JP2025537485A

JP2025537485A - Ｔｌｒ５活性能を有するフラジェリン免疫増強剤誘導体の真核細胞発現システムを用いた製造及び応用

Info

Publication number: JP2025537485A
Application number: JP2025522570A
Authority: JP
Inventors: ヘンイ，ジョン; ウンリ，シ; キム，コムチョイ
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2022-10-19
Filing date: 2023-07-26
Publication date: 2025-11-18
Also published as: CN120092015A; KR102896818B1; EP4606817A4; WO2024085375A1; KR20240055629A; EP4606817A1

Abstract

本発明は、ＴＬＲ５活性能を有するフラジェリン免疫増強剤誘導体の真核細胞発現システムを用いた製造及び応用に関し、本発明に係るフラジェリン変形体は、高い免疫増強効果を有するものであり、様々なワクチン及び免疫治療剤組成物に利用可能である。

Description

本発明は、科学技術情報通信部の支援下で課題番号２０２０Ｒ１Ａ５Ａ２０３１１８５によってなされたもの（寄与率６０％）であり、当該課題の研究管理専門機関は韓国研究財団、研究事業名は「集団研究支援」、研究課題名は「複合癌免疫治療研究センター」、主管機関はジョンナム大学校、研究期間は２０１８．０６．０１～２０２５．０２．２８である。

本発明は、科学技術情報通信部の支援下で課題番号２０２０Ｍ３Ａ９Ｇ３０８０２８２によってなされたもの（寄与率２０％）であり、当該課題の研究管理専門機関は韓国研究財団、研究事業名は「バイオ医療技術開発」、研究課題名は「免疫治療革新研究団」、主管機関はジョンナム大学校、研究期間は２０２０．０６．０１～２０２４．１２．３１である。

本発明は、保健福祉部の支援下で課題番号ＨＶ２２Ｃ００７９によってなされたもの（寄与率２０％）であり、当該課題の研究管理専門機関は韓国保健産業振興院、研究事業名は「ワクチンベース技術開発」、研究課題名は「細胞免疫誘導粘膜免疫増強剤汎用プラットホーム開発」、主管機関はジョンナム大学校、研究期間は２０２２．０４．０１～２０２４．１２．３１である。

本発明は、ＴＬＲ５活性能を有するフラジェリン免疫増強剤誘導体の真核細胞発現システムを用いた製造及び応用に関し、より詳細には、真核細胞において発現可能であり、既存の原核生物由来のフラジェリンタンパク質と同等又はそれ以上の免疫増強効果を有するフラジェリンタンパク質に関する。

細菌鞭毛のフィラメントを構成する構成単位タンパク質をフラジェリン（ｆｌａｇｅｌｌｉｎ）といい、これは、フラジェリンが規則的に組み合わされてフィラメントを形成し、バクテリアが動き得るように機能する。

ＴＬＲ５は、大食細胞及び樹状細胞を含む様々な免疫細胞の表面に発現するパターン認識受容体で、ＴＬＲ５がフラジェリンを認識すると、ＮＦ－ｋＢの活性化と炎症性サイトカインの生成が誘導される。ＮＦ－ｋＢは、免疫及び炎症反応に関与する遺伝子の発現を調節する転写因子で、ＩｋＢ（ＮＦ－ｋＢ抑制剤）という抑制タンパク質を含み、細胞質にタンパク質複合体として存在する。ＴＬＲ５が刺激を受けて活性化すると、ＩｋＢが分解されるとともに、ＮＦ－ｋＢの活性化が誘発されるし、ＮＦ－ｋＢの活性化は、ＴＮＦ－α（ＴｕｍｏｒＮｅｃｒｏｓｉｓＦａｃｔｏｒ－α）及びＩＬ－１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１β）のような前炎症性サイトカインの生成を誘導する。

また、フラジェリンは、細胞質内に存在するＮＬＲＣ４－インフラマソーム（ＮＬＲＣ４－ｉｎｆｌａｍｍａｓｏｍｅ）信号伝達系を刺激し得る病原体関連分子パターン（ｐａｔｈｏｇｅｎ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｐａｔｔｅｒｎ）因子である。したがって、フラジェリンは、細胞表面に存在するＴＬＲ５と細胞質に存在するＮＬＲＣ４－インフラマソームをすべて活性化させ得る免疫調節物質である。

このような特徴から、フラジェリンは様々なワクチン及び免疫治療剤に応用可能な免疫増強剤の開発対象として研究されてきた。様々な抗原をフラジェリンと共に投与したりフラジェリンと組換え融合タンパク質の形態で投与したりすると、抗原特異免疫反応を強化させる機能をし、インフルエンザワクチン、肺炎ワクチン、細菌性歯周疾患、抗癌治療ワクチン、ノロウイルスワクチン、神経退行性疾患、各種免疫疾患において免疫増強剤効能が立証された。また、フラジェリンによるＴＬＲ５活性化は、造血細胞と放射線による胃腸組織を保護し、癌細胞の生存と成長に影響を及ぼすことが報告されたことがある。

ただし、今まで、フラジェリン免疫増強剤効果の研究は、原核細胞である大腸菌において発現した組換えタンパク質を用いて進行されてきた。ところが、フラジェリン免疫増強剤の適用範囲を核酸ベースワクチン（例えば、ＤＮＡワクチン或いはｍＲＮＡワクチンなど）や翻訳後修飾（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）が必須である抗原に応用するためには、真核細胞発現システムにおいて発現したフラジェリンの作製が必要である。ところが、真核細胞システムで製造したフラジェリンは、原核細胞発現フラジェリンに比べてＴＬＲ５－信号伝達能が顕著に低下する。このような現象は、真核細胞においてフラジェリンを発現させる場合に、翻訳後修飾過程による立体障害のためにＴＬＲ５信号伝達を効率的に誘導できなかったことに起因するものと推測される。

このため、強力な免疫調節能を保有するとともに、効果的なワクチン免疫増強剤機能がある、真核細胞において製造され得るフラジェリンタンパク質に対する研究が必要な現状である。

そこで、本発明者らは、真核細胞においてフラジェリンタンパク質を製造し、その免疫増強能及び安全性がとりわけ優れていることを確認した。

具体的には、本発明者らは、真核細胞システムにおいて製造したフラジェリンは、原核細胞において発現したフラジェリンに比べてＴＬＲ５刺激活性が非常に弱いことを確認した。このような現象は、真核細胞においてフラジェリンを発現させる場合に、翻訳後修飾過程によって糖化されたフラジェリン（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ－ｅＦｌａＢ）が生産され、糖化されたフラジェリンは、糖分子による立体障害のためにＴＬＲ５－信号伝達を効率的に誘導できなかったことに起因するものと推測した。この仮設を証明するために生物情報学分析を進行したし、真核細胞において発現させたフラジェリンは、５個のＮ－糖化部位があることを確認した。そこで、位置指定突然変異（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法を導入し、Ｎ－糖化（ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ）部位と推定されるアスパラギンをアラニンで置換したフラジェリン変形体を作製することで、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）及びインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）の条件において当該フラジェリン変形体の活性を検証した。これにより、ｐＦｌａＢと同じＴＬＲ５刺激活性と免疫増強剤効能を示す真核細胞発現フラジェリン免疫増強剤変形体（ｅｕｋＦｌａＢｖａｒｉａｎｔｓ）を導出した。興味深くも、当該変形体（ｅｕｋＦｌａＢｖａｒｉａｎｔ）は脱免疫特性を示した。要するに、免疫情報学的分析とタンパク質変形戦略を用いて、Ｎ－糖化を誘導しない真核細胞発現フラジェリン（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｅｄｆｌａｇｅｌｌｉｎ）を確立することにより、より安全で様々な臨床の適用が可能なフラジェリン免疫増強剤を導出した。

したがって、本発明の目的は、真核細胞において発現可能なフラジェリンタンパク質を提供することである。

本発明の他の目的は、真核細胞において発現可能なフラジェリンタンパク質を含むワクチン用免疫補助剤組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、真核細胞において発現可能なフラジェリンタンパク質を含む免疫機能増強用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、真核細胞において発現可能なフラジェリンタンパク質を含む微生物感染又は癌の予防又は治療用の薬学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、真核細胞において発現可能なフラジェリンタンパク質の、免疫補助用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、真核細胞において発現可能なフラジェリンタンパク質の、免疫機能増強用途を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、真核細胞において発現可能なフラジェリンタンパク質の、自己免疫疾患、炎症性疾患、微生物感染又は癌の予防又は治療用途を提供することである。

本発明は、ＴＬＲ５活性能を有するフラジェリン免疫増強剤誘導体の真核細胞発現システムを用いた製造及び応用に関し、本発明に係るフラジェリンタンパク質は、高い免疫増強効果を示す。

以下、本発明をより詳細に説明する。

本発明の一態様は、配列番号１３のアミノ酸配列において一つ以上のアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）がアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）で置換された、真核細胞において発現可能なポリペプチドに関する。

本発明の一具現例において、ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列において８３、１０１、１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置のアスパラギンがアラニンで置換されたものであってよい。

本発明の一具現例において、ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列において８３番目の位置；及び、１０１、１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；のアスパラギンがアラニンで置換されたものであってよい。

本発明の一具現例において、ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列において８３及び１０１番目の位置；及び、１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；のアスパラギンがアラニンで置換されたものであってよい。

本発明の一具現例において、ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列において８３、１０１、及び１３９番目の位置；及び、２７３及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；のアスパラギンがアラニンで置換されたものであってよい。

本発明の一具現例において、ポリペプチドは、配列番号１４～２３のアミノ酸配列からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列を含むものであってよい。

本発明に係るポリペプチドは、ＴＬＲ－５活性能に優れて高い免疫増強効果を示すので、ワクチン用免疫補助剤組成物、免疫機能増強用組成物、又は自己免疫疾患、炎症性疾患、微生物感染又は癌の予防又は治療用の薬学的組成物として利用可能であるが、これに限定されるものではない。

本発明に係るポリペプチドは、インフルエンザワクチンと共に投与時に、インフルエンザ抗原に特異的な抗体の生成を誘導する効果に優れているので、インフルエンザワクチン用免疫補助剤組成物又はインフルエンザ治療用免疫補助剤組成物として利用可能であるが、これに限定されるものではない。

本発明の他の態様は、配列番号１３のアミノ酸配列において一つ以上のアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）がアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）で置換されたポリペプチドを含む、ワクチン用免疫補助剤組成物に関する。

本発明に係るワクチン用免疫補助剤組成物は、１種以上の一般的に使用される薬剤学的及び／又は獣医学的に許容される担体、希釈剤、抗生剤、補助剤などをさらに含んでよい。

担体は、目的動物（宿主動物）に投与することに対して製薬上許容される任意の溶媒（溶液）、分散媒質、コーティング剤、緩衝剤、等張性作用剤、懸濁液、コロイド、安定化剤、防腐剤、抗生剤（抗菌剤、抗真菌剤など）、吸着遅延剤、補助剤（アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ））、挿入物などを含んでよい。一般に、化学化合物、特に免疫原に対する１種以上の伝達ビークル（Ｖｅｈｉｃｌｅ）の使用は、製薬業界における当業者には周知である。任意の通常の媒質又は作用剤が、活性成分と相溶性でない限り、診断、予防及び治療用の組成物におけるそれの使用が考慮される。また、１種以上の補充活性成分が開示の免疫原性組成物及びワクチン製剤のうちの１種以上内に混入されてもよく、又はこれと共に投与されてよい。

希釈剤としては、水、食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどが含まれてよく、前記等張性作用剤としては、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトースなどが含まれてよく、前記安定化剤としてはアルブミンが含まれてよいが、これに限定されない。

補助剤（アジュバント）としては、鉱物性ゲル、例えばアルミニウムヒドロキシドゲル；表面活性物質、例えばリゾレシチン；グリコシド、例えばサポニン誘導体、例えば、クイルＡ（ＱｕｉｌＡ）又はＧＰＩ－０１００（ＧａｌｅｎｉｃａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，アラバマ州バーミンガム）；プルロンポリオール；多価陰イオン（多重陰イオン）；非イオン性ブロック重合体、例えばプルロンＦ－１２７（Ｂ．Ａ．Ｓ．Ｆ．，米国）；ペプチド；鉱油、例えばモンタニド（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ）ＩＳＡ－２０６（Ｓｅｐｐｉｃ，フランス）、モンタニドＩＳＡ－５０（Ｓｅｐｐｉｃ，フランス）、カボポール（Ｃａｂｏｐｏｌ）、アンフィゲン、アンフィゲンマークＩＩ（ハイドロニックス（Ｈｙｄｒｏｎｉｃ），米国）、アルハイドロゲル、オイルエマルジョン（例えば、ＢａｙｏｌＦ／ＡｒｌａｃｅｌＡのような鉱油と水との乳化液）、又は植物性オイル、水及びレシチンのような乳化剤の乳化液；明礬（ａｌｕｍ）；コレステロール；Ｆｒｅｕｎｄ完全及び不完全補助剤；ブロック共重合体（ＣｙｔＲｘ，ジョージア州アトランタ）；ＳＡＦ－Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ，カリフォルニア州エメリービル）；アンフィゲン（ＡＭＰＨＩＧＥＮ，登録商標）補助剤；モノホスホリル脂質Ａ、アブリジン（Ａｖｒｉｄｉｎｅ）脂質－アミン補助剤；大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）由来の熱不安定性腸毒素（組換えなど）；コレラ毒素；ムラミルジペプチド；ＩＭＳ１３１３（Ｓｅｐｐｉｃ，フランス）；ＩＳＡ２０６；モンタニド０１ゲル（Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ０１ｇｅｌ）（Ｓｅｐｐｉｃ，フランス）；及び、これらの補助剤の混合物が含まれるが、これに限定されず、好ましくは、ＩＭＳ１３１３、カボポール及びモンタニド０１ゲルからなる群から選ばれる１種以上のアジュバントである。該アジュバントは、免疫反応の向上及び／又は接種後の吸収速度を促進する化合物又は混合物のことを指し、任意の吸収促進剤を含む。

本発明のさらに他の態様は、配列番号１３のアミノ酸配列において一つ以上のアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）がアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）で置換されたポリペプチドを含む、免疫機能増強用組成物に関する。

本発明のさらに他の態様は、配列番号１３のアミノ酸配列において一つ以上のアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）がアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）で置換されたポリペプチドを含む、自己免疫疾患、炎症性疾患、微生物感染又は癌の予防又は治療用の薬学的組成物に関する。

本発明の一具現例において、自己免疫疾患は、血球貪食性リンパ組織球症（Ｈｅｍｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃｌｙｍｐｈｏｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｓｉｓ）、全身紅斑ループス（ｓｙｓｔｅｍｉｃｌｕｐｕｓｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）、キクチ（Ｋｉｋｕｃｈｉ）病、血管炎（ｖａｓｃｕｌｉｔｉｓ）、成人発症スティル病（ＡｄｕｌｔｏｎｓｅｔＳｔｉｌｌ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、リウマチ関節炎（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄａｒｔｈｒｉｔｉｓ）、炎症性筋肉炎（ＩｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙＭｙｏｓｉｔｉｓ）、ベーチェット病（Ｂｅｈｃｅｔｄｉｓｅａｓｅ）、ＩｇＧ４連関性疾患、シェーグレン症候群（Ｓｊｏｇｒｅｎｓｙｎｄｒｏｍｅ）、巨大細胞動脈炎（Ｇｉａｎｔｃｅｌｌａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、側頭動脈炎（Ｔｅｍｐｏｒａｌａｒｔｅｒｉｔｉｓ）、１型糖尿病、アトピー皮膚炎、クローン病（Ｃｒｏｈｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、全身性硬化症（ｓｙｓｔｅｍｉｃｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、乾癬、多発性硬化症（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、及びグレーブス甲状腺亢進症（Ｇｒａｖｅｓｈｙｐｅｒｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ）からなる群から選ばれる１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明の一具現例において、炎症性疾患は、敗血症、胃炎、腸炎、腎臓炎、肝炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣｈｒｏｎｉｃＯｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅＰｕｌｍｏｎａｒｙＤｉｓｅａｓｅ：ＣＯＰＤ）、肺線維症、過敏性大腸症候群、炎症性疼痛、片頭痛、頭痛、腰痛、線維筋肉痛、筋膜疾患、ウイルス感染、細菌感染、カビ感染、火傷、外科的又は歯科的手術による傷、プロスタグランジン過剰症候群、アテローム性動脈硬化症、痛風、ホジキン病、膵臓炎、結膜炎、虹彩炎、鞏膜炎、ブドウ膜炎、及び湿疹からなる群から選ばれる１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明の一具現例において、微生物は、インフルエンザーウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）、コロナウイルス（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）、ジカウイルス（Ｚｉｋａｖｉｒｕｓ）、デングウイルス（Ｄｅｎｇｕｅｖｉｒｕｓ，ＤＥＮＶ）、ハンタウイルス（Ｈａｎｔａｖｉｒｕｓ）、巨大細胞ウイルス（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ，ＣＭＶ）、エプスタインバールウイルス（ＥｐｓｔｅｉｎＢａｒｒｖｉｒｕｓ，ＥＢＶ）、ヒト免疫欠乏ウイルス（ｈｕｍａｎｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙｖｉｒｕｓ，ＨＩＶ）、単純疱疹ウイルス（Ｈｅｒｐｅｓｓｉｍｐｌｅｘｖｉｒｕｓ，ＨＳＶ）、チクングニアウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａｖｉｒｕｓ）、エンテロウイルス（Ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）、マールブルグ熱ウイルス（Ｍａｒｂｕｒｇｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ）、パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）、重症熱性血小板減少症候群ウイルス（ＳｅｖｅｒＦｅｖｅｒｗｉｔｈＴｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａＳｙｎｄｒｏｍｅＶｉｒｕｓ，ＳＦＴＳＶ）、ロタウイルス（Ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）、ノロウイルス（Ｎｏｒｏｖｉｒｕｓ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ａ群溶血性連鎖球菌（ＧｒｏｕｐＡＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，ＧＡＳ）、Ｂ群連鎖球菌（ＧｒｏｕｐＢＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，ＧＢＳ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓａｕｒｅｕｓ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、病原性大腸菌（ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＥ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、クラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、無莢膜型インフルエンザ菌（Ｎｏｎ－ｔｙｐｅａｂｌｅＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、クロストリディオイデスディフィシル（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）、マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）、住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）、トリパノソーマ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ）、ブルセラ菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ）、クリプトスポリジウム（Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、及びエントアメーバ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ）からなる群から選ばれる１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明の一具現例において、癌は、乳癌、肺癌、結腸癌、腎臓癌、肝癌、卵巣癌、前立腺癌、精巣癌、泌尿生殖管癌、リンパ系癌、直腸癌、膵癌、食道癌、胃癌、子宮頸癌、甲状腺癌、及び皮膚癌からなる群から選ばれる１種以上であってよいが、これに限定されるものではない。

本発明の薬学的組成物は薬学的有効量で投与されてよい。

本明細書において用語「薬学的有効量」は、上述した組成物の効能又は活性を達成するのに十分な量を意味する。

本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容される担体を含むものであってよい。

本発明の薬学的組成物に含まれる薬学的に許容される担体は、製剤時に通常使用されるものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアガム、リン酸カルシウム、アルジネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、滑石、ステアリン酸マグネシウム、及びミネラルオイルなどを含むが、これに限定されるものではない。本発明の薬学的組成物は、前記成分の他にも潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤などをさらに含んでよい。

本発明に係る薬学的組成物は、ヒトを含む哺乳動物に様々な経路で投与されてよい。投与方式は、通常の如何なる方式であってもよく、例えば、経口、皮膚、静脈、筋肉、皮下などの経路で投与されてよく、好ましくは経口で投与されてよい。

本発明の薬学的組成物の適切な投与量は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢、体重、性別、病的状態、食べ物、投与時間、投与経路、排泄速度、及び反応感応性のような要因によって様々であり、熟練した普通の医師は希望の治療又は予防に効果的な投与量を容易に決定及び処方できる。

本発明の薬剤学的組成物は、当該発明の属する技術の分野における通常の知識を有する者が容易に実施できる方法によって、薬剤学的に許容される担体及び／又は賦形剤を用いて製剤化することにより、単位用量の形態で製造されたり又は多回用量容器内に内入させて製造されてよい。このとき、剤形は、オイル又は水性媒質中の溶液、懸濁液又は乳化液の形態であるか、エキス剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、又はゲル（例えば、ハイドロゲル）の形態であってよく、分散剤又は安定化剤をさらに含んでよい。

本発明のさらに他の態様は、配列番号１３のアミノ酸配列において一つ以上のアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）がアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）で置換されたポリペプチドの、ワクチン免疫補助用途に関する。

本発明のさらに他の態様は、配列番号１３のアミノ酸配列において一つ以上のアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）がアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）で置換されたポリペプチドの、免疫機能増強用途に関する。

本発明のさらに他の態様は、配列番号１３のアミノ酸配列において一つ以上のアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）がアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）で置換されたポリペプチドの、自己免疫疾患、炎症性疾患、微生物感染又は癌の予防又は治療用途に関する。

本発明は、ＴＬＲ５活性能を有するフラジェリン免疫増強剤誘導体の真核細胞発現システムを用いた製造及び応用に関し、本発明に係るフラジェリン変形体は高い免疫増強効果を有するものであり、様々なワクチン及び免疫治療剤組成物に利用可能である。

本発明の一実施例によって原核細胞である大腸菌において発現した敗血症ビブリオ菌由来野生型フラジェリン（ｐｒｏｋＦｌａＢ）と真核細胞であるＥｘｐｉ２９３（商標）細胞において発現した野生型フラジェリン（ｅｕｋＦｌａＢ）をウェスタンブロットによって確認した結果を示す図である。本発明の一実施例によって原核細胞である大腸菌において発現した敗血症ビブリオ菌由来野生型フラジェリン（ｐｒｏｋＦｌａＢ）と真核細胞であるＥｘｐｉ２９３（商標）細胞において発現した野生型フラジェリン（ｅｕｋＦｌａＢ）のＴＬＲ５刺激活性を比較した結果を示すグラフである。本発明の一実施例によって真核細胞であるＥｘｐｉ２９３（商標）細胞において発現した野生型フラジェリン（ｅｕｋＦｌａＢ）を脱糖化酵素であるＰＮＧａｓｅ（ＰｅｐｔｉｄｅＮ－ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ）で処理した前後のタンパク質状態をウェスタンブロットによって確認した結果を示す図である。本発明の一実施例によって真核細胞であるＥｘｐｉ２９３（商標）細胞において発現した野生型フラジェリン（ｅｕｋＦｌａＢ）を脱糖化酵素であるＰＮＧａｓｅ（ＰｅｐｔｉｄｅＮ－ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ）で処理した前後のＴＬＲ５刺激活性を比較した結果を示すグラフである。本発明の一実施例によってフラジェリン（ＦｌａＢ）の糖化アミノ酸配列を予測した結果である。部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を誘導したフラジェリン変形体作製構成を示す図である。図６及び図７は、本発明の一実施例によって真核細胞であるＥｘｐｉ２９３（商標）細胞において発現したフラジェリン変形体の特徴とＴＬＲ５刺激活性を検証した結果である。図６及び図７は、本発明の一実施例によって真核細胞であるＥｘｐｉ２９３（商標）細胞において発現したフラジェリン変形体の特徴とＴＬＲ５刺激活性を検証した結果である。Ｃｏ－ＩＰ（Ｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）方法によってフラジェリン変形体とＴＬＲ５の結合を測定した結果である。本発明の一実施例によって原核細胞である大腸菌において発現した敗血症ビブリオ菌由来野生型フラジェリン（ｐｒｏｋＦｌａＢ）、真核細胞であるＥｘｐｉ２９３（商標）細胞において発現した野生型フラジェリン（ｅｕｋＦｌａＢ）、及び様々なフラジェリン変形体の免疫増強剤効能をインフルエンザワクチンモデルにおいて比較した結果である。本発明の一実施例によって原核細胞である大腸菌において発現した敗血症ビブリオ菌由来野生型フラジェリン（ｐｒｏｋＦｌａＢ）と真核細胞であるＥｘｐｉ２９３（商標）細胞において発現した野生型フラジェリン（ｅｕｋＦｌａＢ）、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３Ａ}、及びｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３／３３０Ａ}をインフルエンザワクチンモデルにおいて免疫増強剤として使用する場合に、ｐｒｏｋＦｌａＢ－或いはｅｕｋＦｌａＢ－選択的な抗体生成の有無を比較した結果である。本発明の一実施例によって原核細胞である大腸菌において発現した敗血症ビブリオ菌由来野生型フラジェリン（ｐｒｏｋＦｌａＢ）、真核細胞であるＥｘｐｉ２９３（商標）細胞において発現した野生型フラジェリン（ｅｕｋＦｌａＢ）及び様々なフラジェリン変形体の安定性を比較した結果である。

本発明は、配列番号１３のアミノ酸配列において一つ以上のアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）がアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）で置換された、真核細胞において発現可能なポリペプチドに関する。

以下、本発明を、下記の実施例によってより詳細に説明する。ただし、これらの実施例は、本発明を例示するためのものにすぎず、本発明の範囲がこれらの実施例によって限定されることはない。

本明細書の全体を通じて、特定物質の濃度を示すために使われる「％」は、特に断らない限り、固体／固体は（重量／重量）％、固体／液体は（重量／体積）％、及び液体／液体は（体積／体積）％である。

実施例１：真核細胞発現野生型フラジェリン生産用プラスミド作製

原核細胞において発現する敗血症ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏｖｕｎｉｆｉｃｕｓ）由来ＦｌａＢ（ｐｒｏｋＦｌａＢ）は、ＬｅｅＳＥ，ｅｔａｌ．Ａｂａｃｔｅｒｉａｌｆｌａｇｅｌｌｉｎ，ＶｉｂｒｉｏｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓＦｌａＢ，ｈａｓａｓｔｒｏｎｇｍｕｃｏｓａｌａｄｊｕｖａｎｔａｃｔｉｖｉｔｙｔｏｉｎｄｕｃｅｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅｉｍｍｕｎｉｔｙ．ＩｎｆｅｃｔＩｍｍｕｎ．２００６；７４（１）：６９４－７０２に開示している方法によって生産された。

前記ＦｌａＢを真核細胞において発現させるために、ＨｉｎｄＩＩＩ（ＡＡＧＣＴＴ）切断部位を含む、下記の表１における正方向プライマーｅｕｋＦｌａＢ－ＦとＮｏｔＩ切断部位を含む逆方向プライマーｅｕｋＦｌａＢ－Ｒを用いて、ＰＣＲ反応によって増幅させた。このとき、哺乳類細胞発現コドン使用（頻度）によって最適化したＦｌａＢを合成した後、ｐＢＨＡプラスミドにクローニングしたｐＢＨＡ：：ｅｕｋＦｌａＢ（バイオニア，韓国）をＰＣＲ反応鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として使用した。

ｅｕｋＦｌａＢＤＮＡ増幅産物と真核細胞発現ベクターｐＳｅｃｔａｇ２Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｖ９００－２０）はそれぞれ、一対の制限酵素（ＲＥ）ＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｏｔＩを３７℃で一晩処理した。制限酵素を処理したＰＣＲ産物と真核細胞発現ベクターであるｐＳｅｃｔａｇ２Ｂを、室温で２時間Ｔ４ＤＮＡ連結酵素（Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ）で結合させた。新しい構造であるｐＳｅｃｔａｇ２Ｂ：：ｅｕｋＦｌａＢプラスミドは、大腸菌コンピテント細胞であるＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で形質転換し、アンピシリンが含まれているＬＢプレートを用いて培養した。発現ベクターのＤＮＡ塩基配列は、ＭａｃｒｏｇｅｎＯｎｌｉｎｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＯｒｄｅｒＳｙｓｔｅｍ（ｈｔｔｐ：／／ｄｎａ．ｍａｃｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｋｏｒ／）を通じてジデオキシ鎖終結塩基配列法（ｄｉｄｅｏｘｙ－ｃｈａｉｎｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で確認した。

実施例２：真核細胞発現システムを活用した組換えタンパク質生産

真核細胞発現系細胞株であるＥｘｐｉ２９３（商標）細胞は、ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｃａｔ＃．Ａ１４６３５）から購入して本発明に使用した。形質注入手続きは、メーカーのプロトコルに従う。Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞は、３７℃、８％ＣＯ_２及び１２５ｒｐｍの速度で撹拌されるインキュベーターで培養した。０日目（形質注入の前日）にＥｘｐｉ２９３（商標）細胞は、培養フラスコ（ｃｏｒｎｉｎｇ）に３ｘ１０^６／ｍｌで接種した。１日目（形質注入の当日）、Ｅｘｐｉ２９３（商標）細胞数を測定して３ｘ１０^６／ｍｌで接種し、０．２２μｍフィルター（Ｍｉｌｌｅｘｍｉｌ－ＧＶ，ＳＬＧＶＲ１３）で濾過して滅菌したｐＳｅｃｔａｇ２Ｂ：：ｅｕｋＦｌａＢプラスミドを細胞培養系に添加した。２日目に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクションエンハンサー１及びエンハンサー２を添加し、４日目まで培養し続けた。このとき、組換えタンパク質は、ＩｇＫ鎖配列を含むｐＳｅｃｔａｇ２Ｂによって培養培地に分泌された。

４日目に、タンパク質が分泌された培養培地は、４℃で２０分間１７，０００ｒｐｍで遠心分離した後、メーカーの指針に従って無細胞上澄液を、Ｎｉ－ＮＴＡアガロースビーズ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が含まれたカラムにロードした。所望のタンパク質を除く残りのタンパク質を除去するために、洗浄バッファーＩ（５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、ｐＨ＝８）と洗浄バッファーＩＩ（５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭＮａＣｌ、及び２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ＝８）を用いて洗浄した。対象タンパク質は、１５分間常温で溶出バッファー（５０ｍＭＮａＨ_２ＰＯ_４、３００ｍＭＮａＣｌ、及び２５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ＝８）を用いて溶かして分離した。このように溶出されたタンパク質は、透析法によって緩衝液をリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）に取り換えた。

組換えペプチドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて生成された抗ＦｌａＢ抗体を使用したウェスタンブロットによって確認し、その結果を図１に示した。

実施例３：真核細胞発現システムを活用して作製した野生型フラジェリンのＴＬＲ５刺激活性検証

真核細胞発現システムを活用して作製した野生型フラジェリンのＴＬＲ５刺激活性を検証するために、様々なタンパク質濃度でＮＦ－κＢ活性を測定した。具体的には、メーカーのプロトコルに従ってＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）検出（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ｈｂ－ｄｅｔ２）分析システムと共にＨＥＫ－Ｂｌｕｅ（商標）ｈＴＬＲ５細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，ｈκｂ－ｈｔｌｒ－５）を使用した。各タンパク質濃度に対して３重ＯＤ６２０ｎｍ値を使用してＥＣ５０を計算した。脱糖化されたｅｕｋＦｌａＢの生物学的活性を確認するためにＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈer Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して試験管内ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター分析を行った。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳ及び１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌの抗生剤（Ｇｉｂｃｏ（商標），ｃａｔ．１５１４０１２２）を含むＤＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ（商標），ｃａｔ．１１９９５－０６５）において３７℃、５％ＣＯ_２で保持した。ＮＦ－κＢレポーター分析のために少なくとも３回の細胞継代を使用した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、２４ウェルプレート（ＳＰＬＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｋｏｒｅａ）に２ｘ１０^５／ｗｅｌｌで接種して２４時間培養した。細胞に形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）するために、レポータープラスミドｐＮＦ－κＢ－ｌｕｃ（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）、ｐ３ｘＦｌａｇ－ｈＴＬＲ５（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）、ｐＣＭＶ－β－Ｇａｌ（５０ｎｇ／ｗｅｌｌ）、及びＥｆｆｅｃｔｅｎｅ（５μｌ／ｗｅｌｌ）（Ｑｉａｇｅｎ，３０１４２７）を入れて一晩培養した。形質注入された細胞にｐｒｏｋＦｌａＢ、ｅｕｋＦｌａＢ又は突然変異ｅｕｋＦｌａＢ変形体を処理して２４時間培養した後、培養液を除去し、細胞溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩＵＳＡ，Ｅ１５３Ａ）で細胞を溶解させた後、細胞溶解物から蛍光酵素活性化を光度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｌｕｍａｔ－ＰｌｕｓＬＢ９６Ｖ）で測定した。

実験の結果、図２に示すように、ｅｕｋＦｌａＢは、ｐｒｏｋＦｌａＢに比べて顕著に低いＴＬＲ５刺激を誘導することを確認した。

実施例４：脱糖化酵素（ＰｅｐｔｉｄｅＮ－ｇｌｙｃｏｓｉｄａｓｅＦ）を使用した真核細胞発現フラジェリン脱糖化（Ｎｄｅｇｌｙｃｏｓｌｙａｔｉｏｎ）反応及び脱糖化された真核細胞発現フラジェリンのＴＬＲ５刺激活性検証

真核細胞発現ｅｕｋＦｌａＢの脱糖化反応は、メーカーのプロトコルに従ってＰＮＧａｓｅＦ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，ｃａｔ．Ｖ４８３Ａ）を用いて行った。ＰＮＧａｓｅＦ酵素（１０Ｕ／μｌ）とｅｕkＦｌａＢ（１５μｇ）を混合した後、３７℃で培養した。２時間後に、脱糖化程度は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＢＡＬＢ／ｃマウスで生成された抗ＦｌａＢ抗体を用いたウェスタンブロットによって確認し、その結果を図３Ａに示した。脱糖化されたｅｕｋＦｌａＢのＴＬＲ５刺激活性は、実施例３と同じ方法で測定し、その結果を図３Ｂに示した。

実験の結果、図３Ｂに示しているように、脱糖化されたｅｕｋＦｌａＢはＴＬＲ５刺激活性を回復することが確認できた。

実施例５：部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）誘導を用いた様々な脱糖化フラジェリン誘導体の作製及び様々な脱糖化された真核細胞発現フラジェリン誘導体のＴＬＲ５刺激活性の検証

ＮｅｔＮＧｌｙｃ－１．０（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｅｒｖｉｃｅｓ．ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅ．ｐｈｐ？ＮｅｔＮＧｌｙｃ－１．０）、Ｎ－糖化共通塩基配列Ａｓｎ－Ｘａａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒを決定する生物情報ツールを用いてＦｌａＢアミノ酸配列のＮ－糖化部位を予測した。

図４に示すように、ｅｕｋＦｌａＢは、Ｎ８３、Ｎ１０１、Ｎ１３９、Ｎ２７３、及びＮ３３０において５個の糖化残基が予測され、３個の残基（Ｎ８３、Ｎ１０１、Ｎ１３９）がＴＬＲ５結合ドメインの近くに位置することが確認された。

そこで、図５に示すように、部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）法を導入して様々な脱糖化フラジェリンタンパク質［ｅｕｋＦｌａＢ^Ｎ８３Ａ、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ１０１Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ１３９Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ２７３Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ３３０Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３Ａ，Ｎ１０１Ａ}（ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１Ａ}）、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３Ａ，Ｎ１０１Ａ，Ｎ１３９Ａ}（ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９Ａ}）、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３Ａ，Ｎ１０１Ａ，Ｎ１３９Ａ，Ｎ２７３Ａ}（ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３Ａ}）、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３Ａ，Ｎ１０１Ａ，Ｎ１３９Ａ，Ｎ２７３Ａ，Ｎ３３０Ａ}（ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３／３３０Ａ}）、及びｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ１３９Ａ，Ｎ２７３Ａ，Ｎ３３０Ａ}（ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ１３９／２７３／３３０Ａ}）を作製した。

ｅｕｋＦｌａＢの部位特異的突然変異（ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄｍｕｔａｔｉｏｎ）の生成は、メーカープロトコルに従って行った（ＥＺｃｈａｎｇｅ（商標）Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄＭｕｔａｔｉｏｎ，Ｃａｔ．＃ＥＺ００４Ｓ）。簡単にいうと、ｐＳｅｃｔａｇ２Ｂ：：ｅｕｋＦｌａＢプラスミドは、ＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用されたし、このとき、使用した表２のプライマーは、特定コドンである「ＡＡＣ」又は「ＡＡＴ」に該当するアミノ酸アスパラギン（Ｎ）を、さらに他の特定コドンである「ＧＣＴ」又は「ＧＣＣ」に該当するアミノ酸アラニン（Ａ）に変化させ、位置誘導突然変異の生成のために設計された。ＥＺ－ＭＩＸ酵素を使用してＰＣＲ産物から母体プラスミドを分離した後、プラスミドは、大腸菌コンピテント細胞（水溶性細胞）であるＴＯＰ１０で形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有のＬＢプレートに薄く伸ばして塗った。ｅｕｋＦｌａＢの陽性突然変異配列は、マイクロジェンオンラインシーケンス（ｈｔｔｐ：／／ｄｎａ．ｍａｃｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｋｏｒ／）から確認した。

組換えペプチドは、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて生成された抗ＦｌａＢ抗体を使用したウェスタンブロットによって確認し、その結果を図６に示した。

前記方法によって製造されたｅｕｋＦｌａＢ、ｅｕｋＦｌａＢ^Ｎ８３Ａ、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ１０１Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ１３９Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ２７３Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ３３０Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３／３３０Ａ}、及びｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ１３９／２７３／３３０Ａ}のペプチド配列は、下記の表３に示した。

様々なフラジェリンの生物学的活性を決定するために、レポーターアッセイによってトル様レセプター５（Ｔｏｌｌ－ｌｉｋｅｒｅｃｅｐｔｏｒ５）信号媒介によるＮＦ－κＢ活性を測定した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ（商標），ｃａｔ．１６００００４４）と１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリンと１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン抗生剤（Ｇｉｂｃｏ（商標），ｃａｔ．１５１４０１２２）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ（商標），ｃａｔ．１１９９５－０６５）培地において保持した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、２４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇｃｏｓｔａｒ，ｃａｔ．３５２６）に２ｘ１０^５／ｗｅｌｌで接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで２４時間培養した。細胞に形質注入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）するためにレポータープラスミドｐＮＦ－κＢ－ｌｕｃ（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）、ｐ３ｘＦｌａｇ－ｈＴＬＲ５（１００ｎｇ／ｗｅｌｌ）、ｐＣＭＶ－β－Ｇａｌ（５０ｎｇ／ｗｅｌｌ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（５μｌ／ｗｅｌｌ）（Ｑｉａｇｅｎ，３０１４２７）を入れて一晩培養した。形質注入された細胞にｐｒｏｋＦｌａＢ、ｅｕｋＦｌａＢ又は突然変異ｅｕｋＦｌａＢ変形体を処理して２４時間培養した後、培養液を除去し、細胞溶解緩衝液で細胞を溶解させた後、細胞溶解物から蛍光酵素活性化を光度計（Ｂｅｒｔｈｏｌｄ，Ｌｕｍａｔ－ＰｌｕｓＬＢ９６Ｖ）で測定し、ＴＬＲ５－信号伝達活性を検証した。

実験の結果、図７に示すように、ｅｕｋＦｌａＢ、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ１０１Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ１３９Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ２７３Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ３３０Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ１３９／２７３／３３０Ａ}は、ＴＬＲ５活性化を誘導しないが、ｅｕｋＦｌａＢ^Ｎ８３Ａ、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３／３３０Ａ}は、ＴＬＲ５活性化を誘導することを確認した。特に、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３／３３０Ａ}は、原核細胞由来フラジェリン（ｐｒｏｋＦｌａＢ）と同じレベルのＴＬＲ５刺激活性を有することを確認した。

実施例６：共同免疫沈降法（Ｃｏ－ＩＰ；Ｃｏ－Ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を用いたフラジェリン変形体とＴＬＲ５結合測定

次のように、共同免疫沈降法（Ｃｏ－ＩＰ）を用いてフラジェリン変形体とＴＬＲ５の結合を測定した。具体的には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をｐ３ＸＦｌａｇ－ｈＴＬＲ５プラスミドで２４時間形質注入させた。プロテアーゼ抑制剤が含まれたＲＩＰＡ緩衝液を使用して細胞を溶解し、超音波処理した後に遠心分離して上澄液を収集した。タンパク質ｐｒｏｋＦｌａＢ、ｅｕｋＦｌａＢ、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９Ａ}、及びｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３／３３０Ａ}を上澄液と混合して４℃で一晩回転させた（ＣｏｍｐｌｅｘＩ）。同時に、ＰｒｏｔｅｉｎＡ／Ｇｐｌｕｓ－ａｇａｒｏｓｅ（ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｓｃ－２００３）と抗Ｆｌａｇタグ抗体（Ａｂｃａｍ，ａｂ１１６２）を混合して４℃で一晩回転させた（ＣｏｍｐｌｅｘＩＩ）。その後、ＩＰバッファー（１％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００、２５ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．５、１０％グリセロール、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＤＴＴ、１ｍＭＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ阻害剤）でＣｏｍｐｌｅｘＩＩを５回洗浄した。ＣｏｍｐｌｅｘＩとＩＩを４℃で６時間混合した後、ＩＰバッファーで５回洗浄して非特異的結合タンパク質を除去した。１ｘＳＤＳローディングバッファー５０μｌを入れて１０分間加熱した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び追加ウェスタンブロットを分析した。抗ＦｌａＢｅｕｋＦｌａＢ変形体が抗Ｍｙｃによってよく検出されるＭｙｃ－タグと共に発現するので、ｅｕｋＦｌａＢ上の糖化によって検出されたｅｕｋＦｌａＢタンパク質が低く、よって、それぞれ、ｐＦｌａＢ及びｅｕｋＦｌａＢ変形体を検出するためのウェスタンブロット分析にマウス抗ＦｌａＢ及び抗Ｍｙｃ－ＨＲＰ（Ｎｏｖｅｘ（登録商標），４６－０７０９）の２種の異なる抗体を使用した。

実験の結果、図８に示すように、ｐｒｏｋＦｌａＢは、ＴＬＲ５と高親和度で結合したが、ｅｕｋＦｌａＢｓｍｓＴＬＲ５と結合しないことが観察できた。また、ｅｕｋＦｌａＢＮ^{８３／１０１／１３９Ａ}及びｅｕｋＦｌａＢＮ^{８３／１０１／１３９／２７３／３３０Ａ}変形体は、ＴＬＲ５結合が回復することが確認された。このことから、糖化がＦｌａＢ－ＴＬＲ５結合を妨害し、脱糖化がより高親和性のＦｌａＢ－ＴＬＲ５結合を招くということが確認できた。

実施例７：マウスを活用したインフルエンザワクチン実験モデルシステムにおいて上記作製した真核細胞発現フラジェリン変形体の免疫増強剤効能検証

生後７週の雌ＢＡＬＢ／Ｃマウス（ｎ＝１０）は、オリエント（韓国キョンキ－ド，ソンナム－シ）から購入し、実験する前に１週間、施設環境で適応させた。マウスは、ゾレチル（登録商標）５０（Ｖｉｒｂａｃｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｒｒｏｓ，Ｆｒａｎｃｅ）とＲｕｍｐｕｎ（商標）（ＢａｙｅｒＡＧ，Ｌｅｖｅｒｋｕｓｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を混合した痲酔剤を腹腔投与して麻酔させた後、免疫を始めた。グループとしては、１）ｓＨ１Ｎ１抗原群（ｓＨ１Ｎ１、０．２ｕｇ／ｍｏｕｓｅ）、２）ｓＨ１Ｎ１（０．２ｕｇ／ｍｏｕｓｅ）とｐｒｏｋＦｌａＢ（４ｕｇ／ｍｏｕｓｅ）、或いは３）ｅｕｋＦｌａＢ（４ｕｇ／ｍｏｕｓｅ）混合物（ｓＨ１Ｎ１＋ｐｒｏｋＦｌａＢ、ｓＨ１Ｎ１＋ｅｕｋＦｌａＢ、ｓＨ１Ｎ１＋ｅｕｋＦｌａＢ^Ｎ８３Ａ、ｓＨ１Ｎ１＋ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１Ａ}、ｓＨ１Ｎ１＋ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９Ａ}、ｓＨ１Ｎ１＋ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３Ａ}、及びｓＨ１Ｎ１＋ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３／３３０Ａ}）を使用して鼻腔内免疫を始めた。ワクチン抗原はＰＢＳで希釈してマウスの各鼻腔に対して１０μｌずつ、総２０μｌ使用した。マウスは、２週間隔で３回免疫接種を受けたし、最後の免疫接種２週後に、抗体反応を決定するために血清を採取した。

インフルエンザ抗原特異抗体免疫反応は、酵素結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）で測定したし、マウス血清は、３回目の免疫２週後に採取した。ＥＬＩＳＡプレート（ＣｏｒｎｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，３６９０）はそれぞれｓＨ１Ｎ１（４μｇ／ｍｌ）を入れてコートさせた後、４℃で一晩静置させた。翌日、プレートは、洗浄緩衝剤であるＰＢＳ－Ｔ［０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０含有のＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｃａｔ．Ｊ２０６０５－ＡＰ）］を用いて３回洗浄し、ブロッキングバッファー［１ｍＭＥＤＴＡ（ＪＵＮＳＥＩ，ｃａｔ．１７３８５Ｓ０４０１）及びＰＢＳ－Ｔ中０．５％ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，ｃａｔ．Ａ２１５３－５０Ｇ）］を入れて常温で１時間ブロッキングして抗原、抗体の非特異的結合を遮断した。マウスから採取した血清は、ブロッキングバッファーを用いて系列希釈（２－ｆｏｌｄｄｉｌｕｔｉｏｎ）し、ウェル当たり４０ｕｌ入れて常温で２時間反応させた。前記プレートは、ＰＢＳ－Ｔを用いて５回洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識抗マウス（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ－ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ）ＩｇＧ抗体を入れて常温で１時間反応させ、ＰＢＳ－Ｔでプレートを洗浄した。その後、基質（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）であるＴＭＢ（ＢＤＯｐｔＥＩＡ，ｃａｔ．５５５２１４）を入れて発色すると、ＳＴＯＰバッファー（１ＮＨ_２ＳＯ_４）を入れて反応を停止させた。マイクロプレート読み取り機（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＭｅｎｌｏＰａｒｋ，ＣＡ）を用いて４５０ｎｍにおいて吸光度を測定した。抗体力価は、何にも入れていないウェルに比べて２倍高い吸光度値を算出し、血清希釈液の逆（ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ）Ｌｏｇ２値を計算した。

実験の結果、図９に示すように、ｅｕｋＦｌａＢ^Ｎ８３Ａ、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３Ａ}、及びｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３／３３０Ａ}は、原核細胞において発現したフラジェリン（ｐｒｏｋＦｌａＢ）と同じレベルのインフルエンザ抗原特異抗体の生成を誘導し、免疫増強剤効能を有することを確認した。

実施例８：原核細胞発現フラジェリンと真核細胞発現フラジェリンに対する抗体生成能比較検証

実施例７のインフルエンザワクチンモデルにおいて、酵素結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）を用いてフラジェリン特異抗体免疫反応を測定した。具体的には、マウス血清は、３回目の免疫２週後に採取した。ＥＬＩＳＡプレート（ＣｏｒｎｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，３６９０）はそれぞれ、ｐｒｏｋＦｌａＢ（１μｇ／ｍｌ）或いは野生型ｅｕｋＦｌａＢ（１μｇ／ｍｌ）を入れてコーティングさせた後、４℃で一晩静置させた。酵素結合免疫吸着分析法（ＥＬＩＳＡ）は実施例７と同じ方法で実施した。

実験の結果、図１０に示すように、原核細胞において発現したフラジェリン（ｐｒｏｋＦｌａＢ）は、ｐｒｏｋＦｌａＢ－及びｅｕｋＦｌａＢ－特異抗体の生成を誘導するが、ｅｕｋＦｌａＢ、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９Ａ}、ｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３Ａ}、及びｅｕｋＦｌａＢ^{Ｎ８３／１０１／１３９／２７３／３３０Ａ}は、ｐｒｏｋＦｌａＢ－及びｅｕｋＦｌａＢ－特異抗体の生成を誘導しないことを確認した。したがって、本発明のｅｕｋＦｌａＢ変形体は、生体内に反復して投与して生物学的製剤であるフラジェリン自体に対する免疫反応を誘導しないことにより、より安全なフラジェリン免疫増強剤を提供できることを確認した。

実施例９：脱糖化された真核細胞発現フラジェリン誘導体の安定性検証

ｐｒｏｋＦｌａＢ、ｅｕｋＦｌａＢ、及びＮ－糖化突然変異体ｅｕｋＦｌａＢを精製して－８０℃、４℃、及び室温のような互いに異なる温度で２週間保管した。タンパク質の構造的安定性と機能性は、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅ－ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）及びＮＦ－κＢレポーター分析によってそれぞれ試験した。

実験の結果、図１１に示すように、原核細胞で作製したフラジェリン（ｐｒｏｋＦｌａＢ）に比べて、真核細胞で作製したフラジェリンが、より優れた安定性があることを確認した。したがって、本発明のｅｕｋＦｌａＢ変形体は、生物学的製剤の生産、流通、及び生体内投与時に、薬動学的に一層優れたフラジェリン免疫増強剤を提供できると予想される。

Claims

配列番号１３のアミノ酸配列において一つ以上のアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）がアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）で置換された、真核細胞において発現可能なポリペプチド。
前記ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列において８３、１０１、１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項１に記載の真核細胞において発現可能なポリペプチド。
前記ポリペプチドは、配列番号１４～２３のアミノ酸配列からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列を含むものである、請求項１に記載の真核細胞において発現可能なポリペプチド。
前記ポリペプチドは、
配列番号１３のアミノ酸配列において８３番目の位置；及び、
１０１、１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；
のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項２に記載の真核細胞において発現可能なポリペプチド。
前記ポリペプチドは、
配列番号１３のアミノ酸配列において８３及び１０１番目の位置；及び、
１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；
のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項２に記載の真核細胞において発現可能なポリペプチド。
前記ポリペプチドは、
配列番号１３のアミノ酸配列において８３、１０１、及び１３９番目の位置；及び、
２７３及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；
のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項２に記載の真核細胞において発現可能なポリペプチド。
配列番号１３のアミノ酸配列において一つ以上のアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）がアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）で置換されたポリペプチドを含む、ワクチン用免疫補助剤組成物。
前記ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列において８３、１０１、１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項７に記載のワクチン用免疫補助剤組成物。
前記ポリペプチドは、配列番号１４～２３のアミノ酸配列からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列を含むものである、請求項７に記載のワクチン用免疫補助剤組成物。
前記ポリペプチドは、
配列番号１３のアミノ酸配列において８３番目の位置；及び、
１０１、１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；
のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項８に記載のワクチン用免疫補助剤組成物。
前記ポリペプチドは、
配列番号１３のアミノ酸配列において８３及び１０１番目の位置；及び、
１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；
のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項８に記載のワクチン用免疫補助剤組成物。
前記ポリペプチドは、
配列番号１３のアミノ酸配列において８３、１０１、及び１３９番目の位置；及び、
２７３及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；
のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項８に記載のワクチン用免疫補助剤組成物。
配列番号１３のアミノ酸配列において一つ以上のアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）がアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）で置換されたポリペプチドを含む、免疫機能増強用組成物。
前記ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列において８３、１０１、１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項１３に記載の免疫機能増強用組成物。
前記ポリペプチドは、配列番号１４～２３のアミノ酸配列からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列を含むものである、請求項１３に記載の免疫機能増強用組成物。
前記ポリペプチドは、
配列番号１３のアミノ酸配列において８３番目の位置；及び、
１０１、１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；
のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項１４に記載の免疫機能増強用組成物。
前記ポリペプチドは、
配列番号１３のアミノ酸配列において８３及び１０１番目の位置；及び
１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；
のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項１４に記載の免疫機能増強用組成物。
前記ポリペプチドは、
配列番号１３のアミノ酸配列において８３、１０１、及び１３９番目の位置；及び
２７３及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；
のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項１４に記載の免疫機能増強用組成物。
配列番号１３のアミノ酸配列において一つ以上のアスパラギン（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ，Ｎ）がアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）で置換されたポリペプチドを含む、自己免疫疾患、炎症性疾患、微生物感染又は癌の予防又は治療用の薬学的組成物。
前記ポリペプチドは、配列番号１３のアミノ酸配列において８３、１０１、１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項１９に記載の自己免疫疾患、炎症性疾患、微生物感染又は癌の予防又は治療用の薬学的組成物。
前記ポリペプチドは、配列番号１４～２３のアミノ酸配列からなる群から選ばれる一つのアミノ酸配列を含むものである、請求項１９に記載の自己免疫疾患、炎症性疾患、微生物感染又は癌の予防又は治療用の薬学的組成物。
前記ポリペプチドは、
配列番号１３のアミノ酸配列において８３番目の位置；及び、
１０１、１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；
のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項２０に記載の自己免疫疾患、炎症性疾患、微生物感染又は癌の予防又は治療用の薬学的組成物。
前記ポリペプチドは、
配列番号１３のアミノ酸配列において８３及び１０１番目の位置；及び
１３９、２７３、及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；
のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項２０に記載の自己免疫疾患、炎症性疾患、微生物感染又は癌の予防又は治療用の薬学的組成物。
前記ポリペプチドは、
配列番号１３のアミノ酸配列において８３、１０１及び１３９番目の位置；及び、
２７３及び３３０番目の位置からなる群から選ばれる一つ以上の位置；
のアスパラギンがアラニンで置換されたものである、請求項２０に記載の自己免疫疾患、炎症性疾患、微生物感染又は癌の予防又は治療用の薬学的組成物。