JP2584594B2 - 代謝標識ｄｎａの検出方法及び前記方法に使用される試薬キット - Google Patents
代謝標識ｄｎａの検出方法及び前記方法に使用される試薬キットInfo
- Publication number
- JP2584594B2 JP2584594B2 JP6129079A JP12907994A JP2584594B2 JP 2584594 B2 JP2584594 B2 JP 2584594B2 JP 6129079 A JP6129079 A JP 6129079A JP 12907994 A JP12907994 A JP 12907994A JP 2584594 B2 JP2584594 B2 JP 2584594B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- antibody
- cells
- metabolically labeled
- bromodeoxyuridine
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 38
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 15
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 69
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 28
- 229950004398 broxuridine Drugs 0.000 claims description 26
- WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 5-bromodeoxyuridine Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 25
- WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N BROMODEOXYURIDINE Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(=O)NC(=O)C(Br)=C1 WOVKYSAHUYNSMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 14
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 claims description 11
- KLWPJMFMVPTNCC-UHFFFAOYSA-N Camptothecin Natural products CCC1(O)C(=O)OCC2=C1C=C3C4Nc5ccccc5C=C4CN3C2=O KLWPJMFMVPTNCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- VSJKWCGYPAHWDS-FQEVSTJZSA-N camptothecin Chemical compound C1=CC=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)[C@]5(O)CC)C4=NC2=C1 VSJKWCGYPAHWDS-FQEVSTJZSA-N 0.000 claims description 9
- 229940127093 camptothecin Drugs 0.000 claims description 9
- VSJKWCGYPAHWDS-UHFFFAOYSA-N dl-camptothecin Natural products C1=CC=C2C=C(CN3C4=CC5=C(C3=O)COC(=O)C5(O)CC)C4=NC2=C1 VSJKWCGYPAHWDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 9
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 claims description 8
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 claims description 5
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 claims description 5
- 238000002372 labelling Methods 0.000 claims description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 4
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 4
- HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 2,3,7,8-tetrachloro-dibenzo-p-dioxin Chemical compound O1C2=CC(Cl)=C(Cl)C=C2OC2=C1C=C(Cl)C(Cl)=C2 HGUFODBRKLSHSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000005865 ionizing radiation Effects 0.000 claims description 3
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 claims description 3
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 23
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 20
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 13
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 10
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 9
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 8
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 6
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 5
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 5
- 238000001466 metabolic labeling Methods 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 4
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 3
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108010033040 Histones Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002187 allostimulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 208000037887 cell injury Diseases 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- -1 ethylphenyl Chemical group 0.000 description 1
- 108010086271 exodeoxyribonuclease II Proteins 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 238000003505 heat denaturation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 238000003118 sandwich ELISA Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、代謝標識ＤＮＡの非放
射性検出方法並びにこの方法を行うのに適する試薬キッ
トに関する。
射性検出方法並びにこの方法を行うのに適する試薬キッ
トに関する。
【０００２】
【従来の技術】細胞の増殖能力の測定は、細胞生物学に
おける研究にとって非常に重要なものである。この方法
においては、試験される細胞個体群のＤＮＡを代謝標識
する。即ち、増殖中の細胞にＤＮＡ生合成の標識された
前駆体をＤＮＡ中に取り込ませる。ゲノミックＤＮＡの
代謝標識の標準的方法では、そのような前駆体としてト
リチウム標識チミジンが用いられる。しかしながら、ト
リチウム標識チミジンの供与量が増加しまた標識化時間
が増加するにつれて標識ＤＮＡの切断化が増加するのが
認められる（ソラリー(E. Solary) ら, Experimental C
ell Research 203(1992), 495-498）。チミジン類縁体
である５−ブロモ−2'−デオキシウリジンに対するモノ
クローナル抗体の産生は、ブロモデオキシウリジンの取
り込みにより代謝標識された非放射性標識ＤＮＡの検出
を可能にする（グラツナー (H. Gratzner), Science 21
8 (1982), 474-475)。最初、天然の、即ち、未変性のＤ
ＮＡ中のブロモデオキシウリジンを認識することを要求
されるモノクローナル抗体が記載された（ゴンチォロフ
(N. Gonchoroff) ら, Cytometry 6 (1985), 506-512）
が、ブロモデオキシウリジンに対するモノクローナル抗
体の結合性のその後のより正確な研究では、ブロモデオ
キシウリジンに対するそれまでに知られた全てのモノク
ローナル抗体は一本鎖領域内のブロモデオキシウリジン
にのみ結合することが記載された（ミラー(M. Miller)
ら, J. Immunol., 136 (1986), 1791-1795) 。従って、
ブロモデオキシウリジンをＤＮＡを代謝標識するのに用
いるときは、該抗体の結合により標識ＤＮＡを検出する
ために、該ＤＮＡの変性が必要である。該記載された細
胞試験系では、細胞をＨＣｌ／エタノールで処理するこ
とにより固定すると同時にそのＤＮＡに結合したタンパ
ク質を解離して該ＤＮＡをこの方法で変性する。しかし
ながら、これら細胞試験系の欠点は、高い非特異性バッ
クグランド、並びに細胞物質全体が固定されているので
代謝標識ＤＮＡの抗体への接近が不確実なことである。
結局のところ、かかる細胞試験系では十分に再現性のあ
る定量的測定を行えない。
おける研究にとって非常に重要なものである。この方法
においては、試験される細胞個体群のＤＮＡを代謝標識
する。即ち、増殖中の細胞にＤＮＡ生合成の標識された
前駆体をＤＮＡ中に取り込ませる。ゲノミックＤＮＡの
代謝標識の標準的方法では、そのような前駆体としてト
リチウム標識チミジンが用いられる。しかしながら、ト
リチウム標識チミジンの供与量が増加しまた標識化時間
が増加するにつれて標識ＤＮＡの切断化が増加するのが
認められる（ソラリー(E. Solary) ら, Experimental C
ell Research 203(1992), 495-498）。チミジン類縁体
である５−ブロモ−2'−デオキシウリジンに対するモノ
クローナル抗体の産生は、ブロモデオキシウリジンの取
り込みにより代謝標識された非放射性標識ＤＮＡの検出
を可能にする（グラツナー (H. Gratzner), Science 21
8 (1982), 474-475)。最初、天然の、即ち、未変性のＤ
ＮＡ中のブロモデオキシウリジンを認識することを要求
されるモノクローナル抗体が記載された（ゴンチォロフ
(N. Gonchoroff) ら, Cytometry 6 (1985), 506-512）
が、ブロモデオキシウリジンに対するモノクローナル抗
体の結合性のその後のより正確な研究では、ブロモデオ
キシウリジンに対するそれまでに知られた全てのモノク
ローナル抗体は一本鎖領域内のブロモデオキシウリジン
にのみ結合することが記載された（ミラー(M. Miller)
ら, J. Immunol., 136 (1986), 1791-1795) 。従って、
ブロモデオキシウリジンをＤＮＡを代謝標識するのに用
いるときは、該抗体の結合により標識ＤＮＡを検出する
ために、該ＤＮＡの変性が必要である。該記載された細
胞試験系では、細胞をＨＣｌ／エタノールで処理するこ
とにより固定すると同時にそのＤＮＡに結合したタンパ
ク質を解離して該ＤＮＡをこの方法で変性する。しかし
ながら、これら細胞試験系の欠点は、高い非特異性バッ
クグランド、並びに細胞物質全体が固定されているので
代謝標識ＤＮＡの抗体への接近が不確実なことである。
結局のところ、かかる細胞試験系では十分に再現性のあ
る定量的測定を行えない。
【０００３】マーチノン(F. Martinon) ら（J. Clin. L
ab. Immunol., 23 (1987), 153-159）は、ブロモデオキ
シウリジンで標識されたＤＮＡの検出のためのサンドイ
ッチＥＬＩＳＡ法を記載しており、ブロモデオキシウリ
ジンに対する第１抗体を用いて該ＤＮＡを不動化し、ブ
ロモデオキシウリジンに対する別の標識抗体を用いて該
結合したＤＮＡを検出するものである。この場合、検出
される代謝標識ＤＮＡは、固相への結合のために既に一
本鎖として存在していなければならないので、この方法
は、該固相への結合前に酸、塩基又は熱変性工程で処理
することによる、試験されるＤＮＡの溶液中での時間を
浪費する変性を必要とする。従って、この方法は、代謝
標識ＤＮＡの日常的測定法としては、あまりに工程が長
く時間を浪費するものである。
ab. Immunol., 23 (1987), 153-159）は、ブロモデオキ
シウリジンで標識されたＤＮＡの検出のためのサンドイ
ッチＥＬＩＳＡ法を記載しており、ブロモデオキシウリ
ジンに対する第１抗体を用いて該ＤＮＡを不動化し、ブ
ロモデオキシウリジンに対する別の標識抗体を用いて該
結合したＤＮＡを検出するものである。この場合、検出
される代謝標識ＤＮＡは、固相への結合のために既に一
本鎖として存在していなければならないので、この方法
は、該固相への結合前に酸、塩基又は熱変性工程で処理
することによる、試験されるＤＮＡの溶液中での時間を
浪費する変性を必要とする。従って、この方法は、代謝
標識ＤＮＡの日常的測定法としては、あまりに工程が長
く時間を浪費するものである。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、容易に行うことができかつ再現性のある定量的測定
を可能にする代謝標識ＤＮＡの検出方法を提供すること
にある。
は、容易に行うことができかつ再現性のある定量的測定
を可能にする代謝標識ＤＮＡの検出方法を提供すること
にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】この目的は、以下の段階
を行うことを特徴とする細胞フラクション中の代謝標識
ＤＮＡの非放射性検出方法によって達成される。 ａ）該細胞フラクションをＤＮＡに結合する抗体と一緒
にインキュベートし、かつこの抗体をインキュベーショ
ンの前又は後に固相に結合させ、 ｂ）該ＤＮＡを変性し、 ｃ）該代謝標識に対する標識抗体を添加し、 ｄ）該固相と液相とを分離し、そして ｅ）段階ｃ）からの抗体の標識を代謝標識ＤＮＡの尺度
として該２相のうちの１相中で測定する。
を行うことを特徴とする細胞フラクション中の代謝標識
ＤＮＡの非放射性検出方法によって達成される。 ａ）該細胞フラクションをＤＮＡに結合する抗体と一緒
にインキュベートし、かつこの抗体をインキュベーショ
ンの前又は後に固相に結合させ、 ｂ）該ＤＮＡを変性し、 ｃ）該代謝標識に対する標識抗体を添加し、 ｄ）該固相と液相とを分離し、そして ｅ）段階ｃ）からの抗体の標識を代謝標識ＤＮＡの尺度
として該２相のうちの１相中で測定する。
【０００６】本発明による方法は、例えば、ブロモデオ
キシウリジンの取り込みにより通常の方法で代謝標識さ
れたＤＮＡを、簡単な方法でかつ再現性のある条件下で
検出するのに用いることができる。従って、本発明によ
る方法は、ＤＮＡを代謝標識することにより増殖能力を
測定する、細胞の増殖能力を測定するための既知の方法
を簡略化する。本発明による代謝標識ＤＮＡの簡単な検
出法は、化学物質、抗体又は細胞障害性細胞の細胞障害
作用を測定するのにも特に重要である。この場合、これ
ら化合物又は細胞の細胞増殖能力への影響が測定され、
又は試験される細胞の細胞核外部の標識ＤＮＡの検出に
より、細胞損傷が測定される。本発明の方法による試験
のための代謝標識付けは、ＤＮＡ生合成の天然前駆体の
あらゆる所望のヌクレオシド類縁体を取り込むことによ
って行うことができる。但し、この類縁体は、天然前駆
体と同じようにしてＤＮＡ中に取り込まれ、かつこの類
縁体に対する抗体が既知のものであることを条件とす
る。
キシウリジンの取り込みにより通常の方法で代謝標識さ
れたＤＮＡを、簡単な方法でかつ再現性のある条件下で
検出するのに用いることができる。従って、本発明によ
る方法は、ＤＮＡを代謝標識することにより増殖能力を
測定する、細胞の増殖能力を測定するための既知の方法
を簡略化する。本発明による代謝標識ＤＮＡの簡単な検
出法は、化学物質、抗体又は細胞障害性細胞の細胞障害
作用を測定するのにも特に重要である。この場合、これ
ら化合物又は細胞の細胞増殖能力への影響が測定され、
又は試験される細胞の細胞核外部の標識ＤＮＡの検出に
より、細胞損傷が測定される。本発明の方法による試験
のための代謝標識付けは、ＤＮＡ生合成の天然前駆体の
あらゆる所望のヌクレオシド類縁体を取り込むことによ
って行うことができる。但し、この類縁体は、天然前駆
体と同じようにしてＤＮＡ中に取り込まれ、かつこの類
縁体に対する抗体が既知のものであることを条件とす
る。
【０００７】本発明による方法を行うには、ＤＮＡに結
合する抗体をまず直接又は間接に固相に結合させる。こ
の結合は当業者に周知の方法で行われ、例えば、固相へ
の抗体の吸着結合により又はストレプトアビジンをコー
ティングした固相へのＤＮＡと結合するビオチニル化抗
体の結合（ストレプトアビジンをコーティングした固相
の作成は、例えば、ＥＰ−Ａ０２６９０９２に従う）に
より行われる。ＤＮＡに結合する抗体としては、直接に
又は付加的結合パートナーを介してＤＮＡに結合するあ
らゆる抗体を用いることができる。ＤＮＡに直接結合す
る抗体は、例えば、アンドレシュワルツ(AndreSchwart
s) ら, Clin. Immunol. Immunopathol.,31 (1984),261
に記載されている。更に、特にヒストンの如きＤＮＡと
結合したタンパク質に対する抗体を用いることも、その
ようなタンパク質と結合した代謝標識ＤＮＡ、即ち、こ
のタンパク質を結合した形で含有する代謝標識ＤＮＡを
検出しようとする場合に可能である。これら抗体それぞ
れは、完全イムノグロブリンとして並びにＦａｂ又はＦ
（ａｂ')2 断片の如きイムノグロブリンの機能性断片と
して用いることができる。サンプルとして用いる細胞フ
ラクションは、細胞の全ＤＮＡであっても、細胞核若し
くは細胞質からの濃縮ＤＮＡフラクションであっても、
溶解した細胞の細胞培養上澄み液からのＤＮＡ断片であ
ってもよい。この場合、溶解した細胞は、少なくとも細
胞のＤＮＡ又はＤＮＡ断片が該細胞から細胞培養上澄み
液の中に移行できる程度までその細胞質膜が溶解した細
胞と理解される。かかる溶解細胞は、例えば、界面活性
剤、好ましくは非イオン性界面活性剤で処理することに
より、又は細胞障害性Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞
とのインキュベーションにより得られる。この方法で得
られるＤＮＡ断片は前処理しないで用いることができ
る。
合する抗体をまず直接又は間接に固相に結合させる。こ
の結合は当業者に周知の方法で行われ、例えば、固相へ
の抗体の吸着結合により又はストレプトアビジンをコー
ティングした固相へのＤＮＡと結合するビオチニル化抗
体の結合（ストレプトアビジンをコーティングした固相
の作成は、例えば、ＥＰ−Ａ０２６９０９２に従う）に
より行われる。ＤＮＡに結合する抗体としては、直接に
又は付加的結合パートナーを介してＤＮＡに結合するあ
らゆる抗体を用いることができる。ＤＮＡに直接結合す
る抗体は、例えば、アンドレシュワルツ(AndreSchwart
s) ら, Clin. Immunol. Immunopathol.,31 (1984),261
に記載されている。更に、特にヒストンの如きＤＮＡと
結合したタンパク質に対する抗体を用いることも、その
ようなタンパク質と結合した代謝標識ＤＮＡ、即ち、こ
のタンパク質を結合した形で含有する代謝標識ＤＮＡを
検出しようとする場合に可能である。これら抗体それぞ
れは、完全イムノグロブリンとして並びにＦａｂ又はＦ
（ａｂ')2 断片の如きイムノグロブリンの機能性断片と
して用いることができる。サンプルとして用いる細胞フ
ラクションは、細胞の全ＤＮＡであっても、細胞核若し
くは細胞質からの濃縮ＤＮＡフラクションであっても、
溶解した細胞の細胞培養上澄み液からのＤＮＡ断片であ
ってもよい。この場合、溶解した細胞は、少なくとも細
胞のＤＮＡ又はＤＮＡ断片が該細胞から細胞培養上澄み
液の中に移行できる程度までその細胞質膜が溶解した細
胞と理解される。かかる溶解細胞は、例えば、界面活性
剤、好ましくは非イオン性界面活性剤で処理することに
より、又は細胞障害性Ｔ細胞又はナチュラルキラー細胞
とのインキュベーションにより得られる。この方法で得
られるＤＮＡ断片は前処理しないで用いることができ
る。
【０００８】ＤＮＡ又はＤＮＡ断片の代謝標識付けは、
好ましくは、ブロモデオキシウリジン取り込みにより行
われる。次いで、ブロモデオキシウリジンに対する標識
抗体を該代謝標識に対する標識抗体として用いる。驚い
たことに、抗体によって固相に結合したＤＮＡのみを解
離することなく、該結合ＤＮＡを抗体結合に要求される
通りに変性することが可能であるということが判明し
た。この場合、溶液中での変性又は細胞試験系について
の当業者に周知の方法で、例えば、マイクロ波処理によ
り又はヌクレアーゼ、好ましくはエキソヌクレアーゼII
I の添加により変性を行うことができる。マイクロ波処
理による変性については、マイクロ波で0.５〜５分間５
００〜１０００Ｗの電力で反応混合液を処理する。ヌク
レアーゼによる変性は、４〜３００ユニット／ｍｌのヌ
クレアーゼを添加し、３７℃で３０分間トリス緩衝液
（６６mmol／ｌ トリス、0.６６mmol／ｌ ＭｇＣl2及
び１mmol／ｌ ２−メルカプトエタノール）中でｐＨ7.
５〜8.５、好ましくはｐＨ8.０でインキュベーションす
ることによって行われる。
好ましくは、ブロモデオキシウリジン取り込みにより行
われる。次いで、ブロモデオキシウリジンに対する標識
抗体を該代謝標識に対する標識抗体として用いる。驚い
たことに、抗体によって固相に結合したＤＮＡのみを解
離することなく、該結合ＤＮＡを抗体結合に要求される
通りに変性することが可能であるということが判明し
た。この場合、溶液中での変性又は細胞試験系について
の当業者に周知の方法で、例えば、マイクロ波処理によ
り又はヌクレアーゼ、好ましくはエキソヌクレアーゼII
I の添加により変性を行うことができる。マイクロ波処
理による変性については、マイクロ波で0.５〜５分間５
００〜１０００Ｗの電力で反応混合液を処理する。ヌク
レアーゼによる変性は、４〜３００ユニット／ｍｌのヌ
クレアーゼを添加し、３７℃で３０分間トリス緩衝液
（６６mmol／ｌ トリス、0.６６mmol／ｌ ＭｇＣl2及
び１mmol／ｌ ２−メルカプトエタノール）中でｐＨ7.
５〜8.５、好ましくはｐＨ8.０でインキュベーションす
ることによって行われる。
【０００９】ブロモデオキシウリジンに対する標識抗体
と変性ＤＮＡとのインキュベーション及び固相と液相と
の分離後、ＤＮＡの代謝標識を該抗体標識による簡単な
方法で測定することができる。この抗体は、酵素、化学
発光色素又は蛍光色素で直接に標識しても、例えば、適
切に標識された追加の抗体により標識してもよい。本発
明による方法のサンプル溶液として細胞培養上澄み液を
用いると、例えば、細胞障害性Ｔ細胞又はナチュラルキ
ラー細胞によるような損傷の結果として溶解された細胞
の代謝標識ＤＮＡ断片の特異的検出が可能になる（ベル
ケ (Berke), Immunol. Today 6 (1991) 21-27 及びベル
ケ, Immunol. Today 12 (1991) 396-399）。 従って、
本発明の好ましい主題は、溶解細胞の細胞培養上澄み液
を細胞フラクションとして添加する本発明による方法の
別の態様である。
と変性ＤＮＡとのインキュベーション及び固相と液相と
の分離後、ＤＮＡの代謝標識を該抗体標識による簡単な
方法で測定することができる。この抗体は、酵素、化学
発光色素又は蛍光色素で直接に標識しても、例えば、適
切に標識された追加の抗体により標識してもよい。本発
明による方法のサンプル溶液として細胞培養上澄み液を
用いると、例えば、細胞障害性Ｔ細胞又はナチュラルキ
ラー細胞によるような損傷の結果として溶解された細胞
の代謝標識ＤＮＡ断片の特異的検出が可能になる（ベル
ケ (Berke), Immunol. Today 6 (1991) 21-27 及びベル
ケ, Immunol. Today 12 (1991) 396-399）。 従って、
本発明の好ましい主題は、溶解細胞の細胞培養上澄み液
を細胞フラクションとして添加する本発明による方法の
別の態様である。
【００１０】細胞障害性Ｔ細胞又はナチュラルキラー細
胞により溶解された細胞とは対照的に、いわゆるアポト
ーシスにより死んだ細胞は、その細胞質内にだけ代謝標
識ＤＮＡ断片を含有する。アポトーシス細胞でも、長時
間インキュベーション（４時間以上）した後だけ、（長
時間インキュベーションの結果である）二次損傷の結果
としてＤＮＡ断片が細胞培養液中に出てくる。アポトー
シスは、プログラム細胞死をもたらす真核細胞の能動的
過程であるか、又は、例えば、カンプトテシン、ダイオ
キシン又はある種の抗体の如き化学物質により又は電離
線により起こされるような誘導された細胞死の結果であ
る（デュバル (Duvall) ら, Immunol. Today 7 (1986)
115-119 ）。かくして、細胞質細胞フラクションを用い
ることにより、本発明の方法の更なる態様において、ア
ポトーシス細胞の代謝標識ＤＮＡ断片を特別に検出する
ことも可能である。従って、本発明の特に好ましい主題
は、細胞質細胞フラクションとＤＮＡに結合する抗体と
を一緒にインキュベートする本発明による方法の別の態
様である。この方法においては、細胞質細胞フラクショ
ンは、好ましくは、非イオン性界面活性剤で処理するこ
とによって得られる。かかる界面活性剤は当業者に既知
である。ＮＰ−４０（エチルフェニル・ポリエチレング
リコール）、ツィーン２０（ポリオキシエチレンソルビ
タン・モノラウリン酸エステル）又はトリトン−Ｘ１０
０（オクチルフェノールポリエチレングリコールエーテ
ル）が好ましく用いられる。それらは、細胞質膜を溶解
するだけで真核細胞の核膜を溶解しない。アポトーシス
細胞では、代謝標識ＤＮＡは、細胞培養物上澄み液中に
出てこないので、細胞質フラクションを単離する前に細
胞培養上澄み液を分離する必要はない。従って、前記界
面活性剤での細胞培養物の直接処理により得られる粗溶
解産物を細胞質細胞フラクションとして用いることが可
能である。
胞により溶解された細胞とは対照的に、いわゆるアポト
ーシスにより死んだ細胞は、その細胞質内にだけ代謝標
識ＤＮＡ断片を含有する。アポトーシス細胞でも、長時
間インキュベーション（４時間以上）した後だけ、（長
時間インキュベーションの結果である）二次損傷の結果
としてＤＮＡ断片が細胞培養液中に出てくる。アポトー
シスは、プログラム細胞死をもたらす真核細胞の能動的
過程であるか、又は、例えば、カンプトテシン、ダイオ
キシン又はある種の抗体の如き化学物質により又は電離
線により起こされるような誘導された細胞死の結果であ
る（デュバル (Duvall) ら, Immunol. Today 7 (1986)
115-119 ）。かくして、細胞質細胞フラクションを用い
ることにより、本発明の方法の更なる態様において、ア
ポトーシス細胞の代謝標識ＤＮＡ断片を特別に検出する
ことも可能である。従って、本発明の特に好ましい主題
は、細胞質細胞フラクションとＤＮＡに結合する抗体と
を一緒にインキュベートする本発明による方法の別の態
様である。この方法においては、細胞質細胞フラクショ
ンは、好ましくは、非イオン性界面活性剤で処理するこ
とによって得られる。かかる界面活性剤は当業者に既知
である。ＮＰ−４０（エチルフェニル・ポリエチレング
リコール）、ツィーン２０（ポリオキシエチレンソルビ
タン・モノラウリン酸エステル）又はトリトン−Ｘ１０
０（オクチルフェノールポリエチレングリコールエーテ
ル）が好ましく用いられる。それらは、細胞質膜を溶解
するだけで真核細胞の核膜を溶解しない。アポトーシス
細胞では、代謝標識ＤＮＡは、細胞培養物上澄み液中に
出てこないので、細胞質フラクションを単離する前に細
胞培養上澄み液を分離する必要はない。従って、前記界
面活性剤での細胞培養物の直接処理により得られる粗溶
解産物を細胞質細胞フラクションとして用いることが可
能である。
【００１１】更に、本発明は、電離線又はダイオキシ
ン、ある種の抗体若しくはカンプトテシンのような化学
物質の如きアポトーシスを起こす物質の作用又は活性を
測定するために、本発明による方法を使用することに関
する。本発明による方法を用いて検出される代謝標識Ｄ
ＮＡ断片は、細胞障害性Ｔ細胞で溶解した場合には、短
時間後に細胞培養上澄み液中に放出されるのに反して、
アポトーシスにより死んだ細胞においては、これら断片
は通常のインキュベート期間中、細胞質細胞フラクショ
ン内で見出されるだけである（上記を参照のこと）。従
って、本発明による方法は、細胞障害性Ｔ細胞により溶
解された細胞とアポトーシス細胞を区別するのに適して
いる。このためには、試験される細胞培養物のＤＮＡ
を、既知の方法で、好ましくはブロモデオキシウリジン
取り込みによって代謝標識する。続いて、本発明による
方法を用いて、代謝標識ＤＮＡ断片が細胞培養上澄み液
中で検出されるか細胞質細胞フラクション中で検出され
るかを２つの平行試料で試験する。細胞質フラクション
中の代謝標識ＤＮＡ断片を検出するには、試験される細
胞培養物を上記のようにして非イオン性界面活性剤で処
理する。この試料においてのみ、アポトーシス細胞の場
合でも代謝標識ＤＮＡ断片が細胞培養上澄み液中で検出
可能である。これに対して、界面活性剤処理をしない第
２平行試料では、代謝標識ＤＮＡ断片は、細胞障害性Ｔ
細胞により溶解された細胞が存在する場合、細胞培養上
澄み液中でのみ検出可能である。
ン、ある種の抗体若しくはカンプトテシンのような化学
物質の如きアポトーシスを起こす物質の作用又は活性を
測定するために、本発明による方法を使用することに関
する。本発明による方法を用いて検出される代謝標識Ｄ
ＮＡ断片は、細胞障害性Ｔ細胞で溶解した場合には、短
時間後に細胞培養上澄み液中に放出されるのに反して、
アポトーシスにより死んだ細胞においては、これら断片
は通常のインキュベート期間中、細胞質細胞フラクショ
ン内で見出されるだけである（上記を参照のこと）。従
って、本発明による方法は、細胞障害性Ｔ細胞により溶
解された細胞とアポトーシス細胞を区別するのに適して
いる。このためには、試験される細胞培養物のＤＮＡ
を、既知の方法で、好ましくはブロモデオキシウリジン
取り込みによって代謝標識する。続いて、本発明による
方法を用いて、代謝標識ＤＮＡ断片が細胞培養上澄み液
中で検出されるか細胞質細胞フラクション中で検出され
るかを２つの平行試料で試験する。細胞質フラクション
中の代謝標識ＤＮＡ断片を検出するには、試験される細
胞培養物を上記のようにして非イオン性界面活性剤で処
理する。この試料においてのみ、アポトーシス細胞の場
合でも代謝標識ＤＮＡ断片が細胞培養上澄み液中で検出
可能である。これに対して、界面活性剤処理をしない第
２平行試料では、代謝標識ＤＮＡ断片は、細胞障害性Ｔ
細胞により溶解された細胞が存在する場合、細胞培養上
澄み液中でのみ検出可能である。
【００１２】更に、本発明は、ＤＮＡに結合する抗体並
びに代謝標識に対する抗体を含有する代謝標識ＤＮＡ断
片検出用試薬キットに関する。好ましくは、ブロモデオ
キシウリジンに対する抗体を代謝標識に対する抗体とし
て用いる。従って、本発明の好ましい主題は、ＤＮＡに
結合する抗体並びに抗ブロモデオキシウリジン抗体を含
有する代謝標識ＤＮＡ断片検出用試薬キットである。本
発明の特に好ましい主題は、ＤＮＡに結合する抗体が固
相への結合のためにビオチニル化された形態で存在し、
かつストレプトアビジンでコーティングされた固相を更
に含有する本発明による試薬キットである。更に、最後
に、本発明は、抗体結合ＤＮＡを変性するためにヌクレ
アーゼを更に含有する本発明による試薬キットに関す
る。この場合、好ましくは、エキソヌクレアーゼIII が
ヌクレアーゼとして用いられる。以下の実施例により本
発明をより詳細に説明する。
びに代謝標識に対する抗体を含有する代謝標識ＤＮＡ断
片検出用試薬キットに関する。好ましくは、ブロモデオ
キシウリジンに対する抗体を代謝標識に対する抗体とし
て用いる。従って、本発明の好ましい主題は、ＤＮＡに
結合する抗体並びに抗ブロモデオキシウリジン抗体を含
有する代謝標識ＤＮＡ断片検出用試薬キットである。本
発明の特に好ましい主題は、ＤＮＡに結合する抗体が固
相への結合のためにビオチニル化された形態で存在し、
かつストレプトアビジンでコーティングされた固相を更
に含有する本発明による試薬キットである。更に、最後
に、本発明は、抗体結合ＤＮＡを変性するためにヌクレ
アーゼを更に含有する本発明による試薬キットに関す
る。この場合、好ましくは、エキソヌクレアーゼIII が
ヌクレアーゼとして用いられる。以下の実施例により本
発明をより詳細に説明する。
【００１３】
【実施例】実施例１ 代謝標識ＤＮＡ断片の検出 試験すべき細胞（例えば、ＨＬ６０細胞、ＡＴＣＣ Ｃ
ＣＬ２４０）を、まず、0.０１mmol／ｌのブロモデオキ
シウリジンと一緒に３７℃で１８時間インキュベーショ
ンすることにより代謝標識した。ＤＮＡ内に取り込まれ
なかった過剰のブロモデオキシウリジンを培地で洗浄す
ることによって除去した後、該細胞（各場合において２
００μｌ、細胞数については表１を参照のこと）を２μ
ｇ／ｍｌのカンプトテシン（シグマ，ミュンヘン）と一
緒にマイクロタイタープレート中で３７℃で４時間イン
キュベートした。その後、細胞溶解のために２０μｌの
１０倍濃縮細胞溶解緩衝液（ＰＢＳ／５０mmol／ｌＥＤ
ＴＡ／２％ツィーン２０）を各試料に添加し、該マイク
ロタイタープレートを遠心分離し、試験のために１００
μｌの上澄み液を各ウェルから取った（ＰＢＳ＝１３７
mmol／ｌ ＮａＣｌ；2.７mmol／ｌ ＫＣｌ；８mmol／
ｌ Ｎa2ＨＰO4及び1.５mmol／ｌ ＫH2ＰO4）。
ＣＬ２４０）を、まず、0.０１mmol／ｌのブロモデオキ
シウリジンと一緒に３７℃で１８時間インキュベーショ
ンすることにより代謝標識した。ＤＮＡ内に取り込まれ
なかった過剰のブロモデオキシウリジンを培地で洗浄す
ることによって除去した後、該細胞（各場合において２
００μｌ、細胞数については表１を参照のこと）を２μ
ｇ／ｍｌのカンプトテシン（シグマ，ミュンヘン）と一
緒にマイクロタイタープレート中で３７℃で４時間イン
キュベートした。その後、細胞溶解のために２０μｌの
１０倍濃縮細胞溶解緩衝液（ＰＢＳ／５０mmol／ｌＥＤ
ＴＡ／２％ツィーン２０）を各試料に添加し、該マイク
ロタイタープレートを遠心分離し、試験のために１００
μｌの上澄み液を各ウェルから取った（ＰＢＳ＝１３７
mmol／ｌ ＮａＣｌ；2.７mmol／ｌ ＫＣｌ；８mmol／
ｌ Ｎa2ＨＰO4及び1.５mmol／ｌ ＫH2ＰO4）。
【００１４】代謝標識ＤＮＡを検出するために、１００
mmol／ｌのＮａＣO3緩衝液（ｐＨ9.６）中で別のマイク
ロタイタープレートにＤＮＡに対する抗体（５μｇ／ｍ
ｌ，ベーリンガー・マンハイムＧｍｂＨ，指定番号１５
２５７６０）をコーティングした。続いて、ウェル当た
り１００μｌの上澄み液（上記を参照のこと）を添加す
ることによって、該代謝標識ＤＮＡを壁面抗体に結合さ
せ、室温で９０分間インキュベーションした。ＰＢＳで
洗浄した後、残りの液を該マイクロタイタープレートの
ウェルから例えば叩いて取り出した。結合した二本鎖Ｄ
ＮＡをマイクロ波処理（５分間６５０ワット，ＡＥＧマ
イクロマット２７５Ｚ）により又は別に１００μｌ（マ
イクロタイタープレートのウェルあたり１ユニットに相
当）のエキソヌクレアーゼIII （ベーリンガー・マンハ
イムＧｍｂＨ，カタログ番号７７９７１７）の添加によ
り変性又は部分的に分解した。続いて、マイクロ波処理
によりＤＮＡを変性した試料を冷蔵庫中８℃で１０分間
冷やした。続いて、エキソヌクレアーゼIII で処理した
試料をＰＢＳで３回洗浄した。その後、ウェル当たり１
００μｌのブロモデオキシウリジンに対するパーオキシ
ダーゼ標識抗体（ベーリンガー・マンハイムＧｍｂＨ，
カタログ番号、指定番号１４４９３３８，２５０ｍＵ／
ｍｌ）を両方の試料に添加して抗体を結合させ、ＡＢＴ
Ｓ（登録商標）を基質（１００μｌ／ウェル，ベーリン
ガー・マンハイムＧｍｂＨ，カタログ番号１２０４５２
１）に用いてパーオキシダーゼ反応を行い、４０５ｎｍ
で吸光度を測定することにより標識ＤＮＡ断片を測定し
た。次の表１は、マイクロ波処理による変性において及
びヌクレアーゼ処理による変性において得られた測定信
号と代謝標識ＤＮＡの量の間の良好な相関関係を示すも
のである。
mmol／ｌのＮａＣO3緩衝液（ｐＨ9.６）中で別のマイク
ロタイタープレートにＤＮＡに対する抗体（５μｇ／ｍ
ｌ，ベーリンガー・マンハイムＧｍｂＨ，指定番号１５
２５７６０）をコーティングした。続いて、ウェル当た
り１００μｌの上澄み液（上記を参照のこと）を添加す
ることによって、該代謝標識ＤＮＡを壁面抗体に結合さ
せ、室温で９０分間インキュベーションした。ＰＢＳで
洗浄した後、残りの液を該マイクロタイタープレートの
ウェルから例えば叩いて取り出した。結合した二本鎖Ｄ
ＮＡをマイクロ波処理（５分間６５０ワット，ＡＥＧマ
イクロマット２７５Ｚ）により又は別に１００μｌ（マ
イクロタイタープレートのウェルあたり１ユニットに相
当）のエキソヌクレアーゼIII （ベーリンガー・マンハ
イムＧｍｂＨ，カタログ番号７７９７１７）の添加によ
り変性又は部分的に分解した。続いて、マイクロ波処理
によりＤＮＡを変性した試料を冷蔵庫中８℃で１０分間
冷やした。続いて、エキソヌクレアーゼIII で処理した
試料をＰＢＳで３回洗浄した。その後、ウェル当たり１
００μｌのブロモデオキシウリジンに対するパーオキシ
ダーゼ標識抗体（ベーリンガー・マンハイムＧｍｂＨ，
カタログ番号、指定番号１４４９３３８，２５０ｍＵ／
ｍｌ）を両方の試料に添加して抗体を結合させ、ＡＢＴ
Ｓ（登録商標）を基質（１００μｌ／ウェル，ベーリン
ガー・マンハイムＧｍｂＨ，カタログ番号１２０４５２
１）に用いてパーオキシダーゼ反応を行い、４０５ｎｍ
で吸光度を測定することにより標識ＤＮＡ断片を測定し
た。次の表１は、マイクロ波処理による変性において及
びヌクレアーゼ処理による変性において得られた測定信
号と代謝標識ＤＮＡの量の間の良好な相関関係を示すも
のである。
【００１５】
【表１】 表 １ 代謝標識ＤＮＡ断片の検出 ──────────────────────────────────── 予備標識細胞の数 ヌクレアーゼ１ユニット マイクロ波での変性 ／ウェルでの変性におけ における吸光度 る吸光度（４０５nm） （４０５nm） ──────────────────────────────────── ６×１０3 0.８７０ 0.７５２ ３×１０3 0.５７２ 0.４２０ 1.５×１０3 0.３４８ 0.２５７ 7.５×１０2 0.１９５ 0.１４８ 3.７５×１０2 0.０９９ 0.０７７ ────────────────────────────────────
【００１６】実施例２ 細胞障害性Ｔ細胞により溶解した細胞の培養上澄み液中
の代謝標識ＤＮＡ断片の検出 マウスＰ８１５細胞系の細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ６４）
を実施例１に記載したようにしてブロモデオキシウリジ
ンで代謝標識した。過剰のブロモデオキシウリジンを洗
い落とした後、２×１０4 の細胞（１００μｌ）を異な
る量の同種異系刺激細胞障害性Ｔ細胞と一緒に各場合に
ついてマイクロタイタープレート中で３７℃で４時間イ
ンキュベートした（該エフェクター対標的細胞の比率に
ついては表２を参照のこと）（細胞障害性Ｔ細胞の調製
は、コリガン (J. Coligan) 、クロイスビーク (A. Kru
isbeek) 、マルグリース (D. Margulies) 、シェバック
(E. Shevach) 及びストロバー (W. Strober) 編，Curr
ent Protocols in Immunology, John, Wiley and Sons,
New York (1992), chapter 3.11に従って行った）。そ
の後、該マイクロタイタープレートを遠心分離し、各場
合について各試料の１００μｌ上澄み液を用い、実施例
１に記載したマイクロ波処理により変性を行って測定を
行った。
の代謝標識ＤＮＡ断片の検出 マウスＰ８１５細胞系の細胞（ＡＴＣＣ ＴＩＢ６４）
を実施例１に記載したようにしてブロモデオキシウリジ
ンで代謝標識した。過剰のブロモデオキシウリジンを洗
い落とした後、２×１０4 の細胞（１００μｌ）を異な
る量の同種異系刺激細胞障害性Ｔ細胞と一緒に各場合に
ついてマイクロタイタープレート中で３７℃で４時間イ
ンキュベートした（該エフェクター対標的細胞の比率に
ついては表２を参照のこと）（細胞障害性Ｔ細胞の調製
は、コリガン (J. Coligan) 、クロイスビーク (A. Kru
isbeek) 、マルグリース (D. Margulies) 、シェバック
(E. Shevach) 及びストロバー (W. Strober) 編，Curr
ent Protocols in Immunology, John, Wiley and Sons,
New York (1992), chapter 3.11に従って行った）。そ
の後、該マイクロタイタープレートを遠心分離し、各場
合について各試料の１００μｌ上澄み液を用い、実施例
１に記載したマイクロ波処理により変性を行って測定を
行った。
【００１７】次の表は、細胞培養上澄み液中で測定した
代謝標識ＤＮＡの量が添加したエフェクター細胞の量と
相関し、従って、細胞障害活性の程度と相関することを
示すものである。これに対して、エフェクター細胞なし
でインキュベートしたＰ８１５標的細胞の細胞培養上澄
み液中及び細胞障害性エフェクター細胞の細胞培養上澄
み液中では代謝標識ＤＮＡは検出できなかった。
代謝標識ＤＮＡの量が添加したエフェクター細胞の量と
相関し、従って、細胞障害活性の程度と相関することを
示すものである。これに対して、エフェクター細胞なし
でインキュベートしたＰ８１５標的細胞の細胞培養上澄
み液中及び細胞障害性エフェクター細胞の細胞培養上澄
み液中では代謝標識ＤＮＡは検出できなかった。
【００１８】
【表２】 表 ２ 細胞障害性Ｔ細胞により溶解した細胞の 細胞培養上澄み液中の代謝標識ＤＮＡ断片の検出 ──────────────────────────────────── 細胞障害性Ｔ細胞 標的細胞なしの 細胞障害性Ｔ細胞 ＋標的細胞の 細胞障害性Ｔ細胞の 対標的細胞の比率 吸光度（４０５nm）1) 吸光度（４０５nm）2) ──────────────────────────────────── １２：１ 0.９７７ 0.０１０ ６：１ 1.０９２ 0.００７ ３：１ 0.８９４ 0.０ 1.５：１ 0.７５２ 0.００９ 0.７５：１ 0.６２０ 0.００１ 0.４：１ 0.４６４ 0.０ ──────────────────────────────────── １）同様に、細胞障害性Ｔ細胞の不存在下でインキュベ
ートした同量のＰ８１５標的細胞の細胞培養上澄み液中
では有意な量の代謝標識ＤＮＡを検出できなかった（吸
光度（４０５ｎｍ）0.０７３）。 ２）予備標識標的細胞なしでインキュベートした対応量
の細胞障害性Ｔ細胞の細胞培養上澄み液をコントロール
として用いた。
ートした同量のＰ８１５標的細胞の細胞培養上澄み液中
では有意な量の代謝標識ＤＮＡを検出できなかった（吸
光度（４０５ｎｍ）0.０７３）。 ２）予備標識標的細胞なしでインキュベートした対応量
の細胞障害性Ｔ細胞の細胞培養上澄み液をコントロール
として用いた。
【００１９】実施例３ アポトーシス細胞の細胞質中の代謝標識ＤＮＡ断片の検
出 ＨＬ６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）を、まず、実
施例１で記述したようにして、ブロモデオキシウリジン
で代謝標識した。過剰のブロモデオキシウリジンを洗い
落とした後、該細胞を種々の濃度のカンプトテシン（５
０００〜０ｎｇ／ｍｌ）と一緒にマイクロタイタープレ
ート中で３７℃で３又は４時間インキュベートした。続
いて、該マイクロタイタープレートを遠心分離し、実施
例２に従って細胞培養上澄み液中の代謝標識ＤＮＡの検
出のために、該細胞培養上澄み液のアリコート（１００
μｌ／ウェル）を取り、そして１００μｌ／ウェルの２
倍濃縮細胞溶解緩衝液（ＰＢＳ／１０mmol／ｌＥＤＴＡ
／0.４％ツィーン２０）を添加することにより、該マイ
クロタイタープレート中の残りの細胞を溶解した。次い
で、こうして得られた溶解産物中の代謝標識ＤＮＡの検
出を実施例１に記載した通りに行った。
出 ＨＬ６０細胞（ＡＴＣＣ ＣＣＬ２４０）を、まず、実
施例１で記述したようにして、ブロモデオキシウリジン
で代謝標識した。過剰のブロモデオキシウリジンを洗い
落とした後、該細胞を種々の濃度のカンプトテシン（５
０００〜０ｎｇ／ｍｌ）と一緒にマイクロタイタープレ
ート中で３７℃で３又は４時間インキュベートした。続
いて、該マイクロタイタープレートを遠心分離し、実施
例２に従って細胞培養上澄み液中の代謝標識ＤＮＡの検
出のために、該細胞培養上澄み液のアリコート（１００
μｌ／ウェル）を取り、そして１００μｌ／ウェルの２
倍濃縮細胞溶解緩衝液（ＰＢＳ／１０mmol／ｌＥＤＴＡ
／0.４％ツィーン２０）を添加することにより、該マイ
クロタイタープレート中の残りの細胞を溶解した。次い
で、こうして得られた溶解産物中の代謝標識ＤＮＡの検
出を実施例１に記載した通りに行った。
【００２０】表３は、３時間インキュベートした試料の
場合、アポトーシス細胞中の代謝標識ＤＮＡは細胞質フ
ラクション中でのみ（即ち、上澄み液中の界面活性剤で
の処理後にのみ）検出可能で、細胞培養上澄み液中では
検出可能でないことを示している。表４は、４時間イン
キュベートした試料の場合、これら細胞質の代謝標識Ｄ
ＮＡ断片の量は、カンプトテシンの量、即ち、アポトー
シスを引き起こす活性と相関することを示している。
場合、アポトーシス細胞中の代謝標識ＤＮＡは細胞質フ
ラクション中でのみ（即ち、上澄み液中の界面活性剤で
の処理後にのみ）検出可能で、細胞培養上澄み液中では
検出可能でないことを示している。表４は、４時間イン
キュベートした試料の場合、これら細胞質の代謝標識Ｄ
ＮＡ断片の量は、カンプトテシンの量、即ち、アポトー
シスを引き起こす活性と相関することを示している。
【００２１】
【表３】 表 ３ アポトーシス細胞中の代謝標識ＤＮＡ断片の検出 ──────────────────────────────────── コントロール（０ng アポトーシス（２００ng ／mlカンプトテシン） ／mlカンプトテシン） 画 分 の吸光度（４０５nm） の吸光度（４０５nm） ──────────────────────────────────── 細胞培養上澄み液 0.０１１ 0.０２０ （実施例２による） 細胞質（界面活性剤 0.０６８ 0.７７０ 処理後の溶解産物） ────────────────────────────────────
【００２２】
【表４】 表 ４ アポトーシス細胞の細胞質中の代謝標識ＤＮＡ断片の検出 ──────────────────────────────────── カンプトテシン（ng／ml） 吸光度（４０５nm） ──────────────────────────────────── ５０００ 1.６７７ １０００ 1.４５７ ２００ 1.００６ ４０ 0.６２５ ８ 0.３４２ 1.６ 0.２９５ ０ 0.２６５ ────────────────────────────────────
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 クレメンス ドプラー ドイツ連邦共和国 82402 シーシャオ プト ティーフェンタルヴェーク 29 イー ４ (72)発明者 エバーハルト ルスマン ドイツ連邦共和国 82377 ペンツバー ク シンデルスドルファー シュトラー セ 73エイ (56)参考文献 ＡＣＴＡ．ＨＩＳＴＯＣＨＥＭ．ＣＹ ＴＯＣＨＥＭ．，25〜１ＡＮＤ２！ 1992 Ｐ．137−141
Claims (5)
- 【請求項１】 細胞フラクション中の代謝標識ＤＮＡの
非放射性検出方法であって、 ａ）該細胞フラクションをＤＮＡに結合する抗体と一緒
にインキュベートし、かつこの抗体をインキュベーショ
ンの前又は後に固相に結合させ、 ｂ）該ＤＮＡを変性し、 ｃ）該代謝標識に対する標識抗体を添加し、 ｄ）該固相と液相とを分離し、そして ｅ）段階ｃ）からの抗体の標識を代謝標識ＤＮＡの尺度
として該２相のうちの１相中で測定する方法。 - 【請求項２】 ブロモデオキシウリジンに対する標識抗
体を標識抗体として用いるブロモデオキシウリジン取り
込みによる代謝標識ＤＮＡの検出方法である、請求項１
記載の方法。 - 【請求項３】 電離線；ダイオキシン、抗体又はカンプ
トテシンのような化学物質；の如きアポトーシスを起こ
す物質、並びに細胞障害性細胞、ナチュラルキラー細
胞、マクロファージ又はＬＡＫ細胞の作用又は活性を測
定する請求項１又は２に記載の方法。 - 【請求項４】 ＤＮＡに結合する抗体、代謝標識に対す
る抗体並びに抗体に結合したＤＮＡを変性するためのヌ
クレアーゼを含有する代謝標識ＤＮＡ断片検出用試薬キ
ット。 - 【請求項５】 代謝標識に対する抗体が抗ブロモデオキ
シウリジン抗体である、請求項４記載の試薬キット。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4319506A DE4319506A1 (de) | 1993-06-12 | 1993-06-12 | Verfahren zum Nachweis metabolisch markierter DNA |
| DE4319506:7 | 1993-06-12 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0755806A JPH0755806A (ja) | 1995-03-03 |
| JP2584594B2 true JP2584594B2 (ja) | 1997-02-26 |
Family
ID=6490204
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6129079A Expired - Lifetime JP2584594B2 (ja) | 1993-06-12 | 1994-06-10 | 代謝標識ｄｎａの検出方法及び前記方法に使用される試薬キット |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5700639A (ja) |
| EP (1) | EP0629856B1 (ja) |
| JP (1) | JP2584594B2 (ja) |
| AT (1) | ATE195809T1 (ja) |
| DE (2) | DE4319506A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE19709881A1 (de) * | 1997-03-11 | 1998-09-17 | Huels Chemische Werke Ag | Verfahren zur Quantifizierung von Bakterien |
| US7626017B2 (en) * | 1997-10-31 | 2009-12-01 | Pressure Biosciences, Inc. | Pressure-enhanced extraction and purification |
| US6111096A (en) | 1997-10-31 | 2000-08-29 | Bbi Bioseq, Inc. | Nucleic acid isolation and purification |
| ES2265682T3 (es) * | 1998-03-18 | 2007-02-16 | Roche Diagnostics Gmbh | Deteccion de productos apoptoticos. |
| US7229772B1 (en) | 1998-03-18 | 2007-06-12 | Roche Diagnostics Gmbh | Detection of apoptotic products |
| EP1064396A4 (en) * | 1998-03-27 | 2004-08-18 | Saigene Corp | SELECTIVE TEST FOR DETERMINING THE IDENTITY OF LIVING MICROORGANISMS IN MIXED CULTURES |
| US6699507B1 (en) | 1999-08-05 | 2004-03-02 | Wisconsin Alulmni Research Foundation | Colloidal particles of different element composition for specific labeling purposes |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5510590A (en) * | 1978-05-04 | 1980-01-25 | Wellcome Found | Enzyme immunity quantity analysis |
| US4496654A (en) * | 1983-04-08 | 1985-01-29 | Quidel | Detection of HCG with solid phase support having avidin coating |
| GB8311018D0 (en) * | 1983-04-22 | 1983-05-25 | Amersham Int Plc | Detecting mutations in dna |
| US4623627A (en) * | 1983-08-19 | 1986-11-18 | Cetus Corporation | Monoclonal antibody having specificity for the double-stranded conformation of native DNA and diagnostic methods using same |
| US4812394A (en) * | 1983-10-18 | 1989-03-14 | University Of California | Flow cytomeric measurement of DNA and incorporated nucleoside analogs |
| WO1991015599A1 (en) * | 1990-04-05 | 1991-10-17 | Amrad Corporation Limited | A method for detecting dna |
| FR2660925B1 (fr) * | 1990-04-11 | 1994-07-01 | Inst Nat Sante Rech Med | Procede de fixation d'une sequence nucleotidique sur un support solide, applications et necessaires pour leur mise en óoeuvre. |
| GB9010093D0 (en) * | 1990-05-04 | 1990-06-27 | British Textile Tech | Diagnostic technique |
| US5238813A (en) * | 1990-12-18 | 1993-08-24 | Washington University | Diagnostic method for nephritis |
| NL9100550A (nl) * | 1991-03-27 | 1992-10-16 | Tno | Werkwijze en kit voor het detecteren van apoptose. |
| US5399586A (en) * | 1993-03-11 | 1995-03-21 | Allergan, Inc. | Treatment of mammals afflicted with tumors with compounds having RXR retinoid receptor agonist activity |
| DE4318402A1 (de) * | 1993-06-03 | 1994-12-08 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zum Nachweis eines programmierten oder induzierten Zelltods eukaryontischer Zeller |
-
1993
- 1993-06-12 DE DE4319506A patent/DE4319506A1/de not_active Withdrawn
-
1994
- 1994-06-08 EP EP94108762A patent/EP0629856B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-08 DE DE59409491T patent/DE59409491D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-08 AT AT94108762T patent/ATE195809T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-06-09 US US08/257,686 patent/US5700639A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-06-10 JP JP6129079A patent/JP2584594B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| ＡＣＴＡ．ＨＩＳＴＯＣＨＥＭ．ＣＹＴＯＣＨＥＭ．，２５〜１ＡＮＤ２！ １９９２ Ｐ．１３７−１４１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE195809T1 (de) | 2000-09-15 |
| DE59409491D1 (de) | 2000-09-28 |
| JPH0755806A (ja) | 1995-03-03 |
| EP0629856A3 (de) | 1996-07-17 |
| EP0629856B1 (de) | 2000-08-23 |
| US5700639A (en) | 1997-12-23 |
| DE4319506A1 (de) | 1994-12-15 |
| EP0629856A2 (de) | 1994-12-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lie et al. | Improved agar plate assays of bovine lysozyme and haemolytic complement activity | |
| Prakash et al. | Development of a sensitive enzymeimmunoassay (EIA) for progesterone determination in unextracted bovine plasma using the second antibody technique | |
| Landegren | Measurement of cell numbers by means of the endogenous enzyme hexosaminidase. Applications to detection of lymphokines and cell surface antigens | |
| Rouzer et al. | Analysis of the Malondialdehyde− 2 ‘-Deoxyguanosine Adduct Pyrimidopurinone in Human Leukocyte DNA by Gas Chromatography/Electron Capture/Negative Chemical Ionization/Mass Spectrometry | |
| US5637465A (en) | Method for the detection of a programmed or induced cell death of eukaryotic cells | |
| CA2360779A1 (en) | Assay with reduced background | |
| EP0714514B1 (en) | Method for detecting biological interactions especially in receptor binding assays | |
| Gharbi et al. | Application for proteomic techniques in studying osteoarthritis: a review | |
| JP2584594B2 (ja) | 代謝標識ｄｎａの検出方法及び前記方法に使用される試薬キット | |
| Domagała et al. | Application of proteomic methods for identification of sperm immunogenic antigens | |
| CA2443320A1 (en) | Separation of target material using affinity substance containing labelled nucleic acid chain by electrophoresis | |
| Powell et al. | Selective degradation-inducing probes for studying cereblon (CRBN) biology | |
| WO2001088543A2 (en) | Methods and compositions for diagnosing chronic immune disease | |
| EP0421589B1 (en) | Drug screening assay | |
| Schrader et al. | Immunoassay of the adenosine deaminase complexing proteins of human tissues and body fluids. | |
| Trask et al. | Immunofluorescent detection of histone 2B on metaphase chromosomes using flow cytometry | |
| US5798218A (en) | Compositions and methods for the specific detection of thy-1 antigen | |
| Kato et al. | Bioassay of bile acids using an enzyme-linked DNA aptamer | |
| Alcantara et al. | Heparin in plasma samples causes nonspecific binding to histones on Western blots | |
| Pillai et al. | Molecular weights and isoelectric points of sperm antigens relevant to autoimmune infertility in men | |
| US4645737A (en) | Enzyme/immunofluorescent assay for anti-treponemal antibodies | |
| Alekseev et al. | Mass spectrometry identification of NASP binding partners in HeLa cells | |
| US20210292746A1 (en) | Enhanced capture of target nucleic acids | |
| Meyer et al. | Biotin-streptavidin amplified enzymeimmunoassay for 13, 14-dihydro-15-keto-PGF2α | |
| Prakash et al. | Development of a simple, direct, microtitre plate enzymeimmunoassay (EIA) for progesterone determination in whole milk of buffaloes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20071121 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20081121 Year of fee payment: 12 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091121 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091121 Year of fee payment: 13 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101121 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101121 Year of fee payment: 14 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111121 Year of fee payment: 15 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121121 Year of fee payment: 16 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131121 Year of fee payment: 17 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |