JP2025504473A - 乳由来のエキソソームを有効成分として含む腸の健康機能改善用組成物及びその製造方法 - Google Patents

乳由来のエキソソームを有効成分として含む腸の健康機能改善用組成物及びその製造方法 Download PDF

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Abstract

Figure 2025504473000001
本発明は、乳由来のエキソソーム；及び治療剤を含み、前記治療剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は小分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であり、前記治療剤は、エキソソームの内部空間に位置して封入されることを特徴とする、腸の健康機能改善用組成物を提供する。また（ａ）乳からエキソソームを分離する段階；（ｂ）分離されたエキソソームを電気穿孔してエキソソームの表面に微細空隙を形成させる段階；（ｃ）前記（ｂ）段階の電気穿孔されたエキソソームと治療剤とを混合する段階；及び（ｄ）エキソソームの内部に封入されていない治療剤を除去する段階を含む腸の健康機能改善用組成物の製造方法を提供する。

Description

特許法第３０条第２項適用申請有り 令和４年（２０２２年）３月２２日 Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ Ｓｃｉｅｎｃｅ、２０２２、ｖｏｌ．１０、ｐｐ．２０７６－２０８７にて公開
関連出願への相互参照
本出願は、２０２２年１月２１日付で出願された大韓民国特許出願第１０-２０２２-０００９０１９号及び２０２２年８月１０日付で出願された大韓民国特許出願第１０-２０２２-００９９８２１号に基づいて優先権を主張し、当該出願の全内容が本出願に参照として組み込まれる。
国家支援の研究開発に関する説明
本研究は、韓国科学技術研究院の主管の下、科学技術情報通信部・韓国科学技術研究院の研究運営費支援（Ｒ＆Ｄ）（主要事業費）事業（ハイパーコネクテッド医療機器リバース仲介研究事業、課題固有番号：１７１１１５２０９４)、科学技術情報通信部・韓国科学技術研究院の研究運営費支援(主要事業費)事業(オーダーメイド型診断・治療、再生、リハビリ及び新薬の開発、課題固有番号：１７１１１７３２９２)、及び科学技術情報通信部・革新新薬基礎基盤技術開発事業(炎症性腸疾患の治療のための革新型ｓｉＲＮＡ経口治療薬の開発、課題固有番号：１７１１１６００７５)の支援によって行われたものである。
本開示は、乳由来のエキソソームを有効成分として含む腸の健康機能改善用組成物に関する発明である。
エキソソームは、直径３０～１５０ｎｍの細胞外小胞体の一種であって、多様な種類の細胞から分泌される。このようなエキソソームは、細胞間情報を伝達する重要な役割を果たすという事実が知られ、次世代薬物送達技術に用いられ始めた。しかし、細胞が分泌するエキソソームの量が小さすぎて、高い純度を確保することが難しく、且つ比較的不安定な物性を持つため、大量生産に限界がある。最近、食品由来のエキソソームが脚光を浴びている。このような食品由来のエキソソームは容易に入手でき且つ一般的に安全である。中でも、特に乳由来のエキソソームは、抗炎症特性があり、病理学的及び生理学的活性を媒介するのに重要なマイクロＲＮＡをエキソソーム自体に含んでいる。乳由来のエキソソームは、乳からエキソソームを高い収率で分離し、精製することができ、急激な環境変化、例えばｐＨや温度などにも高い安定性を維持する。また、乳由来のエキソソームは、生体利用率が高いため薬物の経口投与が可能となり、特に炎症性腸疾患のような胃腸管内に病変が存在する場合に活用度が高い。
一側面において、腸の健康機能改善用組成物を提供することをその目的とする。
一側面において、治療剤がエキソソームの内部空間に位置して封入されることを特徴とする、腸の健康機能改善用組成物を提供することを目的とする。
一側面において、経口投与が可能であり且つ腸関連疾患又は機能改善のための組成物を提供することを目的とする。
一側面において、腸の健康機能改善用組成物の製造方法を提供することを目的とする。
一側面において、乳由来のエキソソーム；及び治療剤を含み、前記治療剤は、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、前記治療剤は、エキソソームの内部空間に位置して封入されることを特徴とする、腸の健康機能改善用組成物を提供する。
他の一側面において、（ａ）乳からエキソソームを分離する段階；（ｂ）分離されたエキソソームを電気穿孔してエキソソームの表面に微細空隙を形成させる段階；（ｃ）前記（ｂ）段階の電気穿孔されたエキソソームと治療剤とを混合する段階；及び（ｄ）エキソソームの内部に封入されていない治療剤を除去する段階を含む、腸の健康機能改善用組成物の製造方法を提供する。
細胞から由来の細胞外小胞体の低い収率及び高い維持コストを克服するために、需給が円滑であり且つ容易にアクセス可能な乳からエキソソームを容易に高い収率で分離及び精製することができる。また、比較的不安定な物性を持つ細胞由来の細胞外小胞体に代えて、ｐＨ、温度などでの急激な環境変化にも高い安定性を維持する特性を持つ乳エキソソームに、電気穿孔法を用いて治療剤を封入することができる。このような乳由来のエキソソームは、生体利用率が高いため薬物の経口投与が可能となり、特に炎症性腸疾患のように胃腸管内に病変が存在する場合、活用度が高いという長所がある。
エキソソームタンパク質マーカー（Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ-１０１、ａｎｄ ＣＤ９）及び非エキソソームタンパク質マーカー（ＧＭ１３０）の発現水準を示す。 乳由来のエキソソームの大きさ分布グラフである。 乳由来のエキソソームの代表的なＴＥＭ画像を示す。 ０、１、４、８、１２又は２４時間の間に０．０５又は０．１ｍｇ／ｍｌのＣｙ５．５標識されたＣｏｌ-ｅｘｏとともに培養されたＲＡＷ２６４．７及びＮＣＭ４６０細胞の共焦点顕微鏡画像である。図中、暗い小さな円がＤＡＰＩを意味し、明るい円はＣｏｌ-ｅｘｏを意味する。 ０、０．１、０．２、０．５又は１ｍｇ／ｍｌの乳由来のエキソソームと２４時間培養したＮＣＭ４６０及びＲＡＷ２６４．７細胞の細胞増殖速度を示す（ｎ＝６；ｎｓ＝有意ではない、**ｐ＜０．０１及び****ｐ＜０．０００１）。 ＮＣＭ４６０の細胞生存率を示したグラフである。 細胞内減少したＲＯＳを確認した画像である。 Ｍ１型大食細胞で炎症性サイトカインをコードするｍＲＮＡの発現を示したグラフである（ｎ＝４；*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、****ｐ＜０．０００１）。 Ｃｙ５．５標識された乳由来のエキソソームの生体分布画像である。図４ａは臓器の全体画像であり、図４ｂは臓器の断面画像である。 ＤＳＳ大腸炎誘導治療及び乳由来のエキソソームの経口投与の日程を示した模式図である。 左側からＤＳＳ大腸炎誘導マウスに対する体重減少、ＤＡＩ指数変化を示したグラフ（ｎ≧１０；ｎs＝有意ではない、*ｐ＜０．０５、**ｐ＜０．０１、ａｎｄ ****ｐ＜０．０００１）、２７日目にマウスを犠牲させ結腸の長さを測定したグラフである（ｎ≧１０；ｎｓ＝有意ではない、***ｐ＜０．００１、ａｎｄ ****ｐ＜０．０００１）。 ＤＳＳ誘発大腸炎の重症度を弱める実施例１の効果を示す。図５ａは、２７日目にヘマトキシリン及びエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色にて分析した結腸組織の組織病理学的画像である（○表面上皮消失、△潰瘍、↑炎症細胞の浸潤）。図５ｂは、ＣＯＸ-２に対する代表的な免疫組織化学（ＩＨＣ）画像であり、矢印はＣＯＸ-２タンパク質が高度に発現される位置を示す。図５ｃは、ＴＵＮＥＬ染色によって検出された結腸壊死の代表的な画像である。 化学発光分析によって測定された結腸のＲＯＳを示す（ｎ≧７；ｎｓ＞０．０５、***ｐ＜０．００１及び****ｐ＜０．０００１）。 ｉＮＯＳに対する免疫蛍光（ＩＦ）染色の代表的な画像である（青色、図中暗い灰色：ＤＡＰＩ、緑色、図中明るい灰色：ｉＮＯＳ）。 結腸組織で炎症性サイトカインをコードするｍＲＮＡの発現を示す（ｎ=４；*ｐ＜０．０５及び***ｐ＜０．００１）。 電気穿孔法に対する乳エキソソームの安定性を示すグラフである。 乳由来のエキソソームに担持されたｓｉＲＮＡをアガロースゲル上で確認した画像である。 電気穿孔変数によるｓｉＲＮＡの乳由来のエキソソームの封入効率を比較したグラフである。 及び ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入された乳由来のエキソソームの視覚化写真及び相対的な蛍光領域の大きさを示したグラフである。 ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡ（Ｃｙ３ ｌａｂｅｌｅｄ）が封入された乳エキソソームの細胞内吸収画像である。 ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入された乳エキソソームの細胞内送達率を示した共焦点画像及び蛍光強度グラフである。 ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入された乳エキソソームの遺伝子沈黙効果（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）を示すグラフである。 ＩＢＤ誘導及び治療日程を示した模式図である。 及び ＩＢＤ誘導マウスの体重減少及びＤＡＩ指数変化を観察したグラフである。
用語の定義
本明細書で用いられた用語「細胞内送達率」とは、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）を用いてＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡを形質注入して染色された細胞の相対的な蛍光強度を基準（１００％）にして、細胞内の相対的なＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡの蛍光強度を測定し百分率で表した、封入されたＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが細胞内でどれだけ送達されるかのことを意味するものである。
以下、本発明を詳しく説明する。
一側面において、本発明は、乳由来のエキソソーム；及び治療剤を含み、前記治療剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は小分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であり、前記治療剤は、エキソソームの内部空間に位置して封入されることを特徴とする、腸の健康機能改善用組成物を提供する。本明細書で「エキソソームの内部空間に位置して封入される」とは、治療剤などの物質がエキソソームの内部空間に完全に入り込んで封入されることを意味し、付着、吸着又は接着などの方式でエキソソームの表面のみに存在するものではないことをいう。
本発明の他の側面において、対象の腸の健康機能改善のための方法であって、当該方法は、乳由来のエキソソーム；及び治療剤の有効量を、これを必要とする対象に投与する段階を含み、前記治療剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は小分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であり、前記治療剤は、エキソソームの内部空間に位置して封入されることを特徴とする方法を提供する。
本発明の他の側面において、腸の健康機能改善のための組成物を製造するに際する乳由来のエキソソーム；及び治療剤の用途を提供する。
本発明の他の側面において、腸の健康機能改善のための乳由来のエキソソーム；及び治療剤を提供する。
例示的な一具現例において、前記乳は、ヒト、牛、羊、山羊、ヤギ、ラクダ、バッファロー又はヤク由来の乳であるか、又は初乳（ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ）であってよく、これらに制限されない。
例示的な一具現例において、前記ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、及びａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡからなる群より選ばれた一つ以上のＲＮＡであってよく、これらに制限されない。
例示的な一具現例において、前記ｓｉＲＮＡは、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ-β ｓｉＲＮＡ、ＪＡＫ３ ｓｉＲＮＡ、及びＩＬ-６Ｒ ｓｉＲＮＡからなる群より選ばれた一つ以上のｓｉＲＮＡであってよい。
例示的な一具現例において、前記ｍｉＲＮＡは、Ｌｅｔ-７ｂ-５ｐ、ｍｉＲ-３２０ａ-３ｐ、及びｍｉＲ-２１からなる群より選ばれた一つ以上のｍｉＲＮＡであってよい。
例示的な一具現例において、前記組成物は液状剤形であってよく、前記治療剤が封入された乳由来のエキソソームを１００～１０００μｇ／ｍｌの濃度で含んでよい。具体的に、前記乳由来のエキソソームは、１００μｇ／ｍｌ以上、１５０μｇ／ｍｌ以上、２００μｇ／ｍｌ以上、２５０μｇ／ｍｌ以上、３００μｇ／ｍｌ以上、３５０μｇ／ｍｌ以上、４００μｇ／ｍｌ以上、４５０μｇ／ｍｌ以上又は５００μｇ／ｍｌ以上であり、且つ１０００μｇ／ｍｌ以下、９５０μｇ／ｍｌ以下、９００μｇ／ｍｌ以下、８５０μｇ／ｍｌ以下、８００μｇ／ｍｌ以下、７５０μｇ／ｍｌ以下、７００μｇ／ｍｌ以下、６５０μｇ／ｍｌ以下、６００μｇ／ｍｌ以下又は５５０μｇ／ｍｌ以下の濃度であってよい。
例示的な一具現例において、前記組成物は凍結乾燥剤形であってよく、前記治療剤が封入された乳由来のエキソソームを、組成物の総重量を基準として０．００１～１００重量％の範囲で含んでよい。具体的に、前記治療剤が封入された乳由来のエキソソームの濃度又は溶媒の種類に応じて当業者が適宜変更して前記含量を調節してよい。例えば、前記含量は、０．００１重量％以上、０．０１重量％以上、０．１重量％以上、１重量％以上、５重量％以上、１０重量％以上、１５重量％以上、２０重量％以上、２５重量％以上、３０重量％以上、３５重量％以上、４０重量％以上、４５重量％以上又は５０重量％以上であり、且つ１００重量％以下、９５重量％以下、９０重量％以下、８５重量％以下、８０重量％以下、７５重量％以下、７０重量％以下、６５重量％以下、６０重量％以下又は５５重量％以下であってよい。
例示的な一具現例において、前記組成物は経口投与するものであってよい。
他の一側面において、本発明は、（ａ）乳からエキソソームを分離する段階；（ｂ）分離されたエキソソームを電気穿孔してエキソソームの表面に微細空隙を形成させる段階；（ｃ）前記（ｂ）段階の電気穿孔されたエキソソームと治療剤とを混合する段階；及び（ｄ）エキソソームの内部に封入されていない治療剤を除去する段階を含む、腸の健康機能改善用組成物の製造方法を提供する。
例示的な一具現例において、前記（ｂ）段階の電気穿孔は、２５０～３５０ｖの電圧を加えることであってよい。具体的に、前記電圧は、２５０ｖ以上、２５５ｖ以上、２６０ｖ以上、２６５ｖ以上、２７０ｖ以上、２７５ｖ以上、２８０ｖ以上、２８５ｖ以上、２９０ｖ以上、２９５ｖ以上又は３００ｖ以上であり、且つ３５０ｖ以下、３４５ｖ以下、３４０ｖ以下、３３５ｖ以下、３３０ｖ以下、３２５ｖ以下、３２０ｖ以下、３１５ｖ以下、３１０ｖ以下又は３０５ｖ以下であってよい。
例示的な一具現例において、前記（ｂ）段階の電気穿孔は、３～７回のパルスを加えることであってよい。具体的に、前記パルスは、３回以上、４回以上、５回以上であり、且つ７回以下又は６回以下であってよい。
例示的な一具現例において、前記（ｂ）段階の電気穿孔は、２０～４０ｍｓの時間の間パルスを加えることであってよい。具体的に、前記パルスは、２０ｍｓ以上、２１ｍｓ以上、２２ｍｓ以上、２３ｍｓ以上、２４ｍｓ以上、２５ｍｓ以上、２６ｍｓ以上、２７ｍｓ以上、２８ｍｓ以上、２９ｍｓ以上又は３０ｍｓ以上であり、且つ４０ｍｓ以下、３９ｍｓ以下、３８ｍｓ以下、３７ｍｓ以下、３６ｍｓ以下、３５ｍｓ以下、３４ｍｓ以下、３３ｍｓ以下、３２ｍｓ以下又は３１ｍｓ以下であってよい。
例示的な一具現例において、前記（ａ）段階の乳は、ヒト、牛、羊、山羊、ヤギ、ラクダ、バッファロー又はヤク由来の乳であるか、又は初乳（ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ）であってよい。
例示的な一具現例において、前記（ｃ）段階の治療剤はＤＮＡであり、前記（ｄ）段階は、ｄｎａｓｅを添加して封入されていない治療剤を除去することであってよい。
例示的な一具現例において、前記（ｃ）段階の治療剤はＲＮＡであり、前記（ｄ）段階は、ｒｎａｓｅを添加して封入されていない治療剤を除去することであってよい。
例示的な一具現例において、前記（ｃ）段階のＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｉＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、及びａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡからなる群より選ばれた一つ以上のＲＮＡであってよい。
例示的な一具現例において、前記（ｃ）段階のｓｉＲＮＡは、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ-β ｓｉＲＮＡ、ＪＡＫ３ ｓｉＲＮＡ、及びＩＬ-６Ｒ ｓｉＲＮＡからなる群より選ばれた一つ以上のｓｉＲＮＡであってよい。
例示的な一具現例において、前記（ｃ）段階のｍｉＲＮＡは、Ｌｅｔ-７ｂ-５ｐ、ｍｉＲ-３２０ａ-３ｐ、及びｍｉＲ-２１からなる群より選ばれた一つ以上のｍｉＲＮＡであってよい。
以下、実施例等を通じて本発明をさらに詳しく説明する。なお、これらの実施例はあくまでも本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではない。本発明の請求の範囲に記載された技術思想と実質的に同一の構成を有し且つ同一の作用効果を奏するものは、いずれも本発明の技術的範囲に含まれる。
１．ウシの初乳由来のエキソソームの炎症性腸疾患の予防及び治療効果の確認
（１）細胞培養
ＮＣＭ４６０細胞及びＲＡＷ２６４．７細胞（４００７１、韓国細胞株バンク）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ、ＦＰ-０５００-Ａ、Ａｔｌａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、ＵＳＡ）及び１％抗生剤-抗真菌剤（１５２４００９６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）が含有された高グルコース（ＳＨ３０２４３．０１、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ＵＳＡ）のダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｅａｇｌｅ ｍｅｄｉｕｍ）で育成した。細胞を５％二酸化炭素（ＣＯ２）とともに３７℃インキュベーターでインキュベートした。Ｍ１様大食細胞を誘導するために、ＲＡＷ２６４．７細胞を、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ（Ｌ４５２４、ｓｉｇｍａ、ＵＳＡ）及び２０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮ-γ（３１５-０５、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ、ＵＫ）で２４時間刺激させた。
（２）初乳からのエキソソームの分離
エキソソームは４℃で連続遠心分離によって製造された。ウシの初乳（慶尚南道昌寧郡桂城面鳳山官洞１路２０所在の李ソンヨンチャンブク牧場入手）を、ＪＡ-１４ローター（Ａｖａｎｔｉ Ｊ-Ｅ、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）付きの高速遠心分離機を用いて、５，０００ｘｇで３０分間及び１２，０００ｘｇで１時間遠心分離した。上層液は４０μｍストレーナー（９３０４０、ＳＰＬ、韓国）に通し、使用するまで－８０℃で保管した。ろ過された乳を、４５ Ｔｉローター（Ｏｐｔｉｍａ ＸＥ-１００、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＵＳＡ）付きの超遠心分離機を用いて、３５，０００ｘｇで１時間及び最大加速／デカール（ａｃｃｅｌ／ｄｅｃａｌ）にて７０，０００ｘｇで３時間遠心分離した。溶液を３つの層に分離し、中間層を孔径０．８、０．４５、０．２μｍ（１６５９２-Ｋ、１６５５５-Ｋ、１６５３４-Ｋ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｅｒｍａｎｙ）のシリンジフィルターにて順次ろ過した。
エキソソームとみなされるペレットは、１００，０００ｘｇで１時間遠心分離して得た。エキソソームをダルベッコのリン酸緩衝食塩水（ＤＰＢＳ、ＬＢ００１、Ｗｅｌｇｅｎｅ、韓国）に再懸濁し４℃で一晩回転させた。このようにして得たエキソソームを以下のウシ初乳由来のエキソソーム（Ｃｏｌ-ｅｘｏ、実施例１）と命名する。
エキソソームのない乳（Ｅｘｏ-ｆｒｅｅ ｍｉｌｋ、比較例１）の製造のために、エキソソームペレットを除いた透明な溶液を２００，０００ｘｇで３時間遠心分離して残っているエキソソームを除去し、上層液をエキソソームのない乳とみなした。
（３）ウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）
エキソソームタンパク質の濃度はＢＣＡ ａｓｓａｙ ｋｉｔ（２３２２５、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）を用いて定量し、タンパク質はＳＤＳ-ＰＡＧＥ ｌｏａｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで変性させた。サンプルをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。分離されたタンパク質をニトロセルローズ膜に移し、５％脱脂乳でブロックした。一次抗体は２４時間標的タンパク質に結合された。前記膜をトリス緩衝食塩水（ｔｒｉｓ-ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）、０．１％ Ｔｗｅｅｎ ２０洗剤（ＴＢＳＴ）ですすぎ、タンパク質は室温で４０分間ＨＲＰ-標識二次抗体とともにインキュベートして標識された。標識されたタンパク質はＣｌａｒｉｔｙ Ｗｅｓｔｅｒｎ ＥＣＬ基質（１７０５０６１、Ｂｉｏ-Ｒａｄ、ＵＳＡ）で視覚化された。
抗体としては、Ａｌｉｘ（１：５００、ＮＢ１００-６５６７８、Ｎｏｖｕｓ、ＵＳＡ）、Ｔｓｇ-１０１（１：１０００、ａｂ８３、Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）、ＣＤ９（１：１０００、ＮＢ５００-４９４、Ｎｏｖｕｓ、ＵＳＡ）、ＧＭ１３０（１：５００、ＰＡ１０７７、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）、ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＨＲＰ）（１：１０００、ＧＴＸ２１３１１-０１、ＧｅｎｅＴｅｘ、ＵＳＡ）、ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（ＨＲＰ）（１：１０００、ＧＴＸ２１３１０-０１、ＧｅｎｅＴｅｘ、ＵＳＡ）が用いられた。
実施例１及び比較例１に対する結果は、図１ａに示すように、エキソソームタンパク質のマーカーであるＡｌｉｘ、Ｔｓｇ-１０１及びＣＤ９は実施例１で確認されたのに対し、非エキソソームタンパク質であるＧＭ１３０は比較例１で発見された。このような結果は、エキソソームの有無によって比較例１（Ｅｘｏ-ｆｒｅｅ ｍｉｌｋ）及び実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）が区別されることを示している。
（４）動的光散乱（Ｄｙｎａｍｉｃ ｌｉｇｈｔｉｎｇ ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ、ＤＬＳ）及び透過電子顕微鏡（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ、ＴＥＭ）
ＤＬＳのためにエキソソームを蒸溜水で０．１μｇ／μｌに希釈し、使い捨てキュベット（ａｒｔ．０１９６０-００、Ｋａｒｔｅｌｌ ＬＡＢＷＡＲＥ、Ｉｔｌａｌｙ）に移した。エキソソームの大きさ分布は１７３゜の固定角でＤＬＳ（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）にて測定した。各サンプルに対して３つの独立的な測定を行い、ソフトウェアによる分析のために平均をとった。
ＴＥＭ画像の確認のために、１０μｇのエキソソームを炭素コートされた銅グリッド（ＣＦ２００-Ｃｕ、Ｅｍｇｒｉｄ Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）にて室温で３０分間蒸着した。エキソソームのネガティブ染色のために、銅グリッドを１分間ウラニルアセテート（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）と対照した。エキソソームの形態はＴＥＭ（ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｆ２０ Ｇ２、Ｐｈｉｌｉｐｓ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）で視覚化した。
図１ｂ及び図１ｃで示したように、実施例１のエキソソームの平均直径が８５．２ｎｍであり、球形であることが確認された。
（５）エキソソームの細胞吸収
エキソソームは、４℃で一晩回転させ、６５０ｎＭシアニン（Ｃｙａｎｉｎｅ）５．５ ＮＨＳエステル（ｅｓｔｅｒ）で標識された。非結合断片をＡｉｒｆｕｇｅを用いて２回洗浄した。細胞は、ＲＡＷ２６４．７細胞の場合は２×１０５細胞／ディッシュ（ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈ）、ＮＣＭ４６０細胞の場合は３×１０５細胞／ディッシュ（ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈ）の密度で共焦点ディッシュにプレートされた。エキソソームを各濃度（０．０５及び０．１ｍｇ／ｍｌ）で処理し、各時点でＤＰＢＳにて洗浄した。画像をキャプチャするために、細胞をホルムアルデヒドで固定してから４',６-ｄｉａｍｉｄｉｎｏ-２-ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ（ＤＡＰＩ）を加えて核酸を１５分間染色した。画像は共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ６、Ｌｅｉｃａ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で撮像した。
（６）細胞増殖及び生存力分析
細胞生存分析はＣｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ-８（ＣＣＫ-８）（ＣＫ０４、Ｄｏｊｉｎｄｏ、Ｊａｐａｎ）ガイドに従い行われた。ＮＣＭ４６０及びＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートにそれぞれ６，０００及び８，０００細胞／ウェル（ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）の密度でシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、２４時間付着できるようにした。細胞を２４時間種々の濃度の比較例１（エキソソームのない乳）又は実施例１のエキソソーム（生存性分析で０．５ｍｇ／ｍｌ）で処理した。生存力分析のための追加段階として、細胞を２．５％ ＤＳＳ（０２１６０１１０８０、ＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ、ＵＳＡ）溶液（ｗ／ｖ）と共に２４時間インキュベートした。培地を１０％ ＣＣＫ-８溶液を含有する無血清培地に取り替えた。４５０ｎｍ波長での吸光度をマイクロプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸ ３４０、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ、ＵＳＡ）で測定した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、エキソソームで処理する前に、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ及び２０ｎｇ／ｍｌ ＩＮＦ-γと共に２４時間培養された。
実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）の細胞内送達効率を調べた。ＲＡＷ２６４．７細胞を０、１、４、８、１２又は２４時間の間に０．０５又は０．１ｍｇ／ｍｌの濃度にてＣｙ５．５で標識された実施例１と共に培養した（図２ａ）。図２ａ中、暗い小さな円はＤＡＰＩを意味し、明るい円はＣｏｌ-ｅｘｏを意味する。共焦点画像をみると、実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）の相当な細胞内吸収が８時間以内に現われ、画像は吸収が２４時間以内に飽和したことを示している。また、ＮＣＭ４６０細胞でも類似したパターンを示した。このようなデータに基づいて、実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）の吸収時間を以降のｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏ実験で２４時間と設定した。
次いで、実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）と細胞成長との関係を調べるために、ＮＣＭ４６０細胞とＲＡＷ２６４．７細胞に対して細胞増殖分析を行った（図２ｂ）。ＮＣＭ４６０細胞に０．１ｍｇ／ｍｌ濃度の実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）を処理したとき、細胞増殖が１１３．１±３．４％と有意に増加したことが分かる。このような細胞増殖は、実施例１の１ｍｇ／ｍｌの濃度まで類似に維持された。他の細胞株であるＲＡＷ２６４．７は、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で細胞成長の有意な増加を示し、特に１ｍｇ／ｍｌの濃度で１２１．８±４．７％に増加した。
また、炎症性腸疾患（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｂｏｗｅｌ ｄｉｓｅａｓｅ、ＩＢＤ）を誘発する化学物質であるｄｅｘｔｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｓｏｄｉｕｍ（ＤＳＳ、３６,０００ - ５０,０００ Ｄａ）で結腸上皮細胞を損傷させてから外部損傷を修復する実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）の能力を観察した（図２ｃ）。２．５％ ＤＳＳを２４時間処理して細胞損傷を発生させ、その結果、細胞成長速度が８２．７±３．７％に減少した。比較例１（Ｅｘｏ-ｆｒｅｅ ｍｉｌｋ）を処理したグループはＤＳＳ処理と類似した水準の細胞生存率を示したのに対し、実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）は９１．８±２．６％まで細胞生存率を回復することができた。結果的に、実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）は、ＮＣＭ４６０及びＲＡＷ２６４．７細胞の増殖を増加させることが分かった。
（７）抗炎症効果の確認
次いで、ウシ初乳由来のエキソソームが細胞内活性酸素種（ＲＯＳ）の濃度を減少させることができるかどうかをＤＣＦ-ＤＡアッセイを用いて確認した。ＲＡＷ２６４．７細胞を共焦点ディッシュに２×１０５細胞の密度でシーディングし、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ及び２０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮ-γを２４時間処理してＭ１大食細胞に誘導した。ＮＣＭ４６０細胞を３×１０５個細胞／ウェル（ｃｅｌｌ／ｗｅｌｌ）の密度で２４時間培養した。エキソソームのない乳又はエキソソームを０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で各細胞に２４時間処理した。酸化ストレス（ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ）は１００μＭのＨ２Ｏ２を３０分間提供し、５０μＭの２',７'-ｄｉｃｈｌｏｒｏｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎ ｄｉａｃｅｔａｔｅ（ＤＣＦＤＡ）を３０分間細胞と共に培養して誘導した。ＤＰＢＳで細胞を洗浄した後、共焦点顕微鏡を用いて蛍光画像を得た。
図３ａに示すように、ＮＣＭ４６０細胞とＲＡＷ２６４．７細胞のいずれもにおいて実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）処理群の細胞内ＲＯＳ数値（明るい円）が過酸化水素処理群又は比較例１（Ｅｘｏ-ｆｒｅｅ ｍｉｌｋ）処理群に比べて顕著に減少した。
（８）試験管内でのサイトカイン水準の定量化
また、炎症反応に関与する細胞内サイトカインをコードするｍＲＮＡの発現水準を分析した。ＲＡＷ２６４．７細胞（２．５×１０５細胞／ｍｌ）を培養ディッシュにプレートし、１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳ及び２０ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮ-γで２４時間刺激した。Ｍ１誘導細胞をエキソソームのない乳又はエキソソームで２４時間処理してからＤＰＢＳで２回洗浄した。メーカのガイドラインに従いＴｒｉｚｏｌＴＭ試薬でｔｏｔａｌ ＲＮＡを抽出し、逆転写後、ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）プライマーでｃＤＮＡを生成した。サイトカインの定量は、ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｐｒｅｍｉｘ（ＲＴ５０１Ｓ、ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、韓国）と各プライマー（表１）を用いた定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ-ＰＣＲ）で進行し、ＰＣＲ周期はｐｒｅｍｉｘプロトコルに従い設定した。
Figure 2025504473000002
先ず、ＲＡＷ２６４．７細胞をＭ１大食細胞に分化させ、それぞれ実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）及び比較例１（Ｅｘｏ-ｆｒｅｅ ｍｉｌｋ）で処理した。図３ｂに示したように、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ-ＰＣＲ）データでは、腫瘍壊死因子-α（ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ-α、ＴＮＦ-α）及びインターロイキン-６（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ-６、ＩＬ-６）のｍＲＮＡ発現水準が、実施例１の方が対照群に比べて０．６９倍及び０．６１倍減少した結果を示した。対照的に、抗炎症性サイトカインであるインターロイキン-１０（ＩＬ-１０）のｍＲＮＡ発現水準は、実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）群の方が対照群に比べて１．７倍増加した結果を示した。したがって、実施例１は細胞水準で抗炎症効果があることが分かった。
（９）初乳由来のエキソソームの生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）分布（ｂｉｏ-ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ）
大腸炎のマウスモデルで実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）の効果を確認する前に、Ｃｙ５．５標識された実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）を経口投与した後、臓器の相対的な生体分布を測定した。ＢＡＬＢ／ｃマウスにＣｙ５．５で標識されたエキソソームを経口投与した。マウスを経口胃管栄養法後、５時間と２４時間経過後に胃腸管と心臓、肺、脾臓、腎臓、及び肝を含むその他の器官を収集した。分離された臓器の蛍光強度は生体内イメージングシステム（ＩＶＩＳ）（Ｌｕｍｉｎａ ＳｅｒｉｅｓＩＩＩ ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）を用いて推定された。エキソソームの吸収は、ホルマリン固定された、パラフィン包埋胃腸器官から観察された。パラフィンが包埋された組織を５μｍの厚さに切断した。代表的な画像は共焦点顕微鏡を用いてキャプチャされた。
その結果、図４ａに示すように、Ｃｙ５．５-ｌａｂｅｌｅｄ Ｃｏｌ-ｅｘｏを食べさせてから５時間後に蛍光強度を測定したとき、胃腸管、特に結腸で強い信号を示した。また、２４時間の時点で胃と結腸で蛍光信号が有意に維持されることを確認した。一方、図４ｂから確認できるように、胃、小腸、結腸をそれぞれスライスしてＣｙ５．５で標識された実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）が臓器に吸収されることを観察した。Ｃｙ５．５で標識された実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）の吸収の大部分は胃と結腸で発見された。２４時間後に吸収されたエキソソームが顕著に減少することを確認した。このため、実施例１を毎日マウスに経口投与した。
（１０）大腸炎マウスモデルの炎症反応の推定
８週齢のＢＡＬＢ／ｃ雌マウス（Ｏｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ、韓国）を潰瘍性大腸炎モデルに使用した。マウスを無作為に３つのグループ、健康対照群（食塩水）、ＤＳＳ-誘導大腸炎（ＤＳＳ）、Ｃｏｌ-ｅｘｏ前処理（実施例１）に分け、１０日間順応期間を設けた。実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）グループは１週間毎日初乳由来のエキソソーム１ｍｇを経口胃管栄養法で前処理し、他のグループには食塩水のみを与えた。２．５％ ＤＳＳ溶液を飲用水に任意に１週間投与して化学的に炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を誘導した。２７日目に、マウスを犠牲させて結腸の長さを推定した（図４ｃ）。
１）疾患活動性指数（Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ、ＤＡＩ）
疾患活動性指数は、体重減少、糞便の粘度、及び糞便出血の特性について、１８日目から２７日目まで毎日各マウスに対して３人の独立した観察者が評価した（表２）。総点数の範囲は０から１２までであり、点数が高いほど疾患の重症度が高い。
Figure 2025504473000003
定められた日程に従い動物実験を進行した結果、ＤＳＳグループは急激な体重減少を示したのに対し、実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）グループはＤＳＳで誘発された大腸炎マウスの体重減少が効果的に抑制された。（図４ｄ）。
２）生体外（ｅｘ ｖｉｖｏ）ＲＯＳイメージング
２７日目にＬ-０１２（１２０-０４８９１、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｊａｐａｎ）をＤＰＢＳに溶解して製造し常温の暗室に保管した。Ｌ-０１２溶液を２０ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内注射し、１５分後にマウスの結腸を分離した。分離された結腸のＲＯＳは生体内イメージングシステム（ＩＶＩＳ）（Ｌｕｍｉｎａ Ｓｅｒｉｅｓ ＩＩＩ ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、ＵＳＡ）によって画像化した。データは５分間測定（ｐ／ｓ／ｃｍ２／ｓｒ）に対する平均輻射効率を示す。
定められた日程に従い動物実験を進行した結果、ＤＳＳグループは急激な体重減少を示したのに対し、実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）グループはＤＳＳで誘発された大腸炎マウスの体重減少が効果的に抑制された。また、実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）グループのＤＡＩ（ｄｉｓｅａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎｄｅｘ）点数はＤＳＳグループよりも有意に低かった。実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）グループの結腸の長さはＤＳＳグループに比べて有意に長く、食塩水グループと類似した水準に回復した（図４ｄ）。以上の実験を通じて実施例１がＤＳＳで誘発された大腸炎を緩和させることを確認した。
（１１）組織学的分析
分離されたマウス結腸組織はＳｗｉｓｓ-ｒｏｌｌ技法で用意された。結腸サンプルをホルマリンに一晩浸漬固定し脱水しパラフィンに包埋した。すべての組織標本を５μｍの厚さに切断した。
１）Ｈ＆Ｅ（Ｈｍａｔｏｘｙｌｉｎ ａｎｄ ｅｏｓｉｎ）
セクションをキシレンで脱ロウしヘマトキシリンで染色した。水道水で洗浄後、ブルーイング剤で核染色を完了した。タンパク質はｅｏｓｉｎ（ａｂ２４５８８０、Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）によって非特異的に染色された。スライドにトルエンを装着し、光学顕微鏡（ＢＸ５１、Ｏｌｙｍｐｕｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｊａｐａｎ）を用いて観察した。
その結果、ＤＳＳグループの結腸から深刻な表在性上皮損傷、潰瘍、及び免疫細胞の浸潤が確認された（図５ａ）。これに対し、実施例１のグループは軽微な上皮増殖を示した。
２）免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、ＩＨＣ）
ＣＯＸ-２は炎症の開始を誘導する核心の分子であるため、免疫組織化学（ＩＨＣ）を用いて各グループでのＣＯＸ-２タンパク質の発現水準を調べた。結腸組織からのＣＯＸ-２の発現は、メーカのプロトコルに従いＭｏｕｓｅ ａｎｄ Ｒａｂｂｉｔ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＨＲＰ／ＤＡＢ（ＡＢＣ）Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ＩＨＣ ｋｉｔ（ａｂ６４２６４、Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）を用いて検出された。標的タンパク質は１％ ＢＳＡ及び０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ-１００を含有するＰＢＳ中のＣＯＸ-２抗体（１：５００、ａｂ１５１９１、Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）でタグを指定した。組織セクションをＤＡＢ基質で染色しヘマトキシリンで対照染色した。画像は光学顕微鏡でキャプチャされた。
図５ｂから確認できるように、実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）グループの大腸では、ＤＳＳグループに比べてＣＯＸ-２タンパク質の発現が減少した。
３）免疫蛍光（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ、ＩＦ）
組織細胞死の程度を視覚化するために、ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｒｉｃ ＴＵＮＥＬ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｇ３２５０、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＳＡ）のメーカ指針に従いＴＵＮＥＬ分析を行った。すなわち、再水和された組織切片をホルムアルデヒドで固定し、透過性のためにプロテイナーゼＫ溶液を添加した。ホルムアルデヒド固定を繰り返し、平衡緩衝液と共にインキュベートした。アポトーシス（Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ）領域はターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）反応によって表示され、ＤＡＰＩで対照染色された。
図５ｃを見ると、結腸細胞の細胞死はＴＵＮＥＬ染色データから分かるように、ＤＳＳグループでひどく発生しており、実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）グループで優勢に回復した。その結果、実施例１は、大腸炎及び細胞死の重症度を軽減するのに有効であった。
（１２）生体内（ｉｎ ｖｉｖｏ）サイトカイン水準の定量化
Ｃｏｌ-ｅｘｏが結腸炎症の緩和に及ぼす影響を確認するために、ルミノールベースの化学発光プローブを用いて結腸のＲＯＳ水準を測定した。マウス結腸組織はＴｒｉｚｏｌＴＭ試薬と共にホモジナイザー（ＨＧ-１５Ｄ、Ｗｉｓｅ Ｔｉｓ、Ｋｏｒｅａ）を用いて均質化された。均質化の後、ＴｒｉｚｏｌＴＭ試薬の手順マニュアルに従い結腸組織の総ＲＮＡを得た。ｃＤＮＡ合成後、メーカのプロトコルに従いＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ（ＲＴ５０１Ｍ、Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ、Ｋｏｒｅａ）を用いてｑＲＴ-ＰＣＲを行った。すべてのｑＲＴ-ＰＣＲはＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏＴＭ１ Ｒｅａｌ-Ｔｉｍｅ ＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＵＳＡ）を用いて行われた。各プライマーは（表１）に要約されている。
その結果、ＲＯＳ水準がＤＳＳグループで有意に増加し、実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）グループで半分未満に減少した結果を示した（図６ａ）。
（１３）腸の炎症改善効果の確認
次いで、Ｃｏｌ-ｅｘｏの腸の炎症改善効果を確認するために、免疫蛍光法（ＩＦ）を用いて伝染症性Ｍ１型大食細胞の標識子であるｉＮＯＳタンパク質の発現を確認した。ｉＮＯＳに対する染色でマウス結腸組織の大食細胞の浸潤を検出した。脱パラフィン化された組織を再水和し、抗原レトリーバー緩衝液（Ｃｉｔｒａｔｅ ｂｕｆｆｅｒ ｐＨ６．０）（ａｂ９３６７８、Ａｂｃａｍ、ＵＳＡ）で沸かした。スライドをＰＢＳ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０洗剤（ＰＢＳＴ）で洗浄し、５％ ＢＳＡ（ｗ／ｖ）を含有するＰＢＳＴにて室温で１０分間ブロックした。１％ ＢＳＡ（ｗ／ｖ）及び０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ-１００（ｖ／ｖ）を含有するＰＢＳで製造されたＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ４８８接合されたｉＮＯＳモノクロラール抗体（５３-５９２０-８２、ｅＢｉｏｓｉｅｎｃｅ、ＵＳＡ）は４℃で一晩セクションを染色した。核酸は室温で１５分間ＤＡＰＩで染色された。スライドは共焦点顕微鏡で撮像した水溶性マウンティングソリューション（０１００-０１、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、ＵＳＡ）でマウントされた。その結果、図６ｂに示すように、ｉＮＯＳタンパク質が、ＤＳＳグループでは過発現したのに対し、実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）グループではほとんど観察されなかった。
また、ｑＲＴ-ＰＣＲを用いて炎症性サイトカインのｍＲＮＡ発現を調べた（図６Ｃ）。ｑＲＴ-ＰＣＲの結果、ＴＮＦ-α及びＩＬ-６のｍＲＮＡ水準は、食塩水グループに比べてＤＳＳグループでそれぞれ３．８倍及び３．６倍増加した結果を示した。対照的に、これらのｍＲＮＡ発現水準は食塩水グループのそれと類似であることが分かった。しかし、抗炎症性サイトカインのｑＲＴ-ＰＣＲの結果は逆の傾向を示し、ＤＳＳグループのＩＬ-１０ｍＲＮＡ発現量が食塩水グループに比べて約２０倍減少した。特に、実施例１（Ｃｏｌ-ｅｘｏ）処理グループのＩＬ-１０発現水準は、ＤＳＳ処理グループの約５倍水準に若干回復した。このような結果は、実施例１が過度な腸の炎症反応を軽減させることを示す。
（１４）統計的分析
データの統計的分析は、パラメトリック一元配置分散分析（ｏｎｅ-ｗａｙ ＡＮＯＶＡ）と二元配置分散分析にてＰｒｉｓｍ ８．０を用いて実行された。すべての結果は、平均±標準偏差で表された。すべてのグラフはＰｒｉｓｍ ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ、ＵＳＡ）で構成された。
２．ＲＮＡが封入された乳由来のエキソソームの炎症性腸疾患治療の効果
（１）エキソソームの抽出
乳は市販の低温殺菌牛乳を使用し、エキソソームの抽出は、前記実施例１．（２）に記載の方法と同じ方法を用いて行った。
（２）電気穿孔に対するエキソソームの安定性の確認
０．１ｍｇ／ｍｌの細胞由来のエキソソーム（ＨＥＫ ｅｘｏ）及び乳由来のエキソソーム（ｍｉｌｋ ｅｘｏ）に、３００Ｖ、３０ｍｓ、５pulses、１ｓインターバル（ｉｎｔｅｒｖａｌ）の電気衝撃をそれぞれ加え、４℃で３時間インキュベートした。実施例１．（４）の動的光散乱（ＤＬＳ）実験方法と同じ方法を用いて、電気衝撃を加える前後のエキソソームの大きさ変化を観察した。
その結果、図７に示すように、細胞由来のエキソソームは、電気穿孔後にエキソソームの大きさが小さくなるのに対し、乳由来のエキソソームは、電気穿孔前後のエキソソームの大きさ分布に変化がほとんどないことを確認した。
（３）ｓｉＲＮＡの封入
前記電気穿孔でエキソソームに微細な空隙（ｐｏｒｅ）を作ってから、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡをエキソソーム溶液に混ぜてエキソソームの内部にＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡを封入させた後、Ｒｎａｓｅを用いてエキソソームの内部に封入されていないｓｉＲＮＡを除去した。電気穿孔を施していないエキソソーム、電気穿孔を施したエキソソーム、電気穿孔を施していないエキソソームにＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡを混ぜた結果物、及び電気穿孔を施したエキソソームにＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡを混ぜて封入したエキソソームを１％アガロースゲルにローディングし、電気泳動装置で１００Ｖ、１０分間電気泳動した。次いで、ゲルイメージ分析機で視覚的に確認し、その結果、図８に示すように、エキソソームに電気穿孔を施した場合、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが効率的にエキソソームの内部に封入されることを確認した。以下、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入されたエキソソームを実施例２と称し、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入されていないエキソソームを比較例２と称する。
（４）電気穿孔変数によるｓｉＲＮＡの封入効率の比較
０．１ｍｇ／ｍｌの乳由来のエキソソームに電圧条件を確認するために、電気穿孔回数は５回、時間は３０ｍｓと固定し、２００、２５０、３００、３５０、及び４００Ｖの電圧をそれぞれ加えたときのＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡの封入効率を比較し、電気穿孔回数条件を確認するために、電圧は３００Ｖ、時間は３０ｍｓと固定し、１、２、３、４、及び５回の電気穿孔を施したときのＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡの封入効率を比較し、電気穿孔時間条件を確認するために、電圧は３００Ｖ、電気穿孔回数は５回と固定し、１０、２０、３０、４０、５０、及び６０ｍｓの時間の間電気衝撃を加えたときのＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡの封入効率を比較した。３００Ｖ、５回、３０ｍｓ間電気穿孔を施した場合、最も効率的にＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡがエキソソームに封入されることを確認することができた（図９）。
（５）ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入された乳由来のエキソソームの視覚化
乳由来のエキソソームに３００Ｖ、３０ｍｓ、５ｐｕｌｓｅｓ、１ｓインターバル（ｉｎｔｅｒｖａｌ）の電気衝撃をそれぞれ加えた後、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡ（ＦＡＭ ｌａｂｅｌｅｄ）を封入して３時間インキュベートし、乳由来のエキソソームをＣｙ５．５でラベリングした。ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入された乳由来のエキソソーム（実施例２）をＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ-Ｇ溶液と混ぜてスライドガラスに固定した。次いで、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入された乳由来のエキソソームをＳｕｐｅｒ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ（ＳＲＭ）でｘ、ｙ、ｚ方向に測定して視覚化し（図１０ａ）、相対的な蛍光領域を図表化した（図１０ｂ）。ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡを封入した後のデータをみると、実施例２の場合、緑色（図中では暗い灰色）ＦＡＭでラベリングされたＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが赤色（図中では白色）Ｃｙ５．５でラベリングされたエキソソームの内部中央に位置していることを確認することができた。また、相対的な蛍光領域の場合も、エキソソームのみを有する比較例２の場合に１００以上の蛍光領域を示していたＣｙ５．５が、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入された場合に１００以下と減少し、相対的にＦＡＭで標識された蛍光領域が増加したことを確認することができた。これは、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡがエキソソームの表面に粘着などの方式で担持されるのではなく、電気穿孔によって生じた微細な空隙からＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡがエキソソームの内部領域中央に正確に入り込んで封入されたことを意味する。
（６）ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入された乳由来のエキソソームの細胞吸収の確認
前記実施例２と同じ電気穿孔法で乳由来のエキソソームに空隙を形成し、Ｃｙ３をラベリングしたＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡを封入し、３時間インキュベートした。次いで、ＮＣＭ４６０細胞に前記エキソソームを処理し、２４時間後に細胞吸収の程度を共焦点顕微鏡で視覚化した。図１１に示すように（図中、暗い灰色はＤＰＡＩ、明るい小さな点はｓｉＲＮＡを示す）、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡのみを細胞に処理した場合に比べて、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡがエキソソームに封入された実施例２の場合は、細胞内への流入が効率的に行われたことを確認することができる。
（７）電気穿孔法でＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入された乳由来のエキソソームの細胞内送達率の確認
前記実施例２と同じ電気穿孔法で乳由来のエキソソームに空隙を形成し、Ｃｙ３をラベリングしたＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡをそれぞれ封入し、３時間、４℃で安定化させた。ＲＡＷ２６４．７細胞の場合、３×１０５細胞／ディッシュ（ｃｅｌｌ／ｄｉｓｈ）の密度で共焦点ディッシュにプレートされた。対照群としてリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ）を用いてＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡを形質移入した。ＲＡＷ２６４．７細胞に対照群及び実施例２をそれぞれ処理し、２４時間後に細胞をＤＰＢＳで洗浄してからホルムアルデヒドで固定した後、Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２で１０分間核を染色した。染色された細胞を共焦点顕微鏡を用いて相対的な蛍光強度を撮像した（ｎ＝４）。撮像された画像の蛍光強度はＩｍａｇｅ Ｊプログラムによって測定された。
図１２に示したように（図中、暗い灰色はＨｏｅｃｈｓｔ、明るい灰色はＴＮＦ-ｓｉ-ＲＮＡを示す）、対照群を処理した細胞内の相対的なＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡ蛍光強度を１００とし（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ：１００±１７．１９）、これを細胞内送達率が１００％であると設定した。これに比べ、実施例２を処理した細胞内の相対的なＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡ蛍光強度は約７５％を示した（実施例２：７５．０４±１１．２５）。すなわち、実施例２の細胞内送達率は約７５％であることが分かる（ｔ-ｔｅｓｔ：ｎｓ）。
（８）ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入された乳由来のエキソソームの遺伝子沈黙効果の確認（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）
前記電気穿孔法と同じ条件で乳由来のエキソソームに空隙を形成し、乳由来のエキソソームとＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡとを１ｍｇ：１４μｇの割合で混合後、３時間インキュベートした。ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ、２４時間）で予め活性化させたＲＡＷ２６４．７細胞にＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入された乳由来のエキソソーム（実施例２）を濃度別に処理した。２４時間後、ｑＲＴ-ＰＣＲでＴＮＦ-α ｍＲＮＡの水準を測定した。その結果、濃度依存的にＴＮＦ-α ｍＲＮＡの発現が減少することを確認することができた（図１３）。
（９）抗炎症効果確認（ｉｎ ｖｉｖｏ）
ＤＳＳ ２．５％で炎症性腸疾患（ＩＢＤ）動物モデル（ＢＡＬＢ／ｃ、Ｆｅｍａｌｅ、８ｗ）を誘導した。乳由来のエキソソーム（比較例２）及びＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入された乳由来のエキソソーム（実施例２）を３日間隔で腹腔内注射し、体重変化及び疾患活動性指数（Ｄｉｓｅａｓｅ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｉｎｄｅｘ、ＤＡＩ）を測定し
た（図１４ａ）。点数は表２に表したとおりである。また、腸の長さと大腸組織をＨ＆Ｅで観察し、Ｈ＆Ｅ実験方法は実施例１．（１２）の方法と同じ方法を用いた。
実施例２を３日間隔で腹腔内注射した結果、ＩＢＤモデルで典型的に現われる体重減少が緩和されることを確認し（図１４ｂ）、ＤＡＩ点数が減少したことから推し量るに（図１４ｃ）、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡが封入された乳エキソソームがＩＢＤ炎症治療効果を奏することが分かる。
具体例
- 具体例１：乳由来のエキソソーム；及び治療剤を含み、前記治療剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は小分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であり、前記治療剤は、エキソソームの内部空間に位置して封入されることを特徴とする、腸の健康機能改善用組成物。
- 具体例２：当該組成物は、６０～９０％の細胞内送達率を有することを特徴とする、具体例１に記載の腸の健康機能改善用組成物。
- 具体例３：前記乳は、ヒト、牛、羊、山羊、ヤギ、ラクダ、バッファロー又はヤク由来の牛乳であるか、又は初乳（ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ）である、具体例１～２に記載の腸の健康機能改善用組成物。
- 具体例４：前記ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、及びａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡからなる群より選ばれた一つ以上のＲＮＡである、具体例１～３に記載の腸の健康機能改善用組成物。
- 具体例５：前記ｓｉＲＮＡは、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ-β ｓｉＲＮＡ、ＪＡＫ３ ｓｉＲＮＡ、及びＩＬ-６Ｒ ｓｉＲＮＡからなる群より選ばれた一つ以上のｓｉＲＮＡである、具体例４に記載の腸の健康機能改善用組成物。
- 具体例６：前記ｍｉＲＮＡは、Ｌｅｔ-７ｂ-５ｐ、ｍｉＲ-３２０ａ-３ｐ、及びｍｉＲ-２１からなる群より選ばれた一つ以上のｍｉＲＮＡである、具体例４に記載の腸の健康機能改善用組成物。
- 具体例７：当該組成物は液状剤形であり、前記治療剤が封入された乳由来のエキソソームを１００～１０００μｇ／ｍｌの濃度で含む、具体例１～６に記載の腸の健康機能改善用組成物。
- 具体例８：当該組成物は凍結乾燥剤形であり、前記治療剤が封入された乳由来のエキソソームを、組成物の総重量を基準として０．００１～１００重量％の範囲で含む、具体例１～７に記載の腸の健康機能改善用組成物。
- 具体例９：当該組成物は経口投与するものである、具体例１～８に記載の腸の健康機能改善用組成物。
- 具体例１０：具体例１～９の組成物を製造する方法であって、（ａ）乳からエキソソームを分離する段階；（ｂ）分離されたエキソソームを電気穿孔してエキソソームの表面に微細空隙を形成させる段階；（ｃ）前記（ｂ）段階の電気穿孔されたエキソソームと治療剤とを混合する段階；及び（ｄ）エキソソームの内部に封入されていない治療剤を除去する段階を含む、方法。
- 具体例１１：前記（ｂ）段階の電気穿孔は、２５０～３５０ｖの電圧を加えることを特徴とする、具体例１０に記載の方法。
- 具体例１２：前記（ｂ）段階の電気穿孔は、３～７回のパルスを加えることを特徴とする、具体例１０～１１に記載の方法。
- 具体例１３：前記（ｂ）段階の電気穿孔は、２０～４０ｍｓの時間の間パルスを加えることを特徴とする、具体例１０～１２に記載の方法。
- 具体例１４：前記（ａ）段階の乳は、ヒト、牛、羊、山羊、ヤギ、ラクダ、バッファロー又はヤク由来の乳であるか、又は初乳（ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ）であることを特徴とする、具体例１０～１３に記載の方法。
- 具体例１５：前記（ｃ）段階の治療剤はＤＮＡであり、前記（ｄ）段階はｄｎａｓｅを添加して封入されていない治療剤を除去する段階である、具体例１０～１４に記載の方法。
- 具体例１６：前記（ｃ）段階の治療剤はＲＮＡであり、前記（ｄ）段階はｒｎａｓｅを添加して封入されていない治療剤を除去する段階である、具体例１０～１５に記載の方法。
- 具体例１７：前記ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、及びａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡからなる群より選ばれた一つ以上のＲＮＡである、具体例１６に記載の方法。
- 具体例１８：前記ｓｉＲＮＡは、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ-β ｓｉＲＮＡ、ＪＡＫ３ ｓｉＲＮＡ、及びＩＬ-６Ｒ ｓｉＲＮＡからなる群より選ばれた一つ以上のｓｉＲＮＡである、具体例１７に記載の方法。
具体例１９：前記ｍｉＲＮＡは、Ｌｅｔ-７ｂ-５ｐ、ｍｉＲ-３２０ａ-３ｐ、及びｍｉＲ-２１からなる群より選ばれた一つ以上のｍｉＲＮＡである、具体例１７に記載の方法。

Claims (19)

  1. 乳由来のエキソソーム；及び治療剤を含み、
    前記治療剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は小分子（ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であり、
    前記治療剤は、エキソソームの内部空間に位置して封入されることを特徴とする、腸の健康機能改善用組成物。
  2. 当該組成物は、６０～９０％の細胞内送達率を有することを特徴とする、請求項１に記載の腸の健康機能改善用組成物。
  3. 前記乳は、ヒト、牛、羊、山羊、ヤギ、ラクダ、バッファロー又はヤク由来の乳であるか、又は初乳（ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ）である、請求項１に記載の腸の健康機能改善用組成物。
  4. 前記ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、及びａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡからなる群より選ばれた一つ以上のＲＮＡである、請求項１に記載の腸の健康機能改善用組成物。
  5. 前記ｓｉＲＮＡは、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ-β ｓｉＲＮＡ、ＪＡＫ３ ｓｉＲＮＡ、及びＩＬ-６Ｒ ｓｉＲＮＡからなる群より選ばれた一つ以上のｓｉＲＮＡである、請求項４に記載の腸の健康機能改善用組成物。
  6. 前記ｍｉＲＮＡは、Ｌｅｔ-７ｂ-５ｐ、ｍｉＲ-３２０ａ-３ｐ、及びｍｉＲ-２１からなる群より選ばれた一つ以上のｍｉＲＮＡである、請求項４に記載の腸の健康機能改善用組成物。
  7. 当該組成物は液状剤形であり、
    前記治療剤が封入された乳由来のエキソソームを１００～１０００μｇ／ｍｌの濃度で含む、請求項１に記載の腸の健康機能改善用組成物。
  8. 当該組成物は凍結乾燥剤形であり、
    前記治療剤が封入された乳由来のエキソソームを、組成物の総重量を基準として０．００１～１００重量％の範囲で含む、請求項１に記載の腸の健康機能改善用組成物。
  9. 当該組成物は経口投与するものである、請求項１に記載の腸の健康機能改善用組成物。
  10. 請求項１～９のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、
    （ａ）乳からエキソソームを分離する段階；
    （ｂ）分離されたエキソソームを電気穿孔してエキソソームの表面に微細空隙を形成させる段階；
    （ｃ）前記（ｂ）段階の電気穿孔されたエキソソームと治療剤とを混合する段階；及び
    （ｄ）エキソソームの内部に封入されていない治療剤を除去する段階を含む、方法。
  11. 前記（ｂ）段階の電気穿孔は、２５０～３５０ｖの電圧を加えることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  12. 前記（ｂ）段階の電気穿孔は、３～７回のパルスを加えることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  13. 前記（ｂ）段階の電気穿孔は、２０～４０ｍｓの時間の間パルスを加えることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  14. 前記（ａ）段階の乳は、ヒト、牛、羊、山羊、ヤギ、ラクダ、バッファロー又はヤク由来の乳であるか、又は初乳（ｃｏｌｏｓｔｒｕｍ）であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
  15. 前記（ｃ）段階の治療剤はＤＮＡであり、
    前記（ｄ）段階は、ｄｎａｓｅを添加して封入されていない治療剤を除去する段階である、請求項１０に記載の方法。
  16. 前記（ｃ）段階の治療剤はＲＮＡであり、
    前記（ｄ）段階は、ｒｎａｓｅを添加して封入されていない治療剤を除去する段階である、請求項１０に記載の方法。
  17. 前記ＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｎｃＲＮＡ、及びａｎｔｉｓｅｎｓｅ ＲＮＡからなる群より選ばれた一つ以上のＲＮＡである、請求項１６に記載の方法。
  18. 前記ｓｉＲＮＡは、ＴＮＦ-α ｓｉＲＮＡ、ＴＧＦ-β ｓｉＲＮＡ、ＪＡＫ３ ｓｉＲＮＡ、及びＩＬ-６Ｒ ｓｉＲＮＡからなる群より選ばれた一つ以上のｓｉＲＮＡである、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記ｍｉＲＮＡは、Ｌｅｔ-７ｂ-５ｐ、ｍｉＲ-３２０ａ-３ｐ、及びｍｉＲ-２１からなる群より選ばれた一つ以上のｍｉＲＮＡである、請求項１７に記載の方法。
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