JP2025520771A - ＲＮＡの安定性又はｍＲＮＡ翻訳増強用の新規調節エレメントおよびこれと相互作用するＺＣＣＨＣ２、並びにその用途 - Google Patents

Abstract

本発明は、ＲＮＡの安定性又はｍＲＮＡ翻訳増強用の新規調節エレメントおよびこれと相互作用するＺＣＣＨＣ２、並びにその用途に関する。
本発明のＲＮＡの安定性または新規ｍＲＮＡ翻訳増強用の調節エレメントおよびこれと相互作用するＺＣＣＨＣ２は、標的タンパク質の発現を増加させることができるので、標的タンパク質の用途に応じて様々な分野に応用可能である。

Description

本発明は、ＲＮＡの安定性又はｍＲＮＡ翻訳増強用の新規調節エレメントおよびこれと相互作用するＺＣＣＨＣ２、並びにその用途に関する。

ウイルスは、細胞の遺伝子発現メカニズムを奪うための多様な機序を進化させたし、この分野の研究は、ＲＮＡ生物学及び生命工学の発展に大きく寄与した。例えば、７－メチルグアノシンキャップ、内部リボソーム侵入部位およびＲＮＡ三重らせんは、レオウイルス、ポリオウイルスおよびカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスで最初に発見された。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、ウイルス転写およびＲＮＡ核外遊出（ｅｘｐｏｒｔ）のための細胞因子を動員させるために、それぞれＴＡＲ（ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒｅｇｉｏｎ）およびＲＲＥ（ｒｅｖ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｌｅｍｅｎｔ）を活用するものと知られている（Ｖａｉｓｈｎａｖ， ｅｔ． ａｌ．， Ｎｅｗ Ｂｉｏｌ．， １９９１， ３， １４２－１５０； Ｄｉｎｇｗａｌｌ， ｅｔ． ａｌ．， ＥＭＢＯ Ｊ．， １９９０， ９， ４１４５－４１５３）。Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、ウイルストランスクリプトームを安定化させる宿主ヌクレオチジル転移酵素を引き出すためにＰＲＥ（ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）に依存する（Ｋｉｍ， ｅｔ． ａｌ．， Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２０２０， ２７， ５８１－５８８； Ｈｕａｎｇ， ｅｔ． ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ．， １９９３， １３， ７４７６－７４８６）。

しかしながら、このような発見は、全体のウイルスのごく一部に過ぎない病原性ウイルスに対して低いスループット（ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ）を有する分析を通じて行われた。これまで６，８２８種のウイルスが命名されており、ＮＣＢＩゲノムデータベースは、１４，７７５個の完全なウイルスゲノム配列を有している（Ｏ’Ｌｅａｒｙ， ｅｔ． ａｌ．， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２０１６， ４４， Ｄ７３３－Ｄ７４５）。近年、ディープシーケンシングに基づくメタゲノミクス（ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃｓ）の研究は、環境および動物サンプルから数十万個の更なるウイルス配列を検出した（Ｎｅｒｉ， ｅｔ． ａｌ．， Ｃｅｌｌ， ２０２２， １８５， ４０２３－４０３７）。このように使用可能な配列の数が膨大であるが、臨床的又は産業的関連性のない配列は、ほとんど未開発のまま存在している。したがって、急増するウイルス配列データは、機能的注釈について重要な課題を提示しており、ウイルス配列データを解釈するためのより効果的な戦略が求められている。

本発明者らは、ウイルス配列データを用いて、ＲＮＡの安定性又はｍＲＮＡ翻訳増強用の調節エレメントをスクリーニングする方法を開発して、前記方法に従って新規調節エレメントを発掘し、これと相互作用するＺＣＣＨＣ２の用途を開発した。

本発明の一つの目的は、ＲＮＡの安定性および／またはｍＲＮＡの翻訳増強用の調節エレメントを提供することにある。

本発明の他の目的は、標的タンパク質の遺伝子およびその３’非翻訳領域に前記調節エレメントを含むコンストラクト、ベクター、または組換え宿主細胞を提供することにある。

本発明のまた他の目的は、前記コンストラクト、ベクター、または組換え宿主細胞を含む組成物を提供することにある。

本発明の別の目的は、前記調節エレメントと相互作用するＺＣＣＨＣ２またはそれをコードする遺伝子を含む組成物を提供することにある。

本発明のまた別の目的は、前記組換え宿主細胞を培養する段階と、標的タンパク質を分離する段階とを含む標的タンパク質の製造方法を提供することにある。

本発明の更なる目的は、前記コンストラクト又はベクターを鋳型として、ｉｎ ｖｉｔｒｏでコンストラクトを転写する段階と、転写されたｍＲＮＡコンストラクトを回収する段階と、を含む、ｍＲＮＡコンストラクトの製造方法を提供することにある。

本発明の更なる他の目的は、前記コンストラクト、ベクター、組換え宿主細胞、又は組成物のＲＮＡ安定性および／またはｍＲＮＡの翻訳増強のための用途を提供することにある。

本発明の更に別の目的は、前記コンストラクト、ベクター、組換え宿主細胞、又は組成物の疾患の予防または治療のための用途を提供することにある。

本発明のまた更なる目的は、前記コンストラクト、ベクター、組換え宿主細胞、又は組成物のｍＲＮＡコンストラクト又は標的タンパク質を製造するための用途を提供することにある。

本発明のＲＮＡの安定性又はｍＲＮＡ翻訳増強用の新規調節エレメントおよびこれと相互作用するＺＣＣＨＣ２は、標的タンパク質の発現を増加させることができるので、標的タンパク質の用途に応じて様々な分野に応用可能である。

図１Ａ～図１Ｅは、ＲＮＡ調節エレメントを同定するためのＶｉｒｏｍｉｃスクリーンに関するものであって、 図１Ａは、ヒトを感染させることができるウイルスをスクリーニングして、種の総数および平均ゲノムサイズを示した図である。各科（ｆａｍｉｌｙ）の種の総数および平均ゲノムサイズは灰色のバーで表した。ライブラリーで扱うゲノムの種の総数および平均部分はカラーバーで表した。 図１Ｂは、Ｖｉｒｏｍｉｃスクリーンのための実験構造の設計および実験手順を示した模式図である。６５ｎｔタイリング段階で１３０ｎｔ長さの３０，３６７個のセグメントをそれぞれ３本の異なるバーコードと連結して、総計９１，１０１個のオリゴを生成した。前記オリゴは、ホタルルシフェラーゼ構造の３’非翻訳領域にクローニングされた。次に、プラスミドプールをＨＣＴ１１６細胞内にトランスフェクトした。ＲＮＡの安定化効果を定量化のために、レポーターＤＮＡおよびＲＮＡを抽出してＰＣＲで増幅した後、シーケンシングした。ポリソームプロファイリングの場合、ショ糖勾配遠心分離で５つの分画を得、レポーターＲＮＡをシーケンシングした。 図１Ｃは、ＲＮＡ存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）を順位別にアライメントしたグラフである。ＲＮＡ存在量スコアは、ｌｏｇ_２比（ＲＮＡのリード断片をＤＮＡのリード断片で割った値）で計算した。陽性対照（ＨＣＭＶ １Ｅ， ＷＰＲＥ）、陰性対照（ＨＣＭＶ １Ｅｍ）、肝炎デルタウイルスの自己切断リボザイムおよびウイルスｍｉＲＮＡを示した。 図１Ｄは、ウイルスレポーターｍＲＮＡのポリソーム（ｐｏｌｙｓｏｍｅ）をプロファイリングした結果を示した図である。色は、各分画におけるＲＮＡの相対的存在量を示すものである。２０個のクラスタは、階層的クラスタリングを用いて生成され、重いポリソーム（ｈｅａｖｙ ｐｏｌｙｓｏｍｅ）と遊離ｍＲＮＡとの間のリードの比に応じてアライメントした。 図１Ｅは、代表的なクラスタにおけるＲＮＡ分布パターンを示した図である。 図２は、ウイルス調節エレメントの検証に関するものであって、 図２Ａは、ＲＮＡ存在量（Ｘ軸）および翻訳（Ｙ軸）に及ぼす影響を比較したグラフである。 図２Ｂは、選択された１６個のセグメントに対する有効性を、ルシフェラーゼ活性を通じた調べたものである。Ｋ１－Ｋ１６（図２Ａで空色の点で表示）は、二重ルシフェラーゼレポーターで別々にクローニングした。Ｃｔｒｌは、Ｋエレメントのないレポーターを示し、正規化に用いられた。データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）で表した（ｎ＝８回の生物学的繰り返し実験）。＊ｐは、０．０５未満を、＊＊ｐは、０．０１未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図２Ｃは、Ｓａｆｆｏｌｄウイルス（ＮＣ＿００９４４８．２、左）およびＡｉｃｈｉウイルス１（ＮＣ＿００１９１８．１、右）のゲノム構造及び各ウイルスに表示されたＫ４及びＫ５エレメントのゲノム座標を示した図である。 図２Ｄは、ＵＴＲレポーターのルシフェラーゼ活性を示した図である。＊ｐ＜０．０５を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図２Ｅは、切断されたＫ５レポーターのルシフェラーゼ活性を示した図であって、１２０－Ｋ５（８１３２－８２５１、１２０－ｎｔ）および１１０－Ｋ５（８１４２－８２５１、１１０－ｎｔ）は、Ｋ５の切断された形態を示している。データは、平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。＊ｐは０．０５未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図３Ａ～図３Ｅは、Ｋ５エレメントの特性に関するものであって、 図３Ａは、Ｋ５変異体およびホモログを含む二次スクリーニングを示した模式図である。相同エレメントは、８８個のピコルナウイルスの３’末端１３０ｎｔセグメントから派生した。ＲＮＡ安定性は、図１Ｂと同様にして測定した。 図３Ｂは、二次スクリーニングの結果を示した図である。ＤＮＡ数（Ｘ軸）およびＲＮＡ数（Ｙ軸）は、塩基配列分析によって測定した。Ｋ５（赤色）、Ｋ５ｍ（濃い赤色）およびコブウイルスの相同セグメント（ピンク色）を表示した。 図３Ｃは、Ｋ５の突然変異を用いた二次スクリーニングの結果であって、置換変異体で測定したＲＮＡ／ＤＮＡ比（上）および１つまたは２つのヌクレオチド欠失後、定量化した比（下）を示した図である。Ｋ５およびＫ５ｍの結果のＲＮＡ／ＤＮＡ比は、水平線で示した。データは、置換について平均±ＳＥＭエラーバーおよび欠失について陰影で表示した（ｎ＝３）。 図３Ｄは、Ｋ５の２次構造を予測したものである。塩基識別スコア（マゼンタ色で表示）および塩基対スコア（塩基対の間の青色線の幅で表示）は二次スクリーニングで測定した。 図３Ｅは、スクリーニングに用いられたピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）３’ＵＴＲ配列のクラドグラムを示した図である。コブウイルス属は、赤い陰影で強調して表示している。エレメント保存スコア（赤色の箱）は、ヒトアイチウイルスのＫ５エレメントに対する配列相同性の程度を示す。ＲＮＡの安定化効果は緑色の箱で示した。 図４は、Ｋ５がＡＡＶベクターおよび合成ｍＲＮＡからの遺伝子発現を向上させることを示しており、 図４Ａは、Ｋ５エレメントまたはＷＰＲＥを含むＡＡＶコンストラクトを示した簡略図である。Ｋ５活動を阻害するＧ－突出部の欠失は、アスタリスクで示した。 図４Ｂは、１０，０００ｍｏｉのＨｅｌａ細胞に形質導入されたＫ５またはＷＰＲＥを含むｒＡＡＶコンストラクトからのＧＦＰ発現を示した図である。データは、シミュレーション値で正規化し、平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。＊ｐは０．０５未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図４Ｃは、ｒＡＡＶに感染されたＨｅｌａ細胞のＧＦＰの発現をフローサイトメトリーで確認した図である。 図４Ｄは、ｅＫ５及びその変異（上）およびαグロビンＵＴＲ（ＧＢＡ）および／またはＫ５（下）を含むｄ２ＥＧＦＰ ＩＶＴ ｍＲＮＡコンストラクトを含むか、または含まないホタルルシフェラーゼエンコードＩＶＴ ｍＲＮＡを示した概略図である。 図４Ｅは、ＨｅＬａ細胞に伝達された合成ｍＲＮＡからのルシフェラーゼ発現を示した図である。データは、Ｃｔｒｌ（２４ｈｐｔ）値で正規化し、平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。＊ｐは０．０５未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図４Ｆは、トランスフェクション後７２時間後にｄ２ＥＧＦＰ ｍＲＮＡレポーターでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞にウェスタンブロットを行った結果である。 図５は、Ｋ５がＴＥＮＴ４により混合テーリングを誘導することを示しており、 図５Ａは、Ｈｉｒｅ－ＰＡＴで測定したポリ（Ａ）テールの長さ分布を示した図である。正規化された強度（任意の単位、ａ．ｕ．）は、リード（ｒｅａｄ）のパーセンタイル順位であり、これを次のような全てＨｉｒｅ－ＰＡＴ分析に適用した。ＨｅＬａ細胞を対照、Ｋ５レポーター、またはその変異体、Ｋ５ｍプラスミドでトランスフェクトさせた。サイズマーカーの役割をするＰＣＲの副産物は、アスタリスクで示した。 図５Ｂは、対照およびＫ５レポーターのルシフェラーゼ発現により測定した末端ヌクレオチジル転移酵素がＫ５活性に及ぼすノックダウン効果を示した図である。密接に関連したパラログは、ＴＥＮＴ３（ＴＥＮＴ３Ａ／ＴＵＴ４／ＺＣＣＨＣ１１およびＴＥＮＴ３Ｂ／ＴＵＴ７／ＺＣＣＨＣ６）、ＴＥＮＴ４（ＴＥＮＴ４Ａ／ＰＡＰＤ７／ＴＲＦ４－１／ＴＵＴ５およびＴＥＮＴ４Ｂ／ＰＡＰＤ５／ＴＲＦ４－２／ＴＵＴ３）およびＴＥＮＴ５（ＴＥＮＴ５Ａ、ＴＥＮＴ５Ｂ、ＴＥＮＴ５ＣおよびＴＥＮＴ５Ｄ）とともに減少したことに留意されたい。データは、各レポーター構造について対照ｓｉＲＮＡ（ｓｉＣｏｎｔ）値に正規化し、平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。＊ｐは０．０５未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図５Ｃは、Ｈｉｒｅ－ＰＡＴにより測定されたＫ５レポーターｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールの長さ分布を示した図である。ＨｅＬａ細胞をＴＥＮＴ４阻害剤ＲＧ７８３４またはＲ－異性体ＲＯ０３２１で処理した。ＰＣＲの副産物は、アスタリスクで示した。 図５Ｄは、ＨｅＬａ細胞において、Ｋ５を含むレポーターのポリ（Ａ）テールの３’末端部位内における非アデノシン残基を計算するための遺伝子特異的ＴＡＩＬ－ｓｅｑを示した図である。各部位の混合テーリングの割合は、３’末端からの距離で表示した。 図５Ｅは、ＲＯ０３２１またはＲＧ７８３４の存在下、Ｋ５及びｅＫ５プラスミドでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のルシフェラーゼ活性を示した図である。データは、各条件下でＫ５エレメント（Ｃｔｒｌ）なしにレポーターについて正規化し、平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。＊ｐは０．０５未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図５Ｆは、ＲＯ０３２１またはＲＧ７８３４の存在下、Ｋ５及びｅＫ５プラスミドでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のＲＴ－ｑＰＣＲの結果を示した図である。データは、各条件下でＫ５エレメント（Ｃｔｒｌ）なしにレポーターについて正規化し、平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。＊ｐは０．０５未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図５Ｇは、ＨＣＴ１１６細胞およびＺＣＣＨＣ１４のＫＯ細胞におけるＫ５レポーターのルシフェラーゼアッセイの結果を示した図である。データは、各条件下でＫ５エレメント（Ｃｔｒｌ）なしにレポーターで正規化し、平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。＊ｐは０．０５未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図５Ｈは、ｅＫ５を用いたＲａＰＩＤ（ＲＮＡ－タンパク質相互作用の検出）実験に引き続いて質量分析を行った結果を示した図である。ｅＫ５エレメントのない３ｘＢｏｘＢ配列は陰性対照として使用した。空色の点は、２回以上の繰返し実験（Ｌｏｇ_２ＦＣ＞１）における濃縮されたタンパク質を示すものである。１００，０００個の近似値は、漏れたＬＦＱ値に追加した。ＤＮＡＪＣ２１およびＺＣＣＨＣ２は、細胞質局在化及び核酸ＧＯ用語を有するタンパク質を示すものである。 図５Ｉは、ｅＫ５を用いたＲａＰＩＤ（ＲＮＡ－タンパク質相互作用の検出）実験に引き続いてウェスタンブロットを行った結果を示した図である。ｅＫ５エレメントのない３ｘＢｏｘＢ配列は陰性対照として使用した。１００，０００個の近似値は、漏れたＬＦＱ値に追加した。ＤＮＡＪＣ２１およびＺＣＣＨＣ２は、細胞質局在化及び核酸ＧＯ用語を有するタンパク質を示すものである。 図６は、Ｋ５のホスト因子としてのＺＣＣＨＣ２の機能を示しており、 図６Ａは、ＺＣＣＨＣ１４およびＣ．ｅｌｅｇａｎｓ ｇｌｓ－１と比較したＺＣＣＨＣ２のドメイン構造を示した図である。３つのタンパク質として計算されたアミノ酸類似性スコアは、各ドメイン構造上に表示した。前記タンパク質の中で最も高い類似性領域は赤色の括弧で示した。図６Ｉ、図６Ｋ、及び図６Ｌに用いられたＺＣＣＨＣ２変異体、ΔＣ（１－３７５ ａ．ａ）、ΔＮ（２０１－１，１７８ ａ．ａ）およびＺｎＦ２変異体をＺＣＣＨＣ２構造の下に示した。 図６Ｂは、ＨｅＬａ親細胞およびＴＥＮＴ４二重ＫＯ細胞の溶解物を用いてＲＮａｓｅ Ａの存在下で抗ＴＥＮＴ４Ａおよび抗ＴＥＮＴ４Ｂとの共免疫沈降でＺＣＣＨＣ２とＴＥＮＴ４との間の相互作用を示した図である。タンパク質は、ウェスタンブロットにより可視化した。ＺＣＣＨＣ１４およびＴＥＮＴ４Ａは同量のサンプルを有する他のゲルで分析した。交差反応バンドはアスタリスクで示した。 図６Ｃは、当該抗体を用いたウェスタンブロットに引き続いて亜細胞アッセイにて検査されたＺＣＣＨＣ２の局在化を示した図である。ＧＭ１３０は、同量のサンプルを有する他のゲルで分析した。 図６Ｄは、３’非翻訳領域内でｅＫ５にてＥＧＦＰ ｍＲＮＡを安定に発現するＨｅＬａ細胞において抗ＺＣＣＨＣ２抗体で免疫沈降した後、ＲＴ－ｑＰＣＲを行った結果を示した図である。正常ウサギＩｇＧを用いた免疫沈降を対照および正規化に使用した。ＥＧＦＰ－ｅＫ５ ｍＲＮＡは、他のＲＮＡ（ＧＡＰＤＨ、Ｕ１ ｓｎＲＮＡおよび１８Ｓ ｒＲＮＡ）と異なり、抗ＺＣＣＨＣ２抗体として特異的に沈殿した。データは、ＥＧＦＰ－ｅＫ５（ＩｇＧ）ｑＰＣＲ値に正規化し、平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。＊ｐは０．０５未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図６Ｅは、ＨｅＬａ親細胞およびＨｅＬａ ＺＣＣＨＣ２ ＫＯ細胞においてＨｉｒｅ－ＰＡＴ分析で測定したＫ５及びＫ５ｍレポーターｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールの長さ分布を示した図である。サイズマーカーの役割をするＰＣＲの副産物は、アスタリスクで示した。 図６Ｆは、ＨｅＬａ親細胞およびＺＣＣＨＣ２ ＫＯ細胞において、遺伝子特異的ＴＡＩＬ－ｓｅｑにより測定されたＫ５レポーターｍＲＮＡの３’ポリ（Ａ）テールの最後の３つの部位における非アデノシン（Ｎｏｎ－ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）の頻度を示した図である。 図６Ｇは、Ｋ５レポーターでトランスフェクトしたＨｅＬａ親細胞およびＺＣＣＨＣ２ＫＯ細胞におけるルシフェラーゼの発現を示した図である。細胞をＴＥＮＴ４阻害剤ＲＧ７８３４またはそのＲ－異性体ＲＯ０３２１で処理した。データは、各条件下でＫ５エレメント（Ｃｔｒｌ）のないレポーターによって正規化し、平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。＊ｐは０．０５未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図６Ｈは、野生型ＺＣＣＨＣ２の異所性の発現を有するＨｅＬａ ＺＣＣＨＣ２ ＫＯ細胞の構造を示した図である。データは、各条件下でＫ５エレメント（Ｃｔｒｌ）のないレポーターによって正規化し、平均値±ＳＥＭとして表示した（ｎ＝３）。＊ｐは０．０５未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図６Ｉは、野生型ＺＣＣＨＣ２、ＺＣＣＨＣ２ジンクフィンガー突然変異およびＺＣＣＨＣ２ ΔＮ構造を示した図である。データは、各条件下でＫ５エレメント（Ｃｔｒｌ）のないレポーターによって正規化し、平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝４（左）、ｎ＝３（右））。 図６Ｊは、テザリング分析結果であって、λＮタグ付きまたはタグなしのＺＣＣＨＣ２タンパク質をＨｅＬａ細胞において３ｘＢｏｘＢルシフェラーゼレポーターｍＲＮＡと共発現した結果を示した図である。ＴＮＲＣ６Ｂタンパク質のＣ末端サイレンシング（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）ドメイン（７１６～１，０２８番目のアミノ酸）を対照として使用した。データは、野生型のサンプルの値に正規化し、平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。＊ｐは０．０５未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図６Ｋは、テザリング分析結果であって、ＺＣＣＨＣ２ジンクフィンガー突然変異レポーターｍＲＮＡに人為的に結合して活性化された結果を示した図である。ＺＣＣＨＣ２ジンクフィンガー突然変異は、レポーターｍＲＮＡに人為的に結合されるときに活性化された。データは、野生型のサンプルの値に正規化し、平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。＊ｐは０．０５未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図６Ｌは、ＦＬＡＧタグ付きＺＣＣＨＣ２タンパク質（Ｆ－ＺＣＣＨＣ２）を、ＨｅＬａ ＺＣＣＨＣ２ ＫＯ細胞で一過的に発現し、抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈降し、ウェスタンブロッティングにより分析した結果を示した図である。全長または切断された突然変異（ΔＣ，ΔＮ）ＺＣＣＨＣ２タンパク質をＴＥＮＴ４タンパク質と相互作用する能力について比較した。ＴＥＮＴ４ＡとＧＡＰＤＨは、同じゲルで検出し、他のタンパク質は、同量のサンプルのある別途のゲルで分析した。交差反応バンドはアスタリスクで示した。 図７は、調節ＲＮＡがウイルス圏（ｖｉｒｏｓｐｈｅｒｅ）に広く広がっていることを示しており、 図７Ａは、ＲＯ０３２１またはＲＧ７８３４を含むＨＣＴ１１６細胞のＫ１～Ｋ１６エレメントに対するルシフェラーゼのレポーター分析を示した図である。 図７Ｂは、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５レポーターでトランスフェクトされたＨＣＴ１１６親細胞およびＺＣＣＨＣ１４ ＫＯ細胞をルシフェラーゼ分析した結果である。データは、各条件下でＫ５（Ｃｔｒｌ）のないレポーターによって正規化し、平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。＊ｐは０．０５未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図７Ｃは、Ｋ３、Ｋ４、Ｋ５レポーターでトランスフェクトしたＨｅＬａ親細胞およびＺＣＣＨＣ２ ＫＯ細胞をルシフェラーゼ分析した結果である。データは、各条件下でのＫ５（Ｃｔｒｌ）のないレポーターによって正規化し、平均±ＳＥＭで表した（ｎ＝３）。＊ｐは０．０５未満を示し、両側スチューデントｔ検定を実施した。 図７Ｄは、混合テーリングを利用するウイルスを概略的に示す模式図である。ＲＥ、１ＥおよびＫ３は、それぞれＨＢＶ、ＣＭＶおよびノロウイルスに由来し、ＴＥＮＴ４を動員（ｒｅｃｒｕｉｔ）するためＺＣＣＨＣ２ １４に依存していた。ＳａｆｆｏｌｄウイルスのＫ４はＴＥＮＴ４に依存するが、ＺＣＣＨＣ１４及びＺＣＣＨＣ２には依存しなかった。 図７Ｅは、ＲＮＡ存在量（左）、翻訳（中央）、および細胞内局在化（右）を制御するウイルス科におけるＲＮＡエレメントの広範な分布を示した図である。 図８は、ＨＣＭＶ １Ｅエレメントおよびループ変異を含むタイル（ｔｉｌｅｓ）を示した図である。 図９は、ＴＥＮＴ４－ＺＣＣＨＣ１４複合体を動員するＳＬ２．７ＲＮＡを餌として用いてＲＮＡプルダウン後に質量分析計による分析を行った結果である。ＳＬ２．７突然変異（Ｘ軸）および「ビード専用」対照群（Ｙ軸）を正規化に使用した。青色点はＳＬ２．７サンプルにおいてかなり豊富なタンパク質を示す（Ｌｏｇ_２ＦＣ＞０．８およびＦＤＲ＜０．１）。漏れたＬＦＱ値に擬似値（ｐｓｅｕｄｏｖａｌｕｅ）１０，０００が追加されている。ＨＥＫ－２９３Ｔ細胞溶解物をＲＮＡプルダウンに使用した（ｎ＝２）。ＳＡＭＤ４タンパク質は、当該ＳＡＭドメインを介してＲＮＡに結合するが、ＳＬ２．７ １１に対する増強活性はない。Ｋ０３５５は、ＳＡＭＤ４Ｂと相互作用するものと知られている。 図１０は、Ｋ５がレンチウイルスベクターおよび合成ｍＲＮＡからの遺伝子発現を向上させることを示しており、 図１０Ａは、Ｋ５エレメントまたはＷＰＲＥを含むレンチウイルスコンストラクトを示す概略図である。Ｋ５活動を阻害するＧ－突出部の欠失は、アスタリスクで示した。 図１０Ｂは、レンチウイルスに感染されたＨｅｌａ細胞のＧＦＰの発現をフローサイトメトリーで確認したものである。 図１１は、ポリソーム分画法（Ｐｏｌｙｓｏｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）によるグラフである。

本発明に開示のそれぞれの説明及び実施の形態は、それぞれの他の説明及び実施形態に適用されてもよい。すなわち、本発明に開示の様々な要素のすべての組み合わせが、本発明の範疇に属する。また、下記具体的な説明によって本発明の範囲が限定されるものではない。また、当該技術分野における通常の知識を有する者は、通常の実験のみを用いて本明細書に記載された本発明の特定の態様に対する多くの均等物を認識または確認することができる。また、このような均等物は、本発明に包含されるものと意図される。

本発明の他の一つの態様は、ＲＮＡの安定性および／またはｍＲＮＡ翻訳増強用調節エレメントである。前記調節エレメントは、ＲＮＡの安定性および／またはｍＲＮＡ翻訳を増強させてタンパク質の発現を増加させることができる。具体的に、本発明の調節エレメントは、（ｉ）アイチウイルス１（Ａｉｃｈｉ ｖｉｒｕｓ １）遺伝子（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿００１９１８．１）のセグメントの塩基配列またはそのＲＮＡの塩基配列；または（ｉｉ）これと少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列；または（ｉｉｉ）（ｉ）の塩基配列と少なくとも５０％の相同性を有するコブウイルスの３’非翻訳領域内の塩基配列を含むことができる。

本発明における前記セグメントは、アイチウイルス１遺伝子内における８２５１番のヌクレオチドから５’方向に連続する１１０個超過２５０個以下のヌクレオチドを含むことができるが、これに限定されない。

一実施の形態として、前記セグメントは、アイチウイルス１遺伝子内における８２５１番のヌクレオチドから５’方向に連続する１２０個～２４０個（例えば１２０個、１３０個、１８５個、２４０個）のヌクレオチドを含むことができるが、これに限定されない。

前記（ｉ）の塩基配列は、配列番号２０、９４または９５の塩基配列またはそのＲＮＡの塩基配列を含むことができるが、これに限定されない。

前記（ｉｉ）の塩基配列は、（ｉ）の塩基配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する塩基配列を含むことができるが、これに限定されない。具体的には、前記（ｉｉ）の塩基配列は、配列番号２０の塩基配列において１番～１４番のヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は両方ともを有する塩基配列またはそのＲＮＡの塩基配列を含むことができるが、これに限定されない。

前記（ｉｉｉ）の塩基配列は、コブウイルスの３’非翻訳領域内の塩基配列であり、かつ、（ｉ）の塩基配列と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を有する塩基配列を含むことができる。具体的に、前記（ｉｉｉ）の塩基配列は、コブウイルスの３’非翻訳領域内における少なくとも２つのヘアピン構造を有する塩基配列を含むことができるが、これに限定されない。また、前記（ｉｉｉ）の塩基配列は、配列番号９８～１４０のいずれかの塩基配列またはそのＲＮＡの塩基配列、又はこれと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性を有する塩基配列を含むことができるが、これに限定されない。

本発明において使用されるウイルスの塩基配列は、公知のデータベース（例えば、ＮＣＢＩなど）から得られる。

一方、本発明において、「特定の配列番号の塩基配列を含む調節エレメント」又は「特定の配列番号の塩基配列を有する調節エレメント」とされているとしても、当該配列番号の塩基配列で構成された調節エレメントと同一又は相当する機能を有する場合であれば、いくつかの配列が欠失、修飾、置換または付加された塩基配列を有する調節エレメントも、本発明で使用されてもよいことは自明である。

例えば、前記調節エレメントと同一又は相当する機能を有する場合であれば、当該配列番号の調節エレメントの配列の内部又は末端に無意味な配列が付加されたものであるか、あるいは当該配列番号の調節エレメントの配列の内部又は末端の一部の配列が欠失した調節エレメントも、本発明の範囲内に属することが明らかである。

相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）および同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、２つの与えられた塩基配列に関連する程度を意味し、百分率で表示することができる。用語の相同性および同一性は、しばしば、互換的に用いられることができる。

任意の２つの配列が相同性、類似性または同一性を有するか否かは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８８）［Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５］：２４４４でのようなデフォルトのパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピューターアルゴリズムを用いて決定できる。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ： Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ， Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．， ２０００， Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ． １６：２７６－２７７）（バージョン５．０．０又はその以降のバージョン）で実行されるように、ニードルマン－ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ， １９７０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３）を用いて決定できる（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ， Ｊ．， ｅｔ ａｌ， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７（１９８４））， ＢＬＡＳＴＰ， ＢＬＡＳＴＮ， ＦＡＳＴＡ （Ａｔｓｃｈｕｌ， ［Ｓ．］ ［Ｆ．，］ ［ＥＴ ＡＬ， Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３（１９９０）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ， Ｍａｒｔｉｎ Ｊ． Ｂｉｓｈｏｐ， ［ＥＤ．，］ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４、および［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴＡ／．］（１９８８）ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３を含む）。例えば、米国立バイオテクノロジー情報センターのデータベースのＢＬＡＳＴ、ＣｌｕｓｔａｌＷを用いて配列の相同性、類似性または同一性を決定することができる。

本発明の調節エレメントは、ＴＥＮＴ４と相互作用するＺＣＣＨＣ２と相互作用して、ポリ（Ａ）テールの長さの増加、混合テーリングによるポリ（Ａ）テールの安定性の増加、又はその両方ともを誘導することができる。

本発明の別の態様は、標的タンパク質の遺伝子およびその３’非翻訳領域に本発明の調節エレメントを含むコンストラクトである。具体的に、前記コンストラクトは、ＤＮＡコンストラクトまたはＲＮＡコンストラクトであり得る。

本発明における標的タンパク質は、本発明の調節エレメントによってＲＮＡ安定性および／またはｍＲＮＡの翻訳を増強させることができる限り、特に制限されないが、レポーター、生理活性ペプチド、抗原、又は抗体又はその断片から選択されることができる。

本発明におけるレポーターは、ルシフェラーゼ、蛍光タンパク質、β－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコール・アセチル転移酵素、またはエクオリン（ａｅｑｕｏｒｉｎ）であり得るが、これに限定されない。

本発明における生理活性ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、サイトカイン結合タンパク質、酵素、成長因子、またはインスリンであるが、これらに限定されない。

本発明において、抗原は、ワクチン抗原、癌関連抗原、アレルギー抗原であり得るが、これらに限定されない。

一実施の形態として、本発明のコンストラクトは、少なくとも１つのバーコード配列、正方向のアダプター配列、逆方向のアダプター配列、ポリ（Ａ）テールの配列、またはこれらの組み合わせをさらに含むことができるが、これらに限定されない。

一実施の形態として、本発明のコンストラクトは、プロモーター配列をさらに含んでいてもよく、この場合、標的タンパク質は、プロモーター配列に作動可能に連結されていてもよいが、これに限定されない。

一実施の形態として、本発明のコンストラクトは、アデノ随伴ウイルス、アデノウイルス、アルファウイルス、レトロウイルス（例えば、ガンマレトロウイルス、及びレンチウイルス）、パルボウイルス、ヘルペスウイルス、およびＳＶ４０からなる群から選択されるウイルスの５’側反復配列および３’側反復配列を含むことができるが、これらに限定されない。

一実施の形態として、本発明のｍＲＮＡコンストラクトは、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリ（Ａ）テールの配列、またはこれらの組み合わせをさらに含むことができるが、これに限定されない。

本発明の他の一態様は、前記コンストラクトを含むベクターまたは該ベクターのプール（ｐｏｏｌ）である。

本発明で使用された用語「ベクター」は、適切な宿主内で標的タンパク質を発現させることができるように適切な調節配列に作動可能に連結されている標的タンパク質をコードする塩基配列を含む遺伝子産物を意味する。前記調節配列は、転写を開始できるプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列などの構成を含み得るが、これらに限定されない。前記ベクターは、適当な宿主細胞内に導入された後、宿主ゲノムとは関係なく複製するかまたは機能することができるか、またはゲノムそれ自体に統合されることができる。

本発明で使用されるベクターは、宿主細胞内で発現できるものであれば特に制限されず、当業界に知られた任意のベクターを用いて宿主細胞に導入させることができる。通用されるベクターの例としては、天然状態または組み換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージが挙げられる。

また、前記用語「作動可能に連結される」とは、標的タンパク質の遺伝子の転写を開始および媒介するプロモーター配列と前記遺伝子配列が機能的に連結されていることを意味する。

本発明のまた他の態様は、前記コンストラクト又はベクターを含む組換え宿主細胞である。

本発明における宿主細胞とは、標的タンパク質を発現することができる細胞をすべて含み、自然的または人為的に遺伝的改変が生じた細胞を包括する。また、前記宿主細胞は、真核細胞および原核細胞を含み、具体的には、真核細胞または哺乳動物（例えば、ヒト）由来の細胞であってもよいが、これらに限定されない。

本発明において、コンストラクトまたはベクターを細胞内に導入させる方法は、核酸を細胞内に導入するいずれの方法（例えば、トランスフェクションまたは形質転換）も含まれ、細胞に応じて、当分野における公知の適切な標準技術を選択して行うことができる。例えば、エレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ_４）の沈殿、塩化カルシウム（ＣａＣｌ_２）の沈殿、マイクロインジェクション（ｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）法、ＤＥＡＥ－デキストラン法、陽イオンリポソーム法、および酢酸リチウム－ＤＭＳＯ法などが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の他の一態様は、前記コンストラクト、ベクター、または組換え宿主細胞を含む組成物である。本発明のコンストラクト、ベクター、組換え宿主細胞またはこれらを含む組成物は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）または生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で標的タンパク質を発現させることができる。

一実施の形態として、前記組成物が個体に投与される場合、前記コンストラクト、ベクター、または組換え宿主細胞によって標的タンパク質を個体に提供することができるので、提供された標的タンパク質の用途に応じて、疾病（例えば、感染症）の予防又は治療効果を奏することができる。したがって、組成物は医薬組成物であってもよいが、これに限定されない。

また、一実施の形態として、前記コンストラクト、ベクター、または組換え宿主細胞を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで本発明のＲＮＡコンストラクト又は標的タンパク質を産生することができる。従って、前記組成物は、本発明のｍＲＮＡコンストラクト又は標的タンパク質を製造するための組成物であってもよいが、これに限定されない。

例えば、標的タンパク質がワクチン抗原である場合、前記コンストラクト、ベクター、組み換え宿主細胞又は組成物それ自体がワクチンとして用いられるか、またはこれらを用いてワクチン抗原を調製することができる。

一実施の形態として、本発明のコンストラクトまたはベクターは、ＺＣＣＨＣ２をコードする遺伝子と、ＴＥＮＴ４をコードする遺伝子と、またはこれらの組み合わせとをさらに含むか、または本発明の組換え宿主細胞又は組成物がＺＣＣＨＣ２またはそれをコードする遺伝子と、ＴＥＮＴ４またはそれをコードする遺伝子と、またはこれらの組み合わせとをさらに含み、ＺＣＣＨＣ２と調節エレメントとの相互作用およびＺＣＣＨＣ２とＴＥＮＴ４との相互作用を通じて、ポリ（Ａ）テールの長さの増加、ポリ（Ａ）テールの安定性の増加、又はその両方を誘導して、ＲＮＡ安定性、又はｍＲＮＡ翻訳を増強させることができるが、これらに限定されない。

本発明の他の一態様は、前記調節エレメントと相互作用するＺＣＣＨＣ２またはそれをコードする遺伝子を含む組成物である。具体的には、前記組成物は、ＲＮＡの安定性又はｍＲＮＡ翻訳増強用組成物であってよい。

前記ＺＣＣＨＣ２は、調節エレメントおよびＴＥＮＴ４との相互作用を通じて、ポリ（Ａ）テールの長さの増加、混合テーリングによるポリ（Ａ）テールの安定性の増加、又はその両方ともを誘導して、ＲＮＡ安定性、又はｍＲＮＡ翻訳を増強させることができる。したがって、前記組成物は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）、生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）または生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）で本発明の標的タンパク質の発現を増加させることができる。

一実施の形態として、標的タンパク質の発現のために、前記組成物は本発明のコンストラクト、ベクター、および／または組換え宿主細胞を更に含むか、ＺＣＣＨＣ２またはそれをコードする遺伝子が本発明のコンストラクト、ベクター、および／または組換え宿主細胞に含まれてもよい。

一実施の形態として、前記組成物はＴＥＮＴ４またはそれをコードする遺伝子をさらに含むことができる。

一実施の形態として、前記組成物によりインビボ発現が増加される標的タンパク質の用途に応じて、前記組成物は、疾病の予防又は治療効果を奏することができる。したがって、前記組成物は医薬組成物であってもよいが、これに限定されない。

また、一実施の形態として、前記組成物を用いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｅｘ ｖｉｖｏで本発明のＲＮＡコンストラクト又は標的タンパク質を産生することができる。従って、前記組成物は、本発明のＲＮＡコンストラクト又は標的タンパク質を製造するための組成物であってもよいが、これに限定されない。

例えば、標的タンパク質がワクチン抗原である場合、前記組成物によりｉｎ ｖｉｖｏでワクチン抗原の発現が増加することができるため、前記組成物をワクチン組成物として用いるか、または前記組成物を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｅｘ ｖｉｖｏでワクチン抗原を調製することができる。

本発明の他の一態様は、前記組換え宿主細胞を培養する段階と、標的タンパク質を回収する段階とを含む標的タンパク質の製造方法である。

本発明で前記組換え宿主細胞を用いて標的タンパク質を産生する方法は、当業界によく知られている方法を用いて行うことができる。具体的には、前記培養は、バッチプロセス、フェッドバッチまたは繰り返しフェッドバッチプロセス（ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｏｒ ｒｅｐｅａｔｅｄ ｆｅｄ ｂａｔｃｈ ｐｒｏｃｅｓｓ）で連続的に培養することができるが、これに限定されるものではない。培養に用いられる培地は、宿主細胞に応じて当業者が適宜選択することができる。具体的には、本発明の組換え宿主細胞を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸および／またはビタミンなどを含有する通常の培地内で、好気性または嫌気性条件下で、温度、ｐＨなどを調節しながら培養することができる。

前記標的タンパク質の製造方法は、前記培養段階後に、更なる工程をさらに含むことができる。前記更なる工程は、標的タンパク質の用途に応じて適宜選択することができる。

具体的に、前記標的タンパク質の製造方法は、前記培養段階以後、前記組換え宿主細胞、組換え宿主細胞の乾燥物、組換え宿主細胞の抽出物、組換え宿主細胞の培養物、前記培養物の上清液は、組換え宿主細胞の破砕物の中から選択された一つ以上の物質から標的タンパク質を回収する段階を含むことができる。

前記方法は、前記回収段階の以前若しくは同時に組み換え宿主細胞を溶解させる段階をさらに含むことができる。組み換え宿主細胞の溶解は、本発明の属する技術分野で通用される方法、例えば、溶解用緩衝液、ソニケーター、熱処理およびフレンチプレッサーなどにより実施することができる。なお、前記溶解段階は、細胞壁／細胞膜分解酵素、核酸分解酵素、核酸転移酵素、および／またはタンパク質分解酵素などの酵素反応を含むことができるが、これらに限定されない。

本発明では、組換え宿主細胞の乾燥物は、目的物質を蓄積した細胞を乾燥させて製造することができるが、これに限定されない。

本発明において、組換え宿主細胞の抽出物は、前記細胞において細胞壁／細胞膜を分離して残った材料を意味することができる。より具体的には、細胞を溶解させて得た成分において細胞壁／細胞膜を除いた残りの成分を意味することができる。前記細胞抽出物は、標的タンパク質を含み、標的タンパク質以外の成分としては、細胞のタンパク質、炭水化物、核酸、繊維の少なくとも１つの成分が含まれていてもよいが、これに限定されない。

本発明における回収段階は、当該技術分野に既知の好適な方法（例えば、遠心分離、ろ過、陰イオン交換クロマトグラフィー、結晶化およびＨＰＬＣなど）を用いて、標的タンパク質を回収することができる。

本発明において回収段階は、精製工程を含むことができる。前記精製工程は、細胞から標的タンパク質のみを分離して純粋精製するものであってもよい。前記精製工程を通じて、純粋精製された標的タンパク質を製造することができる。

本発明の他の一態様は、前記コンストラクト又はベクターをｉｎ ｖｉｔｒｏで転写する段階と、転写されたｍＲＮＡコンストラクトを回収する段階とを含む、ｍＲＮＡコンストラクトの作製方法である。

前記転写方法及び回収方法は、当技術分野に既知の好適な方法を用いることができる。

一実施の形態として、前記方法は、転写後ＤＮａｓｅＩを処理して鋳型として使われたコンストラクトまたはベクターのＤＮＡを除去する段階、および／または洗浄する段階とをさらに含むことができるが、これに限定されない。

本発明の他の一態様は、前記コンストラクト、ベクター、組換え宿主細胞、又は組成物のＲＮＡ安定性および／またはｍＲＮＡの翻訳を増強させるための用途である。

本発明の他の一態様は、前記コンストラクト、ベクター、組換え宿主細胞、又は組成物の疾患の予防または治療のための用途である。

本発明の他の一態様は、前記コンストラクト、ベクター、組換え宿主細胞、又は組成物の標的タンパク質の調製のための用途である。

以下、実験例及び実施例により本発明をより詳しく説明する。ただし、これらは本発明を例示するためのものに過ぎず、本発明の範囲がこれらの実験例および実施例により限定されるものと解釈されてはならない。

＜実験例＞

１．細胞株の培養

本発明で使用される全ての細胞株は、マイコプラズマ否定試験を経た。ＨｅＬａ細胞（ソウル大学校のＣ． Ｈ． Ｃｈｕｎの寄託、ＡＴＣＣ（ＳＴＲプロファイリング）により認証済み）、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ細胞（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、６３２１８０）および２９３ＡＶ細胞（Ｃｅｌｌ ｂｉｏｌａｂｓ社製、ＡＡＶ－１００）を１０％のＦＢＳ（Ｗｅｌｇｅｎｅ社製、Ｓ００１－０１）含有ＤＭＥＭ培地で培養した。ＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ社製、ＣＣＬ－２４７）は、１０％のＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ’ｓ ５Ａ（Ｗｅｌｇｅｎｅ社製、ＬＭ ００５－０１）で培養した。

２．Ｖｉｒｏｍｉｃスクリーン（ｖｉｒｏｍｉｃ ｓｃｒｅｅｎ）のためのオリゴ（ｏｌｉｇｏ）のデザイン

ヒトを感染させることができるウイルスのゲノム配列をＮＣＢＩウイルスゲノムブラウザ（２０２０年１月１０日検索、８０４個の配列、５０４個のウイルス）で検索した。各ウイルスに関する追加情報については、ＮＣＢＩヌクレオチドのＧｅｎＢａｎｋファイルにて検索した。配列類似性およびウイルス分類に基づいて、１４３個の代表的なウイルス種を選定し、ウッドチャック肝炎ウイルスを対照として追加した。ＲＮＡウイルスのタイリング（ｔｉｌｉｎｇ）のために、ポジティブセンス方向である配列の全ゲノムをタイリングに使用した。ＤＮＡウイルスの場合、コードトランスクリプトームの３’非翻訳領域の配列および非コードＲＮＡ配列の全ての配列をオリゴ（ｏｌｉｇｏ）のデザインに使用した。ＵＴＲの注釈がない場合、ＵＴＲはポリアデニル化シグナル（ＰＡＳ）の注釈に基づいて予測された。ＰＡＳの注釈がない場合、ＰＡＳは、終止コドンから８００ｂｐの範囲内でＤｒａｇｏｎ ＰｏｌｙＡ Ｓｐｏｔｔｅｒ ｖｅｒ． １．２を用いて予測した。ＰＡＳが予測できない場合、タイリングのための終止コドンの下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）に存在する３９０ｂｐ領域を使用した。タイリングのためのゲノム領域を決定した後、６５ｎｔシフト（ｓｈｉｆｔ）の大きさに１３０ｎｔのスライディングウィンドウを有するオリゴ（ｏｌｉｇｏ）を設計した。その後、複製に用いられたＳａｃＩまたはＮｏｔｌ制限部位（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ）のあるウィンドウが含まれた場合、制限部位でウィンドウを終止して、より短いセグメント（ｓｅｇｍｅｎｔ）を製造した。次のセグメントは制限部位から開始してプラスミド作製中にＳａｃＩまたはＮｏｔＩによるセグメントの切断を防止した。したがって、前記スクリーニングは、制限部位配列を含むいくつかのウイルスのエレメントを見逃す恐れがある。また、前記設計は、６５ｎｔよりも長い一部のエレメントを見逃す恐れがある。例えば、大きさが１００ｎｔであるエレメントの漏れ確率は約５０％程度である。

少なくとも３のハミング距離（ｈａｍｍｉｎｇ ｄｉｓｔａｎｃｅ）を有する７ｂｐのランダム配列の３つのバーコードを各オリゴ配列に追加した。対照として、１Ｅセグメント及びそのステムループ変異をライブラリーに追加した。さらに、ヒトＢ型肝炎ウイルスＰＲＥ及びそれに対応するステムループ変異を対照として含んでいた。陽性対照および陰性対照をそれぞれタイリングした。合計３０，３６７個のセグメントと９１，１０１個のオリゴを設計した。

２次スクリーニングのために、５つのクラスのＫ５変異をデザインした。１）単一ヌクレオチド置換の場合、Ｋ５全体にわたって各部位の塩基が異なる３つの塩基型に変換された。２）単一ヌクレオチド欠損の場合、各部位の塩基が除去された。３）２つのヌクレオチド欠失の場合、全ての部位で２つの連続したヌクレオチドが欠失した。４）塩基対の有意性を調べるために、２次構造は、６つの他のＲＮＡ二次構造予測ソフトウェアで予測し、３８個の予測された塩基対は、塩基対を収集および保存するやり方で突然変異された（ＡＴ／ＴＡ／ＧＣ／ＣＧ／ＧＵ／ＵＧ／ｄｅｌ）。５）予測ループでランダムに選択された２つの塩基は、他の組み合わせを生成するために変異された。また、他のピコルナウイルス（コブウイルス属の４５個を含む）の８８個の相同エレメントを含むＫ５のホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）をスクリーニングした。相同性が曖昧な場合、オリゴのデザインのために３’－最大１３０ｎｔを使用した。総合して、２次スクリーニングのためのライブラリーは、３つのバーコードのそれぞれに対して１，２８８個のエレメントを含めて、合計３，８６４つのオリゴが生成された。

３．プラスミドプール（ｐｏｏｌ）の生成

１７０ｎｔ長のオリゴ（１６ｎｔの順方向アダプター配列、１７ｎｔの逆方向アダプター配列および７ｎｔのバーコード配列を含む）を、Ｓｙｎｂｉｏ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓで合成した。ＮｏｔＩ及びＳａｃＩ制限部位は、Ｑ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ２Ｘ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＮＥＢ社製、Ｍ０４９２）およびＳａｃＩ－ｕｎｉｖ－ＦおよびＮｏｔＩ－ｕｎｉｖ－Ｒプライマーを用いた６サイクルのＰＣＲにより追加された。増幅産物は、６％のＮａｔｉｖｅ ＰＡＧＥ ｇｅｌ、ＳＹＢＲｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｓ１１４９４）染色を用いて精製した。精製された増幅産物およびｐｍｉｒＧＬＯ－３ＸｍｉＲ－１ベクターは、ＳａｃＩ－ＨＦ（ＮＥＢ社製、Ｒ３１５６Ｓ）およびＮｏｔＩ－ＨＦ（ＮＥＢ社製、Ｒ３１８９Ｓ）で切断し、ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ社製、Ｍ０２０２Ｍ）をＴ４によってホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）遺伝子の３’非翻訳領域にクローニングした。結合産物をＺｙｍｏ Ｏｌｉｇｏ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、＃Ｄ４０６１）で精製し、Ｌｕｃｉｇｅｎ Ｅｎｄｕｒａ ＥｌｅｃｔｒｏＣｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ（Ｌｕｃｉｇｅｎ社製、ＬＵ６０２４２－２）で形質転換した。形質転換された細菌は、３７℃で１時間再生した後３０℃で１４時間振とう培養した。コロニーの数は、おおよそ１Ｅ７であることが確認された。使用したプライマー配列を下記表１に示した。

４．ライブラリーの構築

ＲＮＡ安定性スクリーニングのために、４Ｅ５ ＨＣＴ１１６細胞を、トランスフェクションの１日前に接種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。１．５μｇのプラスミドプール（ｐｏｏｌ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ３０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、Ｌ３０００００１）およびｐ３０００を用いてトランスフェクトさせた。ＲＮＡおよびＤＮＡは、Ａｌｌｐｒｐ ＲＮＡ／ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製、８０００４）を用いて、トランスフェクション後８時間後に抽出し、ＲＮＡに組み換えＤＮａｓｅ Ｉ（ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ）（ＴＡＫＡＲＡ社製、２２７０Ａ）を処理して残ったプラスミドＤＮＡを除去した。ＲＮＡは、ＳＳＩＶ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、１８０９００１０）を用いて逆転写した。抽出されたＤＮＡ、ＲＮＡから得られたｃＤＮＡおよび元のプラスミドプール（ｐｏｏｌ）は、１４サイクルのＰＣＲで増幅され、混合されたプライマーＭＰＲＡｌｉｂ＿Ｎ／ＮＮ／ＮＮＮ＿ＦおよびＭＰＲＡｌｉｂ＿Ｎ／ＮＮ／ＮＮＮ＿Ｒが用いられた（表１）。２番目のＰＣＲの６サイクルは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ｉｎｄｅｘ ｐｒｉｍｅｒを用いて行われた。ＰＣＲ増幅物は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｏｖａｓｅｑ ６０００プラットフォームを用いて次世代シーケンシングによりシーケンシングされた。

核／細胞質分画をスクリーニングするために、細胞質は、細胞溶解バッファー（０．１５μｇ／μｌのジギトニン［Ｍｅｒｃｋ社製、Ｄ１４１］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．０～７．６］、２０Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅ阻害剤［Ａｍｂｉｏｎ社製、ＡＭ２６９６］、１Ｘプロテアーゼ阻害剤［Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、５３５１４０］、１Ｘホスファターゼ阻害剤［Ｍｅｒｃｋ社製、Ｐ００４４］）で得られる。ライブラリーの製造段階は、ＲＮＡ安定性スクリーニングと同様に行われた。

ポリソーム（ｐｏｌｙｓｏｍｅ）分画のスクリーニングのために、Ｇｒａｄｉｅｎｔ Ｍａｓｔｅｒ^ＴＭ（Ｂｉｏｃｏｍｐ社製、Ｂ１０８－２）を用いて１０～５０％のショ糖勾配を用意した。ＲＮＡ安定性スクリーニングの３倍の規模を持つＨＣＴ１１６細胞を３７℃で１分間、１００μｇ／ｍＬシクロヘキシミド（ｃｙｃｌｏｈｅｘｉｍｉｄｅ）で処理し、１５０μｌのＰＥＢ（２０ｍＭのＴｒｉｓ－Ｃｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、０．５％のＮＰ－４０［Ｍｅｒｃｋ社製、７４３８５］）と１００Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅ阻害剤、１Ｘプロテアーゼ阻害剤及び１Ｘホスファターゼ阻害剤で氷上にて１０分間溶解した後、遠心分離した。上清液をショ糖勾配に積層し、ＳＷ４１ＴｉローターとＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ Ｏｐｔｉｍａ ＸＥを用いて４℃で２時間の間３６，０００ｒｐｍで遠心分離した。サンプルは、Ｍｏｄｅｌ ２１１０ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製、７３１８３０３）およびＭｏｄｅｌ ＥＭ－１ Ｅｃｏｎｏ ＵＶ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）に結合されたＢｉｏＬｏｇｉｃ ＬＰ ｓｙｓｔｅｍを用いて０．２５ｍｌの分画として得られた。０．７５ｍｌのＴＲＩｚｏｌ^ＴＭ ＬＳ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を各分画に添加した。図１１のグラフに示すように、ポリソーム分画法（ｐｏｌｙｓｏｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ）に従って遊離ｍＲＮＡ（ｆｒｅｅ ｍＲＮＡ）、モノソーム（ｍｏｎｏｓｏｍｅ）、軽いポリソーム（Ｌｉｇｈｔ ｐｏｌｙｓｏｍｅ；ＬＰ；２～３個のリボソーム）、中間ポリソーム（Ｍｅｄｉｕｍ ｐｏｌｙｓｏｍｅ；ＭＰ；４～８個のリボソーム）、および重いポリソーム（Ｈｅａｖｙ ｐｏｌｙｓｏｍｅ；ＨＰ；９個以上のリボソーム）は、２５４ｎｍでの吸光度の傾向を利用して区分し、Ｄｉｒｅｃｔ－Ｚｏｌ ＲＮＡ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製、Ｒ２０５２）を用いて抽出した。

次に、ライブラリー製造段階は、ＲＮＡ安定性スクリーニングと同様の方法で行った。シーケンシングデータは、下記識別子ＤＯＩでＺｅｎｏｄｏデータベースにおいて利用可能である［ＤＯＩ：１０．５２８１／ｚｅｎｏｄｏ．６７７７９１０（安定性）、１０．５２８１／ｚｅｎｏｄｏ．６７１７９３２（ポリソーム）、１０．５２８１／ｚｅｎｏｄｏ．６６９６８７０（２次スクリーニング）、１０．５２８１／ｚｅｎｏｄｏ．７７７３９４３（核／細胞質分画）。

５．データの分析

全てのサンプルについてｒｅａｄをパラメータ－ｌｏｃａｌと共にｂｏｗｔｉｅ ２．２．６を用いてオリゴに対してアライメントした。アライメントされたｒｅａｄをバーコードと正確に一致する固有のアライメントでフィルタリングした。統計テストは、ｍｐｒａｌｍ関数を用いてＭＰＲＡｎａｌｙｚｅで実行した。ｓｃｉｐｙモジュール及びヒストグラムプロットのスピアマンの相関係数を用いて技術性能を評価した。正規化されたカウントを可視化のために使用した。ポリソーム分析の場合、ＤＥＳｅｑ２を用いた分散安定化を変換した後、５つの分画の平均を差し引いた後、前記各分画の相対距離を計算した。前記各分画の相対距離はｓｃｉｐｙモジュールで階層的クラスタリングを実施するのに用いた。別の翻訳の定量化のために、下記式で平均リボソームローディング（Ｍｅａｎ ｒｉｂｏｓｏｍｅ ｌｏａｄ；ＭＲＬ）を計算した。

１×ｐ（Ｍｏｎｏｓｏｍｅ）＋２．５×ｐ（Ｌｉｇｈｔ ｐｏｌｙｓｏｍｅ）＋６×ｐ（Ｍｅｄｉｄｕｍ ｐｏｌｙｓｏｍｅ）＋１１×ｐ（Ｈｅａｖｙ ｐｏｌｙｓｏｍｅ）

ｐ（Ｘ）：Ｘ（各分画）のシーケンシングリード（ｒｅａｄ）の比率

ｍＲＮＡ安定性のカットオフの場合、負の調節エレメントについてＬｏｇ_２（ＲＮＡ／ＤＮＡ）＜－１およびｐ値＜０．００１を使用し、正の調節エレメントについてＬｏｇ_２（ＲＮＡ／ＤＮＡ）＞０．５及びｐ値＜０．０５を使用した。翻訳活性化エレメントのカットオフには、Ｌｏｇ_２（重いポリソーム／遊離ｍＲＮＡ）＞０．２および／またはＭＲＬ＞４．５を使用し、翻訳下向き調節エレメントのカットオフにはＬｏｇ_２（重いポリソーム／遊離ｍＲＮＡ）＜－０．２および／またはＭＲＬ＜３．５を使用した。

２番目のスクリーニング置換データの場合、置換および欠失の塩基同一性スコア（Ｂａｓｅ－ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）を下記式により計算した。

Ａ／ｍｅａｎ（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ_ｘ， Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ_ｙ， Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ_ｚ）（ｆｏｒ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ， ｘ， ｙ， ｚ ： ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）
Ａ／Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ （ｆｏｒ ｄｅｌｅｔｉｏｎ）
Ａ：野生型Ｋ５の安定性

置換データに対する塩基対スコア（Ｂａｓｅ－ｐａｉｒｉｎｇ ｓｃｏｒｅ）を下記式により計算した。

ｍｅａｎ（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ ｂａｓｅ ｐａｉｒ）－ｍｅａｎ（Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ ｄｉｓｒｕｐｔｉｎｇ ｂａｓｅ ｐａｉｒ）

欠失データに対する塩基対欠スコア（Ｐａｉｒ－ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ）を下記式により計算した。

Ａ／Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ｐａｉｒｗｉｓｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ

ピコルナウイルスツリーを構成するために、ＮＣＢＩで検索されたウイルス配列をＣｌｕｓｔｅｒＯｍｅｇａによってアライメントし、ＦｉｇＴｒｅｅ ｖ１．４．４を用いて可視化した。保存スコア（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｓｃｏｒｅ）は、上位３３種に亘って多重配列をアライメントした後、Ｋ５エレメントと同じヌクレオチドの数として計算した。ＲＮＡ構造の可視化のために、ＲＮＡｆｏｌｄを用いて構造を予測しｆｏｒｎａを用いて可視化した。

６．プラスミドの構築

検証実験のために選択されたエレメントは、プラスミドライブラリープールにてＰＣＲで増幅され、ｐｍｉｒＧＬＯ－３ＸｍｉＲ－１ベクターにおけるホタルルシフェラーゼ遺伝子の３’非翻訳領域にクローニングした。ルシフェラーゼ構造の場合、Ｋ５エレメント（８１２２－８２５１：ＮＣ＿００１９１８．１）をプラスミドプールライブラリーから増幅し、ＰＣＲ増幅によってさらに５５ｂｐおよび１１０ｂｐを加えてｅＫ５エレメント（８０６７－８２５１：ＮＣ＿００１９１８．１）および全ての非翻訳領域（８０１２－８２５１：ＮＣ＿００１９１８．１）を作製した。１２０－Ｋ５エレメント（８１３２－８２５１：ＮＣ＿００１９１８．１）、１１０－Ｋ５エレメント（８１４２－８２５１：ＮＣ＿００１９１８．１）および、Ｋ５ｍエレメント（８１２２－８２５１，８１８５ΔＧ：ＮＣ＿００１９１８．１）は、ｐｍｉｒＧＬＯ－３ＸｍｉＲ－１ Ｋ５プラスミドから増幅し、ｅＫ５ｍエレメント（８０６７－８２５１：ＮＣ＿００１９１８．１）は、ｐｍｉｒＧＬＯ－３ＸｍｉＲ－１ ｅＫ５プラスミドから増幅した。Ｋ４エレメント（７９３１－８０６０：ＮＣ＿００９４４８．２）プラスミドプールライブラリーから増幅し、ＰＣＲ増幅によって５０ｂｐをさらに含めてｅＫ４エレメントを作製した（７８８１－８０６０：ＮＣ＿００９４４８．２）。１Ｅエレメント（４１４－４６３：ＲＮＡ２．７）は、ｐｍｉｒＧＬＯ－３ＸｍｉＲ－１ １Ｅベクターから増幅した。

ＡＡＶ産生のために、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、Ｐｌａｓｍｉｄ ＃３７８２５）プラスミドを鋳型として用いた。Ｋ５エレメント（８１２２－８２５１：ＮＣ＿００１９１８．１）、Ｋ５ｍエレメント（８１２２－８２５１，８１８５ΔＧ：ＮＣ＿００１９１８．１）、ｅＫ５エレメント（８０６７－８２５１：ＮＣ＿００１９１８．１）、およびｅＫ５ｍエレメント（８０６７－８２５１，８１８５ΔＧ：ＮＣ＿００１９１８．１）をｐｍｉｒＧＬＯ－３ＸｍｉＲ－１ ｅＫ５およびｅＫ５ｍプラスミドから増幅したし、ＧｉｂｓｏｎアセンブリによってｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰプラスミド内のＷＰＲＥ配列を代替した。対照プラスミドの場合、ｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰにおけるＧＦＰ遺伝子の３’非翻訳領域のＷＰＲＥ配列をＰＣＲベース増幅で除去した。

ｄ２ＥＧＦＰプラスミドの構築のために、ｐｍｉｒＧＬＯ－３ＸｍｉＲ－１ベクターからのホタルルシフェラーゼ遺伝子をＧＢＡ ５’非翻訳領域、ｄ２ＥＧＦＰ ＣＤＳおよびＧＢＡ ３’非翻訳領域で代替して、対照プラスミドを作製した。ルシフェラーゼコンストラクトからのＵＴＲを増幅させ、前記ｄ２ＥＧＦＰ対照ベクターに挿入した。

テザリングおよびコンストラクトの構築のため、ｐｍｉｒＧＬＯ－３ｘｍｉｒ１－５ｘＢｏｘＢベクターからｐｍｉｒＧＬＯ－３ｘＢｏｘＢを生成し、ｐＧＫ－ＺＣＣＨＣ２コンストラクトの場合ＨＣＴ１１６ ｃＤＮＡから増幅されたＺＣＣＨＣ２をｐＧＫベクター内にサブクローニングした。ＺＣＣＨＣ２ΔＣ（１－３７５ ａ．ａ）およびＺＣＣＨＣ２ΔＮ（２０１ ａａ－１，１７８ ａ．ａ）構造を含むテザリング構造は、ｐＧＫ－ＴＥＶ－ＨＡ－λＮでＺＣＣＨＣ２のサブクローニングすることにより生成した。ＺＣＣＨＣ２ジンクフィンガーの突然変異バージョンを調製するために、ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ＰＣＲでジンクフィンガー（ＣＸ２ＣＸ３ＧＨＸ４Ｃ）の第１および第２のシステインをセリンで代替した。ＴＮＲＣ６Ｂ Ｃ－ｔｅｒｍ構造の場合、ＴＮＲＣ６Ｂ遺伝子のＣ－ｔｅｒｍ領域（７１６－１，０２８ ａ．ａ）をＨＣＴ１１６ ｃＤＮＡで増幅し、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いてｐＧＫおよびｐＧＫ－ＴＥＶ－ＨＡ－λＮベクターにサブクローニングした。

ＲａＰＩＤ実験のために、ｄ２ＥＧＦＰ， ｐｍｉｒＧＬＯ－３ｘＢｏｘＢ、およびｐｍｉｒＧＬＯ－３ｘｍｉｒ－１－ｅＫ５プラスミドからＥＧＦＰ ＣＤＳ、３ｘＢｏｘＢ配列およびｅＫ５配列をそれぞれ増幅し、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを用いてｐＣＫベクター内にサブクローニングした。

前記方法で得られたプラスミドのリストを表１に示した。

７．ルシフェラーゼアッセイおよびトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）

ルシフェラーゼアッセイは、次のような方法で行った。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００によるルシフェラーゼレポーターアッセイのために、０日目に２４ウェルプレート上のＨｅＬａまたはＨＣＴ１１６細胞の２Ｅ５を１００ｎｇ ｐｍｉｒＧＬＯ－３ＸｍｉＲ－１プラスミドでトランスフェクトさせ、２日目に得た。ノックダウン実験のために、各標的遺伝子に対して１００ｎｇ ｐｍｉｒＧＬＯ－３ＸｍｉＲ－１ Ｋ５プラスミドおよび４０ｎＭ ｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ ｓｉＲＮＡ ｓｍａｒｔｐｏｏｌ）をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００で共トランスフェクトした。ＺＣＣＨＣ２構造実験のために、５０ｎｇのｐｍｉｒＧＬＯ－３ＸｍｉＲ－１プラスミドおよび６０ｎｇのｐＧＫ－ｎｕｌｌまたはｐＧＫ－ＺＣＣＨＣ２またはｐＧＫ－ＺＣＣＨＣ２ジンクフィンガー突然変異構造を共トランスフェクトした。デザリング実験のために、５０ｎｇのｐｍｉｒＧＬＯ－３ｘＢｏｘＢプラスミドおよび６０ｎｇのｐＧＫ－ＺＣＣＨＣ２野生型／変異型コンストラクトをλＮ－ＨＡ－ＴＥＶのフラグありまたはフラグなしのように共トランスフェクトした。ルシフェラーゼアッセイのために、製造会社の説明書に従ってＤｕａｌ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）で細胞を溶解し、分析した。

８．ＲＴ－ｑＰＣＲ

ＲＮｅａｓｙ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製、７４１０６）でＲＮＡを抽出し、ＤＮａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ社製、７９２５４）を処理し、Ｐｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ ＲＴｍｉｘ（Ｔａｋａｒａ社製、ＲＲ０３６Ａ）で逆転写した。ｍＲＮＡレベルは、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ａｓｓａｙｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、４３６７６５９）およびＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）またはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ３（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製）で測定した。ＲＴ－ｑＰＣＲプライマーのリストは表１に示されている。

９．ＡＡＶ生成および精製

ＡＡＶ生成および精製は次のような方法で行った。２９３ＡＡＶ細胞株（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社製、＃ＡＡＶ－１００）を１０％のＦＢＳ、０．１ｍＭのＭＥＭ Ｎｏｎ－ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ（ＮＥＡＡ）及び２ｍＭのＬ－グルタミンを含むＤＭＥＭ中で培養した。ＧＦＰタンパク質を運搬するＡＡＶを産生するように、２９３ ＡＡＶ細胞株を、１５０ｍｍのペトリ皿に一晩かけて分注し、７０％程度成長すればｐＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰプラスミド変異体（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、３７８２５）をｐＡｄＤｅｌｔａ６Ｆ６（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、１１２８６７）およびｐＡＡＶＤＪ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社製、ＶＰＫ－４２０－ＤＪ）プラスミドと共にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００およびｐ３０００で共トランスフェクトした。７２時間の間トランスフェクションした後、細胞を得て、２．５ｍｌの無血清ＤＭＥＭに再懸濁した。その後、細胞溶解は、４回の凍結／解凍（アルコール／ドライアイス中で３０分間凍結および３７℃の水槽で１５分間、毎周期ごとに解凍）を行うことによって行われた。ＡＡＶ上清液は、４℃で１０分間１０，０００Хｇで遠心分離することにより得られた。ＶｉｒａＢｉｎｄ^ＴＭ ＡＡＶ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）でＡＡＶを精製した後、製造会社の説明書に従ってＱｕｉｃｋＴｉｔｅｒ^ＴＭ ＡＡＶ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ社製）でウイルス力価を測定した。形質導入のために、ＨｅＬａ細胞を１２ウェルプレートに分注し、対照としてＰＢＳを使用した擬似感染と共に２，０００および１０，０００ｍｏｉでＡＡＶに感染させた。感染後５日後に、ＧＦＰシグナルをフローサイトメトリー（ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｐｌｕｓ）で検出した。

１０．インビトロ転写されたＲＮＡの製造

インビトロ転写されたＲＮＡの場合、ＤＮＡ鋳型は、フォワードプライマー（Ｔ７プロモーター＋ｇｅｎｅ＿ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ｆ）およびリバースプライマー（Ｔ１２０＋ｇｅｎｅ＿ｓｐｅｃｉｆｉｃ＿Ｒ、５’末端の２’－Ｏ－メチル化デオキシウリジンの２つヌクレオチド）を使用したＰＣＲを行うことにより調製した。２５０ｎｇのＤＮＡ鋳型は、ｍＭＥＳＳＡＧＥ ｍＭＡＣＨＩＮＥ^ＴＭ Ｔ７転写キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、ＡＭ１３４４）および成分（それぞれ７．５ｍＭのＡＴＰ／ＣＴＰ／ＵＴＰ［ＮＥＢ社製、Ｎ０４５０Ｓ］、１．５ｍＭのＧＴＰおよび６ｍＭのＣｌｅａｎＣａｐ（登録商標）（Ｒｅａｇｅｎｔ ＡＧ（３’ ＯＭｅ）［ＴｒｉＬｉｎｋ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、Ｎ－７４１３－１０］）を用いてインビトロで転写した。前記ＤＮＡ鋳型は、組換えＤＮａｓｅ Ｉ（ＲＮａｓｅ－ｆｒｅｅ）を用いて除去し、ＲＮｅａｓｙ ＭｉｎｉＥｌｕｔｅ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ社製、７４２０４）を用いて洗浄した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写の鋳型の製造に用いたプライマーは表１に示した。

１１．ｍＲＮＡトランスフェクトされたサンプルの調製および分析

１２ウェルプレート上の２Ｅ５ＨｅＬａ細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘを用いてインビトロ転写されたＲＮＡでトランスフェクトした。ルシフェラーゼｍＲＮＡでトランスフェクトされたサンプルの場合は、細胞を溶解し、製造会社の説明書に従ってＤｕａｌ－ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ ｒｅｐｏｒｔｅｒ ａｓｓａｙ ｓｙｓｔｅｍで分析した。ｄ２ＥＧＦＰサンプルの場合、細胞を１Ｘプロテアーゼ阻害剤および１Ｘホスファターゼ阻害剤を含んでなるＲＩＰＡ ｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、８９９０１）で１０分間氷上にて溶解した後、遠心分離した。前記サンプルを５Ｘ ＳＤＳ緩衝液中で煮沸後、ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、２６６１６）を用いてＮｏｖｅｘ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｇｅｌ（１０～２０％）にロードした。ゲルをメタノールで活性化したＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に移した後、メンブレンを５％のスキムミルクを含むＰＢＳ－Ｔによってブロックした後、一次抗体でプローブして、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。前記一次抗体は、一次抗体としてａｎｔｉ－ＥＧＦＰ（１：３，０００、ＣＡＢ４２１１、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）およびａｎｔｉ－ａｌｐｈａ－ＴＵＢＵＬＩＮ（１：３００、Ａｂｃａｍ社製、ａｂ５２８６６）を使用した。抗マウスまたは抗ウサギのＨＲＰ共役二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を１時間の間培養し、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。化学発光は、Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ又はＦｅｍｔｏ Ｌｕｍｉｎｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を使用し、シグナルは、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で検出した。ｄ２ＥＧＦＰサンプルの場合、ＧＦＰシグナルをフローサイトメトリー（ＢＤ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ Ｐｌｕｓ）で検出した。

１２．Ｈｉｒｅ－ＰＡＴ分析

Ｈｉｒｅ－ＰＡＴ分析およびキャピラリー電気泳動データのシグナル処理を、文献（Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔ． Ｓｔｒｕｃｔ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２０２０， ２７， ５８１－５８８）に説明されたように実施した。ホタルルシフェラーゼ遺伝子のポリ（Ａ）部位を前記文献でサンガーシーケンシング（Ｓａｎｇｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）で確認したように利用し、ポリ（Ａ）部位に対するフォワードＰＣＲプライマーは表１に示されている。

１３．遺伝子特異的ＴＡＩＬ－ｓｅｑ

ＲＧ７８３４処理時、ポリ（Ａ）テールの長さ分布を測定するために、ＨｅＬａ細胞をＲＯ０３２１（Ｇｌｉｘｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ社製、ＧＬＸＣ－１１００４）またはＲＧ７８３４（Ｇｌｉｘｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ社製、ＧＬＸＣ－２２１１８８）が処理されたホタルルシフェラーゼの３’非翻訳領域にＫ５エレメントを含むｐｍｉｒＧＬＯ－３ＸｍｉＲ－１プラスミドでトランスフェクトさせて、２日以内に得た。親細胞とＺＣＣＨＣ２ノックアウト細胞との間のポリ（Ａ）テールの長さ分布を比較するために、親細胞およびＺＣＣＨＣ２ノックアウト細胞をＲＧ７８３４処理されたサンプルと同様に製造した。遺伝子特異的ＴＡＩＬ－ｓｅｑを行うために、ｒＲＮＡが枯渇した全ＲＮＡ（Ｔｒｕｓｅｑ Ｓｔｒｎｄ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ＬＰ Ｇｏｌｄ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製、２００２０５９９）を３’アダプターにライゲーションし、ＲＮａｓｅ Ｔ１（Ａｍｂｉｏｎ社製）で部分的に断片化した。Ｕｒｅａ－ＰＡＧＥ ｇｅｌ（３００－１５００ ｎｔ）で精製した後、ＲＮＡを逆転写し、ＰＣＲで増幅した。ホタルルシフェラーゼＰＣＲ増幅のために、ＧＳ－ＴＡＩＬ－ｓｅｑ－ＦｉｒｅｆｌｙＬｕｃ－Ｆをフォワードプライマーとして用いた。ライブラリーは、ｓｐｉｋｅ－ｉｎ ｍｉｘｔｕｒｅを含むＰｈｉＸ ｃｏｎｔｒｏｌ ｌｉｂｒａｒｙ ｖ．２（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製）でＩｌｌｕｍｉｎａ ｐｌａｔｆｏｒｍ（Ｍｉｓｅｑ）でｐａｉｒｅｄ－ｅｎｄ ｒｕｎ（５１Ｘ２５１ ｃｙｃｌｅｓ）でシーケンシングした。ＴＡＩＬ－ｓｅｑシーケンシングデータは、ＤＯＩ：１０．５２８１／ｚｅｎｏｄｏ．６７８６１７９．の識別子を持つＺｅｎｏｄｏデータベースに保存した。

ＴＡＩＬ－ｓｅｑは、Ｔａｉｌｓｅｅｋｅｒ ｖ．３．１．５で分析した。各々のトランスクリプトームについて、遺伝子はｂｏｗｔｉｅ２．２．６を用いてホタルルシフェラーゼの構成配列及びヒトトランスクリプトームにリード１をマッピングして確認した。次に、当該ポリ（Ａ）テールの長さおよび３’末端の修飾をリード２で抽出した。混合テーリングの割合は、ポリ（Ａ）テールの長さが５０ｎｔよりも長いトランスクリプトームから計算した。

１４． ＴＥＮＴ４、ＺＣＣＨＣ２およびＺＣＣＨＣ１４ノックアウト（ＫＯ）細胞の調製

ＴＥＮＴ４ ｄＫＯ細胞は、前記Ｋｉｍらの文献と同様な方法で調製された。また、ＺＣＣＨＣ２およびＺＣＣＨＣ１４ノックアウト細胞株も前記Ｋｉｍらの文献の説明に従って調製された。６ウェルプレート上の４Ｅ５ＨｅＬａ細胞および２４ウェルプレート上の１Ｅ５ ＨＣＴ１１６細胞をＺＣＣＨＣ２に対するｓｇＲＮＡ（ＡＣＣＴＣＡＧＧＡＣＧＧＡＣＴＴＡＣＣＧ（配列番号９６）、ＰＡＭ配列は、ＴＧＧ）およびＺＣＣＨＣ１４に対するｓｇＲＮＡ（ＣＡＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＧＣＧＣＧＣＣＧＣＣ（配列番号９７）、ＰＡＭ配列はＣＧＧ）を含む３００ｎｇのｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）－２Ａ－ＧＦＰ－ｐｘ４５８プラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、＃４８１３８）を用いてＭｅｔａｆｅｃｔｅｎｅ（Ｂｉｏｎｔｅｘ社製、Ｔ０２０）にそれぞれトランスフェクトした。単一細胞スクリーニング後、Ｓａｎｇｅｒシーケンシングおよびウェスタンブロット分析を行ってノックアウトされた菌株を同定した。親細胞および改変ゲノム配列は、表１に示し、挿入された配列は赤色で表示した。

１５．ＲＮＡ近接依存性標識法による分析

ＲａＰＩＤ（ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ）アッセイは、次のような方法で行った。具体的に、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、６３２１８０）およびＢＡＳＵ ＲａＰＩＤプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ社製、＃１０７２５０）から生成されたレンチウイルス輸送コンストラクトを形質導入してＢＡＳＵ発現ＨｅＬａ安定細胞株を生成した。１５０ｐｉプレートからの１Ｅ７細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ｍＭＡＸ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、ＬＭＲＮＡ０１５）を用いて前記合成された４０μｇのＲＮＡでトランスフェクトした。１６時間後、前記細胞に２００μＭのビオチン（Ｓｉｇｍａ社製、Ｂ４６３９）を１時間の間処理した。処理された細胞を氷上で１Ｘプロテアーゼ阻害剤および１Ｘホスファターゼ阻害剤を含んでなるＲＩＰＡ ｌｙｓｉｓ ａｎｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、８９９０１）で１０分間溶解し、遠心分離した。前記溶融物は、Ｐｉｅｒｃｅ ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｂｅａｄｓ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、８８８１６）と共に一晩４℃で回転しながら培養した。ビーズは洗浄バッファー１（１ｍＭのＤＴＴ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む１％のＳＤＳ）で３回洗浄し、洗浄バッファー（０．１％のＮａ－ＤＯＣ、１％のトリトンＸ－１００、０．５ＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］、１ｍＭのＤＴＴ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む１μＭのＥＤＴＡ）で１回洗浄した後、洗浄バッファー３（０．５％のＮａ－ＤＯＣ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．５％のＮＰ－４０、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテルを含む１μＭのＥＤＴＡ）で１回洗浄した。

ウェスタンブロットの場合、タンパク質をＥｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ（１．５ｘ Ｌａｅｍｅｌｌｉ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒ、０．０２ｍＭのＤＴＴ、４ｍＭのビオチン）で溶出後、抗ＺＣＣＨＣ２（１：２５０、Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製、ＨＰＡ０４０９４３）、抗ＴＥＮＴ４Ａ（１：５００、Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製、ＨＰＡ０４５４８７）、ａｎｔｉ－ａｌｐｈａ－ＴＵＢＵＬＩＮ（１：３００、Ａｂｃａｍ社製、ａｂ５２８６６）およびａｎｔｉ－ＨＡ（１：２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製、７１５５００）の一次抗体を用いてウェスタンブロットにより分析した。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの場合、試料を３７℃で１分間消化バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ［ｐＨ８．０］）で６回洗浄した。洗浄後、タンパク質結合ビーズを３７℃で１時間の間１ＭのＤＴＴを２μＬ含む１８０μＬの消化バッファーで培養し、ついで０．５ＭのＩＡＡを１６μＬ追加して３７℃で１時間の間培養した。その後、０．１ｇ／Ｌのトリプシンを２μＬ追加して３７℃で一晩培養した。残りの分解物はＨｉＰＰＲ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、８８３０５）を用いて除去し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の前にＺｉｐＴｉｐ Ｃ１８樹脂（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製、ＺＴＣ１８Ｓ９６０）で洗浄した。

ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析は、ｎａｎｏＡｃｑｕｉｔｙシステム（Ｗａｔｅｒｓ社製）と組み合わせたＯｒｂｉｔｒａｐ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｒｉｂｒｉｄ（Ｔｈｅｒｍｏ社製）を用いて実施した。キャピラリーアッセイ（内径７５μｍ×１００ｃｍ）およびトラップ（内径１５０ｍ×３ｃｍ）カラムを３ｕｍ Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｃ１８ ｐａｒｔｉｃｌｅ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社製）で充填した。ＬＣフローは、９５％の溶媒Ａ（０．１％のギ酸（Ｍｅｒｃｋ社製））で３５％の溶媒Ｂ（１００％のアセトニトリル、０．１％のギ酸）範囲の６０分の線形勾配で３００ｎｌ／分に設定した。全ＭＳスキャン（ｍ／ｚ ３００－１，８００）は、１２０ｋ解像度（ｍ／ｚ２００）で取得した。高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）断片化は、１．４番目の前駆体隔離ウィンドウを含む３０％の正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）で発生した。ＭＳ２スキャンは、３０ｋの解像度で取得した。

ＭＳ／ＭＳｒａｗデータ、ＦｒａｇＰｉｐｅ（ｖ１８．０）に組み込まれたＭＳＦｒａｇｇｅｒ１（ｖ３．７）、ＩｏｎＱｕａｎｔ２（ｖ１．８．１０）およびＰｈｉｌｏｓｏｐｈｅｒ３（ｖ４．８．１）を用いて分析した。標識されていないタンパク質の同定及び定量化のために、トリプシンと指定された酵素と共にｂｕｉｌｔ－ｉｎ ＦｒａｇＰｉｐｅ ｗｏｒｋｆｌｏｗ（ＬＦＱ－ＭＢＲ）を使用した。標的誘導データベース（汚染物質を含む）は、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ ｈｕｍａｎ ｄａｔａｂａｓｅ４（２０２２年１０月）でＦｒａｇｐｉｐｅで生成した。ｃｏｍｂｉｎｅｄ＿ｐｒｏｔｅｉｎ．ｔｓｖファイルは、追加分析に使用した。濃縮カットオフの場合、少なくとも２回の繰り返し実験によって１を超えるＬｏｇ_２ＦＣが使用された。

１６．共免疫沈降（ｃｏ－ＩＰ）及びウェスタンブロット法

ｃｏ－ＩＰ実験のために、１ｍＭのＤＬ－ジチオレイトール（ＤＴＴ）、１Ｘプロテアーゼ阻害剤およびＲＮａｓｅ Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、ＥＮ０５３１）を含むバッファーＡ（１００ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．５］、０．４％のＮＰ－４０、１０％のグリセロール）を用いて氷上で１５０ｐｉプレートの親細胞およびＴＥＮＴ４ ｄＫＯ細胞を２０分間溶解し、次いで遠心分離した。プロテインＡおよびＧセファロースビーズ（１：１混合物、合計２０μｌ）がコンジュゲートされた１２．５μｇの抗体（ＮＭＧ社製、抗ＴＥＮＴ４Ａおよび抗ＴＥＮＴ４Ｂ）を、１ｍｇの前記溶解物と共に免疫沈降に使用した。４℃で２時間の間培養した後、ビーズを洗浄し、２０μｌの２ＸＳＤＳ緩衝液で煮沸し、ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ社製、２６６１６および２６６１９）と共に４～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル（Ｎｏｖｅｘ社製）にロードした。ドメインｃｏ－ＩＰ実験のために、全長ＺＣＣＨＣ２、切断されたＺＣＣＨＣ２コンストラクト及びフラグタグ付き陰性コンストラクトをＺＣＣＨＣ２ＫＯ細胞にトランスフェクションし、該細胞を２日以内に溶解した。前記溶解物１ｍｇにＡＮＴＩ－ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｇｅｌ（Ｍｅｒｃｋ社製、Ａ２２２０－１０ＭＬ）１０μｌを加えた後、４℃で２時間の間培養して、免疫沈降を実施した。入力サンプルの場合、５０μｇの細胞溶解物を使用した。ゲルをメタノール活性化ＰＶＤＦメンブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）に移した後、メンブレンを５％のスキムミルクを含むＰＢＳ－Ｔでブロッキングし、一次抗体でプローブした後、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。抗ＺＣＣＨＣ２（１：２５０、Ａｔｌａｓ社製、ＨＰＡ０４０９４３）、抗ＺＣＣＨＣ１４（１：１，０００、Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製、Ａ３０３－０９６Ａ）、抗ＴＥＮＴ４Ａ（１：５００、Ａｔｌａｓ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社製、ＨＰＡ０４５４８７）、抗ＴＥＮＴ４Ｂ（１：５００、ｌａｂ－ｍａｄｅ社製）、抗ＧＡＰＤＨ（１：１，０００、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製、ｓｃ－３２２３３）および抗ＦＬＡＧ（１：１０００、ａｂｃａｍ社製、ａｂ１１６２）を前記一次抗体として使用した。抗マウスまたは抗ウサギのＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社製）を用いて１時間の間培養し、ＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。化学発光は、Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ又はＦｅｍｔｏ Ｌｕｍｉｎｏｌ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ社製、３４５８０および３４０９５）で実施されたし、シグナルはＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ＋Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ社製）で検出した。

１７．ＲＮＡプルダウン －ＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータの再解析

ＭＳ／ＭＳデータは、ヒトＳｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔデータベースｖ．１２／５／２０１８基本設定を用いてＭａｘＱｕａｎｔ ｖ．１．５．３．３０で処理されており、タンパク質レベル０．８％のＦＤＲカットオフを適用した。

ＭａｘＱｕａｎｔ出力ファイルの中から、ＭａｘＬＦＱ強度値はｐｒｏｔｅｉｎｇｒｏｕｐｓ．ｔｘｔファイルから抽出した。ＭａｘＬＦＱ強度値に１０，０００の近似値を追加した後、Ｌｉｍｍａを実行し、有意な遺伝子をＬｏｇ_２ＦＣ＜０．８およびＦＤＲ＞０．１でフィルタリングした。

１８．ドメイン保存分析

ＵｎｉＰｒｏｔ Ａｌｉｇｎツールを用いてＺＣＣＨＣ２（Ｑ９Ｃ０Ｂ９）、ＺＣＣＨＣ１４（Ａ０Ａ５９０ＵＪＷ６）およびＧＬＳ－１（Ｑ８Ｉ４Ｍ５）をアライメントし、３つのタンパク質の保存スコアを計算した。

１９．ＲＮＡ免疫沈降

ＺＣＣＨＣ２の免疫沈降のため、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ２９３Ｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、６３２１８０）細胞から生成されたコンストラクトによるレンチウイルス輸送体を形質導入して、３’非翻訳領域においてＫ５エレメントを有するＥＧＦＰを発現するＨｅＬａ安定細胞株を生成した。また、溶解バッファー（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）［Ａｍｂｉｏｎ社製、ＡＭ９８５１およびＡＭ９８５６］、０．４％のＮＰ－４０、１００ｍＭのＫＣｌ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１０％のグリセロール、１ｍＭのＤＴＴ、１Ｘプロテアーゼ阻害剤［Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製、５３５１４０］）で前記細胞を氷上で３０分間処理して溶解し、遠心分離して細胞溶解物を得た。陰性対照としては、１０μｇの正常ウサギＩｇＧ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、２７２９Ｓ）を使用し、ＺＣＣＨＣ２免疫沈降のために１０μｇのＺＣＣＨＣ２抗体（ａｔｌａｓ社製、ＨＰＡ０４０９４３）を使用した。抗体が、プロテインＡ磁気ビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製、１０００２Ｄ）に付着した後、１ｍｇの細胞溶解物を抗体結合ビーズと共に２時間の間培養し、次いで洗浄緩衝液（前記と同じ溶解バッファーであって、０．２％のＮＰ－４０を含む）で洗浄した。正規化のために用いられた５ｎｇのホタルルシフェラーゼｍＲＮＡをｓｐｉｋｅ－ｉｎにて各サンプルに追加した後、ＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）で精製してＲＴ－ｑＰＣＲに使用した。ＲＴ－ｑＰＣＲプライマーは表１に示した。

２０．亜細胞分画

亜細胞分画は次の方法で行った。具体的には、細胞質分画を得るために、細胞を２００μｌの細胞溶解バッファー（０．２μｇ／μｌのｄｉｇｉｔｏｎｉｎ［Ｍｅｒｃｋ社製、Ｄ１４１］、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ［ｐＨ７．０～７．６］、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＤＴＴ、２０Ｕ／ｍｌのＲＮａｓｅ阻害剤、１Ｘプロテアーゼ阻害剤、１Ｘホスファターゼ阻害剤）で溶解した。細胞膜および核分画の場合、製造会社の説明書に従って細胞内タンパク質分画キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製、７８８４０）を用いて分画した。一次抗体としては、抗ＧＭ１３０（１：５００、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社製、６１０８２２）および抗ヒストン（１：２０００、ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ社製、４４９９）を使用した。

本発明の実験例で用いられた試薬および材料を下記表２に示した。

［実施例］

１．調節ＲＮＡエレメントを同定するためのＶｉｒｏｍｉｃスクリーン

ウイルスＲＮＡエレメントのライブラリーを構築するため、オリゴ合成の技術的限界のため、ヒトウイルスで初期の選別を行い、他の関連種を含むように２次スクリーンを拡張する２段階のアプローチを行った。ヒトに感染させることができるウイルスを同定するために、現在、１１４個の属および４０個の科に属する５０２種のヒトウイルスに注釈を付けているＮＣＢＩデータベースを使用した。

図１Ａおよび表３に示すように、手作業で検査した後、９６個の属と３７個の科を代表する１４３種を選定し、配列類似性が近い種、および、曖昧に分類されるかまたはヒト感染に関する明確な証拠が足りない種を除いた。本発明のカタログは、ボルティモア分類システムの７つのグループをいずれも含んでいる。ＲＮＡウイルスの場合、全ゲノム配列を使用した。一般に、より大きなゲノムを持つＤＮＡの場合、非翻訳領域（ＵＴＲ）および暗号化されていない遺伝子が含まれている。

図１Ｂに示すように、スライディングウィンドウのサイズが１３０ｎｔであり、６５ｎの段階サイズにウイルスゲノムをタイリング（ｔｉｌｅ）して合計３０，３６７個のセグメントを生成してスクリーン用オリゴを設計した。各セグメントは、信頼可能な検出のための３種の異なるバーコードを有するように製造した。陽性対照として、ＨＣＭＶ（ｈｕｍａｎ ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）のｌｎｃＲＮＡ２．７からの「１Ｅ」エレメントを含む４つのセグメント（図８）および遺伝子発現を向上させることが知られているウッドチャック肝炎ウイルスのＷＰＲＥ（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ ｐｏｓｔｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｅｌｅｍｅｎｔ）を含む１つのセグメントを含めた。非機能的対照として、本発明者らは１Ｅのループで不活性化変異を含む変異（１Ｅｍ）を使用した。前記設計されたオリゴを合成した後、ＰＣＲによって増幅し、ルシフェラーゼレポータープラスミドの３’非翻訳領域に挿入した。前記構築されたライブラリーには、合計９１，１０１個のレポータープラスミドが含まれており、１４３個のヒトウイルスおよびイヌのウッドチャック肝炎ウイルスで３０，３６７個のセグメントが含まれていた。

機能的評価のために、プラスミドプールを、ヒト結腸癌細胞株（ＨＣＴ－１１６）にトランスフェクトさせて、遺伝子発現に対する各エレメントの影響を定量化した（図１Ｂ）。ＲＮＡ存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）に及ぼす効果をモニタリングすべく、プラスミドおよびｍＲＮＡを全て抽出し、増幅し、シーケンシングして、ｍＲＮＡのリードの比とトランスファクトされたＤＮＡのリードの比との間の割合を計算した（「ＲＮＡ／ＤＮＡ」）。翻訳調節エレメントを探索するために、ショ糖勾配の遠心分離を用いて、細胞質抽出物を５つの分画（遊離ｍＲＮＡ、モノソーム、軽いポリソーム（ＬＰ）、中間ポリソーム（ＭＰ）、および重いポリソーム（ＨＰ））に分離し、前記抽出物を、ＲＮＡ抽出及びシーケンシングに用いて各ＵＴＲについて翻訳効率を予測した。

２．調節ＲＮＡエレメントの同定

ｍＲＮＡ存在量（ａｂｕｎｄａｎｃｅ）に対する３０，３０２個のウイルスセグメント（３つのバーコードが全て感知されたセグメント３０，１９０個）に及ぼす影響を確認するために次のような実験を行った。実験結果は、４回の繰り返し実験とバーコードとの間で再現可能であった。具体的には、１ＥおよびＷＰＲＥにわたる陽性対照は、１Ｅ変異に比してｍＲＮＡレベルが増加された（図１Ｃ）。２４５個の上向き調節セグメントと６２８個の下向き調節セグメントを同定した。ｍＲＮＡの存在量を増加させたセグメントは、ｍＲＮＡの安定性を向上させると知られているＰＲＥの一部であるヒトＢ型肝炎ウイルスのステム－ループαを含んでいた。ネガティブエレメントは、Ｄ型肝炎ウイルス（ＨＤＶ）の自己切断リボザイムのような核酸分解酵素により切断されたＲＮＡ、およびＤＲＯＳＨＡによって切断される可能性のあるヒトサイトメガロウイルス（ヒトβ－ヘルペスウイルス５とも知られている）、およびエプスタイン・バーウイルスのマイクロＲＮＡ遺伝子座を含めて、レポーターｍＲＮＡの分解をもたらした（図１Ｃ）。

したがって、前記実験でＲＮＡを安定化するセグメント（Ｌｏｇ_２（ＲＮＡ／ＤＮＡ）＞０．５、ｐ値＜０．０５）または不安定化するセグメント（Ｌｏｇ_２（ＲＮＡ／ＤＮＡ）＜－１、ｐ値＜０．００１）を効果的に同定した（表４および表５）。表４の５０個のセグメントは、陽性対照ＷＰＲＥまたはＨＣＭＶ１Ｅと類似するか、またはそれより高いＬｏｇ_２（ＲＮＡ／ＤＮＡ）値を有し、優れたＲＮＡ存在量を示していることを確認した（図１Ｃ）。

ＲＮＡを安定化するセグメント

ＲＮＡを不安定化するセグメント

また、ポリソームプロファイリングシーケンシングデータ（図１Ｄ）を用いて、３０，１５５個のセグメント（３つのバーコードが全て感知されたセグメント２９，７８６個）の翻訳作用を評価した。非突然変異ＷＰＲＥと１Ｅは、翻訳に対するポジティブな影響と一致する重いポリソーム分画で豊富に存在した（図１Ｅ）。５３５個の上向き調節セグメントおよび６６個の下向き調節セグメントを識別して、重いポリソームと遊離ｍＲＮＡ分画との間のリード比（Ｌｏｇ_２（ＨＰ／遊離ｍＲＮＡ）＞０．２）を用いて翻訳効率を推定した（表６）。下記表６の３０個のセグメントは、陽性対照ＷＰＲＥおよびＨＣＭＶ１Ｅと同様に、重いポリソーム分画で豊富に存在するので、ｍＲＮＡ翻訳を増強させることができることを確認した（図１Ｅ）。

３．調節エレメントの検証

推定されたｍＲＮＡ存在量と翻訳効率との間の非常に弱い相関関係は、ほとんどのウイルスエレメントがｍＲＮＡ存在量または翻訳に影響を及ぼすことを示唆した。それにもかかわらず、いくつかのセグメントは、両方ともに影響を及ぼすことが確認された。これを検証するために、ＲＮＡ存在量と翻訳をいずれも向上させた、従前に研究されていない１６個の候補を選択した（図２Ａ、表７；Ｌｏｇ_２（ＨＰ／遊離ｍＲＮＡ）＞０．２およびＭＲＬ＞４．５を満たす）。３’非翻訳領域レポーターおよび個々のルシフェラーゼアッセイを用いて、１６個の候補のうち１５個が、統計的有意性（ｐ＜０．０５）をもってルシフェラーゼ発現が増加したことを確認した（図２Ｂ）。

Ｓａｆｆｏｌｄウイルスの３’ＵＴＲ（７９３１－８０６０ ＮＣ＿００９４４８．２）におけるＫ４エレメントおよびアイチ（Ａｉｃｈｉ）ウイルス１（ＡｉＶ－１）の３’ＵＴＲ（８１２２－８２５１：ＮＣ＿００１９１８．１）でＫ５エレメントをさらに調べた（図２Ｃ）。前記２つのウイルスは、いずれも単一ポリペプチドをコードする１本鎖の陽性ＲＮＡゲノムを有するピコルナウイルス（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）科に属し、該ウイルスはタンパク質分解に起因して複数個の断片に加工された。ＳａｆｆｏｌｄウイルスおよびＡｉＶ－１は、それぞれカルジオウイルス（Ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓ）属とコブウイルス（Ｋｏｂｕｖｉｒｕｓ）属に属し、そして、胃腸炎をはじめとする比較的軽微な症状を引き起こすウイルスに広範に分布しており、未だ調査が行われていないことが確認された。

エレメントの境界をマッピングするために、Ｋ４及びＫ５の拡張又は切断されたセグメントを調べた。Ｓａｆｆｏｌｄウイルスの全３’非翻訳領域を含むＫ４の拡張された１８０ｎｔセグメント（「ｅＫ４」、７８８１－８０６０）は、既存のＫ４セグメントと類似した効果を示しており、これによって、３’末端の１３０ｎｔがＫ４の活性を伝達するのに十分であることが確認された。しかし、Ｋ５の拡張された形態（「ｅＫ５」、８０６７－８２５１、１８５ｎｔ、配列番号９４）は、ルシフェラーゼ発現をさらに向上させ、既存のＫ５、Ｋ４、及び拡張されたＫ４（ｅＫ４）を含む他のエレメントを凌いだ（図２Ｄ）。また、Ｋ５よりも短い１２０ｎｔ（８１３２－８２５１、配列番号９５）のセグメントは、Ｋ５よりも高い活性を示した。注目すべき点は、Ｋ５がｍＲＮＡ存在量および翻訳スクリーニングの両方ともにおいて上位２５個の候補のうちの１つとして選定されたということであり、これはＫ５が特に有力なエレメントであることを示唆した。Ｋ５に対する切断実験は、３’末端の１１０ｎｔ（８１４２－８２５１）超過のエレメントが少なくともＫ５エレメントを構成することができることを示した（図２Ｅ）。Ｋ５含有セグメントは、ｍＲＮＡレベルを増加させ、一層重要なことは、タンパク質のレベルがスクリーニングデータと一致した。

４．Ｋ５エレメントの特徴付け

Ｋ５を詳細に特徴付けるために、Ｋ５変異体およびホモログ（ｈｏｍｏｌｏｇ）に対する２次ハイスループットスクリーニングアッセイを実施した（図３Ａおよび図３Ｂ）。突然変異の誘導のために１３０ｎｔのＫ５エレメントの全ての部位に単一ヌクレオチドの置換、単一ヌクレオチドの欠失および２連続ヌクレオチドの欠失を実施した（図３Ｃ）。また、配列を変更したが、予測された二重構造（ｄｕｐｌｅｘ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を保存する補償変異を導入した。さらに、ループは、異なる組み合わせでランダムに選択された最大２つの塩基が置換された。３つのバーコードで、合計１，２０１個の変異体を合成した。クローニング及びトランスフェクション後、ｍＲＮＡ存在量に対する突然変異の効果を評価するために、トランスフェクトされたＤＮＡレベルに相対的なｍＲＮＡレベルを測定した（図３Ｂ）。

図３Ｄに示すように、特定のヌクレオチド配列の寄与度を定量化するために、単一塩基置換データを用いて「塩基同一性スコア」を計算した。また、ステム領域の塩基対に対する要求事項を示す補償変異データに基づいて「塩基対スコア」を計算した。その結果、いくつかの変異、特に最初の１４つのヌクレオチドの変異がｍＲＮＡレベルをわずかに増加させたが（図３Ｃ）、これは自己阻害活性を示し、このような結果は切断実験（図２Ｅ）と一致した。また、他の変異体の場合、Ｋ５に類似するか又はそれよりも高いｍＲＮＡレベルを増加させた（図３Ｃ）。対照的に、第１のヘアピン（ピリミジンリッチ末端ループを含む）および第２のヘアピン（Ｇ突出部（ｂｕｌｇｅ）を含む）に対する変異は、ｍＲＮＡレベルを実質的に減少させ、これにより、前記これらのヘアピンがＫ５活性において肝心なことを確認した（図３Ｄ）。前記結果は、欠失および補償変異の結果と一致した。

Ｋ５の系統発生的分布を調べるために、８８個のピコルナウイルス種（Ｋ５および８７個の異なるピコルナウイルスエレメント）の３’非翻訳領域セグメントを２次スクリーニングに含めた。このピコルナウイルスの中で４３個のコブウイルスセグメント（表８；Ｋ５と少なくとも５９％の相同性を有する）は、第２のヘアピンのＧ突出部に欠失を有する非機能的対照Ｋ５ｍよりもｍＲＮＡレベルを遥かに多く上向き調節したし（図３Ｄおよび図３Ｅ、表８）、Ｋ５に類似するか、またはそれよりも高くｍＲＮＡレベルを上向き調節した。前記結果からＫ５がコブウイルス属に保存されていることを確認した。保存された３’配列が欠失しているいくつかのコブウイルスセグメントは、分析の結果、活性が低かった。かかる３’配列の欠失は、データベースの注釈が不完全であることに起因する場合もある。

コブウイルス属を除いた大部分のピコルナウイルス３’非翻訳領域は、ｍＲＮＡ存在量を増加させなかった（図３Ｅ）。しかしながら、いくつかの例外があったが、特にＫ４陽性エレメント（ＲＮＡ／ＤＮＡ比＝１．５１４）を含むＳａｆｆｏｌｄウイルスに関連するブーンカルジオウイルス１（Ｂｏｏｎｅ ｃａｒｄｉｏｒｖｉｒｕｓ １；ＮＣ＿０３８３０５．１）のセグメント（配列番号１８７；ＲＮＡ／ＤＮＡ比＝１．２４３３）がこれに該当する。これらの２つのウイルスはカルジオウイルスに属する。したがって、カルジオウイルスのＫ４およびその相同エレメントは、別個の保存された調節エレメントグループの構成が可能である。具体的に、下記Ｋ４の塩基配列のうち、下線を引いた塩基配列（ＮＣ＿００９４４８．２の７９５２番～７９８８番）は、ホモログであるブーンカルジオウイルス１のセグメント内における対応する配列（下記下線を引いた塩基配列）と７８．３８％の同一性を有する。したがって、カルジオウイルスの３’非翻訳領域内の塩基配列であり、かつ、Ｓａｆｆｏｌｄウイルス遺伝子内における７９５２～７９８８番の塩基配列と少なくとも７０％の同一性を有する塩基配列を含むホモログは、Ｋ４のようにｍＲＮＡ存在量を増加させることができることが分かる。

Ｋ４

（配列番号８２）

下線：ＮＣ＿００９４４８．２の７９５２－７９８８

Ｂｏｏｎｅ ｃａｒｄｉｏｖｉｒｕｓ １

ＴＴＣＧＧＴＴＧＡＧＣＣＣＣＣＡＣＣＣＧＧＴＡＣＡＡＣＧＣＴＴＴＡＣＣＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＣＴＡＡＧＧＴＧＴＡＣＧＣＧＧＴＣＡＴＣＧＧＧＧＡＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧＧＴＴＴＡＴＴＧＧＴＧＡＡＴＴＡＣＴＡＧＴＴＣＡＧＴＴＡＧＧＴＴＴＴＧＴＴＡＧＴＴＡＧＧ（配列番号１８７）

５．Ｋ５によるベクターおよび合成ｍＲＮＡからの遺伝子発現の増強

Ｋ５が他の分子的背景においても機能することができるかどうかをテストするために、ヒト遺伝子治療に対して低毒性で有効な遺伝子導入を可能にするパルボウイルス系統に属する一本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクター系を使用した。図４に示すように、ＷＰＲＥは、ＡＡＶ３５において遺伝子発現を増強したが、大きなサイズ（～６００ｎｔ）およびＡＶの制限されたパッケージング容量（１．７～３ｋｂ）のためＡＡＶでの用途が制限された。

最小Ｋ５（１２０ｎｔ）またはｅＫ５（１８５ｎｔ）配列及び不活性変異体（Ｋ５ｍとｅＫ５ｍ）及びＷＰＲＥを対照として評価した。ＡＡＶベクター内にＥＧＦＰコード配列の下流に、そのようなセグメントを挿入し、遺伝子発現に及ぼす影響を測定した（図４Ａ）。図４Ｂおよび図４Ｃに示すように、Ｋ５とｅＫ５によって２つとも異なる形質導入条件でＡＡＶベクターからのＧＦＰ発現が増加した。特に、ｅＫ５の効果（～３倍）は、ＷＰＲＥの効果（～２倍）よりも優れていることが確認された。これにより、ｅＫ５がパッケージングスペースを節約しながらＡＡＶベクターを大きく改善することができることを確認した。

また、レンチウイルスベクターを用いて前記実験を繰り返した。その結果、レンチウイルスベクターを用いてもＡＡＶベクターと同様にｅＫ５によりＧＦＰ発現が増加することを確認した（図１０）。

インビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡは、ＣＯＶＩＤ－１９ワクチンによって例示されるように、遺伝子送達のための別の重要なプラットフォームを示した。ＩＶＴｍＲＮＡに対するＫ５の効果をテストするために、図４Ｄに示すように、機能性ｅＫ５の有無によるルシフェラーゼコードｍＲＮＡを合成した。前記ｍＲＮＡはｃａｐ－１ホモログ、ｐｍｉｒＧＬＯベクター由来の３’非翻訳領域配列、および１２０塩基のポリ（Ａ）テールを含んでいた。前記ｍＲＮＡをＨｅＬａ細胞にトランスフェクトさせ、最大７２時間の間培養した。図４Ｅに示すように、機能的ｅＫ５がない場合、ルシフェラーゼレベルが時間の経過に伴って急激に減少して、形質導入されたｍＲＮＡの寿命が短いことを確認した。しかし、ｅＫ５が含まれているときに、発現の持続時間が急激に増加することを確認した。

ｍＲＮＡの安定化のために広く用いられるＧＦＰコード配列（ＥＧＦＰ）とα－グロビン３’ＵＴＲ（ＧＢＡ）を含むまた別のＩＶＴｍＲＮＡセットからも同様な観察が確認された。図４Ｄおよび図４Ｆに示すように、３’非翻訳領域内における位置と関係なく、ｅＫ５を含むことで、前記α－グロビン３′ＵＴＲ含有ｍＲＮＡからタンパク質産生が実質的に増加した。以上の結果から、Ｋ５はプラスミド、ＡＡＶベクター、および合成ｍＲＮＡを含めてテストしたすべての態様で活性化され、これによって、広範な調節活性および治療可能性を確認した。

６．Ｋ５のＴＥＮＴ４による混合テーリングの誘導

合成ｍＲＮＡトランスフェクションを用いた経時実験における伸長されたタンパク質の発現（図４Ｅ）は、Ｋ５が少なくとも細胞質でｍＲＮＡの安定性を増加させることによって作用することを確認した。真核生物のｍＲＮＡ安定性は、主にデアデニレーション（ｄｅａｄｅｎｙｌａｔｉｏｎ）段階で決定される。したがって、Ｋ５のメカニズムを理解するために高分解能ポリ（Ａ）テール分析（Ｈｉｒｅ－ＰＡＴ）を通じて、ポリ（Ａ）テールの長さをモニタリングした。Ｈｉｒｅ－ＰＡＴは、Ｇ／Ｉテーリングに引き続き、遺伝子特異的フォワードプライマーとポリ（Ａ）およびＧ／Ｉ配列との間のコンジュゲート部に結合するリバースプライマーとともにＲＴ－ＰＣＲを使用した。図５Ａに示すように、Ｋ５がレポーターｍＲＮＡの定常状態のポリ（Ａ）テールの長さを増加させることを確認した。これはデアデニレーションの抑制、ポリ（Ａ）テールの拡張又は両方による、ポリ（Ａ）テール調節関連メカニズムを意味する。

前記変化が末端ヌクレオチジル転移酵素（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ；ＴＥＮＴ）により触媒されるテールの拡張に関連する可能性をテストするために、ＴＥＮＴを枯渇させるとともに、Ｋ５レポーターコンストラクトでルシフェラーゼアッセイを行った。図５Ｂに示すように、ＴＥＮＴ４二重特異性抗体（ダイアボディ）（ｐａｒａｌｏｇ）（ＴＥＮＴ４ＡおよびＴＥＮＴ４Ｂ）のノックダウンは、特にＫ５レポーター発現を減少させたことに対し、他のＴＥＮＴ（ＴＥＮＴ１、ＴＥＮＴ２、ＴＥＮＴ３Ａ／Ｂ（ＴＵＴ４およびＴＵＴ７とも呼ぶ）及びＴＥＮＴ５Ａ／Ｂ／Ｃ／Ｄ）はＫ５活動に及ぼす有意な影響が認められなかった。ＴＥＮＴ４の関与をさらに検証するために、ＴＥＮＴ４酵素の化学的阻害剤であるＲＧ７８３４および不活性対照Ｒ－異性体ＲＯ０３２１を使用した。図５Ｃに示すように、Ｋ５レポーターｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、ＲＧ７８３４によって特異的に短縮されてＴＥＮＴ４が実際にＫ５機能に必要であることを確認した。

ＴＥＮＴ４Ａ（ＰＡＰＤ７、ＴＲＦ４－１およびＴＵＴ５としても知られている）およびＴＥＮＴ４Ｂ（ＰＡＰＤ５、ＴＲＦ４－２およびＴＵＴ３としても知られている）は、非アデノシン残基の間欠的な混合と共に、ポリ（Ａ）テールを延長する（「混合テーリング（ｍｉｘｅｄ ｔａｉｌｉｎｇ）」として知られたプロセス）。得られた混合テールは、主な脱アデニル化酵素複合体であるＣＣＲ４ＮＯＴでアデノシン残基を好むので、脱アデニル化を効果的に阻害して、トランスクリプトームを安定化する。混合されたテールの頻度を測定して混合テールの直接的な関与を調べるために、本発明者らはＴＡＩＬ－ｓｅｑの修正されたバージョン（これを「遺伝子特異的ＴＡＩＬ－ｓｅｑ（ＧＳ－ＴＡＩＬ－ｓｅｑ）」と命名する）を開発した。具体的には、ＲＮＡは、ビオチンとコンジュゲートされ、部分的に断片化された３’アダプターにライゲーションされた。３’末端断片は、ストレプトアビジンビーズを用いて濃縮し、アダプターに結合するプライマーで逆転写し、次いでＰＣＲによって遺伝子特異的フォワードプライマーで増幅した。前記シーケンシングデータは、Ｋ５レポーターｍＲＮＡが混合テールについて予想されるように、主に、末端および最後から２番目の位置に非アデノシン残基を有することを確認した。図５Ｄに示すように、混合されたテーリングの頻度は、ＲＧ７８３４処理後に減少し、Ｋ５がＴＥＮＴ４を介して混合テーリングを誘導することを確認した。図５Ｆに示すように、ＧＳ－ＴＡＩＬ－ｓｅｑデータは、さらに、ＲＧ７８３４処理されたセルでＫ５レポーターのポリ（Ａ）テールが短くなることを確認して、図５Ｃに示すＨｉｒｅ－ＰＡＴデータを確かめた。

また、図５Ｅ～図５Ｇに示すように、ＨｅＬａおよびＨＣＴ１１６細胞にＲＧ７８３４を処理したとき、Ｋ５及びｅＫ５レポーターのルシフェラーゼ活性およびｍＲＮＡ存在量は減少した。単一Ｇ欠失（Ｋ５ｍとｅＫ５ｍ）を含むＫ５及びｅＫ５の不活化変異は、ＲＧ７８３４によって有意な影響を受けず、特異性が立証された。これらの結果は、一緒に、ＴＥＮＴ４により触媒される混合テーリングを介してＫ５が作用するメカニズムを支持する。

しかしながら、不思議にもウイルスＲＮＡにＴＥＮＴ４を動員することが知られているアダプタータンパク質であるＺＣＣＨＣ１４がないとき、Ｋ５が完全に活性化された状態を維持することを確認した。図５Ｇに示すように、ＺＣＣＨＣ１４がレポーター発現およびテール伸長性の両方ともにおいてＫ５活性に不要であることを確認した。このようなＺＣＣＨＣ１４の依存性の欠如は、Ｋ５を認識する他の因子が存在し得ることを示唆した。

７．Ｋ５に対するホスト因子（ＺＣＣＨＣ２）の同定

潜在的なＫ５アダプターを同定するために、「ＲＮＡ－タンパク質相互作用検出（ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ；ＲａＰＩＤ）法を実施した。図５Ｈに示すように、ｅＫ５およびＢｏｘＢエレメントを含むＩＶＴｍＲＮＡをλＮペプチド融合ビオチンリガーゼであるＢＡＳＵを安定的に発現する細胞にトランスフェクトした。１６時間後、細胞を１時間の間、ビオチンで処理してＢＡＳＵが餌に関連するタンパク質をビオチン化し、次いで、細胞溶解、ストレプトアビジン捕捉およびビオチン化タンパク質の質量分析を実施した。図５Ｈに示すように、ｅＫ５を欠いた対照ＲＮＡに比べてｅＫ５含有ｍＲＮＡに濃縮されたタンパク質において核酸結合ＧＯ用語のＺＣＣＨＣ２およびＤＮＡＪＣ２１を有する２つの細胞質タンパク質を確認した（図５、表９）。

直交的に、ＨＣＭＶ１Ｅステム－ループ（ＳＬ－２．７）を餌として用いるインビトロでのＲＮＡ－プルダウン実験によって得られることができるＴＥＮＴ４複合体を調べた。その結果、１Ｅと相互作用するものとして知られているＴＥＮＴ４Ａ、ＴＥＮＴ４Ｂ、ＺＣＣＨＣ１４、ＳＡＭＤ４Ａ、Ｋ０３５５に加えて、ＺＣＣＨＣ２も見出された（図９）。ＺＣＣＨＣ２の強度が低く１Ｅ活性に必要ではないが、ＺＣＣＨＣ２は前記プルダウン実験において特異的に濃縮され、ＺＣＣＨＣ２がＴＥＮＴ４複合体の未知の構成要素であり得ることが予想された。特に、ＺＣＣＨＣ２はＲａＰＩＤおよびＲＮＡプルダウン実験の双方で、一般に濃縮された唯一のタンパク質であった。

ＺＣＣＨＣ２とｅＫ５との間の相互作用を検証するために、ＲａＰＩＤ実験に引き続いてウェスタンブロット法を行い、ｅＫ５餌に関連ＺＣＣＨＣ２を検出した（図５Ｉ）。なお、ＴＥＮＴ４Ａは、若干であるもののリッチなので、ＴＥＮＴ４Ａの方がＺＣＣＨＣ２に比べてｅＫ５との関連付けの安定性が劣ることを示している。

８．ＺＣＣＨＣ２の特徴付け

図６Ａに示すように、ＺＣＣＨＣ２は実質的に不規則な状態で長い領域、ＰＸドメインおよびＣＣＨＣ型ジンクフィンガー（ＺｎＦ_２）ドメインを有する１２６ｋＤａの特性がよく確認されていないタンパク質である。ＺＣＣＨＣ２は、ＺＣＣＨＣ１４との関連付けが低いが、１ＥおよびＰＲＥでＣＮＧＧＮペンタループと相互作用することが知られているＳＡＭドメインがないことが確認された。また、Ｃ．ｌｅｇａｎｓのｇｌｓ－１タンパク質は、ＰＸまたはＺｎＦドメインを欠いている場合でも、ＺＣＣＨＣ２と関連付けられていると予想された。ｇｌｓ－１は、以前にＴＥＮＴ４のホモログであるＧＬＤ－４と相互作用することが確認された。

ＺＣＣＨＣ２がＴＥＮＴ４に結合するかどうかをテストするために、共免疫沈降法（ｃｏ－ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ）を実施した。図６Ｂに示すように、ＺＣＣＨＣ２は、ＨｅＬａ親細胞においてＴＥＮＴ４ＡおよびＴＥＮＴ４Ｂに対する抗体とともに共免疫沈降したが、ＴＥＮＴ４Ａ／Ｂ二重ノックアウト細胞では認められなかった。この相互作用は、ＲＮａｓｅＡ処理済みの条件下で検出され、ＴＥＮＴ４とＺＣＣＨＣ２との間のＲＮＡ－非依存的な相互作用を示した。図６Ｃに示すように、細胞内分画は、ＺＣＣＨＣ２が細胞質に限定されることが示され、これは、ＺＣＣＨＣ２がＴＥＮＴ４と細胞質複合体を形成することを示唆した。参考までに、ＴＥＮＴ４タンパク質は、核と細胞質の両方ともに分布し、ＴＥＮＴ４Ａは主に細胞質に、ＴＥＮＴ４Ｂは主に核に分布した。また、３’非翻訳領域内のｅＫ５でＥＧＦＰを安定に発現するＨｅＬａ細胞株を用いてＲＮＡ免疫沈降に続いてＲＴ－ｑＰＲ（ＲＩＰ－ＱＰＣＲ）を実施した。図６Ｄに示すように、ＺＣＣＨＣ２がｅＫ５含有ＥＧＦＰのｍＲＮＡと特異的に相互作用して、図５Ｈおよび図５Ｉに示したＲａＰＩＤおよびＲＮＡプールダウン結果を再確認した。以上の結果から、ＺＣＣＨＣ２は、Ｋ５及びＴＥＮＴ４の両方と相互作用することを確認した。

次に、Ｋ５媒介調節におけるＺＣＣＨＣ２の機能を調べるために、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９でＨｅＬａ細胞においてＺＣＣＨＣ２遺伝子を切除した。前記ノックアウト（ＫＯ）によってＨｉｒｅ－ＰＡＴ分析を実施し、ポリ（Ａ）テールの長さ分布を調べた。図６Ｅに示すように、Ｋ５レポーターｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールは、親細胞に比してＺＣＣＨＣ２ ＫＯ細胞で減少した。対照的に、Ｋ５突然変異は、ＺＣＣＨＣ２ ＫＯ細胞においてそれ以上短くならず、親細胞において短いテールを有することが確認された。同様な結果が、ｅＫ５コンストラクトにおいて確認されたし、ＺＣＣＨＣ２がテール伸長の効果に重要であることを確認した。また、図６Ｆに示すように、遺伝子特異的ＴＡＩＬ－ｓｅｑ実験はＺＣＣＨＣ２ ＫＯが混合テーリングの減少をもたらすことが示されており、これによって、ＺＣＣＨＣ２がＫ５レポーターｍＲＮＡの混合テーリングに必要であることを確認した。

同じく、Ｋ５レポーターを用いたルシフェラーゼアッセイおよびＲＴ－ｑＰＣＲは、ＺＣＣＨＣ２がない場合、Ｋ５がもうレポーター発現を向上させることができないことを確認した。前記結果は、より長いｅＫ５コンストラクトを用いて確認された。図６Ｇに示すように、ＲＧ７８３４親細胞と異なり、ＺＣＣＨＣ２ ＫＯ細胞においてＫ５レポーター発現に有意な影響を及ぼさないことを確認した。以上の結果から、ＺＣＣＨＣ２がＫ５に重要なエレメントであり、かつＺＣＣＨＣ２のこの機能がＴＥＮＴ４の活動を必要とすることを確認した。

ＺＣＣＨＣ２の役割を検証するために、ＺＣＣＨＣ２－発現プラスミドをＺＣＣＨＣ２ ＫＯ細胞にトランスフェクトさせて回復実験を行った。図６Ｈに示すように、ＺＣＣＨＣ２の異所性発現は、Ｋ５及びｅＫ５コンストラクトにおけるルシフェラーゼ発現を増大させたが、変異体では増加しないことを確認した。したがって、ＺＣＣＨＣ２は実際に、Ｋ５の機能を媒介する核心要素であることを確認した。ＺＣＣＨＣ２のＺｎＦ２ドメインに変異を導入した際の変異は、ＫＯ細胞を回復させなかったし、これは、ＲＮＡ結合モチーフが重要な役割を果たすことを示した。また、図６Ａに示すように、ＺＣＣＨＣ２と関連タンパク質ＺＣＣＨＣ１４およびｇｌｓ－１との間に、高い相同性領域（以下では「ＨＳ」ともいう）を含むＮ末端２００アミノ酸を欠く欠失突然変異（ΔＮ）を生成した。図６Ｉに示すように、前記ΔＮ突然変異は、ＺＣＣＨＣ２ ＫＯ細胞の欠陥を回復することに失敗したし、ＺＣＣＨＣ２のＮ末端が重要な機能をすることを示した。

標的ＲＮＡに対するＺＣＣＨＣ２の直接的な活性をさらに確認するために、Ｋ５の代わりＢｏｘＢエレメントを含むルシフェラーゼレポーターを用いて、テザリング（ｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）実験を行った。図６Ｊに示すように、ＺＣＣＨＣ２タンパク質がλＮタグによってテザリングされたとき、レポーターの発現は特異的に上向き調節された。対照として、ＴＮＲＣ６Ｂタンパク質を付着したときに発現が減少した。図６Ｉ及び図６Ｋに示すように、回復実験において不活性状態であったＺＣＣＨＣ２ ＺｎＦ突然変異は、λＮ－ＢｏｘＢシステムを介してレポーターＲＮＡにテザリングされたときに作動することを確認した。以上の結果から、ＺｎＦ２がＲＮＡ結合モジュールとしてのみ作用し、活性化機能に必須ではないことを確認した。

次に、ＺＣＣＨＣ２のどの部分がＴＥＮＴ４動員を担当するかを確認した。図６Ａに示すように、ＦＬＡＧ－タグ付きＺＣＣＨＣ２の２つの欠失突然変異を生成したが、これらの突然変異の１つは、Ｃ末端欠失（ΔＣ、Ｎ末端の１－３７５アミノ酸を含む）を有し、もう１つはＮ末端欠失（ΔＮ、２０１－１、１７８アミノ酸を含む）を有するように調製した。図６Ｌに示すように、抗ＦＬＡＧ抗体は全長およびΔＣ ＺＣＣＨＣ２タンパク質を発現する細胞においてＴＥＮＴ４ＡおよびＴＥＮＴ４Ｂの両方ともを共沈降させ、ＴＥＮＴ４とＺＣＣＨＣ２との間の相互作用が確認された。前記結果から、ＰＸおよびＺｎＦ２ドメインを含むＣ末端部分がＴＥＮＴ４結合に必須であることを確認した。特に、図６Ｉおよび図６Ｌに示すように、ΔＮはＴＥＮＴ４ＡまたはＴＥＮＴ４Ｂと相互作用できなかったが、これは、ＺＣＣＨＣ２Ｎ末端を介してＴＥＮＴ４を動員できることを示した。前記Ｎ末端部分にはＨＳ領域が含まれており、前記ＨＳ領域はＣ． ｅｌｅｇａｎｓ（図６Ａ）においてＺＣＣＨＣ２の遠いホモログであるｇｌｓ－１のＧＬＤ４結合領域と配列が類似することを確認した。よって、ＨＳ領域はタンパク質－タンパク質相互作用を媒介する、従前に定義されていない保存されたドメインを構成することができることを確認した。

以上の結果から、ＺＣＣＨＣ２がＮ末端およびＣ末端を用いてそれぞれＴＥＮＴ４およびＫ５と相互作用することを確認した。図７に示すように、前記相互作用は、ＴＥＮＴ４でＫ５への動員を介して混合テーリングを招くことができることを確認した。また、長いポリ（Ａ）テールは、真核生物翻訳開始因子複合体（ｅＩＦ４Ｆ）の構成要素である、ｅＩＦ４Ｇと相互作用するように、十分に確立した細胞質ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰＣ）を動員して翻訳を促進することができることを確認した。相互排他的ではないが、未知の因子がＫ５およびＺＣＣＨＣ２によって誘導された翻訳活性化に関与することができることをさらに確認した。

以上の説明から、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的思想や必須的特徴を変更することなく、他の具体例として実施できるということを理解できるだろう。これと関連して、前述した実験例および実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。 本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味および範囲、並びにその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されなければならない。

以上の説明から、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明がその技術的思想や必須的特徴を変更することなく、他の具体例として実施できるということを理解できるだろう。これと関連して、前述した実験例および実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。 本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味および範囲、並びにその等価概念から導出されるすべての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈されなければならない。
（付記）
本開示は以下の態様を含む。
項目１：
ｉ）アイチウイルス１（Ａｉｃｈｉ ｖｉｒｕｓ １）遺伝子（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿００１９１８．１）のセグメントの塩基配列またはそのＲＮＡの塩基配列；または（ｉｉ）これと少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列；または（ｉｉｉ）（ｉ）の塩基配列と少なくとも５０％の相同性を有するコブウイルスの３’非翻訳領域内の塩基配列を含む、ＲＮＡ安定性又はｍＲＮＡ翻訳増強用調節エレメントであって、
前記セグメントは、アイチウイルス１遺伝子内の８２５１番のヌクレオチドから５’方向に連続する１１０個超過２５０個以下のヌクレオチドを含む、ＲＮＡ安定性又はｍＲＮＡ翻訳増強用調節エレメント。
項目２：
前記（ｉ）の塩基配列は、配列番号２０、９４、または９５の塩基配列又はそのＲＮＡの塩基配列である、項目１に記載の調節エレメント。
項目３：
前記（ｉｉｉ）の塩基配列は、コブウイルスの３’非翻訳領域内の少なくとも２つのヘアピン構造を有する塩基配列である、項目１に記載の調節エレメント。
項目４：
前記（ｉｉｉ）の塩基配列は、配列番号９８～１４０のいずれか１つの塩基配列またはそのＲＮＡの塩基配列である、項目１に記載の調節エレメント。
項目５：
前記（ｉｉ）の塩基配列は、配列番号２０の塩基配列１～１４のいずれか１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は両方ともを有する塩基配列またはそのＲＮＡの塩基配列である、項目１に記載の調節エレメント。
項目６：
前記調節エレメントは、ＲＮＡの安定性およびｍＲＮＡ翻訳を増強させてタンパク質の発現を増加させる、項目１に記載の調節エレメント。
項目７：
前記調節エレメントは、ＴＥＮＴ４と相互作用するＺＣＣＨＣ２と相互作用して、ポリ（Ａ）テールの長さの増加、ポリ（Ａ）テールの安定性の増加、又はその両方ともを誘導する、項目１に記載の調節エレメント。
項目８：
標的タンパク質の遺伝子と、その３’非翻訳領域に項目１～７のいずれか一項に記載の調節エレメントとを含む、コンストラクト。
項目９：
前記標的タンパク質がレポーター、生理活性ペプチド、抗原、または抗体またはその断片から選択される、項目８に記載のコンストラクト。
項目１０：
前記コンストラクトは、ｍＲＮＡコンストラクトである、項目８に記載のコンストラクト。
項目１１：
項目８に記載のコンストラクトを含む、ベクター。
項目１２：
項目８に記載のコンストラクトまたは該コンストラクトを含むベクターを含む、組換え宿主細胞。
項目１３：
前記宿主細胞は、ＺＣＣＨＣ２またはそれをコードする遺伝子と、ＴＥＮＴ４またはそれをコードする遺伝子と、またはこれらの組み合わせをさらに含む、項目１２に記載の組換え宿主細胞。
項目１４：
項目８に記載のコンストラクトと、前記コンストラクトを含むベクターと、若しくは前記コンストラクト又はベクターを含む組換え宿主細胞とを含む、組成物。
項目１５：
前記組成物は、疾病の予防又は治療と、若しくはｍＲＮＡコンストラクト又は標的タンパク質を製造するためのものである、項目１４に記載の組成物。
項目１６：
前記コンストラクト又はベクターは、ＺＣＣＨＣ２をコードする遺伝子と、ＴＥＮＴ４をコードする遺伝子と、若しくはこれらの組み合わせとをさらに含むか、または
前記組換え宿主細胞または組成物は、ＺＣＣＨＣ２またはそれをコードする遺伝子と、ＴＥＮＴ４又はそれをコードする遺伝子と、若しくはこれらの組み合わせとをさらに含む、項目１４に記載の組成物。
項目１７：
項目１～７のいずれか一項に記載の調節エレメントと相互作用するＺＣＣＨＣ２またはそれをコードする遺伝子を含む、ＲＮＡの安定性又はｍＲＮＡ翻訳増強用組成物。
項目１８：
前記組成物は、ポリ（Ａ）テールの長さの増加、ポリ（Ａ）テールの安定性の増加又はその両方ともを誘導して、ＲＮＡの安定性またはｍＲＮＡ翻訳を増強させる、項目１７に記載の組成物。
項目１９：
前記組成物は、ＴＥＮＴ４またはそれをコードする遺伝子をさらに含む、項目１７に記載の組成物。

Claims (19)

1. （ｉ）アイチウイルス１（Ａｉｃｈｉ ｖｉｒｕｓ １）遺伝子（ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＣ＿００１９１８．１）のセグメントの塩基配列またはそのＲＮＡの塩基配列；または（ｉｉ）これと少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列；または（ｉｉｉ）（ｉ）の塩基配列と少なくとも５０％の相同性を有するコブウイルスの３’非翻訳領域内の塩基配列を含む、ＲＮＡ安定性又はｍＲＮＡ翻訳増強用調節エレメントであって、
   前記セグメントは、アイチウイルス１遺伝子内の８２５１番のヌクレオチドから５’方向に連続する１１０個超過２５０個以下のヌクレオチドを含む、ＲＮＡ安定性又はｍＲＮＡ翻訳増強用調節エレメント。
2. 前記（ｉ）の塩基配列は、配列番号２０、９４、または９５の塩基配列又はそのＲＮＡの塩基配列である、請求項１に記載の調節エレメント。
3. 前記（ｉｉｉ）の塩基配列は、コブウイルスの３’非翻訳領域内の少なくとも２つのヘアピン構造を有する塩基配列である、請求項１に記載の調節エレメント。
4. 前記（ｉｉｉ）の塩基配列は、配列番号９８～１４０のいずれか１つの塩基配列またはそのＲＮＡの塩基配列である、請求項１に記載の調節エレメント。
5. 前記（ｉｉ）の塩基配列は、配列番号２０の塩基配列１～１４のいずれか１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は両方ともを有する塩基配列またはそのＲＮＡの塩基配列である、請求項１に記載の調節エレメント。
6. 前記調節エレメントは、ＲＮＡの安定性およびｍＲＮＡ翻訳を増強させてタンパク質の発現を増加させる、請求項１に記載の調節エレメント。
7. 前記調節エレメントは、ＴＥＮＴ４と相互作用するＺＣＣＨＣ２と相互作用して、ポリ（Ａ）テールの長さの増加、ポリ（Ａ）テールの安定性の増加、又はその両方ともを誘導する、請求項１に記載の調節エレメント。
8. 標的タンパク質の遺伝子と、その３’非翻訳領域に請求項１～７のいずれか一項に記載の調節エレメントとを含む、コンストラクト。
9. 前記標的タンパク質がレポーター、生理活性ペプチド、抗原、または抗体またはその断片から選択される、請求項８に記載のコンストラクト。
10. 前記コンストラクトは、ｍＲＮＡコンストラクトである、請求項８に記載のコンストラクト。
11. 請求項８に記載のコンストラクトを含む、ベクター。
12. 請求項８に記載のコンストラクトまたは該コンストラクトを含むベクターを含む、組換え宿主細胞。
13. 前記宿主細胞は、ＺＣＣＨＣ２またはそれをコードする遺伝子と、ＴＥＮＴ４またはそれをコードする遺伝子と、またはこれらの組み合わせをさらに含む、請求項１２に記載の組換え宿主細胞。
14. 請求項８に記載のコンストラクトと、前記コンストラクトを含むベクターと、若しくは前記コンストラクト又はベクターを含む組換え宿主細胞とを含む、組成物。
15. 前記組成物は、疾病の予防又は治療と、若しくはｍＲＮＡコンストラクト又は標的タンパク質を製造するためのものである、請求項１４に記載の組成物。
16. 前記コンストラクト又はベクターは、ＺＣＣＨＣ２をコードする遺伝子と、ＴＥＮＴ４をコードする遺伝子と、若しくはこれらの組み合わせとをさらに含むか、または
    前記組換え宿主細胞または組成物は、ＺＣＣＨＣ２またはそれをコードする遺伝子と、ＴＥＮＴ４又はそれをコードする遺伝子と、若しくはこれらの組み合わせとをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
17. 請求項１～７のいずれか一項に記載の調節エレメントと相互作用するＺＣＣＨＣ２またはそれをコードする遺伝子を含む、ＲＮＡの安定性又はｍＲＮＡ翻訳増強用組成物。
18. 前記組成物は、ポリ（Ａ）テールの長さの増加、ポリ（Ａ）テールの安定性の増加又はその両方ともを誘導して、ＲＮＡの安定性またはｍＲＮＡ翻訳を増強させる、請求項１７に記載の組成物。
19. 前記組成物は、ＴＥＮＴ４またはそれをコードする遺伝子をさらに含む、請求項１７に記載の組成物。