CN104212821A - Bcr-abl 融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种BCR-ABL融合蛋白突变体编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，还提供了包含该核苷酸序列的表达载体及其构建方法；还提供了一种BCR-ABL融合蛋白突变体，该突变体是基于BCR-ABL/c-ABL SH3结构域位点突变而设计，位于ABL SH3结构79位的苏氨酸突变为酪氨酸，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2。构建的BCR-ABL融合蛋白突变体竞争性结合RIN1，直接阻滞和减少胞内RIN1与BCR-ABL的结合，联合IM作用，进而增加细胞对IM的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡，同时克服了直接敲除RIN1基因引发的潜在并发症。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及BCR-ABL融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体及其构建方法，还涉及该BCR-ABL融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体在治疗慢性粒细胞白血病中的应用。
背景技术
BCR-ABL融合蛋白具有异常激活的酪氨酸激酶活性，是慢性粒细胞白血病(Chronic myelogenous leukemia，CML)的典型标志，大于90％的CML病人表达BCR-ABL融合基因，而正常细胞中不表达BCR-ABL融合蛋白，且ABL位于胞核，RIN1主要定位胞浆。位于ABL段的SH3结构与BCR-ABL蛋白激酶活性激活有着直接的关系，可负向调控BCR-ABL的活性，其关键位点的突变或结合配体的改变均可引起伊马替尼(Imatinib，IM)耐药。酪氨酸激酶抑制剂IM，在CML的治疗中有可喜的成效，是治疗CML的里程碑，但是由于BCR-ABL激酶区T315I突变等原因，造成临床15％-20％病人对IM耐药，给CML的治疗带来一定困难，因此，解决IM耐药的问题已经成为CML研究的热点之一。
研究发现，RIN1蛋白——Ras抑制因子1，是ABL的一个直接的激活因子并且控制对IM敏感的调定点。该蛋白通过自身富含脯氨酸的序列(PPAVPPPPVP)与ABL的SH3(PxxP motif)高特异性低亲和力的结合，降低细胞对IM的敏感性，且RIN1与BCR-ABL的结合不受T315I突变的影响，亦不受除SH3、SH2和TKD以外的Abl结构域的影响。不同的慢性粒细胞白血病细胞株中RIN1蛋白的表达不同，这种表达的不同影响细胞株对IM的敏感性。例如，耐药慢粒细胞株KCL22高表达RIN1蛋白，而对IM敏感的细胞株中RIN1表达较低，而K562细胞表达较低对IM敏感。
目前，关于RIN1在CML方面的研究，主要包括：1.RNA干扰或者基因敲除后，和/或联合IM，分析ABL激酶活性、ABL磷酸化底物水平的变化以及相关的信号通路的研究；2.利用RIN1ABD结构域靶向结合ABL的功能，在RIN1蛋白上连接有功能的酶、核定位信号 等功能片段，或者基因突变该结构，从而达到抑制ABL酪氨酸激酶活性的目的。以上方法，不能直接阻抑RIN1和BCR-ABL的结合，且RIN1在不同的细胞中表现不同的生理功能，如在乳腺细胞中RIN1是抑癌基因，因此敲掉后可能会诱发乳腺癌的发生。
发明内容
本发明的目的是提供一种BCR-ABL融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体及其构建方法。
本发明的另一目的是提供该BCR-ABL融合蛋白突变体及其编码基因、表达载体在治疗慢性粒细胞白血病中的应用。
为了实现本发明目的，本发明提供的一种BCR-ABL融合蛋白突变体编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示：
AACCTTTTCGTTGCACTGTATGATTTTGTGGCCAGTGGAGATAACTATCTAAGCATAACTAAAGGTGAAAAGCTCCGGGTCTTAGGCTATAATCACAATGGGGAATGGTGTGAAGCCCAAACCAAAAATGGCCAAGGCTGGGTCCCAAGCAACTACATCACGCCA
本发明还提供了含有所述核苷酸序列SEQ ID NO:1的表达载体。
所述表达载体为将所述的核苷酸序列SEQ ID NO:1插入穿梭质粒pAd-Track-CMV后与骨架质粒pAd-Easy-1重组得到。
本发明还提供了构建所述含有核苷酸序列SEQ ID NO:1的表达载体的方法，包括如下步骤：
(1)采用重叠延伸PCR方法进行扩增得到核苷酸序列SEQ ID NO:1的片段，包括三个反应体系：PCR1，PCR2和PCR3；PCR1以野生型ABL SH3为模板，上下游引物为F/Rm3；PCR2以野生型ABL SH3为模板，上下游引物为R/Fm3；PCR3以PCR1和PCR2的反应产物作为模板，上下游引物为F/R；所述引物序列为：
F:5'-GCGTCGACAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATT-3',
R:5'-CCGCTCGAGTCATGGCGTGATGTAGTTGCTTGG-3',
Rm3:5'-ATTCCCCATTGTGAATATAGCCTAAGACCC-3,
Fm3:5'-GTGGAGATAACtatCTAAGCATAACTAA-3'；
(2)将步骤1得到的核苷酸序列为SEQ ID NO:1的片段和穿梭质粒pAd-Track-CMV经限制性内切酶Sal Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后，连接构建重组质粒；
(3)将步骤2得到的重组质粒经EcoR I酶切后与骨架质粒pAd-Easy-1连接构成重组腺病 毒载体。
本发明还提供了BCR-ABL融合蛋白突变体，所述的突变体是基于BCR-ABL/c-ABL SH3结构域位点突变而设计，位于ABL SH3结构79位的苏氨酸突变为酪氨酸，所述BCR-ABL融合蛋白突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:2，其序列为：
NLFVALYDFVASGDNYLSITKGEKLRVLGYNHNGEWCEAQTKNGQGWVPSNYITP
更进一步地，本发明还提供了：所述的核苷酸序列SEQ ID NO:1在制备多种治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用；含有核苷酸序列SEQ ID NO:1的表达载体在制备多种治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用；氨基酸序列为SEQ ID NO:2的BCR-ABL融合蛋白突变体在制备多种治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。
本发明的有益效果是：本发明通过计算机模拟构建基于BCR-ABL/c-ABL SH3结构域位点突变的BCR-ABL融合蛋白突变体结构，设计该突变体编码基因的引物扩增得到目的基因片段，构建了含有编码该BCR-ABL融合蛋白突变体基因序列的表达载体。构建的BCR-ABL融合蛋白突变体竞争性结合RIN1，直接阻滞和减少胞内RIN1与BCR-ABL的结合，联合IM作用，进而增加细胞对IM的敏感性，促进肿瘤细胞凋亡，同时克服了直接敲除RIN1基因引发的潜在并发症。肿瘤细胞中，构建的BCR-ABL融合蛋白突变体，直接封闭RIN1与BCR-ABL结合的结构域，不影响其他结合域，有利于RIN1其他生物学功能的发挥；该突变体与RIN1的作用，不受T315I突变的影响，克服了单纯使用IM时，T315I突变引起的耐药。本发明为CML治疗和解决耐药问题奠定了小分子基础，提供了新的选择。
附图说明
图1为突变体M3结构示意图。
图2为重组腺病毒载体构建示意图。
图3为免疫共沉淀验证M3和RIN1的相互作用。
图4为Western blot检测突变体M3单独作用CML细胞株的有效性；图4A为对KCL22细胞作用，图4B为对K562/G01细胞作用，图4C为对K562细胞作用。
图5为M3联合IM作用对CML细胞增殖的影响；图5A为对KCL22细胞增殖的影响，图5B为对K562细胞增殖的影响。
图6为流式细胞术检测细胞凋亡。
图7为流式细胞术检测细胞周期。
图8为突变体M3联合IM作用CML细胞株对BCR-ABL及底物磷酸化水平、BCR-ABL 下游信号通路相关蛋白的表达的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
试验材料和试剂：
1、实验所用细胞株：
2、实验试剂：
LB培养基：胰酵母提取物，蛋白胨，NaCl按照质量比1：2：2的比例称量后溶解于适量双蒸水中，调pH到7.3，定容，121℃高压灭菌15min，4℃保存。
TBS-T：含0.05％的Tween-20的1×TBS溶液。
3、实验分组：
实验组：突变体M3：ABL SH3结构域单位点正义突变，位于79位的T突变为Y，计算机模拟特异性结合RIN1。构建包含突变体M3的重组腺病毒载体，作用CML细胞株。
对照组：M0：ABL SH3野生型
突变体M1：ABL SH3结构域单位点反义突变，位于99位的W突变为R，计算机模拟不结合RIN1。构建包含突变体M1的重组腺病毒载体，作用CML细胞株。
突变体M2：ABL SH3结构域单位点正义突变，位于94位的N突变为W，计算机模拟结合RIN1。构建包含突变体M2的重组腺病毒载体，作用CML细胞株。
突变体M4：ABL SH3结构域双位点正义突变，位于79位T和94位N分别突变为Y和W，计算机模拟结合RIN1。构建包含突变体M4的重组腺病毒载体，作用CML细胞株。
空载组(T)：不含目的片段的重组腺病毒载体，作用CML细胞株。
PBS组(N)：使用PBS处理CML细胞株。
实施例1计算机模拟技术构建突变体结构及结合能力分析
根据蛋白结构数据库PDB中ABL SH3结构(ID:3EG2，chainsA，ABL60-121位，全长62个氨基酸)，将114位的谷氨酰胺(Q)突变为天冬酰胺(N)将其变回野生型的ABL SH3结构，将野生型的ABL SH3结构79位的苏氨酸突变为酪氨酸得到突变体M3(T79Y)，其结构如图1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
通过PepSite2软件分析RIN1富含脯氨酸的结构域与ABL SH3结构域结合的关键氨基酸， 这些关键氨基酸包括：Pro、Asn、Phe、Trp、Tyr，这些氨基酸具有共同的结构特征即含有苯环(Pro、Phe、Trp、Tyr)或类苯环(Asn)。
使用PyMOL1.6和VMD1.8.7完成点突变和图像可视化，NAMD2.6软件在Amber力场下进行突变体的分子动力学模拟建立新的突变的ABL SH3结构。主要的方法为：将蛋白溶解在一个正六面体的水盒子中，所用的溶剂模型为TIP3P水分子模型。动力学模拟过程对溶解后的体系进行了优化。先固定蛋白，优化溶剂5000步，然后放开体系再优化10000步。整个系统在500个ps内温度从0K逐渐升至300K，长程静电相互作用的计算采用particle mesh Ewald(PME)算法。模拟过程中，积分时间步长取2fs，动力学快照每500步(1ps)输出一次。非键相互作用的截止值(cut-off)为非键作用列表每10步更新一次。每个体系的模拟温度都控制在300K，压力控制在1.0个大气压。所有的动力学模拟均在第三军医大学生物信息学平台完成。用PepSite2在线软件分析稳定的突变体结构和RIN1蛋白的结合能力，选择结合能力高的突变体M3展开实验研究。
实施例2突变基因片段的获得
(1)引物设计及合成
根据NCBI GenBank中ABL基因序列(序列号NC_000009.12)中的SH3片段，Primer5.0软件设计M0、M1、M2、M3、M4的PCR引物，Blast比对之后，引物由上海英俊(Invitrogen)生物有限公司合成。其中，ABL SH3野生型(M0)扩增引物(也是重叠延伸PCR外侧引物)上游5’端包含Sal Ⅰ酶切位点，下游引物含Xho Ⅰ酶切位点和终止密码子，引物序列中加框处为终止密码子，粗斜体为酶切位点，小写字母为突变位点。引物序列和突变点见表1。
表1ABL SH3野生型和突变体PCR扩增引物序列
(2)ABL SH3野生型(M0)PCR扩增
pMig210质粒(含BCR-ABL p210)作为ABL SH3野生型(M0)扩增的模板，M0反应体系如下：
PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃，30s；55℃，30s；72℃，20s，共30个循环；72℃，延伸10min；4℃，2h。PCR产物经凝胶回收试剂盒纯化后-20℃保存。
(3)ABL SH3突变体PCR扩增
ABL SH3突变体采用重叠延伸PCR进行扩增，包括三个反应体系：PCR1，PCR2和PCR3。PCR1和PCR2反应旨在带入突变的碱基，前述表1中扩增引物F和R分别和标记有“m”的带突变点的引物配对使用，即F/Rm1，R/Fm1，以此类推。PCR1和PCR2反应体系如下：
各突变体PCR1和PCR2反应对应的引物对为：
每条引物对应的序列如表1所示。
PCR1和PCR2的反应条件：98℃预变性1min；98℃，10s；55℃，15s；72℃，15s，共20个循环；72℃，延伸10min；4℃，2h。
PCR3反应实质上是将PCR1和PCR2产物进行拼接，带入突变位点形成全长的ABL SH3突变体，除模板改为PCR1和PCR2纯化回收产物(PCR1和PCR2纯化回收产物各一半作为模板)外,反应体系和条件与ABL SH3野生型(M0)相同。PCR产物经凝胶回收试剂盒纯化后-20℃保存。
实施例3重组腺病毒载体构建
(1)目的基因克隆入穿梭载体
将实施例2中获得的M0、M1、M2、M3、M4的重叠延伸PCR纯化产物即全长的ABL SH3突变体分别克隆入穿梭载体pAdTrack-CMV载体中。
①实施例2中的PCR纯化产物和pAdTrack-CMV载体分别经内切酶Sal Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切，37℃，过夜；
②酶切产物纯化回收，T4DNA连接酶连接，16℃，连接过夜；
③测定连接产物浓度，取100ng转化由CaCl2法制备的DH5α感受态，在含有卡那霉素的LB平板上培养，37℃，12h；
④挑取单克隆，增菌后提取质粒，同时-80℃保存菌种；
⑤使用ABLSH3野生型(M0)的引物进行PCR扩增鉴定目的片段，取PCR阳性结果测序，测序返回阳性结果的用于重组腺病毒载体的构建。
(2)重组腺病毒载体构建，鉴定
①EcoR Ⅰ酶切前述步骤得到的含目的基因的穿梭载体，37℃，过夜；
②酶切产物纯化及浓度测定后，取100ng转化由CaCl2法制备的含pAdEasy-1的BJ5183 感受态，在含有卡那霉素的LB平板上培养，37℃，16-20h；
③挑取单克隆，增菌后提取质粒，同时-80℃保存菌种；
④Pac Ⅰ酶切鉴定。经由Pac Ⅰ酶切后，1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，重组成功的腺病毒载体被切成两个片段：大片段(与骨架载体质粒平齐，约30kb)和小片段(3kb或者4.5kb)。
(3)重组腺病毒载体包装、扩增及鉴定
①转染前6-15h将AD293细胞接种到1个25cm2的组织培养瓶中，以每个培养瓶接种2×106个细胞为宜；
②取10ug前述步骤获得的重组腺病毒载体经Pac Ⅰ酶切线性化，纯化酶切产物，浓度测定后-20℃保存备用；
③在500μl Opti-MEM中加入3μg步骤2得到的酶切质粒和15μl LipofectamineTM2000脂质体试剂，将DNA/LipofectamineTM2000脂质体混合物于室温孵育15-30min，随后轻柔的逐滴加入融合度达到40％-50％的AD293细胞培养瓶中，同时加入2.5ml Opti-MEM，37℃，5％CO2孵箱孵育；
④4-6h后移去含DNA/LipofectamineTM2000脂质体混合液的培养基，加入7-10ml新鲜DMEM完全培养基；
⑤通过荧光显微镜观察GFP表达来监测转染效率和病毒产量。转染细胞置于37℃、5％CO2孵箱培养14-20天。待细胞发生病变时，收集细胞悬液，离心弃上清后，重复“冷冻-融化-涡旋振荡”过程四次，使病毒从细胞中释放出来，离心收集病毒，分装后-80℃保存。获得的1代病毒用于后续病毒的扩增；
⑥感染前6-15h在两个75cm2培养瓶中接种AD293细胞，当细胞融合度达80％-90％时，每瓶加入30％的1代病毒转染，当30％-50％感染细胞脱落时，收集细胞悬液，离心弃上清后，重复“冷冻-融化-涡旋振荡”过程四次，使病毒从细胞中释放出来，离心收集病毒，分装后-80℃保存。经过3-4轮扩增后，获得高滴度的重组腺病毒。
⑦重组腺病毒载体鉴定：取第一代收获的病毒5μl，加入10μl蛋白酶K(2mg/ml)，55℃孵育1h，再煮沸5min，离心后取上清1-2μl，PCR鉴定。反应体系和条件同ABL SH3野生型(M0)PCR。
重组腺病毒载体构建示意图如图2所示。
实施例4免疫共沉淀检测M1、M3和M4和RIN1的相互作用
将突变体M3单独作用细胞KCL22验证和RIN1的结合，同时设置对照组：M1，M4和空载组(T)作用KCL22细胞。按照如下步骤操作：
⑴将KCL22细胞按照2×106个/瓶，接种到25cm2的培养瓶中。取适量M1、M3和M4加入细胞培养瓶，按照1:1000的体积比加入ploybrene(聚凝胺)，作用72h后，收集全部细胞于10ml离心管中，1500rpm离心10min，弃上清，PBS清洗细胞2次，1500rpm离心10min，弃上清。阴性对照组：空载T，作用方式同M1；
(2)按照ProFound TM HA Tag IP/Co-IP试剂盒说明书操作，提取蛋白后将蛋白转入试剂盒配套的收集管中，加入6μl HA标记的凝胶吸附珠，密封后4℃振摇6h，4℃，12000rpm离心10s；
(3)将收集管用500μl TBS-T洗涤三次，4℃，12000rpm离心10s；
(4)在收集管中加入25μl2×sample buffer，95℃水浴5min，4℃，12000rpm离心10s，收集离下的液体，-20℃保存备用。
(5)制备8％的SDS-PAGE胶，使用RIN1抗体1:500稀释，检测M1、M3和M4和RIN1的相互作用。结果如图3所示，M1不结合RIN1，M3竞争性结合RIN1，M4结合RIN1。说明M3可以特异性结合RIN1蛋白。
实施例5Western blot分析突变体M3单独作用CML细胞株效应
利用Western blot分析突变体M3单独作用CML细胞株562、KCL22和K562/G01的效应，同时设置对照组，对照组分别使用PBS组(N)、空载组(T)、野生型(M0)及突变体M1、M2、M4处理CML细胞。按照如下步骤操作：
⑴K562、KCL22和K562/G01细胞，按照1×106个/孔铺6孔板，分别加入M3突变体腺病毒感染细胞，作用72h。
⑵收集细胞于10ml离心管，预冷PBS洗涤两次，每次1500rpm，5min。弃上清，将沉淀转入1.5ml Epp管中，加入1ml预冷PBS洗涤一次，5000rpm，5min；
⑶弃上清，加入RIPA裂解液(蛋白酶抑制剂PMSF和磷酸化蛋白酶抑制剂NaF、Na3VO4按照1:100的比例混合)，冰上裂解10min，4℃，12000rpm离心10min，收集上清，-80℃储存备用；
⑷测定蛋白浓度后，取60ug蛋白与5×SDS-PAGE上样缓冲液混匀后沸水浴5min后，转置冰上；
⑸分别配置浓度为6％和8％的SDS-PAGE胶电泳。浓缩胶浓度为5％。浓缩胶，80V，电泳时间为30min；分离胶，120V电泳时间约为90min；
⑹转膜：p-Bcr-Abl磷酸化蛋白和总蛋白采用半干转，p-Stat5/Stat5和Crkl/p-Crkl蛋白为湿转。半干转转摸条件：100mA恒流，60min；湿转条件：210mA恒流，80min。PVDF膜的位置甲醇中浸泡至半透明但不超过30s，转入转膜缓冲液中浸泡。
⑺封闭：转膜结束后，将PVDF膜用TBS-T漂洗约5min，转入5％脱脂奶粉的封闭液中，4℃封闭4-6h；
⑻孵育一抗：PVDF膜用TBS-T洗涤3次，每次5min，适量稀释好的一抗孵育，4℃过夜；
⑼孵育二抗：PVDF膜用TBS-T液洗涤3次，每次5min，适量稀释好的二抗孵育，室温孵育1h。
⑽蛋白检测：PVDF膜用TBS-T液洗涤3次，每次5min，ECL发光液Bio-Rad凝胶成像系统检测。β-actin为内参照。
结果表明，针对K562(图4C所示)、KCL22细胞(图4A所示)，与野生型(M0)和空载组(T)作用比较，M3明显抑制BCR-ABL和Stat5磷酸化及总蛋白的表达，抑制Crkl磷酸化蛋白表达但对总蛋白无影响；针对K562/G01细胞(图4B所示)，与M0和T比较，M3较M1，M4效果明显，抑制BCR-ABL和Stat5磷酸化及总蛋白的表达。进一步表明，单独使用突变体M3可以抑制BCR-ABL和底物磷酸化水平。
实施例6突变体M3联合IM作用对CML细胞增殖、凋亡和周期的影响
将突变体M3联合3μM IM作用KCL22及K562细胞，通过MTT、瑞氏染色和流式细胞术观察其对慢粒细胞增殖、形态学、细胞凋亡和周期阻滞的作用。同时设置对照组：PBS组(N)、M1/M1+IM组、和IM组。M1/M1+IM组：为突变体M1单独及联合IM作用；IM组：IM单独作用。
(1)MTT检测突变体M3联合IM作用对K562和KCL22细胞增殖的影响
K562和KCL22细胞，按照1×104个/孔，铺96孔板。M3先加入96孔板细胞培养板，按照1:1000的体积比加入ploybrene，分别作用0h、24h和36h后，再加入3μM IM共同作用24h。同时设置对照组：PBS，M1+IM和T+IM，IM处理细胞；避光加入2mg/ml MTT，37℃、5％CO2孵4h，取出，2000rpm，离心15min，弃上清，每孔加入100μl DMSO，酶标仪检测570nm处的吸光度值。
(2)光镜观察细胞形态变化
①K562和KCL22细胞，按照1×106个/孔，铺6孔板。M1和M3先加入6孔板细胞培养板，按照1:1000的体积比加入ploybrene，作用48h后，再加入3μM IM共同作用24h。同时设置对照组：PBS，M1+IM，M1，IM处理细胞；
②收集全部细胞于10ml离心管中，1500rpm离心10min，弃上清，PBS清洗细胞2次，1500rpm离心10min，尽量去除上清，取2～4μl细胞悬液涂片，晾干后，常规瑞氏染色，显微镜下观察细胞形态的变化，照相并保存结果。
(3)流式细胞术检测细胞凋亡
①K562和KCL22细胞，按照1×106个/孔，铺6孔板。M3先加入6孔板细胞培养板，按照1:1000的体积比加入ploybrene，作用48h后，再加入3μM IM共同作用24h。同时设置对照组：PBS，M1+IM，M1，IM处理细胞；
②收集全部细胞于10ml离心管中，1500rpm离心10min，弃上清，预冷PBS清洗细胞2次，1500rpm离心10min，弃上清；
③用200μl binding buffer悬浮细胞，转入流式管中。每管加入5μl Annexin V-PE混合后，再加入5μl7-AAD，混匀,室温避光反应10min，流式细胞仪检测。
(4)流式细胞术检测细胞周期
①K562和KCL22细胞，按照1×106个/孔，铺6孔板。M1和M3先加入6孔板细胞培养板，按照1:1000的体积比加入ploybrene，作用48h后，再加入3μM IM共同作用24h。同时设置对照组：PBS，M1+IM，M1，IM处理细胞；
②收集全部细胞于10ml离心管中，1500rpm离心10min，弃上清，预冷PBS清洗细胞2次，1500rpm离心10min，弃上清；
③加入1ml预冷的70％的乙醇，转入1.5ml的Epp管中，4℃固定过夜，上机前用PBS洗涤细胞去乙醇，加入终浓度为50μg/ml PI(含50μg/ml RNase)染液，室温避光孵育30min，流式细胞仪检测。
检测结果数值以表示，应用SPSS16.0软件进行方差分析(ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。结果表明，M3联合IM作用显著抑制KCL22细胞(图5A所示)和K562细胞(图5B所示)增殖，与IM组比较存在统计学意义(P<0.05)，且72h作用效果较好；瑞氏染色结果可见核碎裂、聚集，胞浆空泡等现象。流式细胞术检测凋亡可见(图6所示)，与IM单独使用时比较，M3联合IM作用凋亡率明显增高，有统计学意义(P<0.05)；细胞周期阻滞在S期(图7所示)，与IM单独使用比较，有统计学意义(P<0.05)。以上结果表明，M3突变体联合IM作用能有效的抑制CML细胞增殖，促进细胞凋亡，效果优于IM单 独作用。
实施例7突变体M3联合IM作用CML细胞株对BCR-ABL及底物磷酸化水平、BCR-ABL下游信号通路相关蛋白的表达的影响
将突变体M3联合3μM IM作用KCL22及K562细胞，分析联合作用对BCR-ABL及底物磷酸化水平的影响，以及BCR-ABL下游信号通路：Jak2/stat5、PI3K/Akt和Erk信号通路的影响。同时设置对照组：Control组、T+IM组、M1/M4+IM组和IM组。Control组：PBS处理细胞；T+IM组：空载(T)联合IM作用；Control组和T+IM组均为阴性对照。M1/M4+IM组：为突变体M1/M4联合IM作用；IM组：IM单独作用。
结果表明(图8所示)，突变体M3联合IM作用影响BCR-ABL下游信号通路相关蛋白的表达，进而抑制CML细胞增殖，促进凋亡，说明联合用药效果优于IM单独使用，为临床解决耐药问题提供小分子参考。
实施例8突变体M3联合IM对CML细胞骨架重建的影响
将突变体M1、M3联合3μM IM作用KCL22后，γ-tubulin观察微管蛋白(FITC标记二抗检测γ-tubulin结合微管蛋白)，TRITC标记的鬼笔环肽(phalloidin)观察微丝蛋白，DAPI染细胞核。同时设置对照组：N组：PBS处理细胞；T组：空载；M1/M1+IM组：为突变体M1单独及联合IM作用；IM组：IM单独作用。按照如下步骤操作：
(1)K562或KCL22细胞，按照1×106个/孔，铺6孔板。M1和M3先加入6孔板细胞培养板，按照1:1000的体积比加入ploybrene，作用48h后，再加入3μM IM共同作用24h；
(2)收集全部细胞于10ml离心管中，500rpm离心10min，弃上清，PBS清洗细胞2次，500rpm离心10min，尽量去除上清，取2～4μl细胞悬液涂片，晾干；
(3)固定、透化、封闭、一抗和二抗孵育。一抗γ-tubulin稀释比为1:50，二抗FITC标记的羊抗兔IgG稀释比为1:200；
(4)二抗孵育完成后，PBS洗涤三次，每次5min，避光操作；10％正常山羊血清以1:1000稀释TRITC标记的鬼笔环肽，取适量覆盖细胞，37℃孵育1h，PBS洗涤三次，每次5min，避光操作；
(5)DAPI原液1:500稀释，取适量覆盖细胞，室温避光孵育10min，PBS洗涤三次，每次5min；50％甘油封片，荧光显微镜观察，照相，保存。
结果表明，与单独用药比较，联合用药细胞骨架微丝或者微管蛋白出现明显的聚集，且有边缘化或者向中间聚集的现象，提示IM联合M3可能通过影响细胞骨架重排促进细胞死亡。
Claims (8)
1.一种BCR-ABL融合蛋白突变体编码基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.一种含有权利要求1所述核苷酸序列的表达载体。
3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体为将权利要求1所述的核苷酸序列插入穿梭质粒pAd-Track-CMV后与骨架质粒pAd-Easy-1重组得到。
4.一种构建权利要求2或3所述的表达载体的方法，其特征在于：该构建方法包括如下步骤：
(1)采用重叠延伸PCR方法进行扩增得到核苷酸序列SEQ ID NO:1的片段，包括三个反应体系：PCR1，PCR2和PCR3；PCR1以野生型ABLSH3为模板，上下游引物为F/Rm3；PCR2以野生型ABLSH3为模板，上下游引物为R/Fm3；PCR3以PCR1和PCR2的反应产物作为模板，上下游引物为F/R；所述引物序列为：
F:5'-GCGTCGACAACCTTTTCGTTGCACTGTATGATT-3',
R:5'-CCGCTCGAGTCATGGCGTGATGTAGTTGCTTGG-3',
Rm3:5'-ATTCCCCATTGTGAATATAGCCTAAGACCC-3,
Fm3:5'-GTGGAGATAACtatCTAAGCATAACTAA-3'；
(2)将步骤1得到的核苷酸序列为SEQIDNO:1的片段和穿梭质粒pAd-Track-CMV经限制性内切酶Sal Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切后，连接构建重组质粒；
(3)将步骤2得到的重组质粒经EcoR I酶切后与骨架质粒pAd-Easy-1连接构成重组腺病毒载体。
5.一种BCR-ABL融合蛋白突变体，其特征在于：所述的突变体是基于BCR-ABL/c-ABLSH3结构域位点突变而设计，位于ABL SH3结构79位的苏氨酸突变为酪氨酸，所述BCR-ABL融合蛋白突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
6.权利要求1所述的核苷酸序列在制备多种治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。
7.权利要求2或3所述的表达载体在制备多种治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。
8.权利要求5所述的融合蛋白突变体在制备多种治疗慢性粒细胞白血病的药物中的应用。
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