comprising a liquid oxygen storage tank and an evaporator for supplying a culture exhaust gas enriched with oxygen gas, and a dissolved oxygen concentration signal is output by detecting the dissolved oxygen concentration in the culture solution in the culture tank A dissolved oxygen concentration detector, a dissolved oxygen controller that senses the dissolved oxygen concentration signal to adjust the supply of dissolved oxygen, and a carbon dioxide partial pressure in the culture exhaust gas, which is installed in an exhaust gas pipe from the culture tank. A carbon dioxide gas measuring device for measuring the partial pressure of the carbon dioxide gas, and an exhaust gas discharging device for releasing a part of the culture exhaust gas to the outside of the system. Circulating conduit , Culture apparatus microorganism having L- sorbose producing ability, characterized by comprising an air delivery device for supplying air to the culture vessel.
いて、上記空気送入装置から培養槽への空気供給管に空
気流量制御弁を介設し、該空気流量制御弁を上記溶存酸
素コントローラにより制御し、微生物の増殖期までは、
溶存酸素コントローラによる空気流量の制御で溶存酸素
濃度を一定レベルに制御する構成としたことを特徴とす
る微生物の培養装置。5. The culturing apparatus according to claim 4, wherein an air flow control valve is provided in an air supply pipe from the air supply device to the culture tank, and the air flow control valve is connected to the dissolved oxygen. Controlled by a controller, until the microorganism growth phase,
An apparatus for culturing microorganisms, wherein the concentration of dissolved oxygen is controlled to a constant level by controlling an air flow rate by a dissolved oxygen controller.
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|---|---|---|---|
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