JP2025108564A - ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離方法 - Google Patents

ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離方法

Info

Publication number
JP2025108564A
JP2025108564A JP2025065498A JP2025065498A JP2025108564A JP 2025108564 A JP2025108564 A JP 2025108564A JP 2025065498 A JP2025065498 A JP 2025065498A JP 2025065498 A JP2025065498 A JP 2025065498A JP 2025108564 A JP2025108564 A JP 2025108564A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
amino acid
seq
acid sequence
antibody
sequence shown
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2025065498A
Other languages
English (en)
Inventor
ちひろ 佐藤
Chihiro Sato
正弥 羽根
Masaya Hane
開都 早川
Kaito Hayakawa
健 北島
Takeshi Kitajima
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tokai National Higher Education and Research System NUC
Original Assignee
Tokai National Higher Education and Research System NUC
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tokai National Higher Education and Research System NUC filed Critical Tokai National Higher Education and Research System NUC
Publication of JP2025108564A publication Critical patent/JP2025108564A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/18—Antipsychotics, i.e. neuroleptics; Drugs for mania or schizophrenia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

【課題】ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離技術を提供すること。
【解決手段】多量体化ドメイン及び／若しくはストレプトアビジン結合タンパク質が付加されてなる抗体、並びに／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、キットを提供する。また、特定のアミノ酸配列を含む抗ポリシアル酸抗体、および、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体を含む群から選択される少なくとも1種の抗体、並びに／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含むキットを提供する。
【選択図】なし

Description

本発明は、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出・分離方法等に関する。
ポリシアル酸（シアル酸重合体）は、主に細胞間接着分子であるNCAMの修飾糖鎖として存在しており、NCAMの機能制御を担い、またポリシアル酸独自の機能を担っていることが知られている。ポリシアル酸は、従来、細胞間の反発性の場を提示し、細胞間隙を調節して細胞内シグナル強度を制御することが報告されてきた。しかし、近年、ポリシアル酸は、誘因性の場を提示し、各種分子群と特異的に結合することが報告されている。また、ポリシアル酸は、がん細胞に発現すること、精神疾患患者で発現異常が起こっていること、神経変性疾患患者で発現異常が起こっていること、免疫細胞（NK細胞等）の表面上に存在すること等が知られている（非特許文献１）。
Sato, C. and Kitajima, K., Polysialylation and disease. Molecular Aspects of Medicine, 2020 Aug 27;100892.
本発明は、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離技術を提供することを課題とする。
本発明者は上記課題に鑑みて鋭意研究を進めた結果、（抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；（抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；（抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；（抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；（抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び（抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を用いることにより、上記課題を解決できることを見出した。即ち、本発明は、下記の態様を包含する。
項１． （抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
（抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
（抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
（抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
からなる群より選択される少なくとも1種の抗体、及び／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、キット。
項２． 前記抗体Aが、
（抗体A1）配列番号2で示されるアミノ酸配列A1L1のN末端から39番目のチロシン残基、若しくは前記アミノ酸配列A1L1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A1L2における前記チロシン残基に対応するチロシン残基が、他のアミノ酸残基に変異してなるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体、又は
（抗体A2）配列番号20で示されるアミノ酸配列A2L1のN末端から37番目のチロシン残基、若しくは前記アミノ酸配列A2L1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A2L2における前記チロシン残基に対応するチロシン残基が、他のアミノ酸残基に変異してなるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体
である、項１に記載のキット。
項３． 前記抗体Bが、重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体である、項１又は２に記載のキット。
項４． 前記抗体C及び／又は前記抗体DがIgG抗体である、項１～３のいずれかに記載のキット。
項５． 前記抗体Eが、前記抗体AX、前記抗体B、前記抗体C、又は前記抗体Dにストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗ポリシアル酸抗体である、項１～４のいずれかに記載のキット。
項６． ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離用である、項１～５のいずれかに記載のキット。
項７． ポリシアル酸関連疾患の検査用、又はポリシアル酸発現細胞の分離用である、項１～６のいずれかに記載のキット。
項８． （抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
（抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
（抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
（抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
からなる群より選択される少なくとも1種の抗体、及び／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、試薬。
項９． （抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
（抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
（抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
（抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を試料と接触させる工程を含む、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出方法。
項１０． 前記抗体とポリシアル酸又はポリシアル酸保持体とを含む複合体を可視化することを含む、項９に記載の検出方法。
項１１． ELISA法である、項９又は１０に記載の検出方法。
項１２． 前記ELISA法がサンドイッチELISA法である、項１１に記載の検出方法。
項１３． （抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
（抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
（抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
（抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を試料と接触させる工程、及び前記抗体への結合画分と前記抗体への非結合画分を分離する工程を含む、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の分離方法。
項１４． 下記抗体A～抗体Eのいずれかの抗体、及び／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチド：
（抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
（抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
（抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
（抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
（抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体。
本発明によれば、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離技術を提供することができる。
実施例1における、ブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングおよびマウス胎児脳(MEB)を用いたELISAの結果を示す。 実施例2における、ブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングおよびマウス胎児脳(MEB)を用いたELISAの結果を示す。 実施例2における、組織染色の結果を示す。 実施例3における、ブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングの結果を示す。 実施例4における、認識能の異なる2種類の抗ポリシアル酸抗体を用いたサンドイッチELISAの結果を示す。 実施例5における、ブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングおよびマウス胎児脳(MEB)を用いたELISAの結果を示す。 実施例6における、ブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングおよびマウス胎児脳(MEB)を用いたELISAの結果を示す。 実施例7における、マウス胎児脳(MEB)を用いたELISAの結果を示す。 実施例1で使用又は作製した材料のアミノ酸配列を示す。 実施例5で使用又は作製した材料のアミノ酸配列を示す。 実施例9における、マウス胎児脳(MEB)を用いたELISAの結果を示す。 実施例10における、ガングリオシドGD3用いたELISAの結果を示す。
1．定義
本明細書中において、「含有」及び「含む」なる表現については、「含有」、「含む」、「実質的にからなる」及び「のみからなる」という概念を含む。
本明細書においては、アミノ酸／アミノ酸残基を一文字表記で表すこともある。
アミノ酸配列の「同一性」とは、2以上の対比可能なアミノ酸配列の、お互いに対するアミノ酸配列の一致の程度をいう。従って、ある2つのアミノ酸配列の一致性が高いほど、それらの配列の同一性又は類似性は高い。アミノ酸配列の同一性のレベルは、例えば、配列分析用ツールであるFASTAを用い、デフォルトパラメータを用いて決定される。若しくは、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムBLAST（KarlinS，Altschul SF．“Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoringschemes”Proc Natl Acad Sci USA．87:2264－2268（1990）、KarlinS，Altschul SF．“Applications and statistics for multiple high－scoring segments in molecular sequences．”Proc Natl Acad Sci USA．90:5873－7（1993））を用いて決定できる。このようなBLASTのアルゴリズムに基づいたBLASTXと呼ばれるプログラムが開発されている。これらの解析方法の具体的な手法は公知であり、National Center of Biotechnology Information（NCBI）のウェエブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を参照すればよい。また、塩基配列の『同一性』も上記に準じて定義される。
本明細書中において、「保存的置換」とは、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置換されることを意味する。例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジンといった塩基性側鎖を有するアミノ酸残基同士で置換されることが、保存的な置換にあたる。その他、アスパラギン酸、グルタミン酸といった酸性側鎖を有するアミノ酸残基；グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システインといった非帯電性極性側鎖を有するアミノ酸残基；アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンといった非極性側鎖を有するアミノ酸残基；スレオニン、バリン、イソロイシンといったβ－分枝側鎖を有するアミノ酸残基；チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンといった芳香族側鎖を有するアミノ酸残基同士での置換も同様に、保存的な置換にあたる。
本明細書中において、「CDR」とは、Complementarity Determining Regionの略であり、相補性決定領域とも称される。CDRとは、イムノグロブリンの可変領域に存在する領域であり、抗体が有する抗原への特異的な結合に深く関与する領域である。そして、「軽鎖CDR」とはイムノグロブリンの軽鎖の可変領域に存在するCDRであり、「重鎖CDR」とはイムノグロブリンの重鎖の可変領域に存在するCDRのことを意味する。
本明細書中において、「可変領域」とは、上述したCDR1～CDR3（以下、単に「CDRs1-3」という）を含む領域のことを意味する。これらのCDRs1-3の配置順序は特に限定はされないが、好ましくは、N末端側からC末端側の方向に、CDR1、CDR2、及びCDR3の順か、若しくはこの逆の順に、連続又は後述するフレームワーク領域（FR）と称される他のアミノ酸配列を介して、配置された領域を意味する。そして「重鎖可変領域」とは、上述の重鎖CDRs1-3が配置された領域であり、「軽鎖可変領域」とは、上述の軽鎖CDRs1-3が配置された領域である。
各可変領域の上記CDR1-3以外の領域は、上述するようにフレームワーク領域（FR）と称される。特に可変領域のN末端と上記CDR1との間の領域をFR1、CDR1とCDR2との間の領域をFR2、CDR2とCDR3との間の領域をFR3、CDR3と可変領域のC末端との間をFR4とそれぞれ定義される。
FRは、上述した抗原認識配列として特に重要なCDRs1-3を繋ぐリンカー配列としての機能も兼ね備えており、可変領域全体の立体構造形成に寄与する領域である。
2．抗体
本発明は、一態様において、抗体A、抗体AX、抗体B、抗体C、抗体D、及び抗体E（本明細書において、これらをまとめて「本発明の抗体」と示すこともある。）に関する。以下に、これらについて説明する。
2-1．抗体A
抗体Aは、軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体、である。
軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基は、軽鎖CDR1内のチロシン残基であって、軽鎖CDR1内のC末端側に存在するチロシン残基であり、この限りにおいて特に制限されない。「C末端側」とは、例えば軽鎖CDR1のC末端アミノ酸残基を含む1～5つ（好ましくは1～3つ、より好ましくは1～2つ、さらに好ましくは1つ）のアミノ酸残基からなる領域を示す。上記チロシン残基は、軽鎖CDR1内のC末端側に複数のチロシン残基が存在する場合は、最もC末端側のチロシン残基であることが好ましい。
抗体Aは、抗ポリシアル酸抗体において、上記チロシン残基置換が導入された抗体であり、当該チロシン残基置換によりポリシアル酸に対する反応性/結合性が大きく低下している（後述の実施例2のELISAで測定される、ポリシアル酸に対する反応性/結合性が、チロシン残基置換導入前の反応性/結合性100％に対して、例えば50％以下、好ましくは40％以下、より好ましくは30％以下、さらに好ましくは20％以下、よりさらに好ましくは10％以下、とりわけ好ましくは5％以下である）ので、ポリシアル酸ネガティブ抗体として使用することができる。
「他のアミノ酸残基」は、チロシン残基以外のアミノ酸残基である限り、特に制限されない。他のアミノ酸残基としては、例えばG、A、V、I、L等の脂肪族アミノ酸； C、M等の含硫アミノ酸； K、H、R等の塩基性アミノ酸； N、Q等のアミド基含有アミノ酸； S、T等のヒドロキシ基含有アミノ酸； F、W等の芳香族アミノ酸； D、E等の酸性アミノ酸； P等のイミノ酸等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、G、A、V、I、L等の脂肪族アミノ酸； K、H、R等の塩基性アミノ酸； S、T等のヒドロキシ基含有アミノ酸； Wである芳香族アミノ酸； D、E等の酸性アミノ酸等が挙げられ、より好ましくはA、S、I、D、K、W等が挙げられる。
抗体Aは、通常、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。
抗体Aは、抗ポリシアル酸抗体に対して上記チロシン残基置換以外の変異が導入されたものであってもよい。変異としては、アミノ酸の置換、欠失、挿入等が挙げられる。当該変異のアミノ酸残基の数は、抗体構造が保たれる限り特に制限されないが、例えば0～20、0～10、又は0～5であり、或いは抗体（又は重鎖/軽鎖可変領域、重鎖/軽鎖定常領域）の全アミノ酸残基数100％に対して例えば10％以下、5％以下、2％以下、又は1％以下である。
抗体Aは、その一態様において、（抗体A1）配列番号2で示されるアミノ酸配列A1L1のN末端から39番目のチロシン残基、若しくは前記アミノ酸配列A1L1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A1L2における前記チロシン残基に対応するチロシン残基が、他のアミノ酸残基に変異してなるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体、であることが好ましい。
抗体A1は、アミノ酸配列A1L1を軽鎖可変領域として含む抗ポリシアル酸抗体において、上記チロシン残基置換が導入された抗体である。
アミノ酸配列A1L2のアミノ酸配列A1L1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％未満である。アミノ酸配列A1L2において、アミノ酸配列A1L1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば1～5、好ましくは1～2、より好ましくは1である。
なお、本明細書において、「対応するチロシン残基」とは、2つの配列をBLAST（設定はデフォルト）で比較した場合に、アライメント配列上同一の位置のチロシン残基であることを示す。例えば、上記の場合であれば、「アミノ酸配列A1L2における前記チロシン残基に対応するチロシン残基とは、アミノ酸配列A1L1とアミノ酸配列A1L2と配列比較して得られるアライメント配列において、アミノ酸配列A1L2における、アミノ酸配列A1L1のN末端から39番目のチロシン残基と同一の位置のチロシン残基を示す。
抗体A1は、配列番号3で示されるアミノ酸配列A1H1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A1H2を含む重鎖可変領域を含むことが好ましい。
アミノ酸配列A1H2のアミノ酸配列A1H1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列A1H2において、アミノ酸配列A1H1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
抗体Aは、その一態様において、（抗体A2）配列番号20で示されるアミノ酸配列A2L1のN末端から37番目のチロシン残基、若しくは前記アミノ酸配列A2L1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A2L2における前記チロシン残基に対応するチロシン残基が、他のアミノ酸残基に変異してなるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体、であることが好ましい。
抗体A2は、アミノ酸配列A2L1を軽鎖可変領域として含む抗ポリシアル酸抗体において、上記チロシン残基置換が導入された抗体である。
アミノ酸配列A2L2のアミノ酸配列A2L1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％未満である。アミノ酸配列A2L2において、アミノ酸配列A2L1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば1～5、好ましくは1～2、より好ましくは1である。
抗体A2は、配列番号24で示されるアミノ酸配列A2H1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A2H2を含む重鎖可変領域を含むことが好ましい。
アミノ酸配列A2H2のアミノ酸配列A2H1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列A2H2において、アミノ酸配列A2H1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
抗体Aは、ポリシアル酸に対する反応性が低く、ポリシアル酸検出・分離におけるネガティブコントロールとして使用することができる。
2-1X．抗体AX
抗体AXは、配列番号33又は配列番号34（好ましくは配列番号33）で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36（好ましくは配列番号36）で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体、である。
抗体AXは、軽鎖可変領域が配列番号2で示されるアミノ酸配列AXL1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列AXL2を含むことが好ましい。
アミノ酸配列AXL2のアミノ酸配列AXL1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列AXL2において、アミノ酸配列AXL1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
抗体AXは、重鎖可変領域が配列番号3で示されるアミノ酸配列AXH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列AXH2を含むことが好ましい。
アミノ酸配列AXH2のアミノ酸配列AXH1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列AXH2において、アミノ酸配列AXH1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
抗体AXは、IgG抗体であることが好ましい。
抗体AXは、ポリシアル酸の検出/分離に用いることができ、例えばサンドイッチELISA等の複数種の抗ポリシアル酸抗体が必要なアッセイに利用することができる。
2-2．抗体B
抗体Bは、重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体、である。
抗体Bは、マウス由来のCDR配列を有する抗体のヒト化抗体である。
アミノ酸配列BH2のアミノ酸配列BH1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列BH2において、アミノ酸配列BH1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
抗体Bは、配列番号14で示されるアミノ酸配列BL1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BL2を含む軽鎖可変領域を含むことが好ましい。
アミノ酸配列BL2のアミノ酸配列BL1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列BL2において、アミノ酸配列BL1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
上記において、アミノ酸配列BH1又はアミノ酸配列BL1に対して変異した配列である場合、その変異箇所及び変異内容は、ポリシアル酸への反応性が著しく損なわれず、且つヒト化配列部分が著しく変異していない限りにおいて、特に制限されない。当該変異箇所及び変異内容は、各生物種の抗体配列情報、実施例5の内容（図10等）の情報等に基づいて、適宜決定することができる。
ポリシアル酸への反応性の観点から、抗体Bは、配列番号4で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号7で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含むことが好ましい。
抗体Bが定常領域を有する場合、そのアミノ酸配列は、ヒト抗体の定常領域のアミノ酸配列である。
抗体Bは、後述の実施例5のELISAで測定される、ポリシアル酸に対する反応性/結合性が、実施例5で得られたヒト化抗体の反応性/結合性100％に対して、例えば50％以上、好ましくは60％以上、より好ましくは70％以上、さらに好ましくは80％以上、よりさらに好ましくは90％以上である。当該反応性/結合性の上限は特に制限されず、例えば500％、300％、200％、150％、又は120％である。
抗体Bは、ヒト化抗体として、体内診断等において好適に利用することができる。
2-3．抗体C
抗体Cは、配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体、である。
抗体Cは、軽鎖可変領域が配列番号20又は配列番号37（好ましくは配列番号37）で示されるアミノ酸配列CL1に対して95％以上（好ましくは100％）の同一性を有するアミノ酸配列CL2を含むことが好ましい。
アミノ酸配列CL2のアミノ酸配列CL1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列CL2において、アミノ酸配列CL1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
抗体Cは、重鎖可変領域が配列番号24で示されるアミノ酸配列CH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列CH2を含むことが好ましい。
アミノ酸配列CH2のアミノ酸配列CH1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列CH2において、アミノ酸配列CH1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
抗体Cは、IgG抗体であることが好ましい。
抗体Cは、ポリシアル酸の検出/分離に用いることができ、例えばサンドイッチELISA等の複数種の抗ポリシアル酸抗体が必要なアッセイに利用することができる。
2-4．抗体D
抗体Dは、配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体、である。
抗体Dは、軽鎖可変領域が配列番号28で示されるアミノ酸配列DL1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列DL2を含むことが好ましい。
アミノ酸配列DL2のアミノ酸配列DL1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列DL2において、アミノ酸配列DL1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
抗体Dは、重鎖可変領域が配列番号32で示されるアミノ酸配列DH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列DH2を含むことが好ましい。
アミノ酸配列DH2のアミノ酸配列DH1に対する同一性は、好ましくは97％以上、より好ましくは98％以上、さらに好ましくは99％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列DH2において、アミノ酸配列DH1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～5、好ましくは0～2、より好ましくは0～1である。
抗体Dは、IgG抗体であることが好ましい。
抗体Dは、ポリシアル酸の検出/分離に用いることができ、例えばサンドイッチELISA等の複数種の抗ポリシアル酸抗体が必要なアッセイに利用することができる。
2-5．抗体E
抗体Eは、ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体、である。ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインの付加により検出感度を向上させることが可能である。
抗体Eの標的としては、特に制限されず、例えばポリシアル酸等の糖鎖、タンパク質、ペプチド等が挙げられる。
ストレプトアビジン結合タンパク質は、ストレプトアビジンに対して結合性を有するタンパク質である限り特に制限されない。ストレプトアビジン結合タンパク質としては、例えば各種生物（動物、植物、微生物）由来のものを採用することができる。ストレプトアビジン結合タンパク質の具体例としては、配列番号11で示されるアミノ酸配列E1に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列E2からなるタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列E2のアミノ酸配列E1に対する同一性は、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上であり、よりさらに好ましくは98％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列E2において、アミノ酸配列E1から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～30、好ましくは0～15、より好ましくは0～10、さらに好ましくは0～5、よりさらに好ましくは0～2である。
多量体化ドメインは、互いに結合して多量体を形成可能なドメインであり、その限りにおいて特に制限されない。多量体化ドメインとしては、例えば軟骨オリゴマーマトリックスタンパク質ドメイン、ロイシンジッパードメイン、コラーゲン様ドメイン、コレラトキシンBサブユニットドメイン、テトラブラキオンコイルドコアドメイン、レオウイルスσ1タンパク質ドメイン、ヘパチチスデルタ抗原ドメイン等が挙げられる。多量体化ドメインの具体例としては、配列番号10で示されるアミノ酸配列E3に対して70％以上の同一性を有するアミノ酸配列E4からなるタンパク質が挙げられる。アミノ酸配列E4のアミノ酸配列E3に対する同一性は、好ましくは80％以上、より好ましくは90％以上、さらに好ましくは95％以上であり、よりさらに好ましくは98％以上であり、いずれの場合でも100％以下である。アミノ酸配列E4において、アミノ酸配列E3から変異しているアミノ酸残基の数は、例えば0～30、好ましくは0～15、より好ましくは0～10、さらに好ましくは0～5、よりさらに好ましくは0～2である。
ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインの付加の態様は特に制限されず、抗体との融合タンパク質の状態で付加されていてもよいし、抗体と化学架橋により付加されていてもよい。また、ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインは、抗体に直接付加されていてもよいし、リンカー（ペプチドリンカー（例えばGとSから構成されるリンカー等）、鎖状構造の二価の基（例えば置換されていてもよいアルキレン基、置換されていてもよいヘテロアルキレン基等））、ペプチドタグ（例えばHisタグ等の精製タグ等）等の他の構造を介して抗体に付加されていてもよい。抗体の結合性への影響を抑えるために、ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインを付加させる位置は、抗体可変領域とは反対側の末端であることが好ましい。
抗体Eは、IgG抗体であることが好ましい。また、抗体Eは、通常、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域を含む。これらの可変領域又はこれらの可変領域中のCDR配列は、IgM抗体由来の可変領域又はCDR抗体であることが好ましい。IgM抗体の可変領域を用いてIgG抗体を得る（例えば、IgM抗体の可変領域とIgG抗体の定常領域とを融合させてなるキメラ抗体を得る）場合、得られたIgG抗体の標的に対する結合性が大きく低下し得る。この場合、ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインを付加することにより、結合性を向上させることが可能である。
抗体Eは、抗体AX、抗体B、抗体C、又は抗体Dにストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗ポリシアル酸抗体であることが好ましい。
2-6．共通事項
本発明の各抗体について、上記で説明した構成以外の構成については以下のとおりである。
本発明の抗体は、好ましくはモノクローナル抗体である。
本発明の抗体の分子量は、特に制限されないが、下限は、例えば20,000、好ましくは50,000、好ましくは100,000、より好ましくは120,000であり、上限は、例えば1,000,000、好ましくは500,000、より好ましくは200,000である。
本発明の抗体の構造は、特に制限されない。本発明の抗体は、定常領域を含むものであってもよいし、定常領域を含まないものであってもよい。定常領域を含む場合、重鎖の定常領域（CH1、CH2、及びCH3）並びに軽鎖の定常領域（CL）の全てを含んでいてもよいし、これらの内の任意の1種又は2種以上の組み合わせを含んでいてもよい。
本発明の抗体の構造の具体例としては、イムノグロブリン、Fab、F(ab’)2、ミニボディ（minibody）、scFv‐Fc、Fv、scFv、ディアボディ（diabody）、トリアボディ（triabody）、テトラボディ（tetrabody）などが挙げられる。これらの中でも、本発明の効果の観点から、好ましくはイムノグロブリンが挙げられる。
イムノグロブリンは、重鎖可変領域及び重鎖定常領域を有する1本の重鎖と軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を有する1本の軽鎖から成る構造が2つ組み合わされた構造を有する。
Fabとは、重鎖可変領域及び重鎖定常領域中のCH1を含む重鎖の断片と、軽鎖可変領域および軽鎖定常領域（CL）を含む軽鎖とを含み、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが上述する非共有結合性の分子間相互作用によって会合するか、またはジスルフィド結合によって結合してなる構造を有する。Fabにおいて、CH1とCLとは、それぞれに存在するシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合していてもよい。
F(ab’)2とは、2対の上記Fabを有し、CH1同士がこれらに含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合してなる構造である。
ミニボディとは、下記scFvを構成する重鎖可変領域にCH3が結合した断片2つが、CH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。
scFv‐Fcとは、下記scFv、CH2、およびCH3を含む抗体断片2つが、上記ミニボディと同様にCH3同士で非共有結合性の分子間相互作用によって会合し、それぞれのCH3に含まれるシステイン残基のチオール基同士でジスルフィド結合した構造である。
Fvとは、抗体の最小構造単位ともいわれ、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とが非共有結合性の分子間相互作用によって会合した構造である。Fvにおいて、重鎖可変領域および軽鎖可変領域内に存在するシステイン残基のチオール基同士がジスルフィド結合していてもよい。
scFvとは、重鎖可変領域のC末端と軽鎖可変領域のN末端がリンカーで繋がれた構造、又は重鎖可変領域のN末端と軽鎖可変領域のC末端とがリンカーで繋がれた構造であり、単鎖抗体とも呼ばれる。
ディアボディ、トリアボディ、およびテトラボディとは、それぞれ上記scFvが2量体、3量体および4量体を形成し、Fvなどと同様に可変領域同士の非共有結合性の分子間相互作用等により、構造的に安定な状態で会合した構造である。
本発明の抗体がイムノグロブリンである場合、そのクラスは特に制限されない。該クラスとしては、例えばIgA、IgD、IgE、IgG、IgMなど、さらにはこれらのサブクラスが挙げられる。好ましいクラスとしては、例えばIgGが挙げられる。
本発明の抗体の由来は特に制限されない。本発明の抗体は、例えばヒト由来抗体、マウス由来抗体、ラット由来抗体、ウサギ由来抗体、サル由来抗体、チンパンジー由来抗体などであり得る。また、本発明の抗体は、キメラ抗体（例えばヒト以外の生物（マウスなど）由来抗体の定常領域のアミノ酸配列をヒト由来抗体の定常領域のアミノ酸配列に置き換えられてなる抗体）、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体などであってもよい。
本発明の抗体は、例えば、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドにより形質転換させた宿主を培養し、本発明の抗体を含む画分を回収する工程を含む方法によって製造することができる。
本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、本発明の抗体を発現可能な状態で含む限りにおいて特に制限されず、本発明の抗体のコード配列以外に、他の配列を含んでいてもよい。他の配列としては、本発明の抗体コード配列に隣接して配置される分泌シグナルペプチドコード配列、プロモーター配列、エンハンサー配列、リプレッサー配列、インスレーター配列、複製基点、薬剤耐性遺伝子コード配列などが挙げられる。また、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドは、直鎖状のポリヌクレオチドであってもよいし、環状のポリヌクレオチド（ベクターなど）であってもよい。
ポリヌクレオチドの具体例としては、（I）本発明の抗体の重鎖、重鎖可変領域、及び重鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、（II）本発明の抗体の軽鎖、軽鎖可変領域、及び軽鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、（III）本発明の抗体の重鎖、重鎖可変領域、及び重鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチド、並びに本発明の抗体の軽鎖、軽鎖可変領域、及び軽鎖CDRs1-3からなる群より選択される少なくとも1種をコードする塩基配列を含むポリヌクレオチドなどが挙げられる。
宿主は、特に制限されず、例えば昆虫細胞、真核細胞、哺乳類細胞等が挙げられる。中でも、抗体をより効率的に発現させる観点から、哺乳類細胞であるHEK細胞、CHO細胞、NS0細胞、SP2/O細胞、P3U1細胞などが好ましい。形質転換、培養、及び回収の方法は、特に制限されず、抗体製造における公知の方法を採用することができる。回収後は、必要に応じて本発明の抗体を精製してもよい。精製は、抗体製造における公知の方法、例えばクロマトグラフィー、透析などにより行うことができる。
3．試薬、キット
本発明は、その一態様において、本発明の抗体、及び／又は本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、試薬或いはキット、に関する。
本発明の試薬は、必要に応じてさらに他の成分を含んでいてもよい。他の成分としては、特に限定されるものではないが、例えば基剤、担体、溶剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、安定剤、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、増粘剤、保湿剤、着色料、香料、キレート剤等が挙げられる。
本発明のキットは、必要に応じて、遺伝子導入試薬、細胞、緩衝液等、本発明の方法の実施等に必要な他の材料、試薬、器具等を適宜含んでいてもよい。
本発明の試薬、キットは、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離に用いることができる。より具体的には、ポリシアル酸関連疾患の検査用、又はポリシアル酸発現細胞の分離に用いることができる。これらの用途の具体的態様については、次項（4．検出、分離方法）で説明する。
ポリシアル酸関連疾患としては、がん（例えば卵巣がん、肝臓がん、膵臓がん、膀胱がん、尿道がん、大腸がん、皮膚がん、悪性メラノーマ、骨肉腫、頭頚部の扁平上皮がん、胃がん、前立腺がん、乳がん、肺がん、結腸がん、リンパ腫、肝がん、中皮腫、黒色腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経線維腫、神経膠芽細胞腫、上衣細胞腫、神経鞘腫、神経線維肉腫、神経髄芽細胞腫、線維肉腫、扁平上皮細胞がん、神経外胚葉細胞がん、甲状腺腫瘍、下垂体腫瘍、類表皮がん腫等）、精神疾患（統合失調症、双極性障害、うつ病）、神経変性疾患（ハンチントン病、アルツハイマー病、虚血）等が挙げられる。
ポリシアル酸保持体は、ポリシアル酸を保持するもの（例えばタンパク質、細胞等）である限り、特に制限されない。具体例として、ポリシアル酸発現細胞（NK細胞等の免疫細胞等）が挙げられる。ポリシアル酸発現細胞は、ポリシアル酸が細胞表面上に保持されている細胞である。
4．検出、分離方法
本発明は、その一態様において、本発明の抗体を試料と接触させる工程（接触工程）を含む、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出方法（本発明の検出方法）、に関する。また、本発明は、その一態様において、接触工程、及び前記抗体への結合画分と前記抗体への非結合画分を分離する工程（分離工程）を含む、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の分離方法（本発明の分離方法）、に関する。以下、これらについて説明する。
試料は、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体を含み得るものであれば特に制限されず、例えば生体試料であることができる。生体試料の由来生物種としては、特に制限されず、例えばヒト、サル、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウサギなどの種々の哺乳類動物、ウニなどのその他後口動物、バクテリアの莢膜多糖が挙げられ、好ましくはヒトが挙げられる。
生体試料としては、特に制限されず、組織（例えば脳組織、各種がんが存在し得る組織等）、体液（例えば全血、血清、血漿、髄液、唾液、関節液、尿、組織液（気管支肺胞洗浄液を含む）、汗、涙、喀痰、鼻汁等）等、さらにはこれらに由来する（例えば、酵素処理、精製処理等の各種処理を経て得られる）試料等が挙げられる。
接触工程は、in vitro又はin vivoで行うことができる。接触をin vivoで行う場合、本発明の抗体を生体に投与することにより、本発明の抗体と試料とを接触させることができる。
本発明の検出方法において、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出は、本発明の抗体とポリシアル酸又はポリシアル酸保持体とを含む複合体を検出（例えば、可視化）することにより行うことができる。具体的には、例えば各種免疫学的測定法、より具体的には免疫組織化学染色法、ELISA法、サンドイッチELISA法、EIA法、RIA法、ウェスタンブロッティング法等が挙げられる。
本発明の検出方法により検出されたポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の量又は濃度に基づいて、ポリシアル酸関連疾患を検査することができる。例えば、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の量又は濃度に基づいて、ポリシアル酸関連疾患の判定を補助することができる。
分離工程の具体的態様は、特に制限されない。例えば、接触工程の際に本発明の抗体を支持体（担体粒子、基材等）に固定させておき、或いは接触工程の後に本発明の抗体を支持体に固定させ、分離工程において支持体と上清とを分離すること（例えば支持体を洗浄すること）により行うことができる。分離後は、必要に応じて、本発明の抗体とポリシアル酸又はポリシアル酸保持体との複合体を、或いはポリシアル酸又はポリシアル酸保持体を、遊離させることができる。
以下に、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。
実施例1．マウス抗polySia-hIgG1キメラ抗体の作製
下記説明中の配列（配列番号1～3）を図9に示す。図9中、L鎖CDR配列及びH鎖CDR配列の配列番号は次のとおりである。L鎖CDR1：配列番号4、L鎖CDR2：配列番号5、L鎖CDR3：配列番号6、H鎖CDR1：配列番号7、H鎖CDR2：配列番号8、H鎖CDR3：配列番号9。
マウス抗polySia（＝polysialic acid）抗体scFvの発現ベクター（pCold-マウス抗polySia scFv (配列1：配列番号1)）よりマウス抗polySia可変部軽鎖およびマウス抗polySia可変部重鎖領域をPCR法により増幅し、ヒトIgG定常領域の配列を持つpAb-LCおよびpAb-HC Expression Vectorにそれぞれseamless ligation法によってサブクローニングし、pAb-マウス抗polySia LC (可変部、配列2-1：配列番号2)およびpAb-マウス抗polySia HC (可変部、配列2-2：配列番号3)を構築した。これらをExpi293F細胞に共に遺伝子導入し、培養上清をマウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体画分として得た。このマウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体画分を用いてポリシアル酸が高く発現しているブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングおよびマウス胎児脳(MEB)を用いたELISAを行い、その抗体の認識能を確認した（図1）。
実施例2．マウス抗polySia -hIgG1キメラ（ネガティブ）抗体の作製
実施例1で作製したマウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体において可変部軽鎖（配列番号2）の39番目のチロシン残基をアラニン残基に点変異させたネガティブコントロール抗体の作製を行なった。その結果、ポリシアル酸が高く発現しているブタ胎児脳はウエスタンブロッティングで検出できないネガティブ抗体であった（図2）。さらに、39番目のチロシン残基への点変異導入の影響の普遍性を確かめるために、アラニンだけではなく、セリン、イソロイシン、アスパラギン酸、リジン、フェニルアラニン、トリプトファンにそれぞれ変異させたY39A変異体、Y39S変異体、Y39I変異体、Y39D変異体、Y39K変異体、Y39F変異体、Y39W変異体を作製した。これらのアミノ酸は電荷や疎水性などの性質の異なるものの代表として作製した。CBB染色により分泌された抗体を確認したところ、タンパク質としての発現量や安定性に大きな影響は見られなかった（図2）。そして、ブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングでは、その活性は、チロシン同様に芳香族アミノ酸であるフェニルアラニンに変異したY39F変異体には半分程度の活性が残るものの同じく芳香族であるトリプトファンを含め、その他変異体は検出限界以下のネガティブ抗体であった（図2）。さらに、MEBを用いてELISAを行った結果、Y39I変異体が全く反応性を持たない完全ネガティブ抗体であった（図2）。また、マウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体およびネガティブコントロール抗体の有用性を組織染色により示した（図3）。
実施例3．高機能化マウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体の作製
実施例1で作製したマウス抗polySia hIgG1キメラ抗体を多量体化し、その高機能化を行なった。pAb-マウス抗polySiaHCの定常部に5量体化ドメインを持つAVEXIS配列（配列番号10）および、6xHisTag、SBP（ストレプトアビジン結合タンパク質） Tag（配列番号11）を融合し、マウス抗polySia-hIgG1-x5-His-SBP（FL-x5-His-SBP）を作製した。また、hIgG1定常部をヒンジ領域までにしたマウス抗polySia-hIgG1(Hinge)-x5-His-SBP（Hinge-x5-His-SBP）、マウス抗polySia-hIgG1(Hinge)-x5-His（Hinge-x5-His）を作製した。さらに、単量体ではあるがSBP Tagを融合したマウス抗polySia-hIgG1-SBPを作製した。それぞれ、ブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングを行い、その抗体の認識能を確認した。SBP Tagを融合した抗体はStreptavidin-PODによる検出が可能となった（図4）。
実施例4．ポリシアル酸を高感度に検出するサンドイッチELISAの確立
微量なポリシアル酸を検出するため、認識能の異なる2種類の抗ポリシアル酸抗体を用いたサンドイッチELISA法を開発した。具体的には、マウスIgM抗ポリシアル酸抗体（実施例6で作製）を96well plateに固層化し、サンプルを添加しマウスIgM抗ポリシアル酸抗体によりポリシアル酸鎖をキャプチャーし、そしてBSAを用いてブロッキングを行ない、上述した高機能化マウス抗polySia-hIgG1キメラ抗体の一つであるマウス抗polySia-hIgG1-SBPによりキャプチャーされているポリシアル酸鎖を認識し、抗体に付加されているSBPをStreptavidin-PODで認識させた。そしてTMB溶液を基質としPODの活性を用いて呈色させ、A450を測定した。その結果、MEBは1 ng、ポリシアル酸転移酵素を遺伝子導入し、ポリシアル酸を発現させたメラノーマB16細胞の溶解液は125 ng、バクテリア莢膜由来のポリシアル酸（colominic acid）は5 ng、精製したpolySia-NCAM-Fcは0.2 ngまでの定量が可能であった（図5）。
実施例5．完全ヒト化抗polySia抗体の作製
下記説明中の配列（配列番号12～16）を図10に示す。
マウス抗polySia抗体のCDR領域をヒトIgG抗体に移植し、完全ヒト化抗polySia抗体の作製を目指した。移植するヒトIgG抗体として、トラスツズマブの配列(可変部、配列3：配列番号12及び13)を用いた(可変部、配列4：配列番号14及び15)。しかし、その活性は検出限界以下であった。そこで、他のマウスIgGおよびヒトIgGの配列を比較し、重鎖の配列のCDR以外の部分の調整を行った(可変部、配列5：配列番号16)。その結果、その活性はマウス抗polySia-hIgG1キメラ抗体には劣るものの完全ヒト化を達成した（図6）。
実施例6．マウスIgM抗ポリシアル酸抗体のCDR配列のクローニングおよびその活性の評価
マウスIgM抗ポリシアル酸抗体を生産するハイブリドーマよりcDNAを調製し、可変部軽鎖および可変部重鎖領域をPCR法によりクローニングした。そして、ヒトIgG定常領域の配列を持つpAb-LCおよびpAb-HC Expression Vectorにそれぞれseamless ligation法によってサブクローニングし、pAb-mIgMpolySiaLC およびpAb-mIgMpolySiaHCおよび、多量化体となるmIgMpolySia-hIgG1-x5-His-SBP（FL-x5-His-SBP）を作製した。また、抗polySia抗体同様にCDR中にある軽鎖の37番目のチロシン残基をアラニン残基に点変異させたネガティブコントロール抗体の作製を行なった。このmIgMpolySia-hIgG1キメラ抗体を用いてポリシアル酸が高く発現しているブタ胎児脳を用いたウエスタンブロッティングおよびマウス胎児脳(MEB)を用いたELISAを行い、その抗体の認識能を確認した（図7）。
得られた抗体の配列は以下のとおりである：
軽鎖CDR1：QSLLDSDGKTY（配列番号17）
軽鎖CDR2：LVS（配列番号18）
軽鎖CDR3：WQGTHFP（配列番号19）
軽鎖可変領域：DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPFTFGSGTKLEIK（配列番号20）
重鎖CDR1：GYTFTSYWI（配列番号21）
重鎖CDR2：IYPGSGST（配列番号22）
重鎖CDR3：IRSGVRRPHFDY（配列番号23）
重鎖可変領域：QVQLQQPGSELVRPGGSVKLSCRASGYTFTSYWIHWVKQRPGQGLEWIGNIYPGSGSTNYDEEFKRQATLTVDTSSTTAYMQLSSLTSEDSAVYYCIRSGVRRPHFDYWGQGTTLTVSS（配列番号24）。
実施例7．マウスIgM抗オリゴシアル酸抗体のCDR配列のクローニングおよびその活性の評価
マウスIgMoligoSiaを生産するハイブリドーマよりcDNAを調製し、可変部軽鎖および可変部重鎖領域をPCR法によりクローニングした。そして、ヒトIgG定常領域の配列を持つpAb-LCおよびpAb-HC Expression Vectorにそれぞれseamless ligation法によってサブクローニングし、pAb-moligoSiaLC およびpAb-moligoSiaHCおよび、多量化体となるmoligoSia-hIgG1-x5-His-SBP（FL-x5-His-SBP）を作製した。このmoligoSia-hIgG1キメラ抗体を用いてガングリオシドGD3用いたELISAを行い、その抗体の認識能を確認した（図8）。
得られた抗体の配列は以下のとおりである：
軽鎖CDR1：KSVDNYGISF（配列番号25）
軽鎖CDR2：AAS（配列番号26）
軽鎖CDR3：QQSKEVPYT（配列番号27）
軽鎖可変領域：DIVLTQSPASLAVSLGQRATISCRASKSVDNYGISFMNWFQQKPGQPPKLLIYAASNQGSGVPARFSGSGSGTDFSLNIHPMEEDDTAMYFCQQSKEVPYTFGGGTKLEIK（配列番号28）
重鎖CDR1：GFNIKNTY（配列番号29）
重鎖CDR2：IDPANGNTK（配列番号30）
重鎖CDR3：ARRLRSSAGDYFDY（配列番号31）
重鎖可変領域：QVQLKQSVAELVRPGASVKLSCTASGFNIKNTYIHWVNQRPEQGLEWIGRIDPANGNTKYAPKFQGKATISAATSSNTAYLQLSSLTSEDTAMYYCARRLRSSAGDYFDYWGLGTTLTVSS（配列番号32）。
実施例8．高親和性マウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体の作製とその活性の評価
実施例1で作製したマウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体に基づいて以下の5つの点変異体を作製した。
・L鎖CDR1（配列番号4：RSSQSLVHSNGNTYLY）の12番目のアスパラギン残基をグルタミン残基に点変異させた変異抗体（N35Q-mIgGpolySia、L鎖CDR1は配列番号33：RSSQSLVHSNGQTYLY）、
・L鎖CDR1（配列番号4：RSSQSLVHSNGNTYLY）の12番目のアスパラギン残基をロイシン残基に点変異させた変異抗体（N35L-mIgGpolySia、L鎖CDR1は配列番号34：RSSQSLVHSNGLTYLY）、
・H鎖CDR1（配列番号7：GYTFTDY）の6番目のアスパラギン酸残基をグルタミン残基に点変異させた変異抗体（D158Q-mIgGpolySia、H鎖CDR1は配列番号35：GYTFTQY）、
・H鎖CDR1（配列番号7：GYTFTDY）の6番目のアスパラギン酸残基をグルタミン酸残基に点変異させた変異抗体（D158E-mIgGpolySia、H鎖CDR1は配列番号36：GYTFTEY）、及び
・L鎖CDR1（配列番号4：RSSQSLVHSNGNTYLY）の12番目のアスパラギン残基をグルタミン残基に点変異させ、且つH鎖CDR1（配列番号7：GYTFTDY）の6番目のアスパラギン酸残基をグルタミン残基に点変異させた変異抗体（N35Q/D158Q-mIgGpolySia、L鎖CDR1は配列番号33：RSSQSLVHSNGQTYLY、H鎖CDR1は配列番号35：GYTFTQY）。
これら5つの変異抗体、実施例1で作製したマウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体（mIgGpolySia-WT）、及び実施例2で作製したネガティブ抗体（Y39I-mIgGpolySia）のそれぞれについて、バイオレイヤー干渉法（Octet）においてポリシアル酸への親和性を解析した。結果を表１に示す。点変異導入により、ポリシアル酸への親和性が向上した。
実施例9．高親和性マウス抗polySia -hIgG1キメラ抗体の作製とその活性の評価
実施例6で作成したmIgMpolySia-hIgG-x5-His-SBP抗体に基づいて以下の点変異体を作製した。
・軽鎖可変領域（配列番号20：DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPFTFGSGTKLEIK）の60番目のアスパラギン酸残基ををグルタミン残基に点変異させた変異抗体（D60Q、軽鎖可変領域は配列番号37：DVVMTQTPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLQSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPFTFGSGTKLEIK）。
上記変異抗体又は実施例6で作成したmIgMpolySia-hIgG-x5-His-SBP抗体を用いて、マウス胎児脳(MEB)を用いたELISAを行い、その抗体の認識能を確認した。結果を図１１に示す。点変異導入によりポリシアル酸への親和性が向上した。また、上記以外の点変異体をいくつか作製したが、全て、親和性が大きく低下した。
実施例10．低親和性マウスIgM抗オリゴシアル酸抗体の作製およびその活性の評価
実施例7で作成したmIgMoligoSia-hIgG-x5-His-SBP抗体に基づいて以下の点変異体を作製した。
・軽鎖CDR1（配列番号25：KSVDNYGISF）の5番目のアスパラギン残基をアラニン残基に点変異させた変異抗体（N31A、軽鎖CDR1は配列番号38：KSVDAYGISF）。
上記変異抗体又は実施例7で作成したmIgMoligoSia-hIgG-x5-His-SBP抗体について、ガングリオシドGD3用いたELISAを行い、その抗体の認識能を確認した。結果を図１２に示す。

Claims (14)

  1. （抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
    （抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
    （抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
    （抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
    からなる群より選択される少なくとも1種の抗体、及び／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、キット。
  2. 前記抗体Aが、
    （抗体A1）配列番号2で示されるアミノ酸配列A1L1のN末端から39番目のチロシン残基、若しくは前記アミノ酸配列A1L1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A1L2における前記チロシン残基に対応するチロシン残基が、他のアミノ酸残基に変異してなるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体、又は
    （抗体A2）配列番号20で示されるアミノ酸配列A2L1のN末端から37番目のチロシン残基、若しくは前記アミノ酸配列A2L1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列A2L2における前記チロシン残基に対応するチロシン残基が、他のアミノ酸残基に変異してなるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体
    である、請求項１に記載のキット。
  3. 前記抗体Bが、重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体である、請求項１に記載のキット。
  4. 前記抗体C及び／又は前記抗体DがIgG抗体である、請求項１に記載のキット。
  5. 前記抗体Eが、前記抗体AX、前記抗体B、前記抗体C、又は前記抗体Dにストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗ポリシアル酸抗体である、請求項１に記載のキット。
  6. ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離用である、請求項１～５のいずれかに記載のキット。
  7. ポリシアル酸関連疾患の検査用、又はポリシアル酸発現細胞の分離用である、請求項１～５のいずれかに記載のキット。
  8. （抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
    （抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
    （抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
    （抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
    からなる群より選択される少なくとも1種の抗体、及び／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチドを含む、試薬。
  9. （抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
    （抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
    （抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
    （抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
    からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を試料と接触させる工程を含む、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出方法。
  10. 前記抗体とポリシアル酸又はポリシアル酸保持体とを含む複合体を可視化することを含む、請求項９に記載の検出方法。
  11. ELISA法である、請求項９又は１０に記載の検出方法。
  12. 前記ELISA法がサンドイッチELISA法である、請求項１１に記載の検出方法。
  13. （抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
    （抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
    （抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
    （抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体
    からなる群より選択される少なくとも1種の抗体を試料と接触させる工程、及び前記抗体への結合画分と前記抗体への非結合画分を分離する工程を含む、ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の分離方法。
  14. 下記抗体A～抗体Eのいずれかの抗体、及び／又は前記抗体をコードするポリヌクレオチド：
    （抗体A）軽鎖CDR1内のC末端側のチロシン残基 が他のアミノ酸に置換してなる、抗ポリシアル酸ネガティブ抗体；
    （抗体AX）配列番号33又は配列番号34で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号5で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号6で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号35又は配列番号36で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号8で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号9で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体B）重鎖可変領域が配列番号16で示されるアミノ酸配列BH1に対して95％以上の同一性を有するアミノ酸配列BH2を含む、抗ポリシアル酸ヒト化抗体；
    （抗体C）配列番号17で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号18で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号19で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号21で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号22で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号23で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；
    （抗体D）配列番号25又は配列番号38で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号26で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号27で示されるアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域、並びに／或いは配列番号29で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号30で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、及び配列番号31で示されるアミノ酸配列を含む重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む、抗ポリシアル酸抗体；及び
    （抗体E）ストレプトアビジン結合タンパク質及び／又は多量体化ドメインが付加されてなる、抗体。
JP2025065498A 2021-07-01 2025-04-11 ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離方法 Pending JP2025108564A (ja)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2021110251 2021-07-01
JP2021110251 2021-07-01
PCT/JP2022/026183 WO2023277122A1 (ja) 2021-07-01 2022-06-30 ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離方法
JP2023532047A JPWO2023277122A1 (ja) 2021-07-01 2022-06-30

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023532047A Division JPWO2023277122A1 (ja) 2021-07-01 2022-06-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2025108564A true JP2025108564A (ja) 2025-07-23

Family

ID=84691903

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023532047A Pending JPWO2023277122A1 (ja) 2021-07-01 2022-06-30
JP2025065498A Pending JP2025108564A (ja) 2021-07-01 2025-04-11 ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2023532047A Pending JPWO2023277122A1 (ja) 2021-07-01 2022-06-30

Country Status (2)

Country Link
JP (2) JPWO2023277122A1 (ja)
WO (1) WO2023277122A1 (ja)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019524681A (ja) * 2016-07-04 2019-09-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 新規抗体フォーマット

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN119930831A (zh) * 2018-03-14 2025-05-06 纪念斯隆凯特琳癌症中心 抗聚唾液酸抗体及其用途

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2019524681A (ja) * 2016-07-04 2019-09-05 エフ．ホフマン−ラ ロシュ アーゲーＦ． Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ Ｒｏｃｈｅ Ａｋｔｉｅｎｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ 新規抗体フォーマット

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY, vol. 288, no. 47, JPN6026009179, 2013, pages 33784 - 33796, ISSN: 0005813840 *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023277122A1 (ja) 2023-01-05
JPWO2023277122A1 (ja) 2023-01-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10604586B2 (en) Humanized monoclonal antibody and uses thereof
US12007396B2 (en) Methods for characterizing low-abundance host cell proteins
US20230176070A1 (en) Compositions and methods for identifying nanobodies and nanobody affinities
CN113646330A (zh) 工程化cd25多肽及其用途
JP7656835B2 (ja) 抗体又はその抗原結合性断片
JP7245373B2 (ja) 抗体の抗原に対する親和性を制御する方法、抗原に対する親和性が改変された抗体及びその製造方法
WO2022247804A1 (zh) 抗gprc5d抗体、其制备方法与用途
CN120230198A (zh) 抗nmp22的单克隆抗体及其制备方法和用途
JP7222550B2 (ja) ヒトエリスロフェロン抗体及びその使用
WO2022134276A1 (zh) 一种抗人骨桥蛋白的抗体及其应用
US10995133B2 (en) Method for producing antibody
JP7691234B2 (ja) 抗体の抗原に対する親和性を向上させる方法及びその利用
JP2025108564A (ja) ポリシアル酸又はポリシアル酸保持体の検出又は分離方法
CN112979798B (zh) 一种包含c反应蛋白抗原结合结构域的分离的结合蛋白
CN115433277A (zh) 抗cd38兔重组单克隆抗体的制备及应用
US20230324388A1 (en) Antibody for porcine reproductive and respiratory syndrome virus and uses thereof
US12618840B2 (en) Antibody for detecting acetylation of COX2 protein, and uses thereof
CN112724251B (zh) 一种包含c反应蛋白抗原结合结构域的结合蛋白
JP7366411B2 (ja) ヒトαディフェンシンＨＤ５を検出する方法及びキット、並びにこれらにおいて用いられる抗体
KR102442204B1 (ko) Cox2 단백질의 아세틸화 검출용 항체 및 이의 용도
CN121135881A (zh) 一种鼠抗人CD8a重组单克隆抗体及其应用
KR101630228B1 (ko) 단일클론항체 ｃａ２７ 및 이를 이용한 검출방법
CN103641914B (zh) 一种抗人btf的单克隆抗体及应用
CN114478779A (zh) 人源化的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的单克隆抗体及其应用
HK40063514A (en) Engineered cd25 polypeptides and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20250411

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20250411

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20260310

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20260423