JP2555804B2 - 前立腺由来酸性ホスファターゼに対するモノクローナル抗体、それを用いた測定法及び測定用キット - Google Patents
前立腺由来酸性ホスファターゼに対するモノクローナル抗体、それを用いた測定法及び測定用キットInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、前立腺由来酸性ホスフ
ァターゼを抗原として得られるモノクローナル抗体、そ
のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、体液
中の前立腺由来酸性ホスファターゼ活性測定用キット及
び測定方法に関する。本発明のモノクローナル抗体を用
いた測定法によれば、体液中の前立腺由来酸性ホスファ
ターゼの活性を特異的にかつ感度良く測定することがで
き、従って本発明は前立腺癌の診断に極めて有用であ
る。
ァターゼを抗原として得られるモノクローナル抗体、そ
のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ、体液
中の前立腺由来酸性ホスファターゼ活性測定用キット及
び測定方法に関する。本発明のモノクローナル抗体を用
いた測定法によれば、体液中の前立腺由来酸性ホスファ
ターゼの活性を特異的にかつ感度良く測定することがで
き、従って本発明は前立腺癌の診断に極めて有用であ
る。
【０００２】
【従来の技術】前立腺由来酸性ホスファターゼ（ホスホ
モノエステラーゼＥＣ３．１．３．２；以下ＰＡＰと記
す）は、酸性条件下（pH４〜６）においてリン酸モノエ
ステルを加水分解する酵素であり、前立腺癌患者の体液
において、そのレベルの上昇が顕著に観察される酵素で
ある。このため腫瘍マーカーとしてＰＡＰの測定は臨床
診断において注目されている。従来ＰＡＰの測定法に
は、以下の方法が知られている。
モノエステラーゼＥＣ３．１．３．２；以下ＰＡＰと記
す）は、酸性条件下（pH４〜６）においてリン酸モノエ
ステルを加水分解する酵素であり、前立腺癌患者の体液
において、そのレベルの上昇が顕著に観察される酵素で
ある。このため腫瘍マーカーとしてＰＡＰの測定は臨床
診断において注目されている。従来ＰＡＰの測定法に
は、以下の方法が知られている。
【０００３】（１） 酵素活性として測定する方法（Ｅ
Ａ） 以下に示すように、種々の合成基質を使用する方法が報
告されており、また日常の臨床検査に実用化されている
ものもある。これらの方法は全て、酒石酸を用いてＰＡ
Ｐを阻害し残存の酸性ホスファターゼ活性を測定し、総
酸性ホスファターゼ活性から差引いてＰＡＰ活性を求め
ている。 （ａ）β−グリセロリン酸を基質とする方法 β−グリセロリン酸は、酸性ホスファターゼによって加
水分解され、グリセリンとリン酸を生じる。このリン酸
を発色させ測定する〔Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ａ：Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ Ｃｈｅｍ．，１０１，９３，（１９３３）〕。 （ｂ）ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とする方法 酸性ホスファターゼによる加水分解で生じたｐ−ニトロ
フェノールをアルカリによって発色させ測定する〔Ｈｕ
ｄｓｏｎ，Ｐ．Ｂ．：Ｊ．Ｕｒｏｌ．，５８．８９（１
９４７）〕。 （ｃ）フェニルリン酸を基質とする方法 酸性ホスファターゼによる加水分解で生じたフェノール
をＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｎ試薬で発色させる方
法〔Ｋｉｎｇ．Ｅ．Ｊ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ．Ａ．
Ｒ．：Ｃａｎａｄ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．，３１、
３７６（１９３４）〕、及び生じたフェノールを４−ア
ミノアンチピリンを用いて酸化縮合させ生成する赤色キ
ノンを測定する方法〔Ｋｉｎｄ．Ｐ．Ｒ．Ｎ．ａｎｄ
Ｋｉｎｇ．Ｅ．Ｊ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．，７、
３２２（１９５４）〕である。
Ａ） 以下に示すように、種々の合成基質を使用する方法が報
告されており、また日常の臨床検査に実用化されている
ものもある。これらの方法は全て、酒石酸を用いてＰＡ
Ｐを阻害し残存の酸性ホスファターゼ活性を測定し、総
酸性ホスファターゼ活性から差引いてＰＡＰ活性を求め
ている。 （ａ）β−グリセロリン酸を基質とする方法 β−グリセロリン酸は、酸性ホスファターゼによって加
水分解され、グリセリンとリン酸を生じる。このリン酸
を発色させ測定する〔Ｂｏｄａｎｓｋｙ，Ａ：Ｊ．Ｂｉ
ｏｌ Ｃｈｅｍ．，１０１，９３，（１９３３）〕。 （ｂ）ｐ−ニトロフェニルリン酸を基質とする方法 酸性ホスファターゼによる加水分解で生じたｐ−ニトロ
フェノールをアルカリによって発色させ測定する〔Ｈｕ
ｄｓｏｎ，Ｐ．Ｂ．：Ｊ．Ｕｒｏｌ．，５８．８９（１
９４７）〕。 （ｃ）フェニルリン酸を基質とする方法 酸性ホスファターゼによる加水分解で生じたフェノール
をＦｏｌｉｎ−Ｃｉｏｃａｌｔｅｎ試薬で発色させる方
法〔Ｋｉｎｇ．Ｅ．Ｊ．Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ．Ａ．
Ｒ．：Ｃａｎａｄ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｏｃ．Ｊ．，３１、
３７６（１９３４）〕、及び生じたフェノールを４−ア
ミノアンチピリンを用いて酸化縮合させ生成する赤色キ
ノンを測定する方法〔Ｋｉｎｄ．Ｐ．Ｒ．Ｎ．ａｎｄ
Ｋｉｎｇ．Ｅ．Ｊ．：Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈ．，７、
３２２（１９５４）〕である。
【０００４】（ｄ）ナフチルリン酸を基質とする方法 酸性ホスファターゼによる加水分解で生じたナフトール
にＦａｓｔ ＲｅｄＴＲを反応させてアゾ色素として比
色測定する〔Ｈｉｌｌｍａｎ，Ｇ．：Ｚ．Ｋｌｉｎ．Ｃ
ｈｅｍ．，Ｋｌｉｎ．Ｕ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９，２３
７（１９７１）〕。 （ｅ）２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニルリン酸を
基質とする方法 酸性ホスファターゼによる加水分解で生じた２，６−ジ
クロロ−４−ニトロフェノールの黄色の色調を４００ｎ
ｍで比色測定する〔Ｔｅｓｈｉｍａ．Ｓ．：Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１６８、２３１（１９８
７）〕。 （ｆ）２−クロロ−４−ニトロフェニルリン酸を基質と
する方法 酸性ホスファターゼによる加水分解で生じた２−クロロ
−４−ニトロフェノールの黄色の色調を４００ｎｍで比
色測定する〔Ｋ．Ｌｏｒｅｎｔｚ ａｎｄ Ｋ．Ａｓｓ
ｅｌ，Ｅｎｚｙｎｅ，２０，２４８（１９７５）〕。 （ｇ）２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニルリン酸
を基質とする方法 酸性ホスファターゼによる加水分解で生じた２，６−ジ
クロロ−４−アセチルフェノールを３４０ｎｍで測定す
る〔Ｋｕｒｏｉｗａ．Ｋ．，Ｋａｔａｙａｍａ．Ｋ．，
Ｍｉｕｒａ．Ｔ．，；特開平２−１８０８９２〕。
にＦａｓｔ ＲｅｄＴＲを反応させてアゾ色素として比
色測定する〔Ｈｉｌｌｍａｎ，Ｇ．：Ｚ．Ｋｌｉｎ．Ｃ
ｈｅｍ．，Ｋｌｉｎ．Ｕ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，９，２３
７（１９７１）〕。 （ｅ）２，６−ジクロロ−４−ニトロフェニルリン酸を
基質とする方法 酸性ホスファターゼによる加水分解で生じた２，６−ジ
クロロ−４−ニトロフェノールの黄色の色調を４００ｎ
ｍで比色測定する〔Ｔｅｓｈｉｍａ．Ｓ．：Ｃｌｉｎ．
Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ．，１６８、２３１（１９８
７）〕。 （ｆ）２−クロロ−４−ニトロフェニルリン酸を基質と
する方法 酸性ホスファターゼによる加水分解で生じた２−クロロ
−４−ニトロフェノールの黄色の色調を４００ｎｍで比
色測定する〔Ｋ．Ｌｏｒｅｎｔｚ ａｎｄ Ｋ．Ａｓｓ
ｅｌ，Ｅｎｚｙｎｅ，２０，２４８（１９７５）〕。 （ｇ）２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニルリン酸
を基質とする方法 酸性ホスファターゼによる加水分解で生じた２，６−ジ
クロロ−４−アセチルフェノールを３４０ｎｍで測定す
る〔Ｋｕｒｏｉｗａ．Ｋ．，Ｋａｔａｙａｍａ．Ｋ．，
Ｍｉｕｒａ．Ｔ．，；特開平２−１８０８９２〕。
【０００５】(2) 酸性ホスファターゼ蛋白を免疫学的
に測定する方法（ＩＡ） (a) ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法 抗体（抗ＰＡＰ血清）と結合した抗原（患者検体）を放
射性同位元素で標識したＰＡＰと反応した後、抗体と非
結合のそれらを第２抗体を用いて分離し、患者検体中の
ＰＡＰ濃度をガンマーカウンターにて測定する〔Ｖｉｈ
ｋｏ．Ｐ．：Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２４，１９１５
（１９７８）〕。 (b) エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法 患者検体中のＰＡＰを抗ＰＡＰ抗体で捕捉し、次に第２
抗体を加える。この第２抗体はペルオキシダーゼと結合
されており、このペルオキシダーゼ活性を利用してオル
トフェニレンジアミン（ＯＰＤ）によって発色させ比色
定量する〔Ｃｈｏｅ，Ｂ．Ｋ．：Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．
２６，（１３），１８５４（１９８０）〕。 (c) 免疫酵素測定 ポリスチレンチューブ内面に固定した抗ＰＡＰモノクロ
ーナル抗体と検体を反応させ、ＰＡＰを抗ＰＡＰモノク
ローナル抗体−ＰＡＰ複合体としてチューブ表面に捕捉
し、他の成分を洗浄除去後基質と反応させる〔機器・試
薬、ＸIII ：１、４７−５４（１９９０）；機器・試
薬、ＸIII ：４、７６１−７６６（１９９０）〕。
に測定する方法（ＩＡ） (a) ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法 抗体（抗ＰＡＰ血清）と結合した抗原（患者検体）を放
射性同位元素で標識したＰＡＰと反応した後、抗体と非
結合のそれらを第２抗体を用いて分離し、患者検体中の
ＰＡＰ濃度をガンマーカウンターにて測定する〔Ｖｉｈ
ｋｏ．Ｐ．：Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，２４，１９１５
（１９７８）〕。 (b) エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法 患者検体中のＰＡＰを抗ＰＡＰ抗体で捕捉し、次に第２
抗体を加える。この第２抗体はペルオキシダーゼと結合
されており、このペルオキシダーゼ活性を利用してオル
トフェニレンジアミン（ＯＰＤ）によって発色させ比色
定量する〔Ｃｈｏｅ，Ｂ．Ｋ．：Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．
２６，（１３），１８５４（１９８０）〕。 (c) 免疫酵素測定 ポリスチレンチューブ内面に固定した抗ＰＡＰモノクロ
ーナル抗体と検体を反応させ、ＰＡＰを抗ＰＡＰモノク
ローナル抗体−ＰＡＰ複合体としてチューブ表面に捕捉
し、他の成分を洗浄除去後基質と反応させる〔機器・試
薬、ＸIII ：１、４７−５４（１９９０）；機器・試
薬、ＸIII ：４、７６１−７６６（１９９０）〕。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】(1) 酵素活性として
測定する方法（ＥＡ）の問題 酸性ホスファターゼは前立腺にきわめて大量に存在する
ほか、赤血球、骨、血小板、白血球、腎臓、肝臓などほ
とんどすべての臓器に広く分布している。前記した酵素
活性として測定する方法（ＥＡ）では、ＰＡＰが酒石酸
で阻害を受けることから酒石酸を添加しないで酵素活性
をみる総酸性ホスファターゼと、これを添加して求めた
活性を総酸性ホスファターゼとの差によって出した活性
値をＰＡＰの活性値として利用されている。操作も簡便
で安価であるため、汎用の自動分析装置に適応できる試
薬もあり、日常の臨床検査に用いられている。しかし、
酒石酸は特異的にＰＡＰだけを阻害せず、血小板、白血
球、腎臓、肝臓、脾臓のものも阻害するので、厳密にＰ
ＡＰを測定していない。この様に、ＰＡＰの活性値は酒
石酸感受性分画を代用して用いられているに過ぎず、特
異性に欠け前立腺癌のマーカーとしての臨床的意義はう
すい。
測定する方法（ＥＡ）の問題 酸性ホスファターゼは前立腺にきわめて大量に存在する
ほか、赤血球、骨、血小板、白血球、腎臓、肝臓などほ
とんどすべての臓器に広く分布している。前記した酵素
活性として測定する方法（ＥＡ）では、ＰＡＰが酒石酸
で阻害を受けることから酒石酸を添加しないで酵素活性
をみる総酸性ホスファターゼと、これを添加して求めた
活性を総酸性ホスファターゼとの差によって出した活性
値をＰＡＰの活性値として利用されている。操作も簡便
で安価であるため、汎用の自動分析装置に適応できる試
薬もあり、日常の臨床検査に用いられている。しかし、
酒石酸は特異的にＰＡＰだけを阻害せず、血小板、白血
球、腎臓、肝臓、脾臓のものも阻害するので、厳密にＰ
ＡＰを測定していない。この様に、ＰＡＰの活性値は酒
石酸感受性分画を代用して用いられているに過ぎず、特
異性に欠け前立腺癌のマーカーとしての臨床的意義はう
すい。
【０００７】(2) 酸性ホスファターゼ蛋白を免疫学的
に測定する方法（ＩＡ）の問題 (a) ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法は放射性同位元
素を使用するため、特別の施設が必要であり、また管理
上の問題がある。測定に約２日間を要するなどの欠点を
有する。 (b) エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法は放射性同
位元素を用いないためＲＩＡ程使用上の制約を受けず日
常の臨床検査に多く用いられている。しかし、測定に２
〜５時間かかり、Ｂ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離
が必要であり、操作も繁雑で多数検体の処理ができず、
汎用の自動分析装置に適応できない。また検出系に用い
ている基質（ＯＰＤ）等の試薬の安定性が悪い等の欠点
を有する。 (c) 免疫酵素測定法は検出感度が極めて高く正確性の面
においても優れた方法ではあるが、従来の測定法は依然
として操作の複雑なものであり、検出系に用いているＦ
ａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲの安定性が悪い等の欠点を有す
る。
に測定する方法（ＩＡ）の問題 (a) ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）法は放射性同位元
素を使用するため、特別の施設が必要であり、また管理
上の問題がある。測定に約２日間を要するなどの欠点を
有する。 (b) エンザイムイムノアッセイ（ＥＩＡ）法は放射性同
位元素を用いないためＲＩＡ程使用上の制約を受けず日
常の臨床検査に多く用いられている。しかし、測定に２
〜５時間かかり、Ｂ／Ｆ（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ）分離
が必要であり、操作も繁雑で多数検体の処理ができず、
汎用の自動分析装置に適応できない。また検出系に用い
ている基質（ＯＰＤ）等の試薬の安定性が悪い等の欠点
を有する。 (c) 免疫酵素測定法は検出感度が極めて高く正確性の面
においても優れた方法ではあるが、従来の測定法は依然
として操作の複雑なものであり、検出系に用いているＦ
ａｓｔ Ｒｅｄ ＴＲの安定性が悪い等の欠点を有す
る。
【０００８】
【課題を解決するための手段】本発明者は従来法の欠点
を解決すべく鋭意研究した結果、ＰＡＰを抗原とし、そ
の活性を極めて特異的に阻害する新規なモノクローナル
抗体を調製し、それをＰＡＰ測定系内にＰＡＰ活性阻害
剤として含有させて用いることによりＰＡＰ活性を極め
て高感度に且つ簡便に測定できることを見出し本発明に
到達した。
を解決すべく鋭意研究した結果、ＰＡＰを抗原とし、そ
の活性を極めて特異的に阻害する新規なモノクローナル
抗体を調製し、それをＰＡＰ測定系内にＰＡＰ活性阻害
剤として含有させて用いることによりＰＡＰ活性を極め
て高感度に且つ簡便に測定できることを見出し本発明に
到達した。
【０００９】即ち、本発明の第１の目的は、ＰＡＰの酵
素活性を特異的に阻害するモノクローナル抗体を提供す
ることにある。本発明の第２の目的は、上記モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを提供することにあ
る。本発明の第３の目的は、上記のモノクローナル抗体
をＰＡＰ活性阻害剤として用いることを特徴とするＰＡ
Ｐ活性測定法を提供することにある。本発明の第４の目
的は、上記のモノクローナル抗体を１つの試薬として含
むＰＡＰ活性測定用キットを提供することにある。
素活性を特異的に阻害するモノクローナル抗体を提供す
ることにある。本発明の第２の目的は、上記モノクロー
ナル抗体を産生するハイブリドーマを提供することにあ
る。本発明の第３の目的は、上記のモノクローナル抗体
をＰＡＰ活性阻害剤として用いることを特徴とするＰＡ
Ｐ活性測定法を提供することにある。本発明の第４の目
的は、上記のモノクローナル抗体を１つの試薬として含
むＰＡＰ活性測定用キットを提供することにある。
【００１０】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
モノクローナル抗体は、ＰＡＰに対して極めて高い特異
性を有しており、より具体的には、血小板由来酸性ホス
ファターゼ、赤血球由来酸性ホスファターゼ及び白血球
由来酸性ホスファターゼなどのＰＡＰ以外のいずれの酸
性ホスファターゼに対しても、本発明のモノクローナル
抗体は実質的に反応性を有しないか、あるいはいずれに
対しても５％以下の交差反応性しか示さないものであ
る。従って、本発明のモノクローナル抗体はＰＡＰに特
異的に結合し、ＰＡＰ酵素活性をほぼ完全に阻害する。
モノクローナル抗体は、ＰＡＰに対して極めて高い特異
性を有しており、より具体的には、血小板由来酸性ホス
ファターゼ、赤血球由来酸性ホスファターゼ及び白血球
由来酸性ホスファターゼなどのＰＡＰ以外のいずれの酸
性ホスファターゼに対しても、本発明のモノクローナル
抗体は実質的に反応性を有しないか、あるいはいずれに
対しても５％以下の交差反応性しか示さないものであ
る。従って、本発明のモノクローナル抗体はＰＡＰに特
異的に結合し、ＰＡＰ酵素活性をほぼ完全に阻害する。
【００１１】本発明のモノクローナル抗体は、イムノグ
ロブリンクラスＩｇＡに属し、そのＬ鎖はκ鎖である。
本発明のモノクローナル抗体は、以下のようにして得る
ことができる。即ち、動物を例えばヒト由来のＰＡＰで
免疫し、このように得られた免疫動物の脾臓細胞を骨髄
腫細胞と融合し、目的とするモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマをクローニングし、次いでこのハイ
ブリドーマを培養し、産生されるモノクローナル抗体を
単離することにより得ることが出来る。
ロブリンクラスＩｇＡに属し、そのＬ鎖はκ鎖である。
本発明のモノクローナル抗体は、以下のようにして得る
ことができる。即ち、動物を例えばヒト由来のＰＡＰで
免疫し、このように得られた免疫動物の脾臓細胞を骨髄
腫細胞と融合し、目的とするモノクローナル抗体を産生
するハイブリドーマをクローニングし、次いでこのハイ
ブリドーマを培養し、産生されるモノクローナル抗体を
単離することにより得ることが出来る。
【００１２】ＰＡＰで免疫するのに用いる適当な動物
は、ねずみ及びはつかねずみである。より具体的には、
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本クレア社）あるいは、他の
系のマウス、例えば、ＩＣＲ，Ｃ３Ｈ，Ｃ５７ＢＬ，Ｄ
ＢＡ系及びＢａｌｂ／ｃ系のヌードマウスなどを使用す
ることができる。免疫及び後処理は公知の方法〔岩崎辰
夫・安東民衛・市川かおる・保井孝太郎／著：単クロー
ン抗体（講談社）〕に従って行うことができる。免疫及
び後処理は、例えば、ヒトＰＡＰ抗原〔Ｍ．Ｄｅｒｅｃ
ｈｉｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，
２５０，１４３（１９７１）〕をマウスに対し、１０日
−１４日の間隔で腹腔に注射し、最後の抗原注射の数日
後に細胞融合の為に脾臓細胞を取り出す、という方法を
用いることができる。細胞融合に用いる骨髄腫細胞は、
広く知られている例えばＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１細
胞〔ＹｅＨｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔ
ｏｐｉｃｓｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８１，（１９７１）〕を用いる
ことができる。脾臓細胞と骨髄腫細胞とを、適当な融合
促進剤の使用により細胞融合させる。脾臓細胞と骨髄腫
細胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。好ましい融合促進剤としては、例えば、平均分子量
が１０００〜４０００のポリエチレングリコールを有利
に使用できるが、この分野で知られている他の融合促進
剤、例えばセンダイウイルスを使用することもできる。
は、ねずみ及びはつかねずみである。より具体的には、
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（日本クレア社）あるいは、他の
系のマウス、例えば、ＩＣＲ，Ｃ３Ｈ，Ｃ５７ＢＬ，Ｄ
ＢＡ系及びＢａｌｂ／ｃ系のヌードマウスなどを使用す
ることができる。免疫及び後処理は公知の方法〔岩崎辰
夫・安東民衛・市川かおる・保井孝太郎／著：単クロー
ン抗体（講談社）〕に従って行うことができる。免疫及
び後処理は、例えば、ヒトＰＡＰ抗原〔Ｍ．Ｄｅｒｅｃ
ｈｉｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，
２５０，１４３（１９７１）〕をマウスに対し、１０日
−１４日の間隔で腹腔に注射し、最後の抗原注射の数日
後に細胞融合の為に脾臓細胞を取り出す、という方法を
用いることができる。細胞融合に用いる骨髄腫細胞は、
広く知られている例えばＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１細
胞〔ＹｅＨｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔ
ｏｐｉｃｓｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ８１，（１９７１）〕を用いる
ことができる。脾臓細胞と骨髄腫細胞とを、適当な融合
促進剤の使用により細胞融合させる。脾臓細胞と骨髄腫
細胞の好ましい比率は約２０：１〜約２：１の範囲であ
る。好ましい融合促進剤としては、例えば、平均分子量
が１０００〜４０００のポリエチレングリコールを有利
に使用できるが、この分野で知られている他の融合促進
剤、例えばセンダイウイルスを使用することもできる。
【００１３】細胞融合後に得られるハイブリドーマは限
界希釈法でクローン化される。ハイブリドーマのクロー
ン化は、融合細胞の培養上清中の抗ＰＡＰ抗体の存在の
有無を、例えば２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニ
ルリン酸を基質とする酸性ホスファターゼ活性測定法
（特開平２−１８０８９２）により確認しながら限界希
釈法を繰返すことにより実施することができる。本発明
により、代表的には１つのハイブリドーマが確立され、
このハイブリドーマＰＡＰ−Ｄ１１は１９９１年６月２
０日に工業技術院微生物工業技術研究所にブダペスト条
約に基づき国際寄託され、受託番号として微工研条寄第
３４６１号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３４６１）が付与されて
いる。
界希釈法でクローン化される。ハイブリドーマのクロー
ン化は、融合細胞の培養上清中の抗ＰＡＰ抗体の存在の
有無を、例えば２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニ
ルリン酸を基質とする酸性ホスファターゼ活性測定法
（特開平２−１８０８９２）により確認しながら限界希
釈法を繰返すことにより実施することができる。本発明
により、代表的には１つのハイブリドーマが確立され、
このハイブリドーマＰＡＰ−Ｄ１１は１９９１年６月２
０日に工業技術院微生物工業技術研究所にブダペスト条
約に基づき国際寄託され、受託番号として微工研条寄第
３４６１号（ＦＥＲＭ ＢＰ−３４６１）が付与されて
いる。
【００１４】ハイブリドーマから目的とするモノクロー
ナル抗体を得るには以下の方法を採用することができ
る。例えば、ハイブリドーマを一定時間適当な培地で培
養しその培養上清から、そのハイブリドーマの産生する
モノクローナル抗体を得る方法である。他の方法には、
ハイブリドーマを同質遺伝子又は半同質遺伝子を持つ例
えばマウスの腹腔に注射し、注射一定時間後にこの宿主
動物の血液中及び腹水中より、そのハイブリドーマの産
生するモノクローナル抗体を得る方法である。
ナル抗体を得るには以下の方法を採用することができ
る。例えば、ハイブリドーマを一定時間適当な培地で培
養しその培養上清から、そのハイブリドーマの産生する
モノクローナル抗体を得る方法である。他の方法には、
ハイブリドーマを同質遺伝子又は半同質遺伝子を持つ例
えばマウスの腹腔に注射し、注射一定時間後にこの宿主
動物の血液中及び腹水中より、そのハイブリドーマの産
生するモノクローナル抗体を得る方法である。
【００１５】このようにして得られる本発明のモノクロ
ーナル抗体は、ＰＡＰと特異的に反応し、ほぼ完全にＰ
ＡＰ活性を阻害することができる。従って、このモノク
ローナル抗体をＰＡＰ活性阻害剤として用いることによ
って検体中のＰＡＰ活性を高感度に測定することができ
る。従って、より具体的には、以下に示す方法によって
検体中のＰＡＰ活性を極めて高感度で且つ簡便に測定す
ることができる。 即ち、(i) 検体と酸性ホスファターゼの基質とを反応さ
せて検体中の総酸性ホスファターゼ活性を求め； (ii) 他方、検体と上記のモノクローナル抗体とを反応
させて、検体中の前立腺由来酸性ホスファターゼ活性を
阻害させた後に、上記(i) と同様にして検体中の非前立
腺由来の酸性ホスファターゼ活性を求め； (iii) 次いで、上記(i) で求めた総酸性ホスファターゼ
活性から上記(ii)で求めた非前立腺由来の酸性ホスファ
ターゼ活性を差引く； ことによってＰＡＰ活性を測定することができる。
ーナル抗体は、ＰＡＰと特異的に反応し、ほぼ完全にＰ
ＡＰ活性を阻害することができる。従って、このモノク
ローナル抗体をＰＡＰ活性阻害剤として用いることによ
って検体中のＰＡＰ活性を高感度に測定することができ
る。従って、より具体的には、以下に示す方法によって
検体中のＰＡＰ活性を極めて高感度で且つ簡便に測定す
ることができる。 即ち、(i) 検体と酸性ホスファターゼの基質とを反応さ
せて検体中の総酸性ホスファターゼ活性を求め； (ii) 他方、検体と上記のモノクローナル抗体とを反応
させて、検体中の前立腺由来酸性ホスファターゼ活性を
阻害させた後に、上記(i) と同様にして検体中の非前立
腺由来の酸性ホスファターゼ活性を求め； (iii) 次いで、上記(i) で求めた総酸性ホスファターゼ
活性から上記(ii)で求めた非前立腺由来の酸性ホスファ
ターゼ活性を差引く； ことによってＰＡＰ活性を測定することができる。
【００１６】検体としては、前立腺癌が疑われる患者の
血清などが代表的なものとして挙げられる。酸性ホスフ
ァターゼの基質としては、ｐ−ニトロフェニルリン酸、
フェニルリン酸、ナフチルリン酸、２，６−ジクロロ−
４−ニトロフェニルリン酸，２−クロロ−４−ニトロフ
ェニルリン酸、２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニ
ルリン酸などが挙げられる。中でも一番感度が高く、特
に有利なのは２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニル
リン酸である。これらの基質を検体に加えることによっ
て、検体中の酸性ホスファターゼにより基質が加水分解
されて、対応するフェノール誘導体または無機リンが遊
離する。これらを直接あるいは発色試薬によって発色さ
せて比色法により測定することによって、検体中の総酸
性ホスファターゼ活性あるいは非前立腺由来の酸性ホス
ファターゼ活性を求めることができる。上記工程(ii)に
おいては、通常、検体とモノクローナル抗体とを混合
し、予加温後に基質を添加する。予加温時間は使用する
モノクローナル抗体の活性に依り変動し得るが、殊に１
〜１０分間、特に５分間が好ましい。
血清などが代表的なものとして挙げられる。酸性ホスフ
ァターゼの基質としては、ｐ−ニトロフェニルリン酸、
フェニルリン酸、ナフチルリン酸、２，６−ジクロロ−
４−ニトロフェニルリン酸，２−クロロ−４−ニトロフ
ェニルリン酸、２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニ
ルリン酸などが挙げられる。中でも一番感度が高く、特
に有利なのは２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニル
リン酸である。これらの基質を検体に加えることによっ
て、検体中の酸性ホスファターゼにより基質が加水分解
されて、対応するフェノール誘導体または無機リンが遊
離する。これらを直接あるいは発色試薬によって発色さ
せて比色法により測定することによって、検体中の総酸
性ホスファターゼ活性あるいは非前立腺由来の酸性ホス
ファターゼ活性を求めることができる。上記工程(ii)に
おいては、通常、検体とモノクローナル抗体とを混合
し、予加温後に基質を添加する。予加温時間は使用する
モノクローナル抗体の活性に依り変動し得るが、殊に１
〜１０分間、特に５分間が好ましい。
【００１７】上記の測定法に用いる本発明のＰＡＰ活性
測定用キットは、少なくとも本発明のモノクローナル抗
体を１つの試薬として含む。モノクローナル抗体の他に
は、例えば酸性ホスファターゼの基質、基質の加水分解
生成物を測定するための発色系試薬、測定に用いる緩衝
液などをキットの１つの試薬成分として含めることがで
きる。
測定用キットは、少なくとも本発明のモノクローナル抗
体を１つの試薬として含む。モノクローナル抗体の他に
は、例えば酸性ホスファターゼの基質、基質の加水分解
生成物を測定するための発色系試薬、測定に用いる緩衝
液などをキットの１つの試薬成分として含めることがで
きる。
【００１８】
【実施例】実施例１ モノクローナル抗体の調製 （１）免疫 岩崎辰雄ら、「単クローン抗体」、講談社発行に記載さ
れた方法に従ってマウスを免疫した。ヒトＰＡＰ（シグ
マ社、ホスファターゼ、アシッド、ブロスタテイックＬ
ｏｔ．８９Ｈ７８２２）２００μｇを１ｍｌとフロイン
トの完全アジュバント（ＦＣＡ）１ｍｌを混合し油中水
型エマルジョンにして、抗原−ＦＣＡエマルジョンを作
製した。６週令のＢａｌｂ／ｃＡマウスを用い、初回免
疫は、抗原−ＦＣＡエマルジョンの２００μｌ（２０μ
ｇＰＡＰ相当）を腹腔内投与した。２次免疫以降は、初
回免疫から２週間隔で抗原−フロイントの不完全アジュ
バント（ＦＩＣＡ）エマルジョンの１００μｌ（１０μ
ｇＰＡＰ相当）を腹腔内投与した。初回免疫から８週経
過したマウスに抗原−ＦｌＣＡエマルジョンの２００μ
ｌ（２０μｇＰＡＰ相当）を腹腔内投与で最終免疫を行
った。 （２）細胞融合 Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４０５（１９７５）の方法に従って細
胞融合を実施した。最終免疫の３〜４日後の脾細胞１×
１０７個とＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１細胞１×１０８
個を５０％ポリエチレングリコール４０００〔Ｌｉｔｔ
ｌｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｗ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４５，
７０９（１９６４）〕を用い、細胞融合を行ない、９６
穴プレートに分注し、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリ及びチミジンを含む１０％牛胎児血清入りＲ
ＰＭＩ−１６４０〔Ｇ．Ｅ．Ｍｏｏｒｅ，Ａ．Ａ．Ｓａ
ｎｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｋ．Ｕｌｒｉｃｈ，Ｊ．Ｎａ
ｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．３６，４０５（１９６
６）〕で３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
れた方法に従ってマウスを免疫した。ヒトＰＡＰ（シグ
マ社、ホスファターゼ、アシッド、ブロスタテイックＬ
ｏｔ．８９Ｈ７８２２）２００μｇを１ｍｌとフロイン
トの完全アジュバント（ＦＣＡ）１ｍｌを混合し油中水
型エマルジョンにして、抗原−ＦＣＡエマルジョンを作
製した。６週令のＢａｌｂ／ｃＡマウスを用い、初回免
疫は、抗原−ＦＣＡエマルジョンの２００μｌ（２０μ
ｇＰＡＰ相当）を腹腔内投与した。２次免疫以降は、初
回免疫から２週間隔で抗原−フロイントの不完全アジュ
バント（ＦＩＣＡ）エマルジョンの１００μｌ（１０μ
ｇＰＡＰ相当）を腹腔内投与した。初回免疫から８週経
過したマウスに抗原−ＦｌＣＡエマルジョンの２００μ
ｌ（２０μｇＰＡＰ相当）を腹腔内投与で最終免疫を行
った。 （２）細胞融合 Ｋｏｈｌｅｒ．Ｇ．ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４０５（１９７５）の方法に従って細
胞融合を実施した。最終免疫の３〜４日後の脾細胞１×
１０７個とＰ３−Ｘ６３−Ａｇ８−Ｕ１細胞１×１０８
個を５０％ポリエチレングリコール４０００〔Ｌｉｔｔ
ｌｅｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｗ．；Ｓｃｉｅｎｃｅ，１４５，
７０９（１９６４）〕を用い、細胞融合を行ない、９６
穴プレートに分注し、ＨＡＴ培地（ヒポキサンチン、ア
ミノプテリ及びチミジンを含む１０％牛胎児血清入りＲ
ＰＭＩ−１６４０〔Ｇ．Ｅ．Ｍｏｏｒｅ，Ａ．Ａ．Ｓａ
ｎｄｂｅｒｇ ａｎｄ Ｋ．Ｕｌｒｉｃｈ，Ｊ．Ｎａ
ｔ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．３６，４０５（１９６
６）〕で３７℃、５％ＣＯ２下で培養した。
【００１９】(3) 抗体のスクリーニング ハイブリドーマの増殖を認めたウェルについて、培養上
清の抗ＰＡＰ抗体の存在の有無を２，６−ジクロロ−４
−アセチルフェニルリン酸を基質とする酸性ホスファタ
ーゼ活性測定法で測定した。培養上清１００μｌとＰＡ
Ｐ（２０ ＩＵ／リットル相当）１００μｌを合わせ３
７℃、１時間放置後、日立７１５０型自動分析装置を用
いて、特開平２−１８０８９２に記載の方法に従って
２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニルリン酸を基質
とする方法で酸性ホスファターゼ活性を培養上清の代わ
りに０．１Ｍクエン酸緩衝液pH５．４（２５℃）を加え
たものを対照に測定した。活性が対照と比べ１０％以上
低下したものを、抗体産生が陽性と判定した。 (4) クローニング Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ３９，２８５（１９８０）に記載の方法に従っ
てクローニングを行なった。培養上清に、抗体産生が認
められたハイブリドーマは、ＲＰＭＩ １６４０培地を
希釈液に用いて限界希釈法でクローニングを４回行い、
モノクローンになったハイブリドーマを前述の(3) の方
法で再度測定し、モノクローナル抗体産生ハイブリドー
マを確立した。かくして得たハイブリドーマＰＡＰ−Ｄ
１１をブダペスト条約に基づき微工研に１９９１年６月
２０日に寄託し、受託番号としてＦＥＲＭ ＢＰ−３４
６１が付与された。
清の抗ＰＡＰ抗体の存在の有無を２，６−ジクロロ−４
−アセチルフェニルリン酸を基質とする酸性ホスファタ
ーゼ活性測定法で測定した。培養上清１００μｌとＰＡ
Ｐ（２０ ＩＵ／リットル相当）１００μｌを合わせ３
７℃、１時間放置後、日立７１５０型自動分析装置を用
いて、特開平２−１８０８９２に記載の方法に従って
２，６−ジクロロ−４−アセチルフェニルリン酸を基質
とする方法で酸性ホスファターゼ活性を培養上清の代わ
りに０．１Ｍクエン酸緩衝液pH５．４（２５℃）を加え
たものを対照に測定した。活性が対照と比べ１０％以上
低下したものを、抗体産生が陽性と判定した。 (4) クローニング Ｊ．Ｗ．Ｇｏｄｉｎｇ；Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ ３９，２８５（１９８０）に記載の方法に従っ
てクローニングを行なった。培養上清に、抗体産生が認
められたハイブリドーマは、ＲＰＭＩ １６４０培地を
希釈液に用いて限界希釈法でクローニングを４回行い、
モノクローンになったハイブリドーマを前述の(3) の方
法で再度測定し、モノクローナル抗体産生ハイブリドー
マを確立した。かくして得たハイブリドーマＰＡＰ−Ｄ
１１をブダペスト条約に基づき微工研に１９９１年６月
２０日に寄託し、受託番号としてＦＥＲＭ ＢＰ−３４
６１が付与された。
【００２０】（５）モノクローナル抗体の生産及び精製 モノクローナル抗体産生ハイブリドーマＰＡＰ−Ｄ１１
をシャーレ中で増殖させた後、プリスタン（アルドリッ
チ社）で前処理したＢａｌｂ／ｃマウス腹腔内に移植
し、得られたマウス腹水から５０％硫安塩析し、ＤＥＡ
ＥセファロースＣＬ−６Ｂカラム（ファルマシア社製）
を用いて、２０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ８．０）
（グラジェント溶出でＮａＣｌ濃度が５０〜３００ｍ
Ｍ）でクロマトグラフィーを行い、モノクローナル抗体
を精製した。 （６）モノクローナル抗体の性質 モノクローナル抗体のグロブリンサブクラスはウサギ抗
マウスイムノグロブリン（ＩｇＧｌ，Ｇ２ａ，Ｇ２ｂ，
Ｇ３，ＩｇＭ，ＩｇＡ，κ，λ）（ザイメット社）及び
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識したヤギ抗ウサギ抗
体（ザイメット社）を用い、ＥＩＡ法で測定した。その
結果本発明のモノクローナル抗体がイムノグロブリンク
ラスＩｇＡに属し、そのＬ鎖はκ鎖であることが判明し
た。
をシャーレ中で増殖させた後、プリスタン（アルドリッ
チ社）で前処理したＢａｌｂ／ｃマウス腹腔内に移植
し、得られたマウス腹水から５０％硫安塩析し、ＤＥＡ
ＥセファロースＣＬ−６Ｂカラム（ファルマシア社製）
を用いて、２０ｍＭトリスバッファー（ｐＨ８．０）
（グラジェント溶出でＮａＣｌ濃度が５０〜３００ｍ
Ｍ）でクロマトグラフィーを行い、モノクローナル抗体
を精製した。 （６）モノクローナル抗体の性質 モノクローナル抗体のグロブリンサブクラスはウサギ抗
マウスイムノグロブリン（ＩｇＧｌ，Ｇ２ａ，Ｇ２ｂ，
Ｇ３，ＩｇＭ，ＩｇＡ，κ，λ）（ザイメット社）及び
パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）で標識したヤギ抗ウサギ抗
体（ザイメット社）を用い、ＥＩＡ法で測定した。その
結果本発明のモノクローナル抗体がイムノグロブリンク
ラスＩｇＡに属し、そのＬ鎖はκ鎖であることが判明し
た。
【００２１】実施例２ ＰＡＰの測定 試 薬 （Ａ） 緩衝液：０．１Ｍクエン酸、０．５
％ウシ血清アルブミン、 ｐＨ５．４ （Ｂ） 基質液：２，６−ジクロロ−４−アセチルフェ
ニルリン酸 （７．８ｍＭ） （Ｃ） モノクローナル抗体を含む緩衝液： （Ａ）の緩衝液のモノクローナル抗体３２μｇ／ｍｌ含
有 （Ｄ） 検体：ヒト前立腺由来酸性ホスファターゼ（シ
グマ社） （１） 総酸性ホスファターゼ活性の測定 （Ａ）の緩衝液２．０ｍｌに検体０．１ｍｌを加え２〜
５分間、３７℃予加温し、それに（Ｂ）の基質液０．５
ｍｌ加え、同時にストップウォッチをスタートさせ正確
に１分、２分の３４０ｎｍにおける吸光度を測定し１分
間当りの吸光度変化を求める。酸性ホスファターゼ活性
は下記の式により計算される。 １） ΔＯＤ／ｍｉｎは測定波長３４０ｎｍにおける１
分間当りの吸光度の変化量。 ２） 波長３４０ｎｍにおける２，６−ジクロロ−４−
アセチルフェノールの分子吸光係数は２１５００であ
る。
％ウシ血清アルブミン、 ｐＨ５．４ （Ｂ） 基質液：２，６−ジクロロ−４−アセチルフェ
ニルリン酸 （７．８ｍＭ） （Ｃ） モノクローナル抗体を含む緩衝液： （Ａ）の緩衝液のモノクローナル抗体３２μｇ／ｍｌ含
有 （Ｄ） 検体：ヒト前立腺由来酸性ホスファターゼ（シ
グマ社） （１） 総酸性ホスファターゼ活性の測定 （Ａ）の緩衝液２．０ｍｌに検体０．１ｍｌを加え２〜
５分間、３７℃予加温し、それに（Ｂ）の基質液０．５
ｍｌ加え、同時にストップウォッチをスタートさせ正確
に１分、２分の３４０ｎｍにおける吸光度を測定し１分
間当りの吸光度変化を求める。酸性ホスファターゼ活性
は下記の式により計算される。 １） ΔＯＤ／ｍｉｎは測定波長３４０ｎｍにおける１
分間当りの吸光度の変化量。 ２） 波長３４０ｎｍにおける２，６−ジクロロ−４−
アセチルフェノールの分子吸光係数は２１５００であ
る。
【００２２】(2) 非前立腺由来の酸性ホスファターゼ
活性の測定 (C) の緩衝液２．０mlに(1) と同じ検体０．１ｍｌを加
え２〜５分間、３７℃で予加温し、それに(B) の基質液
０．５ml加え、同時にストップウオッチをスタートさせ
正確に１分、２分の３４０nmにおける吸光度を測定し１
分間当りの吸光度変化を求める。非前立腺由来の酸性ホ
スファターゼ活性は上記の式により計算される。(1) で
得られた活性値から(2) の活性値を差引いてＰＡＰ活性
を求める。図１はモノクローナル抗体の最終濃度の関数
としてモノクローナル抗体を添加した系の残存ＰＡＰ活
性（％）を示す。これはＰＡＰを十分に阻害しているこ
とを示している。図２はモノクローナル抗体との反応時
間の関数としてモノクローナル抗体を添加した系の残存
ＰＡＰ活性（％）を示す。これは短時間にＰＡＰを阻害
し得ることを示し、汎用の自動分析装置に適用できるこ
とを示している。図３は本発明の試薬と方法（Ｙ）を用
い日立７１５０型自動分析装置で患者検体３９を測定し
た活性値とＥＩＡ法（Ｘ）で測定した蛋白量との相関を
示す。相関係数０．９９７で回帰式はＹ＝０．４４４３
Ｘ−０．１４３であった。これは従来のＥＩＡ法と極
めて良く相関し、臨床検査での有用性を示唆している。
活性の測定 (C) の緩衝液２．０mlに(1) と同じ検体０．１ｍｌを加
え２〜５分間、３７℃で予加温し、それに(B) の基質液
０．５ml加え、同時にストップウオッチをスタートさせ
正確に１分、２分の３４０nmにおける吸光度を測定し１
分間当りの吸光度変化を求める。非前立腺由来の酸性ホ
スファターゼ活性は上記の式により計算される。(1) で
得られた活性値から(2) の活性値を差引いてＰＡＰ活性
を求める。図１はモノクローナル抗体の最終濃度の関数
としてモノクローナル抗体を添加した系の残存ＰＡＰ活
性（％）を示す。これはＰＡＰを十分に阻害しているこ
とを示している。図２はモノクローナル抗体との反応時
間の関数としてモノクローナル抗体を添加した系の残存
ＰＡＰ活性（％）を示す。これは短時間にＰＡＰを阻害
し得ることを示し、汎用の自動分析装置に適用できるこ
とを示している。図３は本発明の試薬と方法（Ｙ）を用
い日立７１５０型自動分析装置で患者検体３９を測定し
た活性値とＥＩＡ法（Ｘ）で測定した蛋白量との相関を
示す。相関係数０．９９７で回帰式はＹ＝０．４４４３
Ｘ−０．１４３であった。これは従来のＥＩＡ法と極
めて良く相関し、臨床検査での有用性を示唆している。
【００２３】実施例３ モノクローナル抗体の交差反応
性の測定 各種血球を含む検体は、木下喜博：血球の分離法“臨床
検査技術全書３血液検査”４１６−４４７（１９７２）
に記載の方法に従いヒト血液より分離した。分離した血
球は緩衝液（０．１Ｍクエン酸、pH５．４）を用い凍結
融解を４〜５回繰り返し遠心分離後に上清を得、これを
測定に用いた。実施例２で用いたと同様の試薬を用い実
施例２の方法に従い交差反応性を測定した。同時に酒石
酸を用いる方法により同様の測定を行なった。実施例２
の試薬(C)のモノクローナル抗体含む緩衝液の代わりに
酒石酸２６mM含む緩衝液を使用して、実施例２の方法と
同様にして測定した。結果を表１に示す。
性の測定 各種血球を含む検体は、木下喜博：血球の分離法“臨床
検査技術全書３血液検査”４１６−４４７（１９７２）
に記載の方法に従いヒト血液より分離した。分離した血
球は緩衝液（０．１Ｍクエン酸、pH５．４）を用い凍結
融解を４〜５回繰り返し遠心分離後に上清を得、これを
測定に用いた。実施例２で用いたと同様の試薬を用い実
施例２の方法に従い交差反応性を測定した。同時に酒石
酸を用いる方法により同様の測定を行なった。実施例２
の試薬(C)のモノクローナル抗体含む緩衝液の代わりに
酒石酸２６mM含む緩衝液を使用して、実施例２の方法と
同様にして測定した。結果を表１に示す。
【表１】
【００２４】
【発明の効果】本発明のモノクローナル抗体、それを用
いたＰＡＰ活性測定法及びキットの特徴及び利点は、添
付した図１〜３及び表１により明確に示される。図１は
モノクローナル抗体の最終濃度の関数としてモノクロー
ナル抗体を添加した系の残存活性（％）を示す。これは
ＰＡＰを十分に阻害していることを示している。図２は
モノクローナル抗体との反応時間の関数としてモノクロ
ーナル抗体を添加した系の残存活性（％）を示す。これ
は短時間にＰＡＰを阻害し得ることを示し、汎用の自動
分析装置に適用できる。図３は本発明の測定法とキット
で測定した活性値と従来のＥＩＡ法で測定したＰＡＰ蛋
白量との相関を示す。これは従来のＥＩＡ法と極めて良
く相関し、臨床検査での有用性を示している。表１は、
ＰＡＰ以外の血中酸性ホスファターゼに対する交差反応
性（％）を示す。表１は本発明のモノクローナル抗体の
特異性の高さを示している。以上に示される通り、本発
明は、検体中のＰＡＰ活性を簡単に速やかに、かつ極め
て正確に測定することを可能にし、臨床的診断を著しく
改善するものである。
いたＰＡＰ活性測定法及びキットの特徴及び利点は、添
付した図１〜３及び表１により明確に示される。図１は
モノクローナル抗体の最終濃度の関数としてモノクロー
ナル抗体を添加した系の残存活性（％）を示す。これは
ＰＡＰを十分に阻害していることを示している。図２は
モノクローナル抗体との反応時間の関数としてモノクロ
ーナル抗体を添加した系の残存活性（％）を示す。これ
は短時間にＰＡＰを阻害し得ることを示し、汎用の自動
分析装置に適用できる。図３は本発明の測定法とキット
で測定した活性値と従来のＥＩＡ法で測定したＰＡＰ蛋
白量との相関を示す。これは従来のＥＩＡ法と極めて良
く相関し、臨床検査での有用性を示している。表１は、
ＰＡＰ以外の血中酸性ホスファターゼに対する交差反応
性（％）を示す。表１は本発明のモノクローナル抗体の
特異性の高さを示している。以上に示される通り、本発
明は、検体中のＰＡＰ活性を簡単に速やかに、かつ極め
て正確に測定することを可能にし、臨床的診断を著しく
改善するものである。
【図１】図１はモノクローナル抗体の最終濃度の関数と
してモノクローナル抗体を添加した系の残存ＰＡＰ活性
（％）を示す。
してモノクローナル抗体を添加した系の残存ＰＡＰ活性
（％）を示す。
【図２】図２はモノクローナル抗体との反応時間の関数
としてモノクローナル抗体を添加した系の残存ＰＡＰ活
性（％）を示す。
としてモノクローナル抗体を添加した系の残存ＰＡＰ活
性（％）を示す。
【図３】図３は本発明の測定法とＥＩＡ法との相関を示
す。
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/577 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (56)参考文献 特開 昭60−228962（ＪＰ，Ａ) ＰＲＯＳＴＡＴＥ，ＶＯＬ．９，Ｎ Ｏ．１，Ｐ．47−56（1986) Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．ＭＥＴＨＯＤ Ｓ，ＶＯＬ．84，ＮＯ．１−２，Ｐ. 105−116（1985) ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＡＰＰＬ．Ｂ ＩＯＣＨＥＭ．，ＶＯＬ．11，ＮＯ. １，Ｐ．89−95（1989) ＭＯＬ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，ＶＯＬ. 19，ＮＯ．９，Ｐ．1199−1202（1982)
Claims (7)
- 【請求項１】 血小板由来酸性ホスファターゼ、赤血球
由来酸性ホスファターゼ及び白血球由来酸性ホスファタ
ーゼのいずれに対しても実質的に反応性を有しないかあ
るいはいずれに対しても５％以下の交差反応性しか示さ
ず、前立腺由来酸性ホスファターゼに対して特異的にそ
の酵素活性を阻害するモノクローナル抗体。 - 【請求項２】 ＩｇＡクラスに属し、そのＬ鎖がκ鎖で
ある請求項１のモノクローナル抗体。 - 【請求項３】 受託番号として微工研条寄第３４６１号
（ＦＥＲＭ ＢＰ−３４６１）を有するハイブリドーマ
により産生する請求項１または２のモノクローナル抗
体。 - 【請求項４】 請求項１から３のいずれか１つのモノク
ローナル抗体を産生するハイブリドーマ。 - 【請求項５】 受託番号としてＦＥＲＭ ＢＰ−３４６
１を有する請求項４のハイブリドーマ。 - 【請求項６】 （ｉ）検体と酸性ホスファターゼの基質
とを反応させて検体中の総酸性ホスファターゼ活性を求
め； （ｉｉ）他方、検体と請求項１から３のいずれかのモノ
クローナル抗体とを反応させて、検体中の前立腺由来酸
性ホスファターゼ活性を阻害させた後に、上記（ｉ）と
同様にして検体中の非前立腺由来の酸性ホスファターゼ
活性を求め； （ｉｉｉ）次いで、上記（ｉ）で求めた総酸性ホスファ
ターゼ活性から上記（ｉｉ）で求めた非前立腺由来の酸
性ホスファターゼ活性を差引く； ことからなる前立腺由来酸性ホスファターゼ活性測定
法。 - 【請求項７】 少なくとも請求項１から３のいずれかの
モノクローナル抗体を１つの試薬として含む前立腺由来
酸性ホスファターゼ活性測定用キット。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3171192A JP2555804B2 (ja) | 1991-07-11 | 1991-07-11 | 前立腺由来酸性ホスファターゼに対するモノクローナル抗体、それを用いた測定法及び測定用キット |
| DE4222416A DE4222416A1 (de) | 1991-07-11 | 1992-07-08 | Monoklonaler antikoerper gegen saure phosphatase aus prostata und verfahren zur bestimmung von saurer phosphatase unter verwendung desselben sowie kit zur bestimmung derselben |
| US08/380,243 US5719030A (en) | 1991-07-11 | 1995-01-26 | Monoclonal antibody to prostate-derived acid phosphatase and method for determination of acid phosphatase using the same as well as kit for determination |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP3171192A JP2555804B2 (ja) | 1991-07-11 | 1991-07-11 | 前立腺由来酸性ホスファターゼに対するモノクローナル抗体、それを用いた測定法及び測定用キット |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0515392A JPH0515392A (ja) | 1993-01-26 |
| JP2555804B2 true JP2555804B2 (ja) | 1996-11-20 |
Family
ID=15918719
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3171192A Expired - Lifetime JP2555804B2 (ja) | 1991-07-11 | 1991-07-11 | 前立腺由来酸性ホスファターゼに対するモノクローナル抗体、それを用いた測定法及び測定用キット |
Country Status (3)
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|---|---|
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| JP (1) | JP2555804B2 (ja) |
| DE (1) | DE4222416A1 (ja) |
Families Citing this family (4)
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|---|---|---|---|---|
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-
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- 1991-07-11 JP JP3171192A patent/JP2555804B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-07-08 DE DE4222416A patent/DE4222416A1/de not_active Withdrawn
-
1995
- 1995-01-26 US US08/380,243 patent/US5719030A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| ＢＩＯＴＥＣＨＮＯＬ．ＡＰＰＬ．ＢＩＯＣＨＥＭ．，ＶＯＬ．１１，ＮＯ．１，Ｐ．８９−９５（１９８９） |
| Ｊ．ＩＭＭＵＮＯＬ．ＭＥＴＨＯＤＳ，ＶＯＬ．８４，ＮＯ．１−２，Ｐ．１０５−１１６（１９８５） |
| ＭＯＬ．ＩＭＭＵＮＯＬ．，ＶＯＬ．１９，ＮＯ．９，Ｐ．１１９９−１２０２（１９８２） |
| ＰＲＯＳＴＡＴＥ，ＶＯＬ．９，ＮＯ．１，Ｐ．４７−５６（１９８６） |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5719030A (en) | 1998-02-17 |
| DE4222416A1 (de) | 1993-02-04 |
| JPH0515392A (ja) | 1993-01-26 |
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