JP2024526234A - Ｍｙｏｃ発現をサイレンシングするための組成物および方法 - Google Patents

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JP2024526234A JP2023580406A JP2023580406A JP2024526234A JP 2024526234 A JP2024526234 A JP 2024526234A JP 2023580406 A JP2023580406 A JP 2023580406A JP 2023580406 A JP2023580406 A JP 2023580406A JP 2024526234 A JP2024526234 A JP 2024526234A
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Abstract

本開示は、ＭＹＯＣを標的とする二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）組成物、およびかかるｄｓＲＮＡ組成物を使用してＭＹＯＣの発現を変化させる（例えば、阻害する）方法に関する。
【選択図】なし

Description

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年６月２８日に出願された米国特許仮出願第６３／２１５，８０４号に対する優先権の利益、２０２１年１２月８日に出願された米国特許仮出願第６３／２８７，４０４号に対する優先権の利益、および２０２２年６月１０日に出願された米国特許仮出願第６３／３５１，０３３号に対する優先権の利益を主張する。先述の出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含んでおり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年６月２２日に作成された先述のＡＳＣＩＩコピーは、Ａ１０８８６８＿１４９０ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔという名称で、サイズは５９６，４６７バイトである。
本開示は、ＭＹＯＣの発現の特異的阻害に関する。
緑内障（例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ））は、今日の高齢者における不可逆的な視力喪失の主な原因である。ＭＹＯＣタンパク質のミスフォールディングは、小柱網細胞からのその分泌を閉塞し、眼圧の上昇をもたらし、これが次に、視神経を圧縮および損傷し、視覚情報を脳に送信するその能力を低下し、視覚喪失をもたらす。緑内障に対する新しい治療が必要である。
本開示は、ＭＹＯＣの発現を調節するための方法およびｉＲＮＡ組成物を記載する。特定の実施形態では、ＭＹＯＣの発現は、ＭＹＯＣ特異的ｉＲＮＡを使用して低減または阻害される。こうした阻害は、眼障害（例えば、緑内障、例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ））などのＭＹＯＣ発現に関連する障害の治療に有用であり得る。
したがって、細胞中または対象（例えば、ヒト対象などの哺乳動物中）などにおける、ＭＹＯＣのＲＮＡ転写物のＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）媒介性切断をもたらす組成物および方法が本明細書に記載される。また、緑内障（例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ））などのＭＹＯＣの発現に関連する障害を治療するための組成物および方法も記載される。
本明細書に特徴付けられる組成物に含まれるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、ＭＹＯＣ（例えば、ヒトＭＹＯＣ）のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部に実質的に相補的である、領域、例えば、３０ヌクレオチド以下、概して１９～２４ヌクレオチドの長さの領域を有するＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）（本明細書では「ＭＹＯＣ特異的ｉＲＮＡ」とも称される）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ転写物は、ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ転写物、例えば、本明細書に記載の配列番号１などである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡの領域に実質的に相補的である領域を有するアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡは、配列ＮＭ＿０００２６１．２（配列番号１）を有する。ＮＭ＿０００２６１．２の配列もまた、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。配列番号１の逆相補は、本明細書の配列番号２として提供される。
一部の態様では、本開示は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供し、ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、アンチセンス鎖内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的であるように、センス鎖は、ヒトＭＹＯＣのコード鎖の一部の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、およびアンチセンス鎖は、ヒトＭＹＯＣの非コード鎖の対応する部分の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
一部の態様では、本開示は、ＭＹＯＣの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供し、ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、アンチセンス鎖内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的であるように、アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列の一部の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
一部の態様では、本開示は、ＭＹＯＣの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供し、ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、二本鎖ＡＤ－１５６５８０４のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列と０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、二本鎖ＡＤ－１５６５８０４のセンス鎖ヌクレオチド配列と０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
一部の態様では、本開示は、ＭＹＯＣの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤を提供し、ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、二本鎖ＡＤ－１５６５８３７のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列と０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、二本鎖ＡＤ－１５６５８３７のセンス鎖ヌクレオチド配列と０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
一部の態様では、本開示は、他の点では類似した未処理の細胞または組織と比較して、低減されたレベルのＭＹＯＣ ｍＲＮＡまたはＭＹＯＣタンパク質のレベルを含むヒト細胞または組織を提供し、随意に、細胞または組織は、遺伝子操作されておらず（例えば、細胞または組織が、一つ以上の天然に生じる変異を含み、例えば、ＭＹＯＣ変異）、随意に、レベルは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％低減される。いくつかの実施形態では、ヒト細胞または組織は、小柱網組織、毛体様、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、網膜組織、星状細胞、周皮細胞、ミュラー細胞、神経節細胞、内皮細胞、光受容体細胞、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）、または例えば、脈絡膜血管などの脈絡膜組織である。
本開示はまた、一部の態様では、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ剤を含有する細胞を提供する。
別の態様では、他の点では類似した未処理の細胞と比較して、低減されたレベルのＭＹＯＣ ｍＲＮＡまたはＭＹＯＣタンパク質のレベルを含む、ヒト眼細胞、例えば、（小柱網の細胞、毛体様の細胞、ＲＰＥ細胞、網膜細胞、星状細胞、周皮細胞、ミュラー細胞、神経節細胞、内皮細胞、または光受容体細胞）が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、レベルは、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％低減される。
一部の態様では、本開示はまた、本明細書に記載されるｄｓＲＮＡ剤を含む、ＭＹＯＣをコードする遺伝子の発現を阻害するための医薬組成物を提供する。
本開示はまた、一部の態様では、細胞におけるＭＹＯＣの発現を阻害する方法を提供し、方法は、
（ａ）細胞を、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ剤、または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることと、
（ｂ）工程（ａ）で産生された細胞を、ＭＹＯＣのｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって細胞におけるＭＹＯＣの発現を阻害することと、を含む。
本開示はまた、一部の態様では、細胞におけるＭＹＯＣの発現を阻害する方法を提供し、方法は、
（ａ）細胞を、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ剤、または本明細書に記載の医薬組成物と接触させることと、
（ｂ）工程（ａ）で産生された細胞を、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、ＭＹＯＣタンパク質、またはＭＹＯＣ ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルを低減するのに十分な時間維持し、それによって細胞におけるＭＹＯＣの発現を阻害することと、を含む。
本開示はまた、一部の態様では、眼細胞または組織におけるＭＹＯＣの発現を阻害する方法を提供し、方法は、
（ａ）細胞または組織を、ＭＹＯＣに結合するｄｓＲＮＡ剤と接触させることと、
（ｂ）工程（ａ）で産生された細胞または組織を、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、ＭＹＯＣタンパク質、またはＭＹＯＣ ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルを低減するのに十分な時間維持し、それによって細胞または組織におけるＭＹＯＣの発現を阻害することと、を含む。
本開示はまた、一部の態様では、ＭＹＯＣ関連障害と診断された対象を治療する方法を提供し、本明細書に記載のｄｓＲＮＡ剤または本明細書に記載の医薬組成物の治療有効量を対象に投与し、それにより障害を治療することを含む。
本明細書の態様のいずれか、例えば、上記の組成物および方法、本明細書の実施形態のいずれか（例えば、以下）が適用され得る。
いくつかの実施形態では、ヒトＭＹＯＣのコード鎖は、配列番号１の配列を有する。いくつかの実施形態では、ヒトＭＹＯＣの非コード鎖は、配列番号２の配列を有する。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する一部の、０、または１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、センス鎖がアンチセンス鎖中の少なくとも１７個の連続するヌクレオチドに相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列の一部の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１７個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する一部の、０、または１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１７個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、センス鎖がアンチセンス鎖中の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドに相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列の一部の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、センス鎖がアンチセンス鎖中の少なくとも２１個の連続するヌクレオチドに相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列の一部の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の、０、または１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖の部分は、表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つのセンス鎖内の部分である。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖の部分は、表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つのアンチセンス鎖内の部分である。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるアンチセンス配列のうちの一つと、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、アンチセンス配列に対応する表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるセンス配列と、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるアンチセンス配列のうちの一つと、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１７個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、アンチセンス配列に対応する表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるセンス配列と、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１７個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるアンチセンス配列のうちの一つと、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、アンチセンス配列に対応する表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるセンス配列と、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるアンチセンス配列のうちの一つと、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、アンチセンス配列に対応する表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるセンス配列と、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤のセンス鎖は、少なくとも２３個のヌクレオチドの長さ、例えば、２３～３０個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖のうちの少なくとも一つは、一つ以上の親油性部分にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、親油性部分は、ｄｓＲＮＡ剤の二本鎖領域内の一つ以上の位置にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、親油性部分は、リンカーまたは担体を介してコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、親油性部分の親油性は、ｌｏｇＫｏｗによって測定され、０を超える。
いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、二本鎖ＲＮＡｉ剤の血漿タンパク質結合アッセイにおける非結合画分で測定され、０．２を超える。いくつかの実施形態では、血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイである。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、五個以下のセンス鎖ヌクレオチドおよび五個以下のアンチセンス鎖ヌクレオチドは、未修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、センス鎖のすべてのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドは、修飾を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも一つは、デオキシ－ヌクレオチド、３’－末端デオキシ－チミジン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束されたエチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、ヌクレオチドを含む非天然の塩基、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、５’－ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド、および２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド、およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、センス鎖ヌクレオチドのうちの五個以下、およびアンチセンス鎖のヌクレオチドのうちの五個以下は、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、アンロック核酸（ＵＮＡ）、またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）以外の修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、センス鎖の連続する二つのヌクレオチドの間、またはアンチセンス鎖の連続する二つのヌクレオチドの間に、非ヌクレオチドスペーサー（随意に、非ヌクレオチドスペーサーは、Ｃ３－Ｃ６アルキルを含む）を含む。
いくつかの実施形態では、各鎖は、３０ヌクレオチド以下の長さである。いくつかの実施形態では、少なくとも一方の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一方の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一方の鎖が、２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む。
いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、１５～３０ヌクレオチド対の長さである。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、１７～２３ヌクレオチド対の長さである。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、１７～２５ヌクレオチド対の長さである。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、２３～２７ヌクレオチド対の長さである。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、１９～２１ヌクレオチド対の長さである。いくつかの実施形態では、二本鎖領域は、２１～２３ヌクレオチド対の長さである。いくつかの実施形態では、各鎖が、１９～３０ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、各鎖が、１９～２３ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、各鎖が、２１～２３ヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態では、薬剤は、少なくとも一つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結は、一方の鎖の３’末端にある。いくつかの実施形態では、当該鎖は、アンチセンス鎖である。いくつかの実施形態では、当該鎖は、センス鎖である。
いくつかの実施形態では、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結は、一方の鎖の５’末端にある。いくつかの実施形態では、当該鎖は、アンチセンス鎖である。いくつかの実施形態では、当該鎖は、センス鎖である。
いくつかの実施形態では、一方の鎖の５’末端および３’末端の各々は、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、当該鎖は、アンチセンス鎖である。
いくつかの実施形態では、二本鎖のアンチセンス鎖の５’－末端の１位における塩基対は、ＡＵ塩基対である。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、合計２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、合計２３のヌクレオチドを有する。
いくつかの実施形態では、一つ以上の親油性部分は、少なくとも一方の鎖上の一つ以上の内側位置にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、一つ以上の親油性部分は、リンカーまたは担体を介して少なくとも一方の鎖上の一つ以上の内側位置にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、内側位置は、少なくとも一方の鎖の各末端から末端の二つの位置を除く全ての位置を含む。いくつかの実施形態では、内側位置は、少なくとも一方の鎖の各末端から末端の三つの位置を除く全ての位置を含む。いくつかの実施形態では、内側位置は、センス鎖の切断部位領域を除く。いくつかの実施形態では、内側位置は、センス鎖の５’末端から数えて９～１２位を除く全ての位置を含む。いくつかの実施形態では、内側位置は、センス鎖の３’末端から数えて１１～１３位を除く全ての位置を含む。いくつかの実施形態では、内側位置は、アンチセンス鎖の切断部位領域を除く。いくつかの実施形態では、内側位置は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて１２～１４位を除く全ての位置を含む。いくつかの実施形態では、内側位置は、３’末端から数えてセンス鎖上の１１～１３位と、５’末端から数えてアンチセンス鎖上の１２～１４位とを除く全ての位置を含む。
いくつかの実施形態では、一つ以上の親油性部分は、各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の４～８位および１３～１８位ならびにアンチセンス鎖上の６～１０位および１５～１８位からなる群から選択される一つ以上の内側位置にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、一つ以上の親油性部分は、各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の５、６、７、１５、および１７位ならびにアンチセンス鎖上の１５および１７位からなる群から選択される一つ以上の内側位置にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、二本鎖領域における位置は、センス鎖の切断部位領域を除く。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、２１ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチドの長さであり、また親油性部分は、センス鎖の２１位、２０位、１５位、１位、７位、６位もしくは２位またはアンチセンス鎖の１６位にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、親油性部分は、センス鎖の２１位、２０位、１５位、１位、または７位にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、親油性部分は、センス鎖の２１位、２０位または１５位にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、親油性部分は、センス鎖の２０位または１５位にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、親油性部分は、アンチセンス鎖の１６位にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、親油性部分は、センス鎖の５末端から数えて６位にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、親油性部分は、脂肪族化合物、脂環式化合物、または多脂環式化合物である。いくつかの実施形態では、親油性部分は、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール（ｇｅｒａｎｙｌｏｘｙｈｅｘｙａｎｏｌ）、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸（Ｏ３－（ｏｌｅｏｙｌ）ｃｈｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ４～Ｃ３０炭化水素鎖と、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、およびアルキンからなる群から選択される随意の官能基とを含有する。いくつかの実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ６～Ｃ１８炭化水素鎖を含有する。いくつかの実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有する。
いくつかの実施形態では、親油性部分は、内側位置または二本鎖領域において一つ以上のヌクレオチドに置き換わる担体を介してコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、担体は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される環式基であるか、またはセリノール骨格またはジエタノールアミン骨格系の非環式部分である。
いくつかの実施形態では、親油性部分は、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド連結、クリック反応の生成物、またはカルバメートを含有するリンカーを介して二本鎖ｉＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、親油性部分は、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間連結にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、親油性部分または標的化リガンドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジスルフィド、アミド、およびガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの官能化された単糖またはオリゴ糖、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される生物切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、センス鎖の３’末端は、アミンを有する環状基であるエンドキャップを介して保護され、該環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、例えば、眼組織または肝組織を標的とする標的化リガンドをさらに含む。いくつかの実施形態では、眼組織は、小柱網組織、毛体様、網膜組織、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管である。
いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端または５’末端にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、リガンドは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、リガンドは、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む。いくつかの実施形態では、標的化リガンドは、一つ以上のＧａｌＮＡｃコンジュゲートまたは一つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。いくつかの実施形態では、リガンドは、一価、または二価、三価、または四価の分枝リンカーを介して結合した一つ以上のＧａｌＮＡｃ複合体または一つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体である。いくつかの実施形態では、リガンドは、以下のものである。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、以下の図に示すようにリガンドにコンジュゲートされ、
式中、Ｘは、ＯまたはＳである。いくつかの実施形態では、Ｘは、Ｏである。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置の連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置の連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間結連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置またはＳｐ立体配置いずれかの連結リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置の連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置の連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置またはＳｐ立体配置いずれかの連結リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置の連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第一、第二および第三のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置の連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置またはＳｐ立体配置いずれかの連結リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置の連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置の連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第三のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置の連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置またはＳｐ立体配置いずれかの連結リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、Ｓｐ立体配置で連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の３’末端における第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置の連結リン原子を有する、アンチセンス鎖の５’末端における第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、Ｒｐ立体配置またはＳｐ立体配置いずれかの連結リン原子を有する、センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端キラル修飾と、をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、アンチセンス鎖の５’末端のホスフェートまたはホスフェート模倣体をさらに含む。いくつかの実施形態では、ホスフェート模倣体は、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である。
前述のｄｓＲＮＡ剤の様々な実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、ＭＹＯＣをコードするｍＲＮＡのホットスポット領域を標的とする。
別の態様では、本発明は、ミオシリン（ＭＹＯＣ）ｍＲＮＡのホットスポット領域を標的とするｄｓＲＮＡ剤を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞、例えば、ヒト細胞は、ヒト細胞を本明細書に記載のｄｓＲＮＡ剤と接触させることを含むプロセスによって産生された。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物は、ｄｓＲＮＡ剤および脂質製剤を含む。
いくつかの実施形態では（例えば、本明細書に記載の方法の実施形態）、細胞は、対象内にある。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡのレベルは、少なくとも５０％阻害される。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣタンパク質のレベルは、少なくとも５０％阻害される。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣの発現は、少なくとも５０％阻害される。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣの発現を阻害することは、対象からの生体試料（例えば、水性眼液試料）中のＭＹＯＣタンパク質レベルを少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％減少させる。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ遺伝子の発現を阻害することは、対象からの生体試料（例えば、水性眼液試料）中のＭＹＯＣｍＲＮＡレベルを少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％減少させる。
いくつかの実施形態では、対象は、ＭＹＯＣ関連障害と診断されている。いくつかの実施形態では、対象は、ＭＹＯＣ関連障害に対する少なくとも一つの診断基準を満たす。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ関連障害は、緑内障である。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ関連障害は、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）である。
いくつかの実施形態では、眼細胞または組織は、小柱網組織、毛体様、ＲＰＥ、網膜組織、星状細胞、周皮細胞、ミュラー細胞、神経節細胞、内皮細胞、光受容体細胞、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）、または例えば、脈絡膜血管などの脈絡膜組織である。
いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ関連障害は、緑内障である。いくつかの実施形態では、緑内障は、眼圧の上昇によって引き起こされるか、またはそれと関連する。いくつかの実施形態では、緑内障原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ））。
いくつかの実施形態では、治療することには、障害の少なくとも一つの兆候または症状の改善が含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも一つの徴候または症状は、視神経損傷、視力喪失、視野狭窄、かすみ目、眼の痛みまたは存在、レベル、またはＭＹＯＣ活性（例えば、ＭＹＯＣ遺伝子、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、またはＭＹＯＣタンパク質）のうちの一つ以上の尺度を含む。
いくつかの実施形態では、基準レベルよりも高いＭＹＯＣのレベルは、対象が緑内障を有することを示す。いくつかの実施形態では、治療には、障害の進行の予防が含まれる。いくつかの実施形態では、治療は、（ａ）ＭＹＯＣの発現もしくは活性を阻害もしくは低減すること、（ｂ）ミスフォールドされたＭＹＯＣタンパク質のレベルを低減すること、（ｃ）小柱網細胞死を低減すること、（ｄ）眼圧を低減すること、または（ｅ）視力を増加させること、のうちの一つ以上を含む。
いくつかの実施形態では、治療は、小柱網組織、毛体様、網膜、ＲＰＥ、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）、または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡのベースラインから少なくとも平均３０％の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、治療は、小柱網組織、毛体様、網膜、ＲＰＥ、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）、または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡのベースラインから少なくとも平均６０％の減少をもたらす。いくつかの実施形態では、治療は、小柱網組織、毛体様、網膜、ＲＰＥ、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）、または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡのベースラインから少なくとも平均９０％の減少をもたらす。
いくつかの実施形態では、治療後、対象は、網膜におけるＭＹＯＣタンパク質によって評価されるように、ｄｓＲＮＡの単回投与後に少なくとも８週間のノックダウン期間を経験する。いくつかの実施形態では、治療は、網膜におけるＭＹＯＣタンパク質によって評価されるように、ｄｓＲＮＡの単回投与後に少なくとも１２週間のノックダウン期間をもたらす。いくつかの実施形態では、治療することは、網膜におけるＭＹＯＣタンパク質によって評価されるように、ｄｓＲＮＡの単回投与後に少なくとも１６週間のノックダウン期間をもたらす。
いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
いくつかの実施形態では、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で、ｄｓＲＮＡ剤が対象に投与される。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、対象に眼内投与される。いくつかの実施形態では、眼内投与は、硝子体内投与、例えば、硝子体内注射、経強膜内投与、例えば、経強膜内注射、結膜下投与、例えば、結膜下注射、球後投与、例えば、球後注射、前房内投与、例えば、前房内注射、または網膜下投与、例えば、網膜下注射を含む。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、対象に静脈内投与される。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ剤は、対象に局所投与される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、対象におけるＭＹＯＣ（例えば、ＭＹＯＣ遺伝子、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、またはＭＹＯＣタンパク質）のレベルを測定することをさらに含む。いくつかの実施形態では、対象におけるＭＹＯＣのレベルを測定することは、対象からの生体試料（例えば、水性眼液試料）におけるＭＹＯＣタンパク質のレベルを測定することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、血液検査、撮像検査、または水性眼液生検（例えば、房水タップ）を実施することをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の対象においてＭＹＯＣ（例えば、ＭＹＯＣ遺伝子、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、またはＭＹＯＣタンパク質）のレベルをさらに測定する方法は、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物での治療の前に実施される。いくつかの実施形態では、対象が参照レベルよりも大きいＭＹＯＣレベルを有するとの判定により、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物が対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象におけるＭＹＯＣのレベルの測定は、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物を用いた治療後に実施される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＭＹＯＣ関連障害の治療または予防に適した療法を用いて対象を治療することをさらに含み、例えば、療法は、レーザー線維柱帯形成術、線維柱帯切除術、低侵襲性緑内障手術、または眼への排液管の配置を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、ＭＹＯＣ関連障害の治療または予防に好適な追加薬剤を対象に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、炭酸脱水酵素阻害剤、プロスタグランジン、ベータブロッカー、アルファ－アドレナリン作動薬、炭酸脱水酵素阻害剤、Ｒｈｏキナーゼ阻害剤、またはコリン作動薬、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、追加の薬剤は、経口薬または点眼薬を含む。
本明細書において言及する全ての公開公報、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。
本明細書に組み込まれ、かつ本明細書の一部を構成する添付の図は、本開示のいくつかの特徴を示す。
本特許または出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも一つの図面が含まれる。カラー図面を含む本特許または特許出願公開の写しは、請求および必要な料金の支払いにより、特許商標庁によって提供される。
図１Ａは、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子に対してホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）についてのヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－８２２８９９の効果を試験するための実験セットアップを示す。 図１Ｂは、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたまたは何も処置されない（未治療の）Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子に対してホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）を示し、ＡＡＶ２．Ｙ３Ｆ－ＳＡＭ－ｇ４で処理されたマウスはその後、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡまたは対照ルシフェラーゼｓｉＲＮＡのいずれかで処置された。 図２Ａは、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子に対してホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）についてのヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－８２２８９９、ＡＤ－１５６５８０４、ＡＤ－１５６５８３７、ＡＤ－１１９３１７５、およびＡＤ－１５６５５０３の効果を試験するための実験セットアップを示す。 図２Ｂは、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４またはＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子に対してホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたマウスはその後、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－８２２８９９、ＡＤ－１５６５８０４、ＡＤ－１５６５８３７、ＡＤ－１１９３１７５、またはＡＤ－１５６５５０３で処置された。 図２Ｃは、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４またはＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子に対してホモ接合性）におけるＧａｐｄｈに対する、ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現の割合を示すｑＰＣＲの結果を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処理されたマウスはその後、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－８２２８９９、ＡＤ－１５６５８０４、ＡＤ－１５６５８３７、ＡＤ－１１９３１７５、またはＡＤ－１５６５５０３で処理された。 図２Ｄは、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４またはＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子に対してホモ接合性）からの眼におけるヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現の割合を示すＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）分析を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたマウスはその後、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－１５６５８０４またはＡＤ－１５６５８３７で処置された。 図３Ａは、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置された、Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子に対してホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）についてのヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－１５６５８０４またはＡＤ－１５６５８３７の効果を試験するための実験セットアップを示す。 図３Ｂは、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４またはＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子に対してホモ接合性）における眼圧（ＩＯＰ）を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたマウスはその後、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－１５６５８０４またはＡＤ－１５６５８３７で処置された。 図３Ｃは、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４またはＰＢＳで処置されたＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ遺伝子座を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス、各対立遺伝子に対してホモ接合性）におけるＧａｐｄｈに対する、ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現の割合を示すｑＰＣＲの結果を示し、ＬＶ－ＳＡＭ－ｇ４で処置されたマウスはその後、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－１５６５８０４またはＡＤ－１５６５８３７で処置された。 図４は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルにおけるＡＤ－１５６５８３７二本鎖またはＡＤ－１５６５８０４二本鎖のいずれかの投与後８５日目における、ＰＢＳに対してＴＭ中に残存するＭＹＯＣタンパク質の割合を示す。結果は、二つの異なるＭＹＯＣ抗体、Ｒ＆ＤおよびＡｂｎｏｖａについて示されている。 図５は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルにおけるＡＤ－１５６５８３７二本鎖またはＡＤ－１５６５８０４二本鎖のいずれかの投与前、－３５、２２、５０、および８５日目の投与後に対する、房水中に残存するＭＹＯＣタンパク質の割合を示す。 図６Ａは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルにおけるＡＤ－１５６５８３７二本鎖またはＡＤ－１５６５８０４二本鎖のいずれかの投与後８５日目における、ＰＢＳに対して硝子体液および毛体様中に残存するＭＹＯＣタンパク質の割合を示す。 図６Ｂは、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルにおけるＡＤ－１５６５８３７二本鎖またはＡＤ－１５６５８０４二本鎖のいずれかの投与後８５日目における、ＰＢＳに対して虹彩および強膜中に残存するＭＹＯＣタンパク質の割合を示す。 図７は、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）モデルにおけるＡＤ－１５６５８３７二本鎖またはＡＤ－１５６５８０４二本鎖のいずれかの投与後８５日目における、ＰＢＳに対して房水中に残存するＭＹＯＣ ｍＲＮＡの割合を示す。
本開示の様々な実施形態の詳細は、以下の説明に記載される。本開示の他の特徴、目的、および利点は、説明および図面、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
ｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの配列特異的分解を、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスを介して司る。本明細書では、ＭＹＯＣの発現を調節する（例えば、阻害する）ためのｉＲＮＡおよびそれらを使用する方法が記載される。また、緑内障（例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ））などのＭＹＯＣの発現に関連する障害の治療のための組成物および方法も記載される。
ヒトＭＹＯＣは、細胞接着、細胞マトリックス接着、細胞骨格組織化、および細胞遊走を含む異なるプロセスを制御するために、隣接する細胞におけるいくつかのシグナル伝達経路の活性化を調節する、およそ５７ｋＤａの分泌性糖タンパク質である。ＭＹＯＣは、典型的には、網膜ならびに小柱網組織および毛体様などの房水調節に関与する構造を含む様々な組織によって発現および分泌される。異常なＭＹＯＣは、緑内障、例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）と関連している。理論に束縛されることを望むものではないが、異常なＭＹＯＣは、例えば、結果的に眼圧の上昇をもたらす房水の排出を妨げることによって、緑内障の病因を悪化させ得る。
以下の説明は、どのようにｉＲＮＡを含有する組成物を作製および使用して、ＭＹＯＣの発現を調節する（例えば、阻害する）か、ならびにＭＹＯＣの発現に関連する障害を治療するための組成物および方法を開示する。
一部の態様では、ＭＹＯＣ ｉＲＮＡおよび薬学的に許容可能な担体を含有する医薬組成物、ＭＹＯＣの発現を阻害するために組成物を使用する方法、およびＭＹＯＣの発現に関連する障害（例えば、緑内障、例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ））を治療するために医薬組成物を使用する方法が本明細書に特徴付けられる。
Ｉ．定義
便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲で使用される特定の用語および語句の意味を以下に提供する。本明細書の他の部分における用語の使用と本セクションで提供される定義との間に明らかな不整合がある場合、本セクションの定義が優先するものとする。
数値または数値範囲を指す場合、「およそ」という用語は、参照される数または数値範囲が、実験変動性内（または統計実験誤差内）の近似であり、したがって、数または数値範囲は、例えば、記載された数または数値範囲の１％～１５％で変化し得ることを意味する。
ある数字または連続する数字の前にある用語「以上」または「少なくとも」は、文脈から明白な場合、用語「少なくとも」に隣接する数字、および論理的に含まれ得るそれに続く全ての数字または整数を含むことが理解される。例えば、ある核酸分子内のヌクレオチドの数は、整数であるはずである。例えば、「２０ヌクレオチドの核酸分子の少なくとも１７ヌクレオチド」は、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドが、示された特性を有するということを意味する。連続する数字または範囲の前に「少なくとも」がある場合、「少なくとも」は、その連続する数字または範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。
本明細書において使用する場合、「～以下」および「～以下」は、その語句に隣接する値、および文脈から論理的にゼロまでの論理的により小さい値または整数を含むものとして理解される。例えば、「２ヌクレオチド以下」の標的部位に対するミスマッチを有する二本鎖は、２、１、または０個のミスマッチを有する。連続する数字または範囲の前に「～以下」がある場合、「～以下」は、その連続する数字または範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。
本明細書において使用する場合、「～未満」は、その語句に隣接する値を含まず、文脈から論理的なゼロまでのより小さい値または整数を含むものとして理解される。例えば、「３ヌクレオチド未満」の標的部位に対するミスマッチを有する二本鎖は、２、１、または０個のミスマッチを有する。連続する数字または範囲の前に「～未満」がある場合、「～未満」は、その連続する数字または範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。
本明細書において使用する場合、「～超」は、その語句に隣接する値を含まず、文脈から論理的な無限大までのより大きい値または整数を含むものとして理解される。例えば、「３ヌクレオチド超」の標的部位に対するミスマッチを有する二本鎖は、４、５、または６以上個のミスマッチを有する。連続する数字または範囲の前に「～超」がある場合、「～超」は、その連続する数字または範囲のそれぞれを修飾し得ることが理解される。
本明細書で使用される場合、「最大１０」の「最大」は、すなわち、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０の、１０を含む１０までとして理解される。
本明細書に提供される範囲は、全ての個々の整数値および範囲内の全ての部分範囲を含むと理解される。
「活性化する」、「促進する」、「の発現を上方制御する」、「の発現を増加する」などの用語は、ＭＹＯＣ遺伝子を指す限りにおいて、本明細書では、ＭＹＯＣ遺伝子の発現の少なくとも部分的な活性化を指し、これは、第一の細胞または細胞群と実質的に同一であるが、そのように処理されていない第二の細胞または細胞群（対照細胞）と比較して、ＭＹＯＣ遺伝子がそこで転写され、ＭＹＯＣ遺伝子の発現が増加するようにそこで処理された第一の細胞または細胞群から単離され得るまたは第一の細胞または細胞群において検出され得るＭＹＯＣ ｍＲＮＡの量の増加によって示される。
いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ遺伝子の発現は、本明細書に記載されるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％活性化される。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ遺伝子は、本開示に特徴付けられるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約６０％、７０％、または８０％活性化される。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ遺伝子の発現は、本明細書に記載されるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、または９５％以上活性化される。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ遺伝子発現は、本明細書に記載されるｉＲＮＡで処理された細胞において、未処理細胞における発現と比較して、少なくとも１倍、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、またはそれ以上増加する。小さなｄｓＲＮＡによる発現の活性化は、例えば、Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，２００６ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０３：１７３３７－４２、ならびに米国特許出願公開第２００７／０１１１９６３号および第２００５／２２６８４８号に記載されており、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。
「サイレンス」、「の発現を阻害する」、「の発現を下方制御する」、「の発現を抑制する」などいう用語は、ＭＹＯＣを指す限り、本明細書では、例えば、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現、ＭＹＯＣタンパク質発現、またはＭＹＯＣ発現に機能的に連結された別のパラメータに基づいて評価される、ＭＹＯＣの発現の少なくとも部分的な抑制を指す。例えば、ＭＹＯＣ発現の阻害は、対照と比較して、ＭＹＯＣが転写され、ＭＹＯＣの発現が阻害されるように処理された第一の細胞または細胞群において単離され得るか、または検出され得るＭＹＯＣ ｍＲＮＡの量の低減によって現れ得る。対照は、第二の細胞または細胞群がそのように処理されていないことを除いて（対照細胞）、第一の細胞または細胞群と実質的に同一の第二の細胞または細胞群であってもよい。阻害の程度は通常、対照レベルの割合として表され、例えば、
あるいは、阻害の程度は、ＭＹＯＣ発現に機能的に連結されたパラメータ、例えば、ＭＹＯＣ遺伝子によってコードされるタンパク質の量の低減の観点から与えられ得る。ＭＹＯＣ発現に機能的に連結されたパラメータの低減は、同様に、対照レベルの割合として表され得る。原則として、ＭＹＯＣサイレンシングは、構成的にまたはゲノム工学によってのいずれか、および任意の適切なアッセイによって、ＭＹＯＣを発現する任意の細胞で決定され得る。
例えば、特定の例では、ＭＹＯＣの発現は、本明細書に開示されるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％抑制される。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣは、本明細書に開示されるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％抑制される。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣは、本明細書に記載されるｉＲＮＡの投与によって、少なくとも約８５％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはそれ以上抑制される。
用語「アンチセンス鎖」または「ガイド鎖」は、標的配列に対して実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡの鎖、例えばｄｓＲＮＡを指す。
本明細書において使用する場合、用語「相補性領域」は、本明細書において定義される、配列、例えば標的配列に対して実質的に相補的であるアンチセンス鎖上の領域を指す。相補性領域が、標的配列に対して完全に相補的でない場合、そのミスマッチは、分子の内側領域内または末端領域内にあり得る。いくつかの実施形態では、相補性領域は、０、１、または２個のミスマッチを含む。
用語「センス鎖」または「パッセンジャー鎖」は、本明細書において使用する場合、用語を本明細書において規定しているアンチセンス鎖の領域に対して実質的に相補的である領域を含むｉＲＮＡの鎖を指す。
用語「平滑」または「平滑末端」は、ｄｓＲＮＡに関して本明細書において使用する場合、ｄｓＲＮＡの所定の末端において不対ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体が存在しない、すなわち、ヌクレオチドオーバーハングが存在しないことを意味する。ｄｓＲＮＡの一方の末端または両末端が、平滑であり得る。ｄｓＲＮＡの両末端が平滑である場合、ｄｓＲＮＡは、平滑末端であると言う。明瞭化のため、「平滑末端」のｄｓＲＮＡは、両末端が平滑であるｄｓＲＮＡ、すなわち、分子のどちらの末端にもヌクレオチドオーバーハングが存在しないｄｓＲＮＡである。ほとんどの場合、こうした分子は、その全長にわたって二本鎖となるであろう。
本明細書において使用する場合、特に別段に示さない限り、用語「相補的」は、第二のヌクレオチド配列との関連において第一のヌクレオチド配列を説明するために使用される場合には、当業者によって理解されることとなる、第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドと特定の条件下においてハイブリダイズして二本鎖構造を形成する第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの能力を指す。こうした条件は、例えば、厳しい条件であってもよく、厳しい条件は、４００ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＰＩＰＥＳ ｐＨ６．４、１ｍＭのＥＤＴＡ、５０°Ｃまたは７０°Ｃで１２～１６時間、続いて洗浄することを含み得る。生物体内で遭遇し得るような生理学的に関連のある条件などの他の条件を適用することができる。当業者は、ハイブリダイズされたヌクレオチドの最終的な用途に応じて、二つの配列の相補性の試験に最も適切な条件の組を決定することができる。
ｉＲＮＡ内、例えば本明細書において記載するｄｓＲＮＡ内の相補的配列は、一方または両方のヌクレオチド配列の全長にわたって第二のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドに対する、第一のヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの塩基対合を含む。このような配列は、本明細書において、互いに対して「完全に相補的」であると称し得る。しかしながら、本明細書において、第一の配列が第二の配列に対して「実質的に相補的」であるという場合、この二つの配列は、完全に相補的であり得るか、またはそれらはその最終的な用途に、例えばＲＩＳＣ経路を経た遺伝子発現の阻害に最も関連した条件下でハイブリダイズする能力を維持しつつ、最大３０塩基対の二本鎖についてのハイブリダイゼーションの際に、一つ以上であるが、概して５、４、３、または２以下である、ミスマッチ塩基対を形成し得る。しかしながら、二つのオリゴヌクレオチドが、ハイブリダイゼーションの際に一つ以上の一本鎖のオーバーハングを形成するように設計される場合には、かかるオーバーハングは、相補性の判定に関してミスマッチとはみなさないものとする。例えば、長さが２１ヌクレオチドである一方のオリゴヌクレオチドと長さが２３ヌクレオチドであるもう一方のオリゴヌクレオチドとを含むｄｓＲＮＡであって、長い方のオリゴヌクレオチドが、短い方のオリゴヌクレオチドに対して完全に相補的である２１ヌクレオチドの配列を含むようなｄｓＲＮＡは、依然として、本明細書において記載する目的に関しては「完全に相補的」と称し得る。
相補的配列は、本明細書において使用する場合、ハイブリダイズするそれらの能力に関する上記の要件を満たす限り、非ワトソン・クリック塩基対および／または非天然の修飾ヌクレオチドから形成された塩基対も含み得るか、または全体的にそれらから形成され得る。このような非ワトソン・クリック塩基対としては、これらに限定されるわけではないが、Ｇ：Ｕのゆらぎ塩基対またはフーグスティーン型の塩基対が挙げられる。
本明細書における用語「相補的」、「完全に相補的」および「実質的に相補的」は、それらの使用の文脈から理解されるであろうとおり、ｄｓＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖との間、またはｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖と標的配列との間における塩基マッチングに関連して使用され得る。
本明細書において使用する場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）「の少なくとも一部に対して実質的に相補的」であるポリヌクレオチドは、目的のｍＲＮＡ（例えば、ＭＹＯＣタンパク質をコードするｍＲＮＡ）の連続する部分に対して実質的に相補的であるポリヌクレオチドを指す。例えば、ポリヌクレオチドは、配列が、ＭＹＯＣをコードするｍＲＮＡの中断されない部分に対して実質的に相補的である場合、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡの少なくとも一部に対して相補的である。「相補性」という用語は、第一の核酸と第二の核酸の核酸塩基との間の対合能力を指す。
本明細書で使用される場合、「相補性領域」という用語は、別の配列、例えば、ｄｓＲＮＡのセンス配列および対応するアンチセンス配列の領域、またはｉＲＮＡのアンチセンス鎖および標的配列、例えば、本明細書で定義されるＭＹＯＣヌクレオチド配列と実質的に相補的である一つのヌクレオチド配列剤の領域を指す。相補性領域が、標的配列に対して完全に相補的でない場合、そのミスマッチは、ｉＲＮＡのアンチセンス鎖の内側領域内または末端領域内にあり得る。概して、最も許容できるミスマッチは、末端領域内、例えば、ｉＲＮＡｉ剤の５’末端または３’末端の５、４、３、または２ヌクレオチドの範囲内にある。
本明細書で使用される場合、「接触すること」は、細胞に直接接触すること、ならびに細胞に間接的に接触することを含む。例えば、ｉＲＮＡを含む組成物が対象に投与されるとき（例えば、眼内、局所、または静脈内に）、対象内の細胞と接触し得る。
ｉＲＮＡに言及する場合、「細胞に導入すること」は、細胞への取り込みまたは吸収を促進するか、またはそれをもたらすことを意味する。ｉＲＮＡの吸収または取込みは、自発性の拡散的もしくは活動的な細胞内プロセスを介して、または補助の薬剤もしくはデバイスによって、生じ得る。この用語の意味は、インビトロでの細胞に限定されず、ｉＲＮＡはまた、「細胞に導入」されてもよく、細胞は生物の一部である。こうした例では、細胞への導入は、生物への送達を含む。例えば、インビボでの送達の場合、ｉＲＮＡは、組織部位に注入され得るかまたは全身的に投与され得る。インビボ送達はまた、米国特許第５，０３２，４０１号および第５，６０７，６７７号、ならびに米国特許出願公開第２００５／０２８１７８１号に記載されるものなどのβ－グルカン送達システムによるものであってもよく、それらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。インビトロでの細胞内への導入としては、当技術分野で公知の方法、例えばエレクトロポレーション法およびリポフェクション法などが挙げられる。さらなるアプローチは、本明細書の下記において説明されるか、または当技術分野で公知である。本明細書で使用される場合、「ＭＹＯＣ発現に関連する障害」、「ＭＹＯＣ発現に関連する疾患」、「ＭＹＯＣ発現に関連する病理学的プロセス」、「ＭＹＯＣ関連障害」、「ＭＹＯＣ関連疾患」などは、ＭＹＯＣ発現が変化する（例えば、基準レベル、例えば、非疾患対象に特徴的なレベルと比較して減少または増加する）任意の状態、障害、または疾患を含む。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ発現は減少する。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ発現は増加する。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ発現の減少または増加は、対象からの組織試料（例えば、水性眼液試料）において検出可能である。減少または増加は、障害の発症前に同じ個体で観察されるレベルに対して、または障害を有しない他の個体に対して評価されてもよい。減少または増加は、身体の特定の器官、組織、または領域（例えば、眼）に限定され得る。ＭＹＯＣ関連障害としては、緑内障（例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ））が挙げられるが、これらに限定されない。
「緑内障」という用語は、本明細書で使用される場合、視神経への損傷によって引き起こされる、またはそれに関連する眼の任意の疾患を意味する。いくつかの実施形態では、緑内障は、眼圧の上昇に関連する。いくつかの実施形態では、緑内障は無症状である。他の実施形態では、緑内障は、一つ以上の症状、例えば、周辺視覚の喪失、視野狭窄、またはブラインドスポットを有する。本明細書に提供される方法を使用して治療可能な緑内障の非限定的な例は、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）である。
本明細書で使用される場合、「二本鎖ＲＮＡ」、「ｄｓＲＮＡ」、または「ｓｉＲＮＡ」という用語は、標的ＲＮＡに対して「センス」および「アンチセンス」配向を有すると呼ばれる、二つの逆平行かつ実質的に相補的な核酸鎖を含むハイブリダイズされた二本鎖領域を有するＲＮＡ分子または分子の複合体を含むｉＲＮＡを指す。二本鎖領域は、例えば、ＲＩＳＣ経路を介して所望の標的ＲＮＡの特定の分解を可能にする任意の長さとすることができるが、典型的には、９～３６塩基対の長さ、例えば、１５～３０塩基対の長さの範囲である。９～３６塩基対の二本鎖を考慮すると、二本鎖は、この範囲の任意の長さとすることができ、例えば９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６およびその間の任意の部分範囲を含み、１５～３０塩基対、１５～２６塩基対、１５～２３塩基対、１５～２２塩基対、１５～２１塩基対、１５～２０塩基対、１５～１９塩基対、１５～１８塩基対、１５～１７塩基対、１８～３０塩基対、１８～２６塩基対、１８～２３塩基対、１８～２２塩基対、１８～２１塩基対、１８～２０塩基対、１９～３０塩基対、１９～２６塩基対、１９～２３塩基対、１９～２２塩基対、１９～２１塩基対、１９～２０塩基対、２０～３０塩基対、２０～２６塩基対、２０～２５塩基対、２０～２４塩基対、２０～２３塩基対、２０～２２塩基対、２０～２１塩基対、２１～３０塩基対、２１～２６塩基対、２１～２５塩基対、２１～２４塩基対、２１～２３塩基対、または２１～２２塩基対を含むが、これらに限定されない。Ｄｉｃｅｒおよび類似の酵素を用いた処理によって細胞内で生成されたｄｓＲＮＡは、概して１９～２２塩基対の長さの範囲内である。ｄｓＤＮＡの二本鎖領域の一方の鎖は、標的ＲＮＡの領域に実質的に相補的である配列を含む。二本鎖構造を形成する二本鎖は、少なくとも一つの自己相補領域を有する単一のＲＮＡ分子由来であってもよく、または二つ以上の別個のＲＮＡ分子から形成されてもよい。二本鎖領域が単一分子の二本鎖から形成される場合、分子は、二本鎖構造を形成する一方の鎖の３’末端ともう一方の鎖の５’末端との間の一本鎖のヌクレオチドによって分離された二本鎖領域（本明細書では「ヘアピンループ」と呼ばれる）を有し得る。ヘアピンループは、少なくとも一つの不対のヌクレオチドを含むことが可能で、いくつかの実施形態では、ヘアピンループは、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも２３またはそれ以上の、不対のヌクレオチドを含み得る。ｄｓＲＮＡの実質的に相補的な二本の鎖が、別個のＲＮＡ分子で構成される場合、それら分子はその必要はないが、共有結合で結合することができる。いくつかの実施形態では、二本の鎖は、ヘアピンループ以外の手段によって共有結合され、接続構造はリンカーである。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、標的ｍＲＮＡを阻害するために細胞または有機体に導入された「一本鎖ｓｉＲＮＡ」であり得る。いくつかの実施形態では、一本鎖ＲＮＡｉ剤は、ＲＩＳＣエンドヌクレアーゼ アルゴノート２に結合することができ、それは次いで、標的ｍＲＮＡを切断する。一本鎖ｓｉＲＮＡは、概して、１５～３０ヌクレオチドであり、随意に化学的に修飾されている。一本鎖ｓｉＲＮＡの設計および試験は、米国特許第８，１０１，３４８号およびＬｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載されており、それぞれの内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に記載されるアンチセンスヌクレオチド配列（例えば、表２Ａまたは２Ｂに提供される配列）のいずれかは、本明細書に記載される一本鎖ｓｉＲＮＡとして、および随意に、例えば、Ｌｉｍａ ｅｔ ａｌ．，（２０１２）Ｃｅｌｌ １５０：８８３－８９４に記載される方法によって、例えば、本明細書に記載されるように化学修飾されて使用され得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ干渉剤は、標的ＲＮＡ配列と相互作用して標的ＲＮＡの切断を司る、一本鎖ＲＮＡを含む。理論に束縛されることを望むものではないが、細胞内に導入された長い二本鎖ＲＮＡは、Ｄｉｃｅｒとして知られるＩＩＩ型エンドヌクレアーゼによって、ｓｉＲＮＡへと分解される（Ｓｈａｒｐ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．２００１，１５：４８５）。ＤｉｃｅｒであるリボヌクレアーゼＩＩＩ様酵素は、このｄｓＲＮＡを、特徴的な二つの塩基の３’オーバーハングを有する１９～２３塩基対の低分子干渉ＲＮＡへとプロセシングする（Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｎａｔｕｒｅ４０９：３６３）。その後ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれ、そこで一つ以上のヘリカーゼがｓｉＲＮＡ二本鎖を解き、それによって相補的アンチセンス鎖が標的認識を誘導することを可能にする（Ｎｙｋａｎｅｎ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｃｅｌｌ １０７：３０９）。適切な標的ｍＲＮＡに結合すると、ＲＩＳＣ内の一つ以上のエンドヌクレアーゼは、標的を切断してサイレンシングを誘導する（Ｅｌｂａｓｈｉｒ，ｅｔ ａｌ．，（２００１）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１５：１８８）。したがって、いくつかの実施形態では、本開示は、標的遺伝子のサイレンシングをもたらすためにＲＩＳＣ複合体の形成を促進する一本鎖ＲＮＡに関する。
各「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」および「Ｕ」は概して、塩基としてのグアニン、シトシン、アデニン、チミジン、およびウラシルを含むヌクレオチドをそれぞれ表す。しかしながら、用語「デオキシリボヌクレオチド」または「リボヌクレオチド」、または「ヌクレオチド」はまた、以下においてより詳述されるような修飾ヌクレオチド、または代替置換部分も指し得ることは理解されよう。当業者は、グアニン、シトシン、アデニン、およびウラシルは、そのような置換部分を有するヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドの塩基対合特性を実質的に変えることなく、他の部分で置換することができることを十分に認識している。例えば、限定するものではないが、その塩基としてイノシンを含むヌクレオチドは、アデニン、シトシンまたはウラシルを含むヌクレオチドと塩基対合することができる。したがって、ウラシル、グアニン、またはアデニンを含むヌクレオチドは、本開示において取り上げるｄｓＲＮＡのヌクレオチド配列において、例えばイノシンを含むヌクレオチドで置換することができる。別の実施例では、オリゴヌクレオチド内の任意の場所にあるアデニンおよびシトシンも、標的ｍＲＮＡと対合するＧ－Ｕゆらぎ塩基対を形成するために、それぞれグアニンおよびウラシルで置換することができる。そのような置換部分を含む配列は、本開示において取り上げる組成物および方法にとって好適である。
本明細書において使用する、用語「ｉＲＮＡ」、「ＲＮＡｉ」、「ｉＲＮＡ剤」、または「ＲＮＡｉ剤」または「ＲＮＡｉ分子」は、本明細書において用語が定義されるＲＮＡを含有し、および例えば、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）経路を介してＲＮＡ転写物の標的切断を媒介する、薬剤を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｉＲＮＡは、例えば、細胞または哺乳動物における、ＭＹＯＣ発現の阻害をもたらす。ＭＹＯＣ発現の阻害は、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡのレベルの低減またはＭＹＯＣタンパク質のレベルの低減に基づいて評価され得る。
「リンカー」または「連結基」という用語は、化合物の二つの部分を接続する、例えば、化合物の二つの部分を共有結合で結合させる、有機部分を意味する。
用語「親油性」または「親油性部分」は、脂質に対して親和性を有する任意の化合物または化学部分を広く意味する。親油性部分の親油性を特徴付ける方法の一つは、オクタノール－水分配係数ｌｏｇＫｏｗによるものであり、この場合Ｋｏｗは、平衡状態にある二相系のうちの水相の化学物質の濃度に対するオクタノール相の化学物質の濃度の比である。オクタノール－水分配係数は、物質の実験室測定される特性である。しかしながら、それは、第一原理または経験的方法を使用して算出される化学物質の構造成分に起因する係数を使用することによっても予想され得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｔｅｔｋｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｆ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｓｃｉ．４１：１４０７－２１（２００１）を参照）。それは、水よりもむしろ非水性または油性環境を好む物質の傾向の熱力学的尺度（すなわち、その親水性／親油性バランス）をもたらす。原則として、化学物質は、そのｌｏｇＫｏｗが０を超える場合、性質が親油性である。典型的には、親油性部分は、１を超える、１．５を超える、２を超える、３を超える、４を超える、５を超える、または１０を超える、ｌｏｇＫｏｗをもつ。例えば、６－アミノヘキサノールのｌｏｇＫｏｗは、例えばおよそ０．７であると予測される。同じ方法を使用することにより、Ｎ－（ヘキサン－６－オール）カルバミン酸コレステリルのｌｏｇＫｏｗは、１０．７であると予測される。
分子の親油性は、分子が有する官能基に応じて変化し得る。例えば、親油性部分の末端にヒドロキシル基またはアミン基を付加することにより、親油性部分の分配係数（例えば、ｌｏｇＫｏｗ）の値が増加または減少し得る。
あるいは、一つ以上の親油性部分にコンジュゲートされた二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、そのタンパク質結合特性によって測定することができる。例えば、特定の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の血漿タンパク質結合アッセイの非結合画分は、二本鎖ＲＮＡｉ剤の相対的疎水性と正の相関があると判定することができ、それは二本鎖ＲＮＡｉ剤のサイレンシング活性と正の相関がある可能性がある。
いくつかの実施形態では、判定される血漿タンパク質結合アッセイは、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）である。この結合アッセイの例示的プロトコルは、例えば、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３１１７０号において詳細に説明される。結合アッセイにおけるｓｉＲＮＡの非結合画分によって測定される二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性は、増強されたｓｉＲＮＡのインビボでの送達の場合では、０．１５を超える、０．２を超える、０．２５を超える、０．３を超える、０．３５を超える、０．４を超える、０．４５を超える、または０．５を超える。
したがって、親油性部分を二本鎖ＲＮＡｉ剤の内側位置にコンジュゲートすることにより、ｓｉＲＮＡにおける増強されたインビボでの送達のために最適の疎水性がもたらされる。
用語「脂質ナノ粒子」または「ＬＮＰ」は、薬学的に活性な分子を、例えば核酸分子、例えば、ＲＮＡｉ剤またはＲＮＡｉ剤の転写元のプラスミドなどを、封入する脂質層を含む小胞である。ＬＮＰは、例えば米国特許第６，８５８，２２５号、第６，８１５，４３２号、８，１５８，６０１号、および第８，０５８，０６９号に記載されており、その内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で使用される場合、用語「の発現を調節する」は、対照細胞における対応する遺伝子の発現と比較して、本明細書に記載のｉＲＮＡ組成物で処理された細胞における遺伝子（例えば、ＭＹＯＣ遺伝子）発現の少なくとも部分的な「阻害」または部分的な「活性化」を意味する。対照細胞は、未処理細胞、または非標的化対照ｉＲＮＡで処理された細胞を含む。
当業者は、「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」という用語が、自然界で発現または見出されるＲＮＡ分子だけでなく、本明細書に記載される、または当技術分野で公知の一つ以上のリボヌクレオチド／リボヌクレオシド類似体または誘導体を含むＲＮＡの類似体および誘導体も包含することを認識するであろう。厳密に言えば、「リボヌクレオシド」は、ヌクレオシド塩基およびリボース糖を含み、「リボヌクレオチド」は、一つ、二つ、または三つのリン酸部分またはその類似体（例えば、ホスホロチオエート）を有するリボヌクレオシドである。しかしながら、用語「リボヌクレオシド」および「リボヌクレオチド」は、本明細書で使用される場合、同等であると考えることができる。ＲＮＡは、例えば、以下に記載されるように、核酸塩基構造、リボース構造、またはリボース－リン酸骨格構造において、修飾され得る。しかしながら、リボヌクレオシド類似体または誘導体を含む分子は、二本鎖を形成する能力を保持しなければならない。非限定的な例として、ＲＮＡ分子はまた、限定されないが、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオシド、５’ホスホロチオエート基を含むヌクレオシド、コレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に連結された末端ヌクレオシド、ロックヌクレオシド、脱塩基ヌクレオシド、非環式ヌクレオシド、グリコールヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ修飾ヌクレオシド、２’－アミノ修飾ヌクレオシド、２’－アルキル修飾ヌクレオシド、モルホリノヌクレオシド、ヌクレオシドを含むホスホルアミデートまたは非天然塩基、またはそれらの任意の組み合わせ、を含む少なくとも一つの修飾リボヌクレオシドを含み得る。その代わりに、または組み合わせて、ＲＮＡ分子は、少なくとも二個の修飾リボヌクレオシド、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１５個、少なくとも２０個またはそれ以上を、ｄｓＲＮＡ分子の全長まで含み得る。修飾は、ＲＮＡ分子中のこのような複数の修飾リボヌクレオシドの各々に対して同じである必要はない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法および組成物での使用が企図される修飾ＲＮＡは、必要とされる二本鎖構造を形成する能力を有し、例えば、ＲＩＳＣ経路を介して標的ＲＮＡの特異的分解を許容または媒介するペプチド核酸（ＰＮＡ）である。明確にするために、「ｉＲＮＡ」という用語は、天然に存在する二本鎖ＤＮＡ分子または１００％デオキシヌクレオシド含有ＤＮＡ分子を包含しないことが理解される。
一部の態様では、修飾リボヌクレオシドは、デオキシリボヌクレオシドを含む。このような例では、ｉＲＮＡ剤は、例えば、デオキシヌクレオシドオーバーハングを含む一つ以上のデオキシヌクレオシド、またはｄｓＲＮＡの二本鎖部分内の一つ以上のデオキシヌクレオシドを含み得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ分子は、例えば、一方または両方の鎖において、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％またはそれ以上（しかし１００％ではない）のデオキシリボヌクレオシドの割合を含む。
本明細書において使用する場合、用語「ヌクレオチドオーバーハング」は、ｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡの二本鎖構造から突出する少なくとも一つの不対ヌクレオチドを指す。例えば、ｄｓＲＮＡの一方の鎖の３’末端が、もう一方の鎖の５’末端を越えて延びる場合、またはその逆の場合も同様に、ヌクレオチドオーバーハングが存在する。ｄｓＲＮＡは、少なくとも一つのヌクレオチドのオーバーハングを含み得、あるいは該オーバーハングは、少なくとも二つのヌクレオチド、少なくとも三つのヌクレオチド、少なくとも四つのヌクレオチド、または少なくとも五つのヌクレオチド、またはそれ以上を含み得る。ヌクレオチドオーバーハングは、デオキシヌクレオチド／ヌクレオシドなどを含むヌクレオチド／ヌクレオシド類似体を含み得るかまたは該類似体からなり得る。オーバーハングは、センス鎖上、アンチセンス鎖上、またはそれらのいずれかの組合せ上にあり得る。さらに、あるオーバーハングのヌクレオチドは、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖またはセンス鎖のいずれかの５’末端、３’末端、または両末端上に存在し得る。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に１～１０のヌクレオチドのオーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡのセンス鎖は、３’末端および／または５’末端に１～１０のヌクレオチドのオーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、オーバーハングにおけるヌクレオチドの一つ以上は、ヌクレオシドチオホスフェートで置換される。
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」は、薬理学的有効量の治療剤（例えば、ｉＲＮＡ）および薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬理学的有効量」、「治療有効量」、または単に「有効量」は、意図される薬理学的、治療的、または予防的な結果をもたらすのに有効な薬剤（例えば、ｉＲＮＡ）の量を指す。例えば、ＭＹＯＣ発現に関連する障害（例えば、緑内障、例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ））を治療する方法では、有効量は、障害に関連する一つ以上の症状を低減するのに有効な量（例えば、（ａ）ＭＹＯＣの発現または活性を阻害または低減する、（ｂ）ミスフォールドされたＭＹＯＣタンパク質のレベルを低減する、（ｃ）小柱網細胞死を低減する、（ｄ）眼圧を低減する、または（ｅ）視力を増加させる、ために有効な量、を含む。例えば、疾患または障害に関連する測定可能なパラメータに少なくとも１０％の低減があるときに、所与の臨床治療が効果的であるとみなされる場合、その疾患または障害の治療のための治療有効量の薬剤は、そのパラメータの少なくとも１０％の低減を得るために必要な量である。例えば、ＭＹＯＣを標的とするｉＲＮＡの治療有効量は、任意の測定可能な量、例えば、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡのレベルまたはＭＹＯＣタンパク質のレベルを低減することができる。
「薬学的に許容可能な担体」という用語は、治療剤の投与のための担体を指す。こうした担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、ブドウ糖、水、グリセロール、エタノール、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、特に細胞培養培地を含まない。経口投与される薬剤については、薬学的に許容可能な担体には、不活性希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、着色剤、および保存剤などの薬学的に許容可能な担体が含まれるが、これらに限定されない。適切な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カルシウム、リン酸ナトリウムおよびリン酸カルシウム、ならびにラクトースが含まれ、一方でトウモロコシデンプンおよびアルギン酸は適切な崩壊剤である。結合剤は、デンプンおよびゼラチンを含んでもよく、一方、潤滑剤は、存在する場合、概してステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクである。必要に応じて、錠剤は、消化管における吸収を遅延させるために、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリルなどの材料でコーティングされてもよい。薬物製剤に含まれる薬剤は、本明細書において以下にさらに説明される。
本明細書において使用される場合、用語「ＳＮＡＬＰ」は、安定した核酸－脂質粒子を指す。ＳＮＡＬＰは、ｉＲＮＡまたはｉＲＮＡが転写されるプラスミドなどの核酸を含む、還元された水性内部をコーティングする脂質の小胞を表す。ＳＮＡＬＰは、例えば、米国特許出願公開第２００６／０２４００９３号、第２００７／０１３５３７２号、および国際公開第２００９／０８２８１７号に記載されている。これらの出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＳＮＡＬＰは、ＳＰＬＰである。本明細書で使用される場合、「ＳＰＬＰ」という用語は、脂質小胞内に封入されたプラスミドＤＮＡを含む核酸脂質粒子を指す。
本明細書において使用する場合、用語「配列を含む鎖」は、標準的なヌクレオチドの用語体系を使用して言及される配列によって説明されるヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドを指す。
本明細書で使用される場合、本明細書に記載の方法に従って治療される「対象」は、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、哺乳動物を含む。哺乳動物は、例えば、齧歯類（例えば、ラットまたはマウス）または霊長類（例えば、サル）であってもよい。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトである。
「それを必要とする対象」は、ＭＹＯＣ発現、例えば、過剰発現に関連する障害（例えば、緑内障）を有する、有すると疑われる、または発症するリスクがある対象を含む。いくつかの実施形態では、対象は、ＭＹＯＣ発現または過剰発現に関連する障害を有するか、または有すると疑われる。いくつかの実施形態では、対象は、ＭＹＯＣ発現または過剰発現に関連する障害を発症するリスクがある。
本明細書において使用する場合、「標的配列」は、一次転写産物のＲＮＡプロセシングの産物であるｍＲＮＡを含む、例えば、ＭＹＯＣなどの、遺伝子の転写中に形成されるｍＲＮＡ分子のヌクレオチド配列における連続する部分を意味する。該配列の標的部分は、少なくとも、その部分またはその近傍においてｉＲＮＡが誘導する切断のための基質として機能するのに十分な長さとなるであろう。例えば、標的配列は、概して、９～３６個のヌクレオチドの長さ、例えば、１５～３０個のヌクレオチドの長さであり、その間の全ての部分範囲を含む。非限定的な例として、標的配列は、１５～３０ヌクレオチド、１５～２６ヌクレオチド、１５～２３ヌクレオチド、１５～２２ヌクレオチド、１５～２１ヌクレオチド、１５～２０ヌクレオチド、１５～１９ヌクレオチド、１５～１８ヌクレオチド、１５～１７ヌクレオチド、１８～３０ヌクレオチド、１８～２６ヌクレオチド、１８～２３ヌクレオチド、１８～２２ヌクレオチド、１８～２１ヌクレオチド、１８～２０ヌクレオチド、１９～３０ヌクレオチド、１９～２６ヌクレオチド、１９～２３ヌクレオチド、１９～２２ヌクレオチド、１９～２１ヌクレオチド、１９～２０ヌクレオチド、２０～３０ヌクレオチド、２０～２６ヌクレオチド、２０～２５ヌクレオチド、２０～２４ヌクレオチド、２０～２３ヌクレオチド、２０～２２ヌクレオチド、２０～２１ヌクレオチド、２１～３０ヌクレオチド、２１～２６ヌクレオチド、２１～２５ヌクレオチド、２１～２４ヌクレオチド、２１～２３ヌクレオチド、または２１～２２ヌクレオチドであり得る。
本明細書で使用される場合、「治療有効量」および「予防的有効」などの語句は、ＭＹＯＣ発現に関連する任意の障害または病理学的プロセス（例えば、緑内障、例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ））の治療、予防、または管理において治療的利益を提供する量を指す。治療有効である特定の量は、例えば、障害または病理学的プロセスのタイプ、患者の病歴および年齢、障害または病理学的プロセス段階、ならびに他の療法の投与など、当技術分野で公知の因子に応じて変化し得る。
本開示の文脈では、「治療する」、「治療」などの用語は、ＭＹＯＣ発現に関連する障害に関連する少なくとも一つの症状を防止、遅延、緩和、もしくは緩和すること、またはかかる障害の進行もしくは予想される進行を遅らせるもしくは逆転させることを意味する。例えば、緑内障を治療するために採用されるとき、本明細書に特徴付けられる方法は、本明細書に記載されるように、緑内障の一つ以上の症状を低減または防止するように、または関連する状態のリスクまたは重症度を低減するように機能し得る。したがって、文脈が別途明確に示さない限り、「治療する」、「治療」などの用語は、予防、例えば、ＭＹＯＣ発現に関連する障害および／または障害の症状の予防を包含することが意図される。治療はまた、治療が行われない場合に予測される生存時間と比較して、生存時間を延ばすことも意味し得る。
疾患マーカーまたは症状の文脈において「低化させる」ことは、任意の減少、例えば、そのようなレベルの統計的または臨床的に有意な減少を意味する。減少は、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％であり得る。減少は、そのような障害を有しない個体に対して正常範囲内として受け入れられるレベルまでの低下であり得る。
本明細書で使用される場合、「ＭＹＯＣ」は、ｍＲＮＡ（「ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ」）に対応する「ミオシリン」、または対応するタンパク質（「ＭＹＯＣタンパク質」）を指す。ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ転写物の配列は、配列番号１に見出すことができる。
ＩＩ．ｉＲＮＡ剤
ＭＹＯＣの発現を調節する（例えば、阻害する）ｉＲＮＡ剤が本明細書に記載される。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、細胞または哺乳動物におけるＭＹＯＣの発現を活性化する。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、細胞または対象（例えば、哺乳動物において例えば、ヒトにおいて）においてＭＹＯＣの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）分子を含み、該ｄｓＲＮＡは、ＭＹＯＣの発現において形成されるｍＲＮＡの少なくとも一部と相補的である相補性領域を有するアンチセンス鎖を含み、該相補性領域は、概して１９～２４ヌクレオチドの長さである３０ヌクレオチド以下の長さであり、および該ｄｓＲＮＡは、ＭＹＯＣを発現する細胞と接触すると、ＭＹＯＣの発現を、例えば、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％阻害する。
ＭＹＯＣの発現の調節（例えば、阻害）は、例えば、ＰＣＲもしくは分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）ベースの方法によって、またはウェスタンブロットなどのタンパク質ベースの方法によってアッセイすることができる。ＣＯＳ細胞、ＡＲＰＥ－１９細胞、ｈＴＥＲＴ ＲＰＥ－１細胞、ＨｅＬａ細胞、初代肝細胞、ＨｅｐＧ２細胞、初代培養細胞、または対象からの生体試料などの細胞培養におけるＭＹＯＣの発現は、ｂＤＮＡもしくはＴａｑＭａｎアッセイなどによりＭＹＯＣ ｍＲＮＡレベルを測定することによって、または例えばウェスタンブロットもしくはフローサイトメトリー技術を使用した免疫蛍光分析などによりタンパク質レベルを測定することによってアッセイすることができる。
ｄｓＲＮＡは、典型的には二本のＲＮＡ鎖を含み、それらは、ｄｓＲＮＡが使用されることとなる条件下において、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成するのに十分に相補的である。ｄｓＲＮＡの一方の鎖（アンチセンス鎖）は、典型的に、ＭＹＯＣの発現中に形成されるｍＲＮＡの配列に由来する標的配列に対して、実質的に相補的であり、また概して完全に相補的である、相補性領域を含む。もう一方の鎖（センス鎖）は、典型的にアンチセンス鎖に対して相補的である領域を含むため、当該二本の鎖は、好適な条件下で組み合わされた場合に、ハイブリダイズして二本鎖構造を形成する。概して、二本鎖構造は、１５～３０塩基対、より一般的には１８～２５塩基対、さらにより一般的には１９～２４塩基対、最も一般的には１９～２１塩基対の長さである。同様に、標的配列に対する相補性領域は、１５～３０個、より一般的には１８～２５個、さらにより一般的には１９～２４個、最も一般的には１９～２１個のヌクレオチドの長さである。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、１５～２０個のヌクレオチドの長さであり、他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２５～３０個のヌクレオチドの長さである。当業者が認識することとなるように、切断のために標的とされるＲＮＡの標的領域は、ほとんどの場合、より長いＲＮＡ分子の一部、多くの場合ｍＲＮＡ分子となることとなる。関連する場合、ｍＲＮＡ標的の「一部」は、ＲＮＡｉ依存性切断（すなわち、ＲＩＳＣ経路を経る切断）のための基質となるのに十分な長さのｍＲＮＡ標的の連続する配列である。９塩基対しか長さを持たない二本鎖ｄｓＲＮＡでも、いくつかの状況下では、ＲＮＡｉによるＲＮＡ切断を媒介し得る。ほとんどの場合、標的は、少なくとも１５個のヌクレオチドの長さ、例えば、１５～３０個のヌクレオチドの長さである。
当業者であれば、二本鎖領域が、ｄｓＲＮＡの主要な機能性部分であり、例えば約９～３６塩基対、例えば１５～３０塩基対の二本鎖領域であることも認識するであろう。すなわち、いくつかの実施形態では、切断のために所望のＲＮＡを標的とする、例えば、１５～３０塩基対の機能性二本鎖へとプロセシングされる限り、３０超の塩基対の二本鎖領域を有するＲＮＡ分子またはＲＮＡ分子の複合体は、ｄｓＲＮＡである。したがって、当業者は、いくつかの実施形態では、よって、ｍｉＲＮＡがｄｓＲＮＡであることを認識するであろう。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、天然に生じるｍｉＲＮＡではない。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ発現を標的とするのに有用なｉＲＮＡ剤は、より大きなｄｓＲＮＡの切断によって標的細胞内で生成されない。
本明細書において説明されるｄｓＲＮＡは、一つ以上の一本鎖ヌクレオチドオーバーハングをさらに含むことができる。ｄｓＲＮＡは、例えば、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．などから市販されているような、例えば、自動ＤＮＡ合成機を用いて、以下でさらに論じるように、当技術分野で公知の標準的な方法によって合成することができる。
いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣは、ヒトＭＹＯＣである。
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａまたは２Ｂに提供されるセンス配列から選択されるセンス配列を含むか、またはそのセンス配列からなるセンス鎖と、表２Ａまたは２Ｂに提供されるアンチセンス配列から選択されるアンチセンス配列を含むか、またはそのアンチセンス配列なるアンチセンス鎖と、を含む。
一部の態様では、ｄｓＲＮＡは、少なくともセンスおよびアンチセンスヌクレオチド配列を含み、それによって、センス鎖は、表２Ａまたは２Ｂに提供される配列から選択され、対応するアンチセンス鎖は、表２Ａまたは２Ｂに提供される配列から選択される。
これらの態様では、二つの配列の一方は、二つの配列の他方に対して相補的であり、この場合、配列の一方は、ＭＹＯＣの発現によって生じたｍＲＮＡの配列に対して実質的に相補的である。このように、ｄｓＲＮＡは、二つのオリゴヌクレオチドを含むこととなるが、一つのオリゴヌクレオチドは、センス鎖として記載され、第二のオリゴヌクレオチドは、対応するアンチセンス鎖として記載される。本明細書の他の箇所で説明され、また当技術分野で公知であるように、ｄｓＲＮＡの相補配列はまた、別個のオリゴヌクレオチド上に存在するのに対して、単一の核酸分子の自己相補領域として含有され得る。
当業者は、約２０～２３塩基対、例えば、具体的には２１塩基対の二本鎖構造を有するｄｓＲＮＡが、ＲＮＡ干渉を導入する際に特に有効であるとして歓迎されてきたことを十分に意識している（Ｅｌｂａｓｈｉｒ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ ２００１，２０：６８７７－６８８８）。しかしながら、他のものは、より短いまたはより長いＲＮＡ二本鎖構造も有効であり得ることを見出した。
上記に記載した実施形態では、表２Ａまたは２Ｂにて提供するオリゴヌクレオチド配列の性質により、本明細書に記載するｄｓＲＮＡは、最小でも１９ヌクレオチドの長の少なくとも一つの鎖を含むことができる。表２Ａまたは２Ｂ中の配列の一つを有するより短い二本鎖から、一方または両方の末端上の少数のヌクレオチドのみを差し引いたものが、上述したｄｓＲＮＡと比較して同様に有効であろうことが合理的に予想できる。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａまたは２Ｂの配列のうちの一つから少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれ以上の連続するヌクレオチドの部分配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａまたは２Ｂに提供されるアンチセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、または１９個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス配列、および表２Ａまたは２Ｂに提供される対応するセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、または１９個の連続するヌクレオチドを含むセンス配列を有する。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａまたは２Ｂに提供されるアンチセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス配列、および表２Ａまたは２Ｂに提供される対応するセンス配列の少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２１個の連続するヌクレオチドを含むセンス配列を含む。
一部のこうした実施形態では、ｄｓＲＮＡは、表２Ａまたは２Ｂに提供される配列の一部のみを含むが、表２Ａまたは２Ｂに提供される完全長配列を含むｄｓＲＮＡと同様に、ＭＹＯＣ発現のレベルを阻害するのに等しく有効である。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、本明細書に開示される全配列を含むｄｓＲＮＡと比較して、そのＭＹＯＣの発現レベルの阻害が、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０％以下の阻害で異なる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｉＲＮＡは、配列番号２のヌクレオチド配列の一部の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｉＲＮＡは、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の、０、または１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むセンス鎖を含む。
ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡは、本明細書にて提供される配列番号１の配列を有し得る。
ホモサピエンスミオシリン（ＭＹＯＣ）、ｍＲＮＡ
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配列番号１の逆相補は、本明細書にて配列番号２として提供される。
ＴＴＧＧＧＴＡＡＧＡＡＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＣＡＣＡＡＴＧＴＡＡＡＧＧＧＴＴＡＴＧＴＧＡＧＡＣＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＴＣＴＡＴＣＴＧＡＡＧＣＡＴＴＡＧＡＡＧＣＣＡＡＣＴＧＴＡＧＴＡＡＡＴＧＣＡＴＣＴＴＡＣＴＴＡＴＡＴＴＣＧＡＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＴＡＴＴＣＴＧＣＴＴＣＣＴＴＴＡＧＡＡＧＴＴＡＴＧＣＴＴＴＴＴＡＴＴＧＴＧＧＣＴＴＧＴＧＧＴＡＡＣＣＡＴＧＴＡＡＣＡＴＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＴＴＴＴＣＡＧＧＡＡＧＡＡＡＣＴＡＴＴＡＴＧＣＣＴＴＡＣＡＧＣＴＴＴＴＧＣＣＣＣＡＡＡＴＣＡＣＡＡＧＡＡＡＡＣＴＴＧＡＡＣＴＡＴＧＴＣＡＴＴＡＡＡＣＡＴＣＣＣＡＴＡＡＡＴＧＣＴＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＡＡＡＧＧＡＴＡＴＴＴＡＴＴＡＴＡＴＧＡＡＡＴＴＧＴＣＴＡＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＴＡＣＡＡＴＴＣＣＴＧＡＡＴＡＧＴＴＡＧＡＴＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＴＣＣＴＴＣＴＧＧＡＴＴＡＡＴＧＡＡＡＡＣＴＴＧＧＡＡＡＧＣＡＧＴＣＡＡＡＧＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＧＣＴＧＧＣＴＣＴＣＣＣＴＴＣＡＧＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＣＣＡＧＧＡＧＣＣＣＴＧＡＧＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣＴＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＧＴＡＣＡＧＣＴＴＧＧＡＧＧＣＴＴＴＴＣＡＣＡＴＣＴＴＧＧＡＧＡＧＣＴＴＧＡＴＧＴＣＡＴＡＡＧＴＧＡＣＣＡＴＧＴＴＣＡＡＧＴＴＧＴＣＣＣＡＧＧＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＴＴＣＴＣＣＡＧＧＧＧＧＴＴＧＴＡＧＴＣＡＡＴＣＡＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＴＡＴＡＧＣＧＧＴＴＣＴＴＧＡＡＴＧＧＧＡＴＧＧＴＣＡＧＧＧＴＣＴＴＧＣＴＧＡＴＡＣＣＴＧＴＧＣＣＴＧＴＧＴＣＡＴＡＡＧＣＡＡＡＧＴＴＧＡＣＧＧＴＡＧＣＡＴＣＴＧＣＴＧＡＧＧＴＧＴＡＧＣＴＧＣＴＧＡＣＧＧＴＧＴＡＣＡＡＧＧＴＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣＡＴＴＧＧＣＧＡＣＴＧＡＣＴＧＣＴＴＡＣＧＧＡＴＧＴＴＴＧＴＣＴＣＣＣＡＧＧＴＴＴＧＴＴＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＴＧＧＧＴＴＣＡＧＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧＡＣＡＡＴＧＧＣＡＣＣＴＴＴＧＧＣＣＴＣＡＴＣＧＧＴＧＣＴＧＴＡＡＡＴＧＡＣＣＣＡＧＡＧＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＡＧＣＣＡＡＧＴＣＡＡＴＧＴＣＣＧＴＧＴＡＧＣＣＡＣＣＣＣＡＡＧＡＡＴＡＣＧＧＧＡＡＣＴＧＴＣＣＧＴＧＧＴＡＧＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＧＧＴＡＴＴＣＡＧＣＴＣＡＴＡＴＣＴＴＡＴＧＡＣＡＧＴＴＣＴＧＧＡＣＴＣＡＧＣＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＴＡＧＡＧＧＣＴＣＣＣＣＧＡＧＴＡＣＡＣＣＡＣＡＧＣＡＣＣＣＧＴＧＣＴＴＴＣＣＡＧＴＧＧＣＣＴＡＧＧＣＡＧＴＡＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＡＧＡＡＧＧＧＴＡＧＣＣＣＴＧＣＡＴＡＡＡＣＴＧＧＣＴＧＡＴＧＡＧＧＴＣＡＴＡＣＴＣＡＡＡＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＡＣＡＴＣＣＧＴＧＣＣＡＡＣＴＧＴＧＴＣＧＡＴＴＣＴＣＣＡＣＧＴＧＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＴＧＴＡＧＧＧＧＴＡＧＧＴＧＧＧＣＴＴＧＧＧＧＴＣＴＣＧＣＡＴＣＣＡＣＡＣＡＣＣＡＴＡＣＴＴＧＣＣＡＧＴＡＡＴＴＧＴＴＴＣＴＧＣＴＧＴＴＣＴＣＡＧＣＧＴＧＡＧＡＧＧＣＴＣＴＣＣＴＡＣＣＣＡＡＡＣＴＡＧＴＴＣＴＣＣＡＣＡＴＣＣＧＧＴＧＴＣＴＣＣＣＴＣＴＣＣＡＣＴＣＣＴＧＡＧＡＴＡＧＣＣＡＧＡＴＧＧＧＣＴＣＴＣＣＴＴＣＡＡＡＡＴＴＣＧＧＧＡＡＧＣＡＧＧＡＡＣＴＴＣＡＧＴＴＡＧＣＴＣＧＧＡＣＴＴＣＡＧＴＴＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＧＴＣＣＡＡＡＴＴＣＣＡＣＧＴＡＧＡＡＡＣＴＴＣＴＣＴＧＧＡＧＣＣＴＧＧＴＧＧＣＡＣＡＧＣＣＣＧＡＧＣＡＧＴＧＴＣＴＣＧＧＧＴＣＴＧＧＧＧＡＣＡＣＴＧＧＣＣＣＣＴＴＣＴＣＡＧＣＣＴＴＧＣＴＡＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＴＴＣＣＡＡＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＡＴＴＣＴＣＡＴＴＴＴＣＴＴＧＣＣＴＴＡＧＴＣＧＣＴＴＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＡＣＴＴＧＴＣＴＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＧＣＴＧＴＡＧＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＣＴＣＴＣＴＧＧＴＴＴＧＧＧＴＴＴＣＣＡＧＣＴＧＧＴＣＣＣＧＣＴＣＣＣＧＣＣＴＣＡＧＧＧＴＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＣＴＣＴＧＣＡＧＣＣＣＣＴＣＣＴＧＧＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＧＣＣＴＧＧＣＡＧＣＣＴＧＧＴＣＣＡＡＧＧＴＣＡＡＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＴＣＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＡＧＴＣＧＡＧＣＴＴＴＧＧＴＧＧＣＣＴＣＣＡＧＧＴＣＴＡＡＧＣＧＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＣＴＧＴＡＡＧＴＴＡＴＧＧＡＴＧＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＣＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＧＡＴＴＣＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＡＧＧＴＡＴＡＣＴＧＧＣＡＴＣＧＧＣＣＡＣＴＣＴＧＧＴＣＡＴＴＧＧＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＣＴＧＡＧＣＴＧＴＣＣＴＧＧＣＣＣＣＣＡＣＡＴＣＣＣＡＣＡＣＣＡＧＧＣＡＧＧＣＣＡＧＡＡＧＣＡＧＣＡＧＣＴＧＧＡＣＡＧＣＴＧＧＣＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＣＡＣＡＧＡＡＧＡＡＣＣＴＣＡＴＴＧＣＡＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＧＡＧＧＣＴＴＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＧＣＴＣＴＧＣＴＧＴＧＣＴＧＡＧＡＧＧＴＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＴＴＧＣＴＧＧＣＴＣ（配列番号２）
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｉＲＮＡは、表２Ａおよび２Ｂに提供される配列のうちの一つから少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含み、随意に、ＭＹＯＣにおいて選択された配列に連続する領域から取られる追加のヌクレオチド配列に結合され得る。
標的配列の長さは概して１５～３０ヌクレオチドであるが、任意の所与の標的ＲＮＡの切断を方向付けるためのこの範囲の特定配列の適合性には幅広い変動がある。本明細書に記載される様々なソフトウェアパッケージおよびガイドラインは、任意の所与の遺伝子標的に対する最適な標的配列の識別のためのガイダンスを提供するが、所与のサイズ（非限定的な例として、２１個のヌクレオチド）の「ウィンドウ」または「マスク」が、標的ＲＮＡ配列上に文字通りまたは比喩的に（例えば、コンピューター内で、を含む）配置されて、標的配列として機能し得るサイズ範囲内の配列を識別する経験的アプローチも講じることができる。配列「ウィンドウ」を初期標的配列位置から一ヌクレオチドだけ上流または下流に漸進的に移動させることによって、選択された任意の所与の標的サイズに対して可能な配列の完全なセットが特定されるまで、次の潜在的な標的配列を特定することができる。このプロセスは、特定された配列の系統合成および試験（本明細書に記載されるか、または当該技術分野で公知のアッセイを使用して）と組み合わされて、最適に実行される配列を特定することにより、ｉＲＮＡ剤で標的化されたときに標的遺伝子発現の最良の阻害を媒介するＲＮＡ配列を特定することができる。したがって、阻害効率のさらなる最適化は、所与の配列の上流または下流に一ヌクレオチドだけ漸進的に「ウィンドウを歩くこと」により、同等またはより良好な阻害特性を有する配列を特定することによって達成され得ることが企図される。
さらに、例えば、表２Ａおよび２Ｂで特定される任意の配列について、より長いまたはより短い配列を生成するためにヌクレオチドを系統的に追加または除去し、その点から標的ＲＮＡを上下に、より長いまたはより短いサイズのウィンドウを歩くことによって生成されるそれらおよび配列を試験することによって、さらなる最適化を達成できることが企図される。再び、このアプローチを、当該技術分野で公知または本明細書に記載される阻害アッセイにおけるそれらの標的配列に基づいて、ｉＲＮＡの有効性を試験する新しい候補標的の生成に結合することは、阻害の効率のさらなる改善につながり得る。さらにまた、そのような最適化された配列は、発現阻害剤として分子をさらに最適化（例えば、血清安定性または循環半減期の増加、熱安定性の増加、膜貫通送達の強化、特定の場所または細胞型の標的化、サイレンシング経路酵素との相互作用の増加、エンドソームからの放出の増加、など）するために、例えば、本明細書に記載されるもしくは当該技術分野で公知の修飾ヌクレオチドの導入、オーバーハングの追加または変更、または当該技術分野で既知であり、および／または本明細書で考察される他の修飾によって、調整され得る。
いくつかの実施形態では、本開示は、未修飾または未コンジュゲートである表２ＢのｉＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、表２Ａに提供されるヌクレオチド配列を有するが、表に示される一つ以上のリガンドまたは部分を欠く。リガンドまたは部分（例えば、親油性リガンドまたは部分）は、本願において提供される位置のいずれかに含まれ得る。
本明細書において記載するｉＲＮＡは、標的配列に対する一つ以上のミスマッチを含有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書において記載するｉＲＮＡは、３以下のミスマッチを含有する。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が標的配列に対するミスマッチを含む場合、ミスマッチの面積は、相補性領域の中心に位置しない。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡのアンチセンス鎖が、標的配列に対してミスマッチを含有する場合、該ミスマッチは、相補性領域の５’末端または３’末端のいずれかから最後の５ヌクレオチドの範囲内にあるように制限することができる。例えば、２３ヌクレオチドのｉＲＮＡ剤の場合、ＭＹＯＣの領域に対して相補的であるＲＮＡ鎖は、概して、中央の１３ヌクレオチドの範囲内にいかなるミスマッチも含有しない。本明細書において記載する方法または当技術分野で公知の方法を使用することにより、標的配列に対してミスマッチを含有するｉＲＮＡが、ＭＹＯＣの発現の阻害において効果的であるか否かを判定することができる。とりわけ、ＭＹＯＣ遺伝子における特定の相補性領域が、集団内での多型配列バリエーションを有することがわかっている場合には、ＭＹＯＣの発現を阻害するミスマッチを有するｉＲＮＡの有効性を考慮することが重要である。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡの少なくとも一つの端は、１～４、概して１または２のヌクレオチドの一本鎖ヌクレオチドオーバーハングを有する。いくつかの実施形態では、少なくとも一つのヌクレオチドオーバーハングを有するｄｓＲＮＡは、それらの平滑末端対応物と比較して優れた阻害特性を有する。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡのＲＮＡ（例えばｄｓＲＮＡ）は、安定性または他の有益な特徴を増強するように化学的に修飾される。本開示において特徴とされる核酸は、当技術分野で十分に確立された方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，”Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｒｓ．），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡ、に記載されるものなどによって合成または修飾できる。修飾としては、例えば、（ａ）末端修飾、例えば、５’末端修飾（リン酸化、コンジュゲーション、逆方向結合など）３’末端修飾（コンジュゲーション、ＤＮＡヌクレオチド、逆方向結合など）、（ｂ）塩基修飾、例えば、安定化塩基、不安定化塩基、または伸長したレパートリーのパートナーと塩基対合する塩基での置換、塩基除去（脱塩基ヌクレオチド）またはコンジュゲートされた塩基、（ｃ）糖修飾（例えば、２’位もしくは４’位における、もしくは非環式糖を有する）または糖の置換、ならびに（ｄ）ホスホジエステル結合の修飾または置換を含む主鎖修飾、が挙げられる。本開示における有用なＲＮＡ化合物の具体例としては、これに限定されないが、修飾骨格を含有する、または非天然のヌクレオシド間連結を含有するＲＮＡが挙げられる。修飾骨格を有するＲＮＡとしては、中でも、骨格内にリン原子を有さないものが挙げられる。本明細書の目的上、また時には当技術分野で言及されるように、それらのヌクレオシド間骨格内にリン原子を有さない修飾ＲＮＡもまた、オリゴヌクレオシドであるとみなされ得る。特定の実施形態では、修飾ＲＮＡは、そのヌクレオシド間主鎖内にリン原子を有するであろう。
修飾ＲＮＡ骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’－アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルのホスホネート、ホスフィネート、３’－アミノホスホルアミデートおよびアミノアルキルホスホルアミデートを含むホスホルアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびに通常の３’－５’連結を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’連結類似体、ならびに隣接するヌクレオシド単位の対が３’－５’から５’－３’または２’－５’から５’－２’で結合している反転した極性を有するもの）が挙げられる。種々の塩、混合塩および遊離酸の形態も含まれる。
上記のリン含有連結の調製を教示する代表的な米国特許としては、これに限定されないが、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９５号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３１６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号、第５，６２５，０５０号、第６，０２８，１８８号、第６，１２４，４４５号、第６，１６０，１０９号、第６，１６９，１７０号、第６，１７２，２０９号、第６，２３９，２６５号、第６，２７７，６０３号、第６，３２６，１９９号、第６，３４６，６１４号、第６，４４４，４２３号、第６，５３１，５９０号、第６，５３４，６３９号、第６，６０８，０３５号、第６，６８３，１６７号、第６，８５８，７１５号、第６，８６７，２９４号、第６，８７８，８０５号、第７，０１５，３１５号、第７，０４１，８１６号、第７，２７３，９３３号、第７，３２１，０２９号、および米国特許第ＲＥ３９４６４号が含まれ、それら各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
骨格内にリン原子を含まない修飾ＲＮＡ骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子およびアルキルもしくはシクロアルキルのヌクレオシド間連結、または一つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環のヌクレオシド間連結によって形成される骨格を有する。これらとしては、モルホリノ連結を有するもの（ヌクレオシドの糖部分から一部形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシドおよびスルホン骨格、ホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノ骨格、スルホネートおよびスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびにＮ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２の混合した構成要素部分を有する他のものが挙げられる。
上記のオリゴヌクレオシドの調製を教示する代表的な米国特許としては、これに限定されないが、米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号、および第５，６７７，４３９号が挙げられ、このそれぞれの内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
ｉＲＮＡにおいて使用するのに好適であり、または企図される他のＲＮＡ模倣体において、ヌクレオチド単位の糖およびヌクレオシド間連結、すなわちその骨格、の両方が、新規の基と置換される。この塩基単位は、適切な核酸標的化合物とのハイブリダイゼーションのために維持される。このようなオリゴマー化合物の一つ、優れたハイブリダイゼーション特性を有するとわかっているＲＮＡ模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と呼ばれる。ＰＮＡ化合物においては、ＲＮＡの糖骨格は、アミド含有骨格で、特にアミノエチルグリシン骨格で置換されている。核酸塩基が、保持されて、骨格のアミド部分のアザ窒素原子に直接的または間接的に結合される。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、これに限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号、および第５，７１９，２６２号が挙げられ、それらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。ＰＮＡ化合物のさらなる教示は、例えば、Ｎｉｅｌｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７－１５００に見出すことができる。
本開示において特徴づけられるいくつかの実施形態としては、ホスホロチオエート骨格をもつｄｓＲＮＡおよびヘテロ原子骨格をもつオリゴヌクレオシドが挙げられ、特に上記で参照した米国特許第５，４８９，６７７号の、－－ＣＨ２－－ＮＨ－－ＣＨ２－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｏ－－ＣＨ２－－［（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる］、－－ＣＨ２－－Ｏ－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ３）－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－、および－－Ｎ（ＣＨ３）－－ＣＨ２－－ＣＨ２－－［天然のホスホジエステル骨格を－－Ｏ－－Ｐ－－Ｏ－－ＣＨ２－－として表す］、ならびに上記で参照した米国特許第５，６０２，２４０号のアミド骨格、が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書において取り上げるＲＮＡは、上記で参照した米国特許第５，０３４，５０６号のモルホリノ骨格構造を有する。
修飾ＲＮＡはまた、一つ以上の置換された糖部分を含み得る。本明細書において取り上げられるｉＲＮＡ、例えば、ｄｓＲＮＡは、２’位に以下のうちの一つを含み得る：ＯＨ、Ｆ、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキル、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルケニル、Ｏ－、Ｓ－またはＮ－アルキニル、またはＯ－アルキル－Ｏ－アルキルであって、式中アルキル、アルケニル、およびアルキニルは、置換または非置換のＣ１～Ｃ１０アルキルまたはＣ２～Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルであり得る。例示的な好適な修飾としては、Ｏ［（ＣＨ２）ｎＯ］ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ［（ＣＨ２）ｎＣＨ３）］２が挙げられ、式中ｎおよびｍは、１から約１０である。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、２’位において以下のうちの一つを含む：Ｃ１～Ｃ１０低級アルキル、置換された低級アルキル、アルカリル、アラルキル、Ｏ－アルカリルまたはＯ－アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、ｉＲＮＡの薬物動態特性を改善するための基、またはｉＲＮＡの薬力学的特性を改善するための基、および同様の特性を有する他の置換基。いくつかの実施形態では、修飾には、２’－メトキシエトキシ（２’－Ｏ－－ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’－Ｏ－（２－メトキシエチル）または２’－ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８：４８６－５０４）、すなわち、アルコキシ－アルコキシ基、が含まれる。別の例示的な修飾には、２’－ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、２’－ＤＭＡＯＥとしても知られる、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基、および２’－ジメチルアミノエトキシエトキシ（当技術分野で２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチルまたは２’－ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｏ－－ＣＨ２－－Ｎ（ＣＨ２）２、がある。
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、一つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上）の非環式ヌクレオチド（またはヌクレオシド）を含む。特定の実施形態では、センス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方は、鎖当たり五個未満の非環式ヌクレオチド（例えば、鎖当たり四、三、二、または一個の非環式ヌクレオチド）を含む。一つ以上の非環式ヌクレオチドは、例えば、ｉＲＮＡ薬剤の、センス鎖もしくはアンチセンス鎖、または両方の鎖の二本鎖領域；センス鎖もしくはアンチセンス鎖、または両方の鎖の５’末端、３’末端、５’末端および３’末端の両方、に見出すことができる。いくつかの実施形態では、一つ以上の非環式ヌクレオチドは、センス鎖もしくはアンチセンス鎖、またはその両方の１位～８位に存在する。いくつかの実施形態では、一つ以上の非環式ヌクレオチドは、アンチセンス鎖の５’－末端から４位～１０位（例えば、６位～８位）でアンチセンス鎖に見られる。いくつかの実施形態では、一つ以上の非環式ヌクレオチドは、ｉＲＮＡ剤の一方または両方の３’末端オーバーハングに見られる。
本明細書で使用される場合、「非環式ヌクレオチド」または「非環式ヌクレオシド」という用語は、非環式糖、例えば、非環式リボースを有する任意のヌクレオチドまたはヌクレオシドを指す。例示的な非環式ヌクレオチドまたはヌクレオシドは、核酸塩基、例えば、天然核酸塩基または修飾核酸塩基（例えば、本明細書に記載される核酸塩基）を含み得る。特定の実施形態では、任意のリボース炭素（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４またはＣ５）の間の結合は、独立して、または組み合わせて、ヌクレオチドに存在しない。いくつかの実施形態では、リボース環のＣ２－Ｃ３炭素間の結合は存在しない、例えば、非環式２’－３’－セコ－ヌクレオチドモノマー。他の実施形態では、Ｃ１－Ｃ２，Ｃ３－Ｃ４、またはＣ４－Ｃ５の間の結合は存在しない（例えば、１’－２’、３’－４’、または４’－５’－セコヌクレオチドモノマー）。例示的な非環式ヌクレオチドは、米国特許第８，３１４，２２７号に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。例えば、非環式ヌクレオチドは、米国特許第８，３１４，２２７号の図１～２のモノマーＤ～Ｊのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態では、非環式ヌクレオチドは、以下のモノマーを含む：
塩基は、核酸塩基、例えば、天然核酸塩基または修飾核酸塩基（例えば、本明細書に記載される核酸塩基）である。
特定の実施形態では、非環式ヌクレオチドは、例えば、非環式ヌクレオチドを別の部分、例えばリガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ、コレステロールリガンド）、アルキル、ポリアミン、糖、ポリペプチドなどに結合することによって、修飾または誘導体化され得る。
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、一つ以上の非環式ヌクレオチドおよび一つ以上のＬＮＡ（例えば、本明細書に記載されるＬＮＡ）を含む。例えば、一つ以上の非環式ヌクレオチドおよび／または一つ以上のＬＮＡは、センス鎖、アンチセンス鎖、またはその両方に存在し得る。一本鎖における非環式ヌクレオチドの数は、対向する鎖におけるＬＮＡの数と同一であっても異なっていてもよい。特定の実施形態では、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、二本鎖領域または３’オーバーハングに位置する五個未満のＬＮＡ（例えば、四、三、二、または一個のＬＮＡ）を含む。他の実施形態では、一つまたは二つのＬＮＡは、センス鎖の二本鎖領域または３’オーバーハングに位置する。その代わりに、または組み合わせて、センス鎖および／またはアンチセンス鎖は、二本鎖領域または３’オーバーハング中に五個未満の非環式ヌクレオチド（例えば、四、三、二、または一個の非環式ヌクレオチド）を含む。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤のセンス鎖は、センス鎖の３’オーバーハングに一つまたは二つのＬＮＡ、およびｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の二本鎖領域（例えば、アンチセンス鎖の５’末端から４位～１０位（例えば、６位～８位））に一つまたは二つの非環式ヌクレオチドを含む。
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤中に一つ以上の非環式ヌクレオチド（単独で、または一つ以上のＬＮＡに加えて）を含めることにより、ｉＲＮＡ分子の（ｉ）オフターゲット効果の低減、（ｉｉ）ＲＮＡｉにおけるパッセンジャー鎖関与の低減、（ｉｉｉ）その標的ｍＲＮＡに対するガイド鎖の特異性の増加、（ｉｖ）マイクロＲＮＡオフターゲット効果の低減、（ｖ）安定性の増加、または（ｖｉ）分解に対する耐性の増加のうちの一つ以上（またはすべて）が生じる。
他の修飾としては、２’－メトキシ（２’－ＯＣＨ３）、２’－５アミノプロポキシ（２’－ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）および２’－フルオロ（２’－Ｆ）が挙げられる。同様の修飾はまた、ｉＲＮＡのＲＮＡ上の他の位置、特に３’末端ヌクレオチド上または２’－５’結合ｄｓＲＮＡ中の糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位においてもなされ得る。ｉＲＮＡはまた、ペントフラノシル糖の代わりにシクロブチル部分などの糖模倣体を有し得る。こうした修飾糖構造の調製を教示する代表的な米国特許として、これに限定されないが、米国特許第第４，９８１，９５７号、第５，１１８，８００号、第５，３１９，０８０号、第５，３５９，０４４号、第５，３９３，８７８号、第５，４４６，１３７号、第５，４６６，７８６号、第５，５１４，７８５号、第５，５１９，１３４号、第５，５６７，８１１号、第５，５７６，４２７号、第５，５９１，７２２号、第５，５９７，９０９号、第５，６１０，３００号、第５，６２７，０５３号、第５，６３９，８７３号、第５，６４６，２６５号、第５，６５８，８７３号、第５，６７０，６３３号、および第５，７００，９２０号が挙げられ、それらのうちいくつかは、本出願と共同所有され、それらそれぞれが、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
ｉＲＮＡはまた、核酸塩基（当技術分野では単に「塩基」と称することも多い）の修飾または置換を含み得る。本明細書において使用する場合、「未修飾の」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基のアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基のチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、他の合成核酸塩基および天然核酸塩基が挙げられ、例えば５－メチルシトシン（５－ｍｅ－Ｃ）、５－ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２－アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６－メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２－プロピルおよび他のアルキル誘導体、２－チオウラシル、２－チオチミンおよび２－チオシトシン、５－ハロウラシルおよびシトシン、５－プロピニルウラシルおよびシトシン、６－アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５－ウラシル（シュードウラシル）、４－チオウラシル、８－ハロ、８－アミノ、８－チオール、８－チオアルキル、８－ヒドロキシルおよび他の８－置換のアデニンおよびグアニン、５－ハロ、特に５－ブロモ、５－トリフルオロメチルおよび他の５－置換のウラシルおよびシトシン、７－メチルグアニンおよび７－メチルアデニン、８－アザグアニンおよび８－アザアデニン、７－デアザグアニンおよび７－ダアザアデニン（７－ｄａａｚａａｄｅｎｉｎｅ）ならびに３－デアザグアニンおよび３－デアザアデニンなどである。
さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｐ．ｅｄ．Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２００８に開示されるもの、Ｔｈｅ Ｃｏｎｃｉｓｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ ８５８－８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｌ，ｅｄ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されるもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １５，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ ２８９－３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄ．，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されるもの、が挙げられる。これら核酸塩基のうちのいくつかは、本開示において取り上げるオリゴマー化合物の結合親和性を増大するのに特に有用である。これらには、２－アミノプロピルアデニン、５－プロピニルウラシルおよび５－プロピニルシトシンを含む、５－置換ピリミジン、６－アザピリミジンおよびＮ－２、Ｎ－６および０～６置換プリンが挙げられる。５－メチルシトシン置換は、核酸の二本鎖安定性を０．６～１．２℃高めることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，Ｅｄｓ．，ｄｓＲＮＡ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６－２７８）、特に２’－Ｏ－メトキシエチル糖修飾と組み合わせた場合には、さらに例示的な塩基置換である。
上述の修飾核酸塩基ならびに他の修飾核酸塩基の一部の調製を教示する代表的な米国特許としては、これに限定されるものではないが、上述の米国特許第３，６８７，８０８号、ならびに米国特許第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０、第５，５８７，４６９号、第５，５９４，１２１号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，６８１，９４１号、第６，０１５，８８６号、第６，１４７，２００号、第６，１６６，１９７号、第６，２２２，０２５号、第６，２３５，８８７号、第６，３８０，３６８号、第６，５２８，６４０号、第６，６３９，０６２号、第６，６１７，４３８号、第７，０４５，６１０号、第７，４２７，６７２号、および第７，４９５，０８８号が挙げられ、これらそれぞれが参照により本明細書に組み込まれる。第５，７５０，６９２号もまた参照により本明細書に組み込まれる。
ｉＲＮＡのＲＮＡはまた、一つ以上の（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上）二環式糖部分を含むように修飾され得る。「二環式糖」は、二個の原子を架橋することによって修飾されたフラノシル（ｆｕｒａｎｏｓｙｌ）環である。「二環式のヌクレオシド」（「ＢＮＡ」）は、糖環の二つの炭素原子を接続し、それによって二環式環系を形成する架橋を含む糖部分を有するヌクレオシドである。特定の実施形態では、架橋が、糖環の４’－炭素と２’－炭素を接続する。したがって、いくつかの実施形態では、本開示の薬剤は、一つ以上のロック核酸（ＬＮＡ）（本明細書において「ロックヌクレオチド」とも呼ばれる）を含み得る。いくつかの実施形態では、ロック核酸は、リボース部分が、例えば、２’および４’炭素を接続する追加の架橋を含む、修飾リボース部分を有するヌクレオチドである。この構造は、３’－エンド構造立体配座内にリボースを効率的に「ロックする」。ｓｉＲＮＡへのロック核酸の付加により、血清中のｓｉＲＮＡ安定性が増大し、熱安定性が増加し、オフターゲット効果が低減することが示されている（Ｅｌｍｅｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３３（１）：４３９－４４７；Ｍｏｏｋ，ＯＲ．ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｍｏｌ Ｃａｎｃ Ｔｈｅｒ ６（３）：８３３－８４３；Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３１（１２）：３１８５－３１９３）。
本開示のポリヌクレオチドにおいて使用するための二環式ヌクレオシドの例として、制限するものではないが、４’と２’リボシル環原子の間の架橋を含むヌクレオシドが挙げられる。特定の実施形態では、本開示のアンチセンスポリヌクレオチド剤として、４’から２’への架橋を含む一つ以上の二環式ヌクレオシドが挙げられる。このような４’から２’架橋二環式ヌクレオシドの例としては、限定するものではないが、４’－（ＣＨ２）－Ｏ－２’（ＬＮＡ）；４’－（ＣＨ２）－Ｓ－２’；４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’（ＥＮＡ）；４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’（「拘束されたエチル」または「ｃＥｔ」とも呼ばれる）および４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第第７，３９９，８４５号を参照）、４’－Ｃ（ＣＨ３）（ＣＨ３）－Ｏ－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，２８３号を参照）、４’－ＣＨ２－Ｎ（ＯＣＨ３）－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，４２５号を参照）、４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（ＣＨ３）－２’（例えば、米国特許公開第２００４／０１７１５７０号を参照）、４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’であり、式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ１－Ｃ１２アルキル、または保護基である（例えば、米国特許第７，４２７，６７２号参照）、４’－ＣＨ２－Ｃ（Ｈ）（ＣＨ３）－２’（例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８－１３４参照）、および４’－ＣＨ２－Ｃ（＝ＣＨ２）－２’（およびその類似体、例えば、米国特許第８，２７８，４２６号を参照）、が挙げられる。前述の各々の内容は、本明細書で提供する方法のために参照により本明細書に組み込まれる。ロック核酸の調製を教示する代表的な米国特許としては、限定するものではないが、以下が挙げられる：米国特許第６，２６８，４９０号、第６，６７０，４６１号、第６，７９４，４９９号、第６，９９８，４８４号、第７，０５３，２０７号、第７，０８４，１２５号、第７，３９９，８４５号、および第８，３１４，２２７号、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。例示的なＬＮＡとしては、２’，４’－Ｃメチレンビシクロヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｗｅｎｇｅｌ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＴ５国際公開第００／６６６０４号および国際公開第９９／１４２２６号を参照）。
例えばα－Ｌ－リボフラノースおよびβ－Ｄ－リボフラノースをはじめとする一つ以上の立体化学的な糖立体配座を有する前述の二環式ヌクレオシドのいずれもが、調製可能である（国際公開第９９／１４２２６号を参照）。
本開示のＲＮＡｉ剤をまた、一つ以上の拘束されたエチルヌクレオチドを含むように修飾できる。本明細書において使用される場合、「拘束されたエチルヌクレオチド」または「ｃＥｔ」は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’架橋を含む二環式糖部分を含むロック核酸である。いくつかの実施形態では、拘束されたエチルヌクレオチドは、Ｓ立体配座であり、本明細書において「Ｓ－ｃＥｔ」と称する。
本開示のＲＮＡｉ剤はまた、一つ以上の「立体配座制限ヌクレオチド」（「ＣＲＮ」）を含み得る。ＣＲＮは、リボースのＣ２’およびＣ４’炭素を、またはリボースのＣ３’および－Ｃ５’炭素を接続するリンカーを有するヌクレオチド類似体である。ＣＲＮは、リボース環を安定な立体配座にロックして、ｍＲＮＡに対するハイブリダイゼーション親和性を増大する。リンカーは、酸素を安定性および親和性にとって最適な位置に配置するのに十分な長さのものであり、その結果、リボース環のパッカリングを少なくする。
上記のＣＲＮのある特定のものの調製を教示する代表的な刊行物として、限定するものではないが、米国特許出願公開第２０１３／０１９０３８３および国際公開第２０１３／０３６８６８号が挙げられ、それらの各々の内容は、参照により本明細書に提供される方法のために本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、ＵＮＡ（アンロック核酸）ヌクレオチドである一つ以上のモノマーを含む。ＵＮＡは、アンロック非環式核酸であり、その糖の結合のいずれもが除去され、アンロック「糖」残基を形成する。一実施例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合が除去されているモノマーも包含する（すなわち、Ｃ１’炭素とＣ４’炭素との間の共有結合による炭素－酸素－炭素間結合）。別の例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’とＣ３’炭素との間の炭素－炭素の共有結合）が除去される（Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒｉｅｓ，５２，１３３－１３４（２００８）ａｎｄ Ｆｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，２００９，１０，１０３９を参照）。
ＵＮＡの調製を教示する代表的な米国の刊行物として、限定するものではないが、米国特許第８，３１４，２２７号、および米国特許出願公開第２０１３／００９６２８９号、第２０１３／００１１９２２号、および第２０１１／０３１３０２０号が挙げられ、この各々の内容は、参照により本明細書に提供される方法のために本明細書に組み込まれる。
他の実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、一つ以上（例えば、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上）のＧ－クランプヌクレオチドを含む。Ｇ－クランプヌクレオチドは、修飾シトシン類似体であり、修飾は、二本鎖内の相補的グアニンのワトソンクリック面およびフーグスティーン面の両方を水素結合する能力を付与する、例えば、Ｌｉｎ ａｎｄ Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ，１９９８，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２０、８５３１－８５３２を参照。オリゴヌクレオチド内の単一のＧ－クランプ類似体置換は、相補的オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた場合、実質的に強化されたらせん状の熱安定性およびミスマッチ識別をもたらし得る。ｉＲＮＡ分子にかかるヌクレオチドを含めることにより、核酸標的、相補的配列、または鋳型鎖に対する親和性および特異性が強化され得る。
ＲＮＡ分子の末端に対する安定化修飾として可能性があるものとしては、Ｎ－（アセチルアミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－ＮＨＡｃ）、Ｎ－（カプロイル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６）、Ｎ－（アセチル－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－ＮＨＡｃ）、チミジン－２’－Ｏ－デオキシチミジン（エーテル）、Ｎ－（アミノカプロイル）－４－ヒドロキシプロリノール（Ｈｙｐ－Ｃ６－アミノ）、２－ドコサノイル－ウリジン－３’’－ホスフェート、逆位塩基（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｂａｓｅ）ｄＴ（ｉｄＴ）およびその他などが挙げられ得る。この修飾の開示は、国際公開第２０１１／００５８６１号に見出される。
本開示のＲＮＡｉ剤の他の修飾としては、５’ホスフェートまたは５’ホスフェート模倣体、例えば、ＲＮＡｉ剤のアンチセンス鎖上の５’－末端ホスフェートまたはホスフェート模倣体が挙げられる。好適なホスフェート模倣体は、例えば、その内容が本明細書に提供される方法のために参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／０１５７５１１号に開示されている。一実施形態では、本発明の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドの５’－ホスフェートまたは５’－ホスフェート模倣体をさらに含む。別の実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤は、アンチセンス鎖の５’ヌクレオチドの５’－ホスフェート模倣体をさらに含む。具体的な実施形態では、５’ホスフェート模倣体は、５’－ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）である。一実施形態では、ホスフェート模倣体は、５’－シクロプロピルホスホネート（ＶＰ）である。いくつかの実施形態では、二本鎖ｉＲＮＡ剤のアンチセンス鎖の５’－末端は、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）を含有しない。
一実施形態では、修飾ヌクレオチドの少なくとも一つが、デオキシ－ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド（ＧＮＡ）、例えばＧｇｎ、Ｃｇｎ、ＴｇｎまたはＡｇｎ、２’ホスフェートを有するヌクレオチド、例えば、Ｇ２ｐ、Ｃ２ｐ、Ａ２ｐ、Ｕ２ｐ、およびビニル－ホスホネートヌクレオチド、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される。他の実施形態では、表５および６の二本鎖の各々は、本開示の別の二本鎖ｉＲＮＡ剤を提供するように特に修飾され得る。一実施例では、各センス二本鎖の３’末端は、３’末端Ｌ９６リガンドを除去し、三個の３’末端ヌクレオチド間で二個のホスホジエステルヌクレオチド間結合をホスホロチオエートヌクレオチド間結合と交換することによって修飾され得る。すなわち、式：
５’－Ｎ１－… －Ｎｎ－２Ｎｎ－１ＮｎＬ９６ ３’
のセンス配列の三つの３’末端ヌクレオチド（Ｎ）は、
５’－Ｎ１－… －Ｎｎ－２ｓＮｎ－１ｓＮｎ ３’、で置換され得る。
ＲＮＡ標的は、その領域へのＲＮＡｉ剤の結合によって誘導されるＲＮＡ干渉を介してＲＮＡ標的の切断を媒介するのに、ＲＮＡ標的の他の領域よりも比較的影響を受けやすくまたは受容性が高い、標的ＲＮＡのヌクレオチド配列の領域またはスパンを有し得る。こうした「ホットスポット領域」（または単に「ホットスポット」）内のＲＮＡ干渉に対する受容性の増加は、その領域を標的とするｉＲＮＡ剤が、標的ＲＮＡの他の領域を標的とするｉＲＮＡ剤よりも、ｉＲＮＡ干渉の誘導において高い有効性を有する可能性が高いことを意味する。例えば、理論に束縛されるものではないが、標的ＲＮＡの標的領域へのアクセス可能性は、その領域を標的とするｉＲＮＡ剤の有効性に影響を与え得、一部のホットスポット領域は、アクセス可能性が増加している。例えば、ＲＮＡ標的（例えば、ホットスポット領域内またはその近傍）内に形成される二次構造は、ｉＲＮＡ剤が標的領域に結合し、ＲＮＡ干渉を誘導する能力に影響を与え得る。
本発明の特定の態様によれば、ｉＲＮＡ剤は、標的ＲＮＡの任意の特定された部分（例えば、特定のエクソン）を含む、本明細書に記載の標的ＲＮＡのいずれかのホットスポット領域を標的とするように設計され得る。本明細書で使用される場合、ホットスポット領域は、ＲＮＡｉ剤を使用した標的化が、同じ標的ＲＮＡの他の領域の標的化と比較して、有効なサイレンシングを明らかにより高い可能性で提供する、標的ＲＮＡ配列の約１９～２００、１９～１５０、１９～１００、１９～７５、１９～５０、２１～２００、２１～１５０、２１～１００、２１～７５、２１～５０、５０～２００、５０～１５０、５０～１００、５０～７５、７５～２００、７５～１５０、７５～１００、１００～２０、または１００～１５０個のヌクレオチド領域を指し得る。本発明の特定の態様によれば、ホットスポット領域は、標的ＲＮＡの限定された領域、場合によっては、例えば、標的ＲＮＡの長さの半分未満、例えば、標的ＲＮＡの長さの約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、または３０％などを含む、標的の実質的に限定された領域を含み得る。逆に、ホットスポットが比較される他の領域は、標的ＲＮＡの長さの少なくとも過半を累積的に含み得る。例えば、他の領域は、標的ＲＮＡの長さの少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％を累積的に含み得る。
標的ＲＮＡの比較領域は、インビトロまたはインビボスクリーニングアッセイから得られた有効性データを使用してホットスポットの特定について経験的に評価され得る。例えば、標的ＲＮＡに及ぶ様々な領域を標的とするＲＮＡｉ剤は、各領域に結合する有効なｉＲＮＡ剤の頻度（例えば、ｍＲＮＡ発現またはタンパク質発現によって測定される、標的遺伝子発現が阻害される量）について比較され得る。一般に、ホットスポットは、ＲＮＡ標的の限定された領域に結合する複数の有効なＲＮＡｉ剤のクラスタリングを観察することによって認識され得る。ホットスポットは、ホットスポットとして特定される標的領域の少なくとも約６０％、例えば、領域の両端を含む領域の長さの約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％以上（すなわち、領域の各末端のヌクレオチドを含む領域内のヌクレオチドの少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％以上がｉＲＮＡ剤によって標的化された）に累積的に及ぶｉＲＮＡ剤の有効性を観察することによって、十分に特徴付けられ得る。本発明のいくつかの態様によれば、領域にわたる少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％の阻害（例えば、約５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％以下のｍＲＮＡの残存）を示すｉＲＮＡ剤は、有効であると特定され得る。
ＲＮＡ領域の標的化に対する適合性はまた、定義されたサイズ（例えば、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、または２００ｎｔｓ）の異なる領域にわたる阻害測定値の定量的比較を使用して評価され得る。例えば、阻害の平均レベルは、各領域について決定されてもよく、各領域の平均を比較してもよい。ホットスポット領域内の阻害の平均レベルは、評価されたすべての領域の平均よりも実質的に高くてもよい。いくつかの態様によれば、ホットスポット領域における阻害の平均レベルは、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％高くてもよい。いくつかの態様によれば、ホットスポット領域における阻害の平均レベルは、平均の平均よりも、少なくとも約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２．０標準偏差が高くてもよい。阻害の平均レベルは、統計的に有意な（例えば、ｐ＜０．０５）量だけ高くてもよい。いくつかの態様によれば、ホットスポット領域内の各阻害測定値は、閾値量（例えば、残留するｍＲＮＡの閾値量以下）を超えてもよい。いくつかの態様によれば、領域内の各阻害測定値は、すべての測定された領域にわたるすべての阻害測定値の平均よりも実質的に高くてもよい。例えば、ホットスポット領域における各阻害測定値は、すべての阻害測定値の平均よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％高くてもよい。いくつかの態様によれば、各阻害測定値は、全ての阻害測定値の平均よりも、少なくとも約１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、または２．０標準偏差が高くてもよい。各阻害測定値は、すべての阻害測定値の平均よりも統計的に有意（例えば、ｐ＜０．０５）な量だけ高くてもよい。ホットスポットを評価するための基準は、適合する上記の標準（例えば、少なくとも約第一の量の阻害の平均レベルであり、第一の量よりも小さい第二の量の閾値レベルを下回る阻害測定値を有しない）の様々な組み合わせを含み得る。
したがって、標的ＲＮＡのホットスポット領域を標的とする、本明細書に記載の特定の例示的なｉＲＮＡ剤を含む任意のｉＲＮＡ剤は、好ましくは、そのようなホットスポット領域を標的とすることが、ホットスポット領域ではない領域を標的とすることと比較して、堅牢な阻害応答を示す可能性が高いため、標的ｍＲＮＡのＲＮＡ干渉を誘発するために選択され得ることが明示的に企図される。実質的に重複する（例えば、標的配列長さの少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％）、または好ましくは完全にホットスポット領域内に存在する標的配列を標的とするＲＮＡｉ剤は、ホットスポット領域を標的とするとみなされ得る。本発明のＲＮＡ標的のホットスポット領域は、本明細書に開示されるデータは、そのようなホットスポット領域の範囲が明示的に指定されているか否かにかかわらず、本明細書の他の箇所に記載される基準のいずれかを含む、有効なＲＮＡｉ剤による標的化のより高い頻度を示す任意の領域を含み得る。
様々な実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡ剤は、ＭＹＯＣをコードするｍＲＮＡのホットスポット領域を標的とする。
ＩＩＩ．ｉＲＮＡモチーフ
本開示の特定の態様においては、本開示の二本鎖ＲＮＡｉ剤は、例えばその内容が本明細書で提供される方法のために参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１３／０７５０３５号において開示されるような化学修飾を有する薬剤を含む。本明細書および国際公開第２０１３／０７５０３５号において示されるように、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一修飾のうちの一つ以上のモチーフを、特に切断部位においてまたはその近傍において、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖またはアンチセンス鎖に導入することによって、優れた結果が得られ得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、そうでなければ完全に修飾され得る。これらモチーフの導入は、存在する場合には、センス鎖またはアンチセンス鎖の修飾パターンを中断する。ＲＮＡｉ剤は、随意に、例えばセンス鎖上の、親油性部分またはリガンドと、例えば、Ｃ１６部分またはリガンドとコンジュゲートし得る。ＲＮＡｉ剤は、随意に、例えばアンチセンス鎖の一つ以上の残基において、（Ｓ）－グリコール核酸（ＧＮＡ）修飾で修飾され得る。得られたＲＮＡｉ剤は、優れた遺伝子サイレンシング活性を示す。
いくつかの実施形態では、センス鎖配列は、式（Ｉ）：
５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉ）
で表され得、
式中、
ｉおよびｊは各々独立に、０または１であり、
ｐおよびｑは各々独立に、０～６であり、
各Ｎａは独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表すものであって、各配列は少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各Ｎｂは独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐおよびｎｑは独立に、オーバーハングヌクレオチドを表すものであり、
式中、ＮｂおよびＹは、同一の修飾を有さず、ならびに
ＸＸＸ、ＹＹＹおよびＺＺＺは各々独立に、三つの連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表す。いくつかの実施形態では、ＹＹＹは、すべて２’－Ｆ修飾ヌクレオチドである。
いくつかの実施形態では、Ｎａおよび／またはＮｂは、交互パターンの修飾を含む。
いくつかの実施形態では、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位またはその近傍において生じる。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチドの長さの二本鎖領域を有する場合、ＹＹＹモチーフは、センス鎖の切断部位においてまたはその近傍において生じ得（例えば、６、７、８位、７、８、９位、８、９、１０位、９、１０、１１位、１０、１１、１２位、または１１、１２、１３位において生じ得る）、この数字は、５’末端から、第１のヌクレオチドから開始し、または随意に、この数字は、５’末端から、二本鎖領域内の第１の対合ヌクレオチドにおいて開始する。
いくつかの実施形態では、ｉは１であり、かつｊは０であり、またはｉは０であり、かつｊは１であり、またはｉおよびｊは両方１である。したがって、センス鎖は、以下の式、
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｂ）、
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｃ）、または
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉｄ）、
で表され得る。
センス鎖が式（Ｉｂ）で表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が式（Ｉｃ）として表される場合、Ｎｂは、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
センス鎖が式（Ｉｄ）で表される場合、各Ｎｂは独立に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。いくつかの実施形態では、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
Ｘ、ＹおよびＺの各々は、互いに同一であっても、異なっていてもよい。
他の実施形態では、ｉは０であり、かつｊは０であり、またセンス鎖は、式
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’（Ｉａ）、
で表され得る。
センス鎖が、式（Ｉａ）で表される場合、各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉのアンチセンス鎖配列は、式（Ｉｅ）、
５’ｎｑ’－Ｎａ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｌ－Ｎ’ａ－ｎｐ’３’（Ｉｅ）、
で表され得、
式中、
ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
ｐ’およびｑ’は各々独立に、０～６であり、
各Ｎｂ’は独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各Ｎｂ’は独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
各ｎｐ’およびｎｑ’は独立に、オーバーハングヌクレオチドを表し、
Ｎｂ’およびＹ’は、同一の修飾を有さず、
および
Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立して、三個の連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾のうちの一つを表す。
いくつかの実施形態では、Ｎａ’および／またはＮｂ’は、交互パターンの修飾を含む。
Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の切断部位においてまたはその近傍において生じる。例えば、ＲＮＡｉ剤が、１７～２３ヌクレオチドの長さの二本鎖領域を有する場合、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、アンチセンス鎖の９、１０、１１位、１０、１１、１２位、１１、１２、１３位、１２、１３、１４位、または１３、１４、１５位において生じ得、この数字は、５’末端から、第１のヌクレオチドから開始し、または随意に、この数字は、５’末端から、二本鎖領域内の第１の対合ヌクレオチドにおいて開始する。いくつかの実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、１１、１２、１３位において生じる。
いくつかの実施形態では、Ｙ’Ｙ’Ｙ’モチーフは、全て２’－Ｏｍｅ修飾ヌクレオチドである。
一実施形態では、ｋは１であり、ｌは０であるか、またはｋは０であり、ｌは１であるか、または５ｋおよびｌは両方とも１である。
したがって、アンチセンス鎖は、以下の式、
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’ｎｐ’３’（Ｉｇ）、
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－ｎｐ’３’（Ｉｈ）、または
５’ｎｑ’－Ｎａ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎａ’－ｎｐ’３’（Ｉｉ）、
で表され得る。
アンチセンス鎖が、式（Ｉｇ）で表される場合、Ｎｂ’は、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
アンチセンス鎖が式（Ｉｉ）で表される場合、各Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。いくつかの実施形態では、Ｎｂは、０、１、２、３、４、５、または６である。
他の実施形態では、ｋは０であり、かつｌは０であり、またアンチセンス鎖は、式：
５’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’３’（Ｉｆ）、で表され得る。
アンチセンス鎖が式（Ｉｆ）として表される場合、各Ｎａ’は独立して、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
Ｘ’、Ｙ’およびＺ’の各々は、互いに同一であっても、異なっていてもよい。
センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、ＧＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－ヒドロキシルまたは２’－フルオロで独立に修飾され得る。例えば、センス鎖およびアンチセンス鎖の各ヌクレオチドは、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立に修飾される。各Ｘ、Ｙ、Ｚ、Ｘ’、Ｙ’およびＺ’は、特に２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾を表し得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤のセンス鎖は、二本鎖領域が２１ｎｔである場合に、鎖の９、１０および１１位で生じるＹＹＹモチーフを含有し得、この数字は５’末端から第１のヌクレオチドから開始するか、または随意に、この数字は５’末端から二本鎖領域内の第１の対合ヌクレオチドで開始し、またＹは、２’－Ｆ修飾を表す。センス鎖は、二本鎖領域の対向する側の末端においてウイング修飾としてＸＸＸモチーフまたはＺＺＺモチーフをさらに含有し得、またＸＸＸおよびＺＺＺは各々独立に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、鎖の１１、１２、１３位で生じるＹ’Ｙ’Ｙ’モチーフを含有し得、この数字は５’末端から第１のヌクレオチドから開始し、または随意に、この数字は５’末端から二本鎖領域内の第１の対合ヌクレオチドで開始し、またＹ’は、２’－Ｏ－メチル修飾を表す。アンチセンス鎖は、二本鎖領域の対向する側の末端においてウイング修飾としてＸ’Ｘ’Ｘ’モチーフまたはＺ’Ｚ’Ｚ’モチーフをさらに含有し得、またＸ’Ｘ’Ｘ’およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立に、２’－ＯＭｅ修飾または２’－Ｆ修飾を表す。
上記の式（Ｉａ）、（Ｉｂ）、（Ｉｃ）、および（Ｉｄ）のいずれか一つで表されるセンス鎖は、それぞれ式（Ｉｆ）、（Ｉｇ）、（Ｉｈ）、および（Ｉｉ）のいずれか一つで表されるアンチセンス鎖を伴う二本鎖を形成する。
したがって、本開示の方法において使用する特定のＲＮＡｉ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得、その各鎖は、１４～３０ヌクレオチドを有し、ＲＮＡｉ二本鎖は、式（Ｉｊ）：
センス：５’ｎｐ－Ｎａ－（ＸＸＸ）ｉ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－（ＺＺＺ）ｊ－Ｎａ－ｎｑ３’
アンチセンス：３’ｎｐ’－Ｎａ’－（Ｘ’Ｘ’Ｘ’）ｋ－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－（Ｚ’Ｚ’Ｚ’）ｌ－Ｎａ’－ｎｑ’５’、
で表され得、
（Ｉｊ）
式中、
ｉ、ｊ、ｋおよびｌは各々独立に、０または１であり、
ｐ、ｐ’、ｑおよびｑ’は各々独立に、０～６であり、
各ＮａおよびＮａ’は独立に、０～２５の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、各配列は、少なくとも二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含み、
各ＮｂおよびＮｂ’は独立に、０～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表し、
式中、
各ｎｐ’、ｎｐ、ｎｑ’およびｎｑは、それらの各々が、存在していても存在していなくてもよく、独立して、オーバーハングヌクレオチドを表し、および
ＸＸＸ、ＹＹＹ、ＺＺＺ、Ｘ’Ｘ’Ｘ’、Ｙ’Ｙ’Ｙ’、およびＺ’Ｚ’Ｚ’は各々独立して、三個の連続するヌクレオチド上の三つの同一の修飾の一つのモチーフを表す。
いくつかの実施形態では、ｉは０であり、かつｊは０であり、またはｉは１であり、かつｊは０であり、またはｉは０であり、かつｊは１であり、またはｉおよびｊは両方とも０であり、またはｉおよびｊは両方とも１である。いくつかの実施形態では、ｋは０であり、かつｌは０であり、またはｋは１であり、かつｌは０であり、ｋは０であり、かつｌは１であり、またはｋおよびｌは両方とも０であり、またはｋおよびｌは両方とも１である。
ＲＮＡｉ二本鎖を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖の例示的な組合せは、以下の式：
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ’－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’ｎｑ’５’
（Ｉｋ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ－Ｎａ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（Ｉｌ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（Ｉｍ）
５’ｎｐ－Ｎａ－ＸＸＸ－Ｎｂ－ＹＹＹ－Ｎｂ－ＺＺＺ－Ｎａ－ｎｑ３’
３’ｎｐ－Ｎａ’－Ｘ’Ｘ’Ｘ’－Ｎｂ’－Ｙ’Ｙ’Ｙ’－Ｎｂ’－Ｚ’Ｚ’Ｚ’－Ｎａ’－ｎｑ’５’
（Ｉｎ）、
を含む。
ＲＮＡｉ剤が式（Ｉｋ）で表される場合、各Ｎａは独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩ）で表される場合、各Ｎｂは独立に、１～１０、１～７、１～５、または１～４の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（Ｉｍ）で表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。
ＲＮＡｉ剤が式（Ｉｎ）で表される場合、各Ｎｂ、Ｎｂ’は独立に、０～１０、０～７、０～５、０～４、０～２、または０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。各Ｎａ、Ｎａ’は独立に、２～２０、２～１５、または２～１０の修飾ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド配列を表す。Ｎａ、Ｎａ’、Ｎｂ、およびＮｂ’の各々は独立に、交互パターンの修飾を含む。
式（Ｉｊ）、（Ｉｋ）、（Ｉｌ）、（Ｉｍ）、および（Ｉｎ）の中のＸ、Ｙ、およびＺの各々は、互いに同一であっても異なっていてもよい。
ＲＮＡｉ剤が式（Ｉｊ）、（Ｉｋ）、（Ｉｌ）、（Ｉｍ）、および（Ｉｍ）で表される場合、Ｙヌクレオチドの少なくとも一つが、Ｙ’ヌクレオチドの一つと塩基対を形成し得る。あるいは、少なくとも二つのＹヌクレオチドが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、またはすべての三つのＹヌクレオチドすべてが、対応するＹ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩ）または（Ｉｎ）で表される場合、Ｚヌクレオチドの少なくとも一つが、Ｚ’ヌクレオチドの一つと塩基対を形成し得る。あるいは、少なくとも二つのＺヌクレオチドが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、またはすべての三つのＺヌクレオチドすべてが、対応するＺ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
ＲＮＡｉ剤が式（Ｉｍ）または（Ｉｎ）として表される場合、Ｘヌクレオチドの少なくとも一つが、Ｘ’ヌクレオチドの一つと塩基対を形成し得る。あるいは、Ｘヌクレオチドの少なくとも二つが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成し、またはすべての三つのＸヌクレオチドのすべてが、対応するＸ’ヌクレオチドと塩基対を形成する。
いくつかの実施形態では、Ｙヌクレオチド上の修飾は、Ｙ’ヌクレオチド上の修飾とは異なるか、Ｚヌクレオチド上の修飾は、Ｚ’ヌクレオチド上の修飾とは異なるか、および／またはＸヌクレオチド上の修飾は、Ｘ’ヌクレオチド上の修飾とは異なる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩｄ）で表される場合には、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチル修飾または２’－フルオロ修飾である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（Ｉｎ）で表される場合、Ｎａ修飾は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、またｎｐ’＞０および少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（Ｉｎ）で表される場合、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０およびまた少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結され、またセンス鎖は、二価または三価の分枝リンカーを介して結合した一つ以上の部分またはリガンド（例えば、一つ以上の親油性部分、随意に一つ以上のＣ１６部分、または一つ以上のＧａｌＮＡｃ部分）にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（Ｉｎ）で表される場合、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０およびまた少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結され、またセンス鎖は、二価または三価の分枝リンカーを介して結合した一つ以上の部分またはリガンド（例えば、一つ以上の親油性部分、随意に一つ以上のＣ１６部分、または一つ以上のＧａｌＮＡｃ部分）にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤が式（ＩＩＩａ）で表される場合、Ｎａ修飾は２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾であり、ｎｐ’＞０およびまた少なくとも一つのｎｐ’は、ホスホロチオエート連結を介して隣接するヌクレオチドに連結され、またセンス鎖は、二価または三価の分枝リンカーを介して結合した一つ以上の部分またはリガンド（例えば、一つ以上の親油性部分、随意に一つ以上のＣ１６部分、または一つ以上のＧａｌＮＡｃ部分）にコンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（Ｉｊ）、（Ｉｋ）、（ＩＩ）、（Ｉｍ）、および（Ｉｍ）で表される少なくとも二つの二本鎖を含有する多量体であり、該二本鎖は、リンカーで接続される。該リンカーは、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある。随意に、多量体は、リガンドをさらに含む。二本鎖の各々は、同一の遺伝子または二つの異なる遺伝子を標的にし得、または二本鎖の各々は、二つの異なる標的部位における同一の遺伝子を標的とし得る。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、式（Ｉｊ）、（Ｉｋ）、（Ｉｌ）、（Ｉｍ）および（Ｉｎ）で表される三、四、五、六、またはそれ以上の二本鎖を含有する多量体であり、該二本鎖は、リンカーで接続される。該リンカーは、切断可能である場合も、切断可能でない場合もある。随意に、多量体は、リガンドをさらに含む。二本鎖の各々は、同一の遺伝子または二つの異なる遺伝子を標的にし得、または二本鎖の各々は、二つの異なる標的部位における同一の遺伝子を標的とし得る。
いくつかの実施形態では、式（Ｉｊ）、（Ｉｋ）、（Ｉｌ）、（Ｉｍ）および（Ｉｎ）で表される二つのＲＮＡｉ剤は、５’末端で互いに連結され、また３’末端の一方または両方が、随意にリガンドにコンジュゲートされる。当該剤は各々、同一の遺伝子または二つの異なる遺伝子を標的とし得、または当該剤の各々は、二つの異なる標的部位において同一の遺伝子を標的にし得る。
種々の公開公報には、本開示の方法において使用され得る多量体ＲＮＡｉ剤が記載されている。当該公開公報としては、国際公開第２００７／０９１２６９号、国際公開第２０１０／１４１５１１号、国際公開第２００７／１１７６８６号、国際公開第２００９／０１４８８７号、および国際公開第２０１１／０３１５２０号、および米国特許第７８５８７６９号が挙げられ、それらの各々の内容は参照により本明細書に提供される方法のために本明細書に組み込まれる。特定の実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤は、ＧａｌＮＡｃリガンドを含み得る。
以下により詳細に記載するように、ＲＮＡｉ剤への一つ以上の炭水化物部分のコンジュゲーションを含有するＲＮＡｉ剤は、ＲＮＡｉ剤の一つ以上の特性を最適化できる。多くの場合、炭水化物部分は、ＲＮＡｉ剤の修飾サブユニットに結合させることとなる。例えば、ｄｓＲＮＡ剤の一つ以上のリボヌクレオチドサブユニットのリボース糖を、別の部分で、例えば、炭水化物リガンドが結合する非炭水化物（好ましくは、環式の）の担体で置換することができる。リボヌクレオチドのサブユニットであって、該サブユニットリボース糖がそのように置換されているリボヌクレオチドサブユニットを、本明細書においては、リボース置換修飾サブユニット（ＰＲＭＳ）と称する。環式担体は、環状炭素系であり得、すなわち、すべての環原子が炭素原子であるか、または複素環系であり得、すなわち、一つ以上の環原子が例えば、窒素、酸素、硫黄であるヘテロ原子であり得る。環式担体は、単環式環系であり得、または二つ以上の環、例えば、縮合環、を含有し得る。環式担体は、完全に飽和の環系であり得、または一つ以上の二重結合を含有し得る。
リガンドは、担体を介してポリヌクレオチドに結合し得る。担体は、（ｉ）少なくとも一つの「骨格結合点」、好ましくは二つの「骨格結合点」と、（ｉｉ）少なくとも一つの「係留結合点」を含む。「骨格結合点」とは、本明細書で使用する場合、例えば、ヒドロキシル基である官能基を指し、または概して、リボ核酸の骨格、例えば、ホスフェート、もしくは例えば、硫黄含有である修飾ホスフェートの骨格である骨格内に担体を組み込むために利用可能であり好適である結合を指す。いくつかの実施形態における「係留結合点」（ＴＡＰ）は、選択された部分を接続する環式担体の構成環原子、例えば、炭素原子またはヘテロ原子（骨格結合点を提供する原子とは別の）を指す。この部分は、例えば、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、および多糖であり得る。随意に、選択部分は、介在する係留によって環式担体に接続される。したがって環式担体は、しばしば、例えば、アミノ基である官能基を含む、または概して結合であって、構成する環への、例えば、リガンドである別の化学的実体の組み込みもしくは係留に適している結合を提供することとなる。
ＲＮＡｉ剤は、担体を介してリガンドにコンジュゲートされ得るものであり、担体は、環式基または非環式基であり得、好ましくは、環式基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラン、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリルおよびデカリン、好ましくは非環式の基は、セリノール骨格またはジエタノールアミン骨格から選択される。
特定の実施形態では、本開示の方法で使用するＲＮＡｉ剤は、表２Ａおよび２Ｂのいずれか一つに列記された剤の群から選択される剤である。これら剤は、リガンドをさらに含み得る。リガンドは、３’末端、５’末端、または両方の末端で、センス鎖、アンチセンス鎖、または両方の鎖に結合できる。例えば、リガンドは、センス鎖、特に、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされ得る。
ＩＶ．ｉＲＮＡコンジュゲート
本明細書に開示されるｉＲＮＡ剤は、コンジュゲートの形態であり得る。コンジュゲートは、ｉＲＮＡ分子の任意の好適な位置に、例えば、センス鎖またはアンチセンス鎖の３’末端または５’末端に結合し得る。コンジュゲートは、随意にリンカーを介して結合される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のｉＲＮＡ剤は、例えば、ｉＲＮＡの活性、細胞分布、または細胞取り込みに影響を与える（例えば、強化する）ことによって機能性を付与し得る、一つ以上のリガンド、部分、またはコンジュゲートに化学的に連結される。こうした部分としては、これに限定されるものではないが、例えばコレステロール部分などである脂質部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｉｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３－６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４：１０５３－１０６０）、チオエーテル、例えば、ベリル－Ｓ－トリチルチオール（ｂｅｒｙｌ－Ｓ－ｔｒｉｔｙｌｔｈｉｏｌ）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６－３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５－２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３－５３８）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ，１９９１，１０：１１１１－１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７－３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９－５４）、リン脂質、例えば、ジヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７－３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９－９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１－３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９－２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニルオキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３－９３７）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、リガンドは、それが組み込まれるｉＲＮＡ剤の分布、ターゲティング、または寿命を変化させる。いくつかの実施形態では、リガンドは、例えば、このようなリガンドが存在しない種と比較した場合に、選択された標的に対する、例えば、分子、細胞または細胞型、例えば、細胞または臓器のコンパートメントなどのコンパートメント、組織、身体の器官または領域に対する、親和性の増強をもたらす。通常のリガンドは、二本鎖核酸において二本鎖対合に関与しない。
リガンドとしては、天然に存在する物質、例えばタンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）またはグロブリン）、炭水化物（例えば、デキストラン、プルラン、キチン、キトサン、イヌリン、シクロデキストリンまたはヒアルロン酸）または脂質を挙げることができる。リガンドはまた、組換えまたは合成分子、例えば合成ポリマー、例えば、合成ポリアミノ酸であり得る。ポリアミノ酸の例としては、ポリリジン（ＰＬＬ）、ポリＬ－アスパラギン酸、ポリＬ－グルタミン酸、スチレン－無水マレイン酸共重合体、ポリ（Ｌ－ラクチド－コ－グリコリド（Ｌ－ｌａｃｔｉｄｅ－ｃｏ－ｇｌｙｃｏｌｉｅｄ））共重合体、ジビニルエーテル－無水マレイン酸共重合体、Ｎ－（２－ヒドロキシプロピル）メタクリルアミド共重合体（ＨＭＰＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリウレタン、ポリ（２－エチルアクリル酸（ｐｏｌｙ（２－ｅｔｈｙｌａｃｒｙｌｌｉｃ ａｃｉｄ））、Ｎ－イソプロピルアクリルアミドポリマーまたはポリホスファジンであるポリアミノ酸が挙げられる。ポリアミンの例としては、ポリエチレンイミン、ポリリジン（ＰＬＬ）、スペルミン、スペルミジン、ポリアミン、シュードペプチド－ポリアミン、ペプチド模倣体ポリアミン、デンドリマーポリアミン、アルギニン、アミジン、プロタミン、カチオン性脂質、カチオン性ポルフィリン、ポリアミンの第四級塩またはαヘリックスペプチドが挙げられる。
リガンドにはまた、ターゲティング基が含まれ得、例えば、細胞または組織ターゲティング剤であり、例えば、レクチンであり、例えば腎細胞など特定の細胞型に結合する糖タンパク質、脂質またはタンパク質、例えば、抗体である。ターゲティング基は、甲状腺刺激ホルモン、メラニン細胞刺激ホルモン、レクチン、糖タンパク質、界面活性剤プロテインＡ、ムチン炭水化物、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノース、多価フコース、グリコシル化ポリアミノ酸、多価ガラクトース、トランスフェリン、ビスホスホネート、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸、脂質、コレステロール、ステロイド、胆汁酸、葉酸、ビタミンＢ１２、ビオチン、またはＲＧＤペプチドもしくはＲＧＤペプチド模倣体であり得る。
リガンドの他の例としては、色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、ソラーレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン（ｔｅｘａｐｈｙｒｉｎ）、サフィリン（Ｓａｐｐｈｙｒｉｎ））、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ（例えば、ＥＤＴＡ）、親油性分子、例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレンブタン酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メントール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチドコンジュゲート（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ－４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射性標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジン－イミダゾールコンジュゲート、テトラアザマクロサイクルのＥｕ３＋錯体）、ジニトロフェニル、ＨＲＰまたはＡＰが挙げられる。
リガンドは、タンパク質、例えば糖タンパク質、またはペプチド、例えば共リガンド（ｃｏ－ｌｉｇａｎｄ）に対して特異的親和性を有する分子、または抗体、例えば眼細胞などの特定の細胞型に結合する抗体、であり得る。リガンドにはまた、ホルモンおよびホルモン受容体が含まれ得る。それらにはまた、非ペプチド種、例えば脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、コファクタ、多価ラクトース、多価ガラクトース、Ｎ－アセチル－ガラクトサミン、Ｎ－アセチル－グルコサミン多価マンノースまたは多価フコース、が含まれ得る。リガンドは、例えば、リポ多糖、ｐ３８ＭＡＰキナーゼのアクチベーター、またはＮＦ－κＢのアクチベーターであり得る。
リガンドは、例えば、細胞の細胞骨格系を破壊することによって、例えば、細胞の微小管、微小線維および／または中間径線維を破壊することによって、細胞内へのｉＲＮＡ剤の取り込みを増大し得る物質、例えば薬物であり得る。該薬物は、例えば、タキソン（ｔａｘｏｎ）、ビンクリスチン、ビンブラスチン、サイトカラシン、ノコダゾール、ジャスプラキノリド、ラトルンクリンＡ、ファロイジン、スウィンホリドＡ（ｓｗｉｎｈｏｌｉｄｅ Ａ）、インダノシン（ｉｎｄａｎｏｃｉｎｅ）またはミオセルビン（ｍｙｏｓｅｒｖｉｎ）であり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書において記載するｉＲＮＡに結合するリガンドは、薬物動態モジュレーター（ＰＫモジュレーター）として作用する。ＰＫモジュレーターとしては、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合剤、ＰＥＧ、ビタミンなどが挙げられる。例示的なＰＫモジュレーターとしては、これに限定されないが、コレステロール、脂肪酸、コール酸、リトコール酸、ジアルキルグリセリド、ジアシルグリセリド、リン脂質、スフィンゴ脂質、ナプロキセン、イブプロフェン、ビタミンＥ、ビオチンなどが挙げられる。いくつかのホスホロチオエート連結を含むオリゴヌクレオチドはまた、血清タンパク質に結合することがわかっており、したがって骨格中に複数のホスホロチオエート連結を含む短いオリゴヌクレオチド、例えば、約５塩基、１０塩基、１５塩基または２０塩基のオリゴヌクレオチドもまた、リガンドとして（例えば、ＰＫ調節リガンドとして）本開示に適している。さらに、血清成分（例えば、血清タンパク質）を結合するアプタマーもまた、本明細書において記載する実施形態においてＰＫ調節リガンドとして使用するのに適している。
本開示のリガンドがコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドは、反応性官能性ペンダント側鎖を有するオリゴヌクレオチドの使用によって合成でき、例えば該ペンダント側鎖は該オリゴヌクレオチド（以下に記載される）上への連結分子の結合に由来するものなどである。この反応性オリゴヌクレオチドを、市販のリガンド、種々の保護基のいずれかを有する合成されたリガンド、またはそれに結合する連結部分を有するリガンドと、直接反応させてもよい。
本開示のコンジュゲートにおいて使用するオリゴヌクレオチドは、固相合成の周知の技術によって好都合に、ごく普通に作製できる。こうした合成のための機器は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．）をはじめとするいくつかのベンダーによって販売されている。当技術分野で公知の当該合成のための任意の他の手段を、追加的にまたは代替的に採用してもよい。例えばホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体などである、他のオリゴヌクレオチドを調製する同様の技術を使用することも知られている。
本開示のリガンドがコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドおよびリガンド分子を保有する配列特異的な連結ヌクレオシドにおいて、オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシドは、標準ヌクレオチドまたはヌクレオシドの前駆体を利用する好適なＤＮＡシンセサイザー、または連結部分を既に保有するヌクレオチドもしくはヌクレオシドのコンジュゲート前駆体、リガンド分子を既に保有するリガンドヌクレオチドもしくはリガンドヌクレオシドのコンジュゲート前駆体、または非ヌクレオシドリガンド保有構成単位上において組み立てられ得る。
連結部分を既に保有するヌクレオチド－コンジュゲート前駆体を使用する場合には、典型的に、配列特異的に連結されるヌクレオシドの合成が完了してから、次いで、リガンド分子が連結部分と反応して、リガンドがコンジュゲートしたオリゴヌクレオチドを形成する。いくつかの実施形態では、本開示のオリゴヌクレオチドまたは連結ヌクレオシドは、市販の、オリゴヌクレオチド合成でごく普通に使用する標準ホスホラミダイトおよび非標準ホスホラミダイトに加えて、リガンド－ヌクレオシドコンジュゲートから誘導したホスホラミダイトを使用して、自動化シンセサイザーによって合成される。
Ａ．親油性部分
特定の実施形態では、親油性部分は、脂肪族、環式、例えば脂環式、または多環式、例えば、多脂環式化合物、例えばステロイド（例えば、ステロール）または直鎖状もしくは分枝状の脂肪族炭化水素である。親油性部分は一般に、環式または非環式であり得る炭化水素鎖を含み得る。炭化水素鎖は、様々な置換基、または酸素もしくは窒素原子などの一つ以上のヘテロ原子を含んでもよい。こうした親油性脂肪族部分には、飽和または不飽和Ｃ４－Ｃ３０炭化水素（例えば、Ｃ６－Ｃ１８炭化水素）、飽和または不飽和脂肪酸、ワックス（例えば、脂肪酸の一価アルコールエステルおよび脂肪酸ジアミド）、テルペン（例えば、Ｃ１０テルペン、Ｃ１５セスキテルペン、Ｃ２０ジテルペン、Ｃ３０トリテルペン、およびＣ４０テトラテルペン）、ならびに他の多脂環式炭化水素が含まれるが、これらに限定されない。例えば、親油性部分は、Ｃ４－Ｃ３０炭化水素鎖（例えば、Ｃ４－Ｃ３０アルキルまたはアルケニル）を含有してもよい。いくつかの実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ６－Ｃ１８炭化水素鎖（例えば、直鎖Ｃ６－Ｃ１８アルキルまたはアルケニル）を含有する。いくつかの実施形態では、親油性部分は、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖（例えば、直鎖Ｃ１６アルキルまたはアルケニル）を含有する。
親油性部分は、親油性部分に既に存在する官能基を介して、またはヒドロキシ基（例えば、－ＣＯ－ＣＨ２－ＯＨ）などのＲＮＡｉ剤に導入される官能基を介して、当技術分野で公知の任意の方法によってＲＮＡｉ剤に結合され得る。親油性部分に既に存在するか、またはＲＮＡｉ剤に導入される官能基には、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、およびアルキンが含まれるが、これらに限定されない。
ＲＮＡｉ剤と親油性部分のコンジュゲートは、例えば、ヒドロキシとアルキル基Ｒ－、アルカノイル基ＲＣＯ－、または置換カルバモイル基ＲＮＨＣＯ－との間のエーテルもしくはカルボン酸もしくはカルバモイルエステル結合の形成を介して生じ得る。アルキル基Ｒは、環式（例えば、シクロヘキシル）または非環式（例えば、直鎖または分枝鎖、および飽和または不飽和）であってもよい。アルキル基Ｒは、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、またはオクタデシル基などであってもよい。
いくつかの実施形態では、親油性部分は、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド連結、クリック反応の生成物（例えば、アジド－アルキン環化付加からのトリアゾール）、またはカルバメートを含有するリンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされる。
別の実施形態では、親油性部分はステロイド、例えばステロールである。ステロイドは、ペルヒドロ－１，２－シクロペンタノフェナントレン環系を含有する多環式化合物である。ステロイドには、胆汁酸（例えば、コール酸、デオキシコール酸、およびデヒドロコール酸）、コルチゾン、ジゴキシゲニン、テステステロン、コレステロール、およびコルチゾンなどのカチオン性ステロイドが含まれるが、これらに限定されない。「コレステロール誘導体」は、例えば、置換基の置換、付加、または除去による、コレステロールに由来する化合物を指す。
別の実施形態では、親油性部分は芳香族部分である。この文脈では、「芳香族」という用語は、単芳香族および多芳香族炭化水素を広く指す。芳香族基としては、随意に置換されていてもよい、一から三個の芳香族環を含むＣ６－Ｃ１４アリール部分と、アルキル基に共有結合されたアリール基を含む「アラルキル」または「アリールアルキル」基であって、そのいずれも独立して、任意選択で置換されていてもよく、または非置換でもよい「アラルキル」または「アリールアルキル」基と、および「ヘテロアリール」基と、が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」という用語は、５～１４個の環原子、好ましくは５、６、９、または１０個の環原子を有する基、環状配列で共有される６、１０、または１４πの電子を有する基、および炭素原子に加えて、窒素（Ｎ）、酸素（Ｏ）、および硫黄（Ｓ）からなる群から選択される一から約三個のヘテロ原子を有する基を指す。
本明細書で用いられる場合、「置換」アルキル、シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、または複素環式基は、一から四個、好ましくは一から約三個、より好ましくは一つまたは二つの非水素置換基を有するものである。好適な置換基としては、ハロ、ヒドロキシ、ニトロ、ハロアルキル、アルキル、アルカリル、アリール、アラルキル、アルコキシ、アリールオキシ、アミノ、アシルアミノ、アルキルカルバモイル、アリールカルバモイル、アミノアルキル、アルコキシカルボニル、カルボキシ、ヒドロキシアルキル、アルカンスルホニル、アレーンスルホニル、アルカンスルホンアミド、アレーンスルホンアミド、アラルキルスルホンアミド、アルキルカルボニル、アシルオキシ、シアノ、およびウレイド基が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、親油性部分は、アラルキル基、例えば、２－アリールプロパノイル部分である。アラルキル基の構造的特徴は、親油性部分がインビボで少なくとも一つのタンパク質に結合するように選択される。特定の実施形態では、アラルキル基の構造的特徴は、親油性部分が血清、血管、または細胞タンパク質に結合するように選択される。特定の実施形態では、アラルキル基の構造的特徴は、アルブミン、免疫グロブリン、リポタンパク質、α－２－マクログルブリン、またはα－１－糖タンパク質への結合を促進する。
特定の実施形態では、リガンドは、ナプロキセンまたはナプロキセンの構造誘導体である。ナプロキセンの合成手順は、米国特許第３，９０４，６８２号、および米国特許第４，００９，１９７号に見出され、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。ナプロキセンは、化学名（Ｓ）－６－メトキシ－α－メチル－２－ナフタレン酢酸を有し、構造は、
である。
特定の実施形態では、リガンドは、イブプロフェンまたはイブプロフェンの構造誘導体である。イブプロフェンの合成手順は、米国特許第３，２２８，８３１に見出すことができ、これは、本明細書に提供される方法のために参照により本明細書に組み込まれる。イブプロフェンの構造は、
である。
追加の例示的なアラルキル基は、米国特許第７，６２６，０１４号に示されており、これは、本明細書に提供される方法のために参照により本明細書に組み込まれる。
別の実施形態では、好適な親油性部分は、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール（ｇｅｒａｎｙｌｏｘｙｈｅｘｙａｎｏｌ）、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸（Ｏ３－（ｏｌｅｏｙｌ）ｃｈｏｌｅｎｉｃ ａｃｉｄ）イブプロフェン、ナプロキセン、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンを含む。
特定の実施形態では、特に親油性部分が低親油性または疎水性を有する場合、二つ以上の親油性部分を二本鎖ＲＮＡｉ剤に組み込むことができる。いくつかの実施形態では、二つ以上の親油性部分が、二本鎖ＲＮＡｉ剤の同じ鎖に組み込まれる。いくつかの実施形態では、二本鎖ＲＮＡｉ剤の同じ鎖は、一つ以上の組み込まれた親油性部分を有する。いくつかの実施形態では、二つ以上の親油性部分は、二本鎖ＲＮＡｉ剤の同じ位置（すなわち、同じ核酸塩基、同じ糖部分、または同じヌクレオチド間結合）に組み込まれる。これは、例えば、担体を介して二つ以上の親油性部分をコンジュゲートすること、または分岐リンカーを介して二つ以上の親油性部分をコンジュゲートすること、または一つ以上のリンカーを介して二つ以上の親油性部分を、親油性部分を連続的に連結する一つ以上のリンカーとコンジュゲートすることによって達成することができる。
親油性部分は、ＲＮＡｉ剤のリボ糖への直接結合を介してＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされ得る。あるいは、親油性部分は、リンカーまたは担体を介して二本鎖ＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされてもよい。
特定の実施形態では、親油性部分は、一つ以上のリンカー（係留）を介してＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされ得る。
いくつかの実施形態では、親油性部分は、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド連結、クリック反応の生成物（例えば、アジド－アルキン環化付加からのトリアゾール）、またはカルバメートを含有するリンカーを介して二本鎖ＲＮＡｉ剤にコンジュゲートされる。
Ｂ．脂質コンジュゲート
いくつかの実施形態では、リガンドは、脂質または脂質系分子である。このような脂質または脂質系分子は、通常、血清タンパク質を、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を結合できる。ＨＳＡ結合リガンドは、標的組織へのコンジュゲートの血管分布を可能にする。例えば、標的組織は眼とすることができる。ＨＳＡを結合可能な他の分子もまた、リガンドとして使用できる。例えば、ネプロキシン（ｎｅｐｒｏｘｉｎ）またはアスピリンを使用できる。脂質または脂質系リガンドは、（ａ）コンジュゲートの分解に対する耐性を増大できる、（ｂ）標的細胞もしくは細胞膜内へのターゲティングもしくは輸送を増大できる、および／または（ｃ）血清タンパク質、例えば、ＨＳＡへの結合を調整するために使用できる。
脂質系リガンドを使用して、コンジュゲートの標的組織への結合を調節、例えば、制御（例えば、阻害）することができる。例えば、より強力にＨＳＡに結合する脂質または脂質系リガンドは、腎臓を標的とする可能性が低く、したがって身体から排除される可能性が低くなる。コンジュゲートが腎臓を標的とするように、あまり強力にＨＳＡに結合しない脂質または脂質系リガンドを使用することができる。
いくつかの実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡを結合する。例えば、リガンドは、十分な親和性でＨＳＡに結合でき、その結果、非腎臓組織へのコンジュゲートの分布が増強される。しかしながら、この親和性は、通常、ＨＳＡ－リガンド間結合を元に戻すことができないほど強力ではない。
いくつかの実施形態では、脂質系リガンドは、ＨＳＡに弱く結合するか、または全く結合せず、その結果腎臓へのコンジュゲートの分布が増強される。脂質系リガンドの代わりに、または脂質系リガンドに加えて、腎臓細胞を標的とする他の部分も使用できる。
別の態様では、リガンドは、標的細胞、例えば、増殖性細胞によって取り込まれる、例えば、ビタミンである部分である。これらは、例えば、悪性または非悪性種の、例えば、がん細胞の望まれない細胞増殖を特徴とする障害の治療に特に有用である。例示的なビタミンとしては、ビタミンＡ、ＥおよびＫが挙げられる。他の例示的なビタミンとしては、ビタミンＢ、例えば、葉酸、Ｂ１２、リボフラビン、ビオチン、ピリドキサール、またはがん細胞に取り込まれる他のビタミンもしくは栄養素が挙げられる。ＨＳＡおよび低密度リポタンパク（ＬＤＬ）もまた挙げられる。
Ｃ．細胞透過剤
別の態様では、リガンドは、細胞透過剤、例えばヘリカル（ｈｅｌｉｃａｌ）細胞透過剤などである。いくつかの実施形態では、該薬剤は、両親媒性である。例示的な剤としては、例えばｔａｔまたはアンテノペディア（ａｎｔｅｎｎｏｐｅｄｉａ）などのペプチドがある。該薬剤がペプチドである場合、それは修飾可能であり、これにはぺプチジル模倣体、逆転異性体、非ペプチドまたは疑似ペプチド連結、およびＤ－アミノ酸の使用、が含まれる。ヘリカル（ｈｅｌｉｃａｌ）剤は、通常、α－ヘリカル（ｈｅｌｉｃａｌ）剤であり、親油性相および疎油性相を有し得る。
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であり得る。ペプチド模倣体（本明細書においてオリゴペプチド模倣体とも称する）は、天然ペプチドと類似する規定された三次元構造にフォールディング可能な分子である。ペプチドおよびペプチド模倣体のｉＲＮＡ剤への結合は、細胞認識および吸収を増強することなどによって、ｉＲＮＡの薬物動態分布に影響を及ぼし得る。ペプチドまたはペプチド模倣体部分は、約５～５０アミノ酸長であり得、例えば、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０アミノ酸長である。
ペプチドまたはペプチド模倣体は、例えば、細胞透過ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチドまたは疎水性ペプチド（例えば、主にＴｙｒ、ＴｒｐまたはＰｈｅからなる）であり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、拘束されたペプチドまたは架橋されたペプチドであり得る。別の選択肢としては、ペプチド部分は、疎水性の膜輸送配列（ＭＴＳ）を含み得る。例示的な疎水性ＭＴＳ含有ペプチドは、アミノ酸配列ＡＡＶＡＬＬＰＡＶＬＬＡＬＬＡＰ（配列番号３）を有するＲＦＧＦがある。疎水性ＭＴＳを含有するＲＦＧＦ類似体（例えば、アミノ酸配列ＡＡＬＬＰＶＬＬＡＡＰ（配列番号４））も、標的化部分であり得る。ペプチド部分は、細胞膜を横断してペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質を含む大きな極性分子を運搬することができる、「送達」ペプチドであり得る。例えば、ＨＩＶ Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号５））およびＤｒｏｓｏｐｈｉｌａ Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号６））からの配列は、送達ペプチドとして機能することができることがわかっている。ペプチドまたはペプチド模倣体は、ファージディスプレイライブラリーまたは１ビーズ１化合物（ｏｎｅ－ｂｅａｄ－ｏｎｅ－ｃｏｍｐｏｕｎｄ）（ＯＢＯＣ）コンビナトリアルライブラリー（Ｌａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４：８２－８４，１９９１）から同定されるペプチドなど、ＤＮＡのランダム配列によってコードされ得る。通常、組み込まれたモノマー単位を介してｄｓＲＮＡ剤に係留されるペプチドまたはペプチド模倣体として、細胞ターゲティングペプチド、例えばアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチドまたはＲＧＤ模倣体などがある。ペプチド部分は、長さが、約５アミノ酸～約４０アミノ酸の範囲であり得る。ペプチド部分は、例えば安定性を増大させるまたは立体配座特性を司るなどの構造的な修飾を有し得る。以下に記載する構造的な修飾のいずれもが利用可能である。
本開示の組成物および方法において使用するためのＲＧＤペプチドは、直鎖状であっても環状であってもよく、また特定の組織へのターゲティングを促進するように修飾、例えば、グリコシル化またはメチル化、されてもよい。ＲＧＤ含有ペプチドおよびペプチド模倣体は、Ｄ－アミノ酸ならびに合成ＲＧＤ模倣体を含み得る。ＲＧＤに加えて、インテグリンリガンドを標的とする他の部分が使用可能である。いくつかの実施形態では、このリガンドのコンジュゲートは、ＰＥＣＡＭ－１またはＶＥＧＦを標的とする。
ＲＧＤペプチド部分を、特定の細胞種、例えば腫瘍細胞、例えば、内皮腫瘍細胞または乳がん腫瘍細胞、を標的とするために使用可能である（Ｚｉｔｚｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，６２：５１３９－４３，２００２）。ＲＧＤペプチドは、ｄｓＲＮＡ剤の肺、腎臓、脾臓または肝臓を含むさまざまな他の組織の腫瘍へのターゲティングを促進できる（Ａｏｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ８：７８３－７８７，２００１）。通常、ＲＧＤペプチドは、ｉＲＮＡ剤の腎臓へのターゲティングを促進することとなる。ＲＧＤペプチドは、直鎖状または環状であり得、また特定の組織へのターゲティングを促進するように修飾され得、例えば、グリコシル化またはメチル化され得る。例えばグリコシル化されたＲＧＤペプチドは、αＶβ３を発現する腫瘍細胞にｉＲＮＡ剤を送達可能である（Ｈａｕｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，４２：３２６－３３６，２００１）。
「細胞透過ペプチド」は、細胞、例えば、バクテリアもしくは真菌細胞などである微生物細胞、または例えばヒト細胞などの哺乳動物細胞を、透過可能である。微生物細胞透過性ペプチドは、例えばα－ヘリックス直鎖ペプチド（例えば、ＬＬ－３７またはセロピン（Ｃｅｒｏｐｉｎ）Ｐ１）、ジスルフィド結合含有ペプチド（例えば、α－デフェンシン、β－デフェンシンまたはバクテネシン（ｂａｃｔｅｎｅｃｉｎ））または一つもしくは二つの支配的なアミノ酸のみを含有するペプチド（例えば、ＰＲ－３９またはインドリシジン）であり得る。細胞透過性ペプチドはまた、核移行シグナル（ＮＬＳ）を含み得る。例えば、細胞透過性ペプチドは、ＨＩＶ－１ ｇｐ４１とＳＶ４０ラージＴ抗原のＮＬＳとの融合ペプチドドメインに由来する、例えばＭＰＧなどである二部分の両親媒性ペプチドであり得る（Ｓｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３１：２７１７－２７２４，２００３）。
Ｄ．炭水化物コンジュゲートおよびリガンド
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態では、ｉＲＮＡオリゴヌクレオチドは、炭水化物をさらに含む。炭水化物とコンジュゲートされたｉＲＮＡは、本明細書に記載するように、核酸のインビボでの送達に有利であると同時にインビボでの治療的使用に適した組成物である。本明細書において使用する場合、「炭水化物」とは、各炭素原子に結合した酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに少なくとも６個の炭素原子を有する一つ以上の単糖単位で構成されている炭水化物自体（直鎖状、分枝または環状であり得る）、またはその一部として、各炭素原子に結合した酸素、窒素もしくは硫黄原子とともに各々が少なくとも六個の炭素原子を有する一つ以上の単糖単位で構成されている炭水化物部分（直鎖状、分枝または環状であり得る）を有する化合物、のいずれかである化合物を指す。代表的な炭水化物としては、糖（単糖、二糖、三糖、および約４、５、６、７、８または９の単糖単位を含有するオリゴ糖）ならびに多糖、例えばデンプン、グリコーゲン、セルロースおよび多糖類樹脂、が挙げられる。特定の単糖としては、Ｃ５、および上記の（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）糖が挙げられ、二糖および三糖としては、二または三の単糖単位（例えば、Ｃ５、Ｃ６、Ｃ７またはＣ８）を有する糖が挙げられる。
特定の実施形態では、本開示の組成物および方法は、Ｃ１６リガンドを含む。例示的な実施形態では、本開示のＣ１６リガンドは、以下の構造を有し（ウラシル塩基について本明細書で以下に例示されるが、Ｃ１６リガンドの結合は、任意の塩基（Ｃ、Ｇ、Ａなど）を提示する、または本明細書に提示される任意の他の修飾を有するヌクレオチドについて企図される、ただし、２’リボ結合は保持される）、そのように修飾された残基内のリボの２’位で結合される。
上述のように、Ｃ１６リガンド修飾残基は、そのように修飾された例示的な残基（ここではウラシル）の２’－リボ位に直鎖アルキルを提示する。
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡｉ剤の炭水化物コンジュゲートは、これに限定されないがＰＫモジュレーターまたは細胞透過ペプチドなどである、上記のような一つ以上のさらなるリガンドをさらに含む。
本開示において使用するのに適したさらなる炭水化物コンジュゲート（およびリンカー）としては、国際公開第２０１４／１７９６２０号および国際公開第２０１４／１７９６２７号に記載されるものが挙げられ、各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特定の実施形態では、本開示の組成物および方法は、本明細書において記載するＲＮＡｉ剤のビニルホスホネート（ＶＰ）修飾を含む。例示的実施形態では、本開示のビニルホスホネートは、以下の構造を有する：
本開示のビニルホスホネートは、本開示のｄｓＲＮＡのアンチセンスまたはセンス鎖のいずれかに結合し得る。特定の好ましい実施形態では、本開示のビニルホスホネートを、随意に、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖の５’端で、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖に結合させる。ｄｓＲＮＡｉ剤は、センス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端においてリン含有基を含み得る。５’末端リン含有基は、５’末端ホスフェート（５’－Ｐ）、５’末端ホスホロチオエート（５’－ＰＳ）、５’末端ホスホロジチオエート（５’－ＰＳ２）、５’末端ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）、５’末端メチルホスホネート（ＭＭｅＰｈｏｓ）、または５’－デオキシ－５’－Ｃ－マロニルであり得る。５’末端リン含有基が５’末端ビニルホスホネート（５’－ＶＰ）である場合、５’－ＶＰは、５’－Ｅ－ＶＰ異性体（すなわち、トランス－ビニルホスホネート、
５’－Ｚ－ＶＰ異性体（すなわち、シス－ビニルホスホネート、
またはそれらの混合物のいずれかであり得る。
本開示の組成物および方法のためにビニルリン酸修飾も企図される。例示的ビニルホスフェート構造は以下の通りである。
いくつかの実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、単糖を含む。いくつかの実施形態では、単糖は、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。一つ以上のＮ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）誘導体を含むＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば米国特許第８，１０６，０２２号に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、ｉＲＮＡを特定の細胞に標的化するリガンドとして機能する。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、例えば、肝臓の細胞（例えば、肝細胞）のアシアロ糖タンパク質受容体のリガンドとして機能することによって、ｉＲＮＡが肝臓の細胞を標的にする。
いくつかの実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、一つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体を含む。ＧａｌＮＡｃ誘導体は、リンカーを介して、例えば、二価または三価の分枝リンカーを介して、結合させることができる。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、リンカーを介して、例えば、本明細書において記載するようなリンカーを介して、ｉＲＮＡ剤に（例えば、センス鎖の３’末端に）コンジュゲートされる。
いくつかの実施形態では、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、
式ＩＩである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、以下の概略図で示すようなリンカーを介して炭水化物コンジュゲートに結合し、式中Ｘは、ＯまたはＳである。
いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、表１において規定され、以下に示す通り、Ｌ９６にコンジュゲートする。
いくつかの実施形態では、本開示の組成物および方法において使用するための炭水化物コンジュゲートは、以下からなる群から選択される：
。
本明細書において記載する実施形態において使用するための別の代表的な炭水化物コンジュゲートとしては、これに限定されないが、
（式ＸＸＩＩＩ）が挙げられ、ＸまたはＹのうち一方がオリゴヌクレオチドである場合は、もう一方が水素である。
いくつかの実施形態では、炭水化物コンジュゲートは、これに限定されないがＰＫモジュレーターおよび／または細胞透過ペプチドなどである、上記のような一つ以上のさらなるリガンドをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｉＲＮＡは、リンカーを通じて炭水化物にコンジュゲートされる。本開示の組成物および方法のリンカーを有するｉＲＮＡ炭水化物コンジュゲートの限定されない例としては、これに限定されないが、
および
が挙げられ、ＸまたはＹのうち一方がオリゴヌクレオチドである場合は、もう一方が水素である。
Ｅ．熱的不安定化修飾
特定の実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２～９位において）中に熱的不安定化修飾を組み込んで、オフターゲット遺伝子サイレンシングを低減または阻害することによって、ｄｓＲＮＡ分子をＲＮＡ干渉のために最適化できる。アンチセンス鎖の５’末端から数えて最初の９ヌクレオチドの位置内にある二本鎖の少なくとも一つの熱的不安定化修飾を含むアンチセンス鎖を有するｄｓＲＮＡが、オフターゲット遺伝子サイレンシング活性を低減したことを発見した。したがって、いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、アンチセンス鎖の５’領域の最初の９ヌクレオチドの位置内に、二本鎖の少なくとも一つ（例えば、一、二、三、四、五またはそれより多い）の熱的不安定化修飾を含む。いくつかの実施形態では、一つ以上の二本鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２～９位、または好ましくは４～８位に位置する。いくつかのさらなる実施形態では、二本鎖の熱的不安定化修飾飾は、アンチセンス鎖の５’末端から６、７または８位に位置する。またいくつかのさらなる実施形態では、二本鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から７位に位置する。「熱的不安定化修飾」という用語は、そうした修飾を有していないｄｓＲＮＡのＴｍよりも、より低い全体的な融解温度（Ｔｍ）（好ましくは一、二、三または四度低いＴｍ、を有するｄｓＲＮＡをもたらすこととなる修飾を含む。いくつかの実施形態では、二本鎖の熱的不安定化修飾は、アンチセンス鎖の５’末端から２、３、４、５または９位に位置する。
熱的不安定化修飾としては、これらに限らないが、脱塩基修飾、対向する鎖における対向するヌクレオチドとのミスマッチ、および糖修飾、例えば、２’－デオキシ修飾または非環式ヌクレオチド、例えば、アンロック核酸（ＵＮＡ）またはグリコール核酸（ＧＮＡ）を挙げることができる。
例示的な脱塩基修飾としては、これに限定されないが、以下が挙げられる：
式中、Ｒ＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ、Ｒ’＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ、Ｒ”＝Ｈ、Ｍｅ、ＥｔまたはＯＭｅ
式中、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基である。
例示的な糖修飾としては、これに限定されないが、以下が挙げられる：
式中、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基である。
いくつかの実施形態では、二本鎖の熱的不安定化修飾は、以下からなる群から選択される：
式中、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基であり、また各構造上のアスタリスクは、Ｒ、Ｓまたはラセミのいずれかを表す。
用語「非環式ヌクレオチド」は、非環式のリボース糖を有する任意のヌクレオチドを指し、例えば、リボース炭素間の結合（例えば、Ｃ１’－Ｃ２’、Ｃ２’－Ｃ３’、Ｃ３’－Ｃ４’、Ｃ４’－Ｏ４’、またはＣ１’－Ｏ４’）のいずれかが、存在しないか、またはリボース炭素もしくは酸素のうち少なくとも一つ（例えば、Ｃ１’、Ｃ２’、Ｃ３’、Ｃ４’、またはＯ４’）が独立に、もしくは組み合わせて、ヌクレオチドに存在しないものである。いくつかの実施形態では、非環式ヌクレオチドは、
であり、Ｂは、修飾または未修飾の核酸塩基であり、Ｒ１およびＲ２は、独立して、Ｈ、ハロゲン、ＯＲ３またはアルキルであり、またＲ３は、Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、または糖である）。「ＵＮＡ」という用語は、糖の結合のいずれかが除去されて、アンロック「糖」残基を形成する、非環式のアンロック核酸を指す。一実施例では、ＵＮＡはまた、Ｃ１’－Ｃ４’間の結合が除去されているモノマーを包含する（すなわち、Ｃ１’炭素とＣ４’炭素との間の炭素－酸素－炭素の共有結合）。別の実施例では、糖のＣ２’－Ｃ３’結合（すなわち、Ｃ２’炭素とＣ３’炭素との間の炭素－炭素の共有結合）が除去される（Ｍｉｋｈａｉｌｏｖ ｅｔ．ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２６（１７）：２０５９（１９８５）、およびＦｌｕｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｓｙｓｔ．，１０：１０３９（２００９）を参照されたく、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。非環式誘導体は、ワトソン－クリック対合に影響を及ぼすことなく、より大きな骨格柔軟性を与える。非環式ヌクレオチドは、２’－５’または３’－５’連結を介して連結され得る。
「ＧＮＡ」という用語は、グリコール核酸を指し、これはＤＮＡまたはＲＮＡと類似のポリマーであるが、ホスホジエステル結合によって連結された反復するグリセロール単位から構成される点でその「骨格」の組成が異なる。
二本鎖の熱的不安定化修飾は、熱不安定化ヌクレオチドと、ｄｓＲＮＡ二本鎖内の対向する鎖内の対向するヌクレオチドとの間のミスマッチ（すなわち、非相補的な塩基対）であり得る。例示的なミスマッチ塩基対としては、Ｇ：Ｇ、Ｇ：Ａ、Ｇ：Ｕ、Ｇ：Ｔ、Ａ：Ａ、Ａ：Ｃ、Ｃ：Ｃ、Ｃ：Ｕ、Ｃ：Ｔ、Ｕ：Ｕ、Ｔ：Ｔ、Ｕ：Ｔ、またはそれらの組み合わせが挙げられる。当技術分野で公知の他のミスマッチ塩基対合も本発明に従う。ミスマッチは、天然に存在するヌクレオチドまたは修飾ヌクレオチドのいずれかであるヌクレオチドの間に生じ得、すなわち、ミスマッチ塩基対合は、ヌクレオチドのリボース糖上の修飾とは独立してそれぞれのヌクレオチドに由来する核酸塩基間で生じ得る。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、２’－デオキシ核酸塩基であるミスマッチ対合内の少なくとも一つの核酸塩基を含有し、例えば、２’－デオキシ核酸塩基は、センス鎖内にある。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域内の二本鎖の熱的不安定化修飾は、標的ｍＲＮＡ上の相補的塩基とのＷ－Ｃ Ｈ結合が損なわれたヌクレオチドを含み、例えば以下のものである。
脱塩基ヌクレオチド、非環式ヌクレオチド修飾（ＵＮＡおよびＧＮＡを含む）およびミスマッチ修飾のより多くの例は、国際公開第２０１１／１３３８７６号に詳細に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
熱的不安定化修飾はまた、対向し合う塩基と水素結合を形成する能力が低減または消失したユニバーサル塩基およびリン酸修飾を含み得る。
いくつかの実施形態では、二本鎖の熱的不安定化修飾には、非標準塩基を有するヌクレオチド、例えばこれに限定されないが、対向する鎖内の塩基と水素結合を形成する能力が損なわれた、または完全に消失した核酸塩基修飾が含まれる。これら核酸塩基修飾は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／００１１８９５号に記載されるように、ｄｓＲＮＡ二本鎖の中心領域の不安定化について評価されている。例示的な核酸塩基の修飾としては、以下がある。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖のシード領域内の二本鎖の熱的不安定化修飾としては、標的ｍＲＮＡ上の塩基と相補的である一つ以上のα－ヌクレオチドを含み、例えば以下がある：
式中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、ＯＣＨ３、Ｆ、ＮＨ２、ＮＨＭｅ、ＮＭｅ２またはＯ－アルキルである。
天然のホスホジエステル連結と比較して、ｄｓＲＮＡ二本鎖の熱的安定性を低下させることがわかっている例示的なリン酸修飾としては以下のものがある：
Ｒ基のアルキルは、Ｃ１－Ｃ６アルキルであり得る。Ｒ基の具体的なアルキルとしては、これに限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、ペンチルおよびヘキシルが挙げられる。
当業者が認識することとなるように、核酸塩基の機能的役割が本開示のＲＮＡｉ剤の特異性を規定しているということを考慮して、核酸塩基修飾は本明細書に記載するような種々の手法で、例えば、オフターゲット効果に対してオンターゲット効果を増強する目的のために、例えば、本開示のＲＮＡｉ剤に不安定化修飾を導入することを実施することが可能であるが、利用可能であって、概して本開示のＲＮＡｉ剤上に存在する修飾の範囲は、例えば、ポリリボヌクレオチドの糖基またはホスフェート骨格に対する修飾である非核酸塩基修飾に対してずっと大きい傾向がある。こうした修飾は、本開示の他の項でより詳細に記載するものであり、また本明細書において上記または他の場所で記載されるような天然の核酸塩基または修飾核酸塩基のいずれかを有する本開示のＲＮＡｉ剤のために明確に企図される。
ｄｓＲＮＡはまた、熱的不安定化修飾を含むアンチセンス鎖に加えて、一つ以上の安定化修飾を含み得る。例えばｄｓＲＮＡは、少なくとも二つ（例えば、二、三、四、五、六、七、八、九、十またはそれ以上）の安定化修飾を含み得る。限定するものではないが、安定化修飾は全て、一方の鎖内に存在し得る。いくつかの実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖の両方が、少なくとも二つの安定化修飾を含む。安定化修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのヌクレオチドで生じ得る。例えば、安定化修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチド上でも生じ得、各安定化修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターン内で生じ得、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターン内で両方の安定化修飾を含む。センス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、またセンス鎖上の安定化修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の安定化修飾の交互パターンに対して相対的な移動がある場合がある。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも二つ（例えば、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七、八、九、十またはそれ以上）の安定化修飾を含む。限定されるものではないが、アンチセンス鎖内の安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端から２、６、８、９、１４および１６位に安定化修飾を含む。いくつかの他の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端から２、６、１４、および１６位に安定化修飾を含む。さらにいくつかの他の実施形態では、アンチセンス鎖は、５’末端から２、１４、および１６位に安定化修飾を含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接する少なくとも一つの安定化修飾を含む。例えば、安定化修飾は、不安定化修飾の５’末端または３’末端にある、すなわち、不安定化修飾の位置から－１位または＋１位にある、ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’末端および３’末端の各々にある、すなわち、不安定化修飾の位置から－１位および＋１位にある、安定化修飾を含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’末端にある、すなわち、不安定化修飾の位置から＋１位および＋２位にある、少なくとも二つの安定化修飾を含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、少なくとも二つ（例えば、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、七つ、八つ、九つ、十またはそれ以上）の安定化修飾を含む。限定されるものではないが、センス鎖内の安定化修飾は、任意の位置に存在し得る。いくつかの実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、１０および１１位に安定化修飾を含む。いくつかの他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、９、１０および１１位に安定化修飾を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖の１１、１２および１５位に対して対向する位置または相補的な位置に安定化修飾を含む。いくつかの他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖の１１、１２、１３および１５位に対して対向する位置または相補的な位置に安定化修飾を含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、二、三または四つの安定化修飾のブロックを含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖内の二本鎖の熱的不安定化修飾に対向する位置または相補的な位置に安定化修飾を含まない。
例示的な熱的安定化修飾としては、これに限定されないが、２’－フルオロ修飾が挙げられる。他の熱的安定化修飾としては、これに限定されないが、ＬＮＡが挙げられる。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、少なくとも四つ（例えば、四、五、六、七、八、九、十またはそれ以上）の２’－フルオロヌクレオチドを含む。これに限定されないが、２’－フルオロヌクレオチドはすべて、一方の鎖内に存在し得る。いくつかの実施形態では、センスおよびアンチセンス鎖の両方が、少なくとも二つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。２’－フルオロ修飾は、センス鎖またはアンチセンス鎖のいずれかのヌクレオチド上で生じ得る。例えば、２’－フルオロ修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチド上でも生じる得、各２’－フルオロ修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上の交互パターンにおいて生じ得、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、両方とも交互パターンにおいて２’－フルオロ修飾を含む。センス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一である場合も異なっている場合もあり、またセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上の２’－フルオロ修飾の交互パターンに対して相対的な移動があり得る。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、少なくとも二つ（例えば、二、三、四、五、六、七、八、九、十またはそれ以上）の２’－フルオロヌクレオチドを含む。これに限定されるものではないが、アンチセンス鎖内の２’－フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、８、９、１４、および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、６、１４、および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。さらにいくつかの他の実施形態では、アンチセンスは、５’末端から２、１４および１６位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾に隣接する少なくとも一つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。例えば、２’－フルオロヌクレオチドは、不安定化修飾の５’末端または３’末端にある、すなわち、不安定化修飾の位置から－１位または＋１位の位置にある、ヌクレオチドであり得る。いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の５’末端および３’末端の各々に、すなわち、不安定化修飾の位置から－１および＋１位の位置に、２’－フルオロヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖は、不安定化修飾の３’末端に、すなわち、不安定化修飾の位置から＋１および＋２位に、少なくとも二つの２’－フルオロヌクレオチドを含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、少なくとも二つ（例えば、二つ、三、四、五、六、七、八、九、十またはそれ以上）の２’－フルオロヌクレオチドを含む。これに限定されるものではないが、センス鎖内の２’－フルオロ修飾は、任意の位置に存在し得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスは、５’末端から７、１０および１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの他の実施形態では、センス鎖は、５’末端から７、９、１０および１１位に２’－フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖の１１、１２および１５位に対して対向する位置または相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの他の実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖の５’末端から数えて、アンチセンス鎖の１１、１２、１３および１５位に対して対向する位置または相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、センス鎖は、二、三または四つの２’－フルオロヌクレオチドのブロックを含む。
いくつかの実施形態では、センス鎖は、アンチセンス鎖内の二本鎖の熱的不安定化修飾に対向する位置または相補的な位置に２’－フルオロヌクレオチドを含まない。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、２１ヌクレオチド（ｎｔ）のセンス鎖と２３ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンスとを含み、該アンチセンス鎖は少なくとも一つの熱的不安定化ヌクレオチドを含有し、該少なくとも一つの熱的不安定化ヌクレオチドはアンチセンス鎖のシード領域（すなわち、アンチセンス鎖の５’末端の２～９位にある）内で生じるものであり、ｄｓＲＮＡの一方の末端が平滑である一方で他方の末端は２ｎｔのオーバーハングを含み、またｄｓＲＮＡは随意に、少なくとも一つ（例えば、一つ、二つ、三つ、四つ、五つ、六つ、または七つすべて）の以下の特徴をさらに含むものである：（ｉ）アンチセンスは、２、３、４、５または６つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｉｉ）アンチセンスは、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｉｉｉ）センス鎖は、リガンドとコンジュゲートされる、（ｉｖ）センス鎖は、２、３、４または５つの２’－フルオロ修飾を含む、（ｖ）センス鎖は、１、２、３、４または５つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、（ｖｉ）ｄｓＲＮＡは、少なくとも四つの２’－フルオロ修飾を含む、および（ｖｉｉ）ｄｓＲＮＡは、アンチセンス鎖の５’末端に平滑末端を含む。好ましくは、２ｎｔのオーバーハングは、アンチセンスの３’末端にある。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖およびアンチセンス鎖内のどのヌクレオチドも修飾され得る。各ヌクレオチドは、同一または異なる修飾で修飾され得、当該修飾としては、非連結ホスフェート酸素の一方もしくは両方の、または連結ホスフェート酸素の一つ以上のうちの一つ以上の変更、リボース糖の構成成分の変更、例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルの変更、ホスフェート部分の「脱リン酸化」リンカーでの大規模な置換、天然に存在する塩基の修飾または置換、およびリボースホスフェート骨格の置換または修飾が挙げられ得る。
核酸はサブユニットのポリマーであるので、修飾の多くは、核酸内で反復される位置で生じ、例えば、塩基またはホスフェート部分、またはホスフェート部分の非連結のＯの修飾である。一部の場合においては、修飾は、核酸中の対象位置の全てにおいて生じることとなるが、多くの場合、生じることとならない。例として、修飾は、３’末端または５’末端の位置においてのみ生じ得、末端領域においてのみ生じ得、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置、または鎖の最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチドにおいて生じ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域または両方において生じ得る。修飾は、ＲＮＡの二本鎖領域においてのみ生じ得、またはＲＮＡの一本鎖領域においてのみ生じ得る。例えば、非連結のＯの位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端でのみ生じ得る、末端領域においてのみ、例えば、鎖の末端ヌクレオチド上の位置または最後の２、３、４、５もしくは１０ヌクレオチドにおいて生じ得る、または二本鎖および一本鎖領域において、特に末端において、生じ得る。５’末端をリン酸化することが可能である。
それにより、例えば、安定性を増強すること、オーバーハング内に特定の塩基を含めること、または一本鎖のオーバーハング内、例えば、５’オーバーハングもしくは３’オーバーハング内、または両オーバーハング内に、修飾ヌクレオチドもしくはヌクレオチド代替物を含めることが可能であり得る。例えば、オーバーハング内にプリンヌクレオチドを含めることが望ましいものであり得る。いくつかの実施形態では、３’オーバーハングまたは５’オーバーハング内の塩基の全てまたは一部が、例えば、本明細書において記載する修飾で修飾され得る。修飾は、例えば、当技術分野で公知である修飾でのリボース糖の２’位における修飾の使用、例えば、核酸塩基のリボ糖の代わりに修飾された、デオキシリボヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロ（２’－Ｆ）または２’－Ｏ－メチルの使用、およびホスフェート基における修飾、例えば、ホスホロチオエート修飾、を含み得る。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、ＬＮＡ、ＨＮＡ、ＣｅＮＡ、２’－メトキシエチル、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－アリル、２’－Ｃ－アリル、２’－デオキシまたは２’－フルオロで独立に修飾される。これら鎖は、二つ以上の修飾を含有し得る。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロで独立に修飾される。これら修飾は、アンチセンス鎖内に存在する二本鎖の少なくとも一つの熱的不安定化修飾に付加されるということを理解されたい。
少なくとも二つの異なる修飾が、典型的には、センス鎖およびアンチセンス鎖上に存在する。それらの二つの修飾は、２’－デオキシ、２’－Ｏ－メチルまたは２’－フルオロ修飾、非環式ヌクレオチドなどであり得る。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖は各々、２’－Ｏ－メチルまたは２’－デオキシから選択される、二つの異なるように修飾されたヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、センス鎖およびアンチセンス鎖の各残基は、独立して、２’－Ｏ－メチルヌクレオチド、２’－デオキシヌクレオチド、２’－デオキシ－２’－フルオロヌクレオチド、２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－ジメチルアミノエトキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）ヌクレオチド、または２’－アラ－Ｆヌクレオチド（２’－ａｒａ－Ｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）で修飾される。ここでも、これら修飾は、アンチセンス鎖内に存在する二本鎖の少なくとも一つの熱的不安定化修飾に付加されるということを理解されたい。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、特にＢ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ１’、Ｂ２’、Ｂ３’、Ｂ４’領域における、交互パターンの修飾を含む。「交互モチーフ」または「交互パターン」という用語は、本明細書で使用する場合、一つ以上の修飾を有するモチーフを指し、各修飾は、一本の鎖の交互ヌクレオチド上で生じる。交互ヌクレオチドとは、一つ置きのヌクレオチド毎に一つまたは三つのヌクレオチド毎に一つまたは類似のパターンを指し得る。例えば、Ａ、ＢおよびＣが各々、ヌクレオチドに対する一タイプの修飾を表す場合、当該交互モチーフは、「ＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＡＢＢＡＡＢＢＡＡＢＢ…」、「ＡＡＢＡＡＢＡＡＢＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＡＡＡＢＡＡＡＢ…」、「ＡＡＡＢＢＢＡＡＡＢＢＢ…」または「ＡＢＣＡＢＣＡＢＣＡＢＣ…」などであり得る。
交互モチーフ内に含有されるこのタイプの修飾は、同一である場合も、異なっている場合もある。例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが各々、ヌクレオチド上の一タイプの修飾を表す場合、交互パターンが、すなわち、一つ置きのヌクレオチド上の修飾が、同一であり得るが、センス鎖またはアンチセンス鎖の各々が、例えば「ＡＢＡＢＡＢ…」、「ＡＣＡＣＡＣ…」、「ＢＤＢＤＢＤ…」、または「ＣＤＣＤＣＤ…」などである交互モチーフの範囲内のいくつかの可能性のある修飾から選択され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、アンチセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンに対して相対的に移動されているセンス鎖上の交互モチーフの修飾パターンを含む。当該移動は、センス鎖のヌクレオチドの修飾基が、アンチセンス鎖のヌクレオチドの異なるように修飾された基に対応するようになされたものであり得、逆もまた同様である。例えば、センス鎖は、ｄｓＲＮＡ二本鎖内のアンチセンス鎖と対合される場合には、センス鎖内の交互モチーフは、鎖の５’－３’から「ＡＢＡＢＡＢ」で開始し得、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは、二本鎖領域内の鎖の３’－５’から「ＢＡＢＡＢＡ」で開始し得る。別の例としては、センス鎖内の交互モチーフは、鎖の５’－３’から「ＡＡＢＢＡＡＢＢ」で開始し得、またアンチセンス鎖内の交互モチーフは、二本鎖領域内の鎖の３’－５’から「ＢＢＡＡＢＢＡＡ」で開始し得、その結果、センス鎖およびアンチセンス鎖間の修飾パターンの完全な移動または部分的な移動が存在する。
本開示のｄｓＲＮＡ分子は、少なくとも一つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結をさらに含み得る。ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾は、鎖の任意の位置にあるセンス鎖またはアンチセンス鎖または両鎖のいずれかのヌクレオチド上で生じ得る。例えば、ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上のどのヌクレオチドでも生じ得る、各ヌクレオチド間連結修飾は、センス鎖もしくはアンチセンス鎖上で交互パターンで生じ得る、またはセンス鎖もしくはアンチセンス鎖は、交互パターンで両方のヌクレオチド間連結修飾を含む。センス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖と同一または異なり得、またセンス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンは、アンチセンス鎖上のヌクレオチド間連結修飾の交互パターンに対して相対的な移動があり得る。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子は、オーバーハング領域内にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾を含む。例えば、オーバーハング領域は、二つのヌクレオチドを含むものであって、該二つのヌクレオチドの間にホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結を有する二つのヌクレオチドを含む。ヌクレオチド間連結修飾はまた、オーバーハングヌクレオチドを二本鎖領域内の末端の対合されるヌクレオチドと連結させるようになされ得る。例えば、少なくとも２、３、４または全てのオーバーハングヌクレオチドは、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結によって連結され得、随意に、オーバーハングヌクレオチドを、オーバーハングヌクレオチドと隣接する対合したヌクレオチドと連結するさらなるホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結が存在し得る。例えば、三つのヌクレオチドのうち二つがオーバーハングヌクレオチドであり、三番目が、オーバーハングヌクレオチドに隣接する対合ヌクレオチドであるような、末端の三つのヌクレオチド間に、少なくとも二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結が存在し得る。好ましくは、これら末端の三つのヌクレオチドは、アンチセンス鎖の３’末端にあり得る。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５または１６のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される二から十のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の１～１０ブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該センス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むアンチセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される二つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される三つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される四つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される五つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される六つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、６、７、または８のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される七つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、４、５、または６のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される八つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖は、１、２、３、または４のホスフェートヌクレオチド間連結によって分離される九つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の二つのブロックを含むものであり、このホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結の一つは、オリゴヌクレオチド配列内の任意の位置に配置され、また当該アンチセンス鎖は、ホスホロチオエート、メチルホスホネートおよびホスフェートのヌクレオチド間連結のいずれかの組み合わせを含むセンス鎖とまたはホスホロチオエートもしくはメチルホスホネートもしくはホスフェート連結のいずれかを含むアンチセンス鎖と対合する。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センスまたはアンチセンス鎖の末端の１～１０位の範囲内に一つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０ヌクレオチドが、センスまたはアンチセンス鎖の一方の末端または両末端においてホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結を介して連結され得る。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センスまたはアンチセンス鎖の各々の二本鎖の内側領域の１～１０位の範囲内に一つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０のヌクレオチドが、センス鎖の５’末端から数えて二本鎖領域の８～１６位にあるホスホロチオエートメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾を介して連結され得、当該ｄｓＲＮＡ分子は、随意に、その末端の１～１０位の範囲内に一つ以上のホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾をさらに含み得る。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に一から五つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一から五つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における一から五つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の一から五つをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の二つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一つ、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１～５位の範囲内に二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内に一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と１８～２３位の範囲内の二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２０および２１位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１位における一つをさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２０および２１位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１および２２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１および２２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２２および２３位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、センス鎖の（５’末端から数えて）１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２１位における一つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾、ならびにアンチセンス鎖の（５’末端から数えて）１および２位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾と２３および２３位における二つのホスホロチオエートヌクレオチド間連結修飾をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本開示の化合物は、骨格キラル中心のパターンを含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも５つのヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも６つのヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも７つのヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも８つのヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも９つのヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１０のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１１のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１２のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１３のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１４のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１５のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１６のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１７のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１８のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１９のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置の８以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置の７以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置の６以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置の５以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置の４以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置の３以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置の２以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｒｐ立体配置の１以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない８以下のヌクレオチド間連結を含む（限定されない例として、ホスホジエステル）。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない７以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない６以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない５以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない４以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない３以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない２以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、キラルでない１以下のヌクレオチド間連結を含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１０のヌクレオチド間連結と、キラルでない８以下のヌクレオチド間連結とを含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１１のヌクレオチド間連結と、キラルでない７以下のヌクレオチド間連結とを含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１２のヌクレオチド間連結と、キラルでない６以下のヌクレオチド間連結とを含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１３のヌクレオチド間連結と、キラルでない６以下のヌクレオチド間連結とを含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１４のヌクレオチド間連結と、キラルでない５以下のヌクレオチド間連結とを含む。いくつかの実施形態では、骨格キラル中心の通常のパターンは、Ｓｐ立体配置の少なくとも１５のヌクレオチド間連結と、キラルでない４以下のヌクレオチド間連結とを含む。いくつかの実施形態では、Ｓｐ立体配置のヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、または連続でなくてもよい。いくつかの実施形態では、Ｒｐ立体配置のヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、または連続でなくてもよい。いくつかの実施形態では、キラルでないヌクレオチド間連結は、連続であってもよく、または連続でなくてもよい。
いくつかの実施形態では、本開示の化合物は、立体化学ブロックであるブロックを含む。いくつかの実施形態では、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間連結がＲｐである点でＲｐブロックである。いくつかの実施形態では、５’－ブロックは、Ｒｐブロックである。いくつかの実施形態では、３’－ブロックは、Ｒｐブロックである。いくつかの実施形態では、ブロックは、ブロックの各ヌクレオチド間連結がＳｐである点でＳｐブロックである。いくつかの実施形態では、５’－ブロックは、Ｓｐブロックである。いくつかの実施形態では、３’－ブロックは、Ｓｐブロックである。いくつかの実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、ＲｐブロックおよびＳｐブロックの両方を含む。いくつかの実施形態では、提供されたオリゴヌクレオチドは、一つ以上のＲｐブロックを含むが、Ｓｐブロックを含まない。いくつかの実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、一つ以上のＳｐブロックを含むが、Ｒｐブロックを含まない。いくつかの実施形態では、提供されるオリゴヌクレオチドは、一つ以上のＰＯブロックであって、各ヌクレオチド間連結が天然のホスフェート連結であるＰＯブロックを含む。
いくつかの実施形態では、本開示の化合物は、各糖部分が２’－Ｆ修飾を含むＳｐブロックである５’－ブロックを含む。いくつかの実施形態では、５’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が修飾ヌクレオチド間連結であり、また各糖部分が２’－Ｆ修飾を含む、Ｓｐブロックである。いくつかの実施形態では、５’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々がホスホロチオエート連結であり、また各糖部分が２’－Ｆ修飾を含む、Ｓｐブロックである。いくつかの実施形態では、５’－ブロックは、４以上のヌクレオシド単位を含む。いくつかの実施形態では、５’－ブロックは、５以上のヌクレオシド単位を含む。いくつかの実施形態では、５’－ブロックは、６以上のヌクレオシド単位を含む。いくつかの実施形態では、５’－ブロックは、７以上のヌクレオシド単位を含む。いくつかの実施形態では、３’－ブロックは、各糖部分が２’－Ｆ修飾を含む、Ｓｐブロックである。いくつかの実施形態では、３’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々が修飾ヌクレオチド間連結であり、また各糖部分が２’－Ｆ修飾を含む、Ｓｐブロックである。いくつかの実施形態では、３’－ブロックは、ヌクレオチド間連結の各々がホスホロチオエート連結であり、また各糖部分が２’－Ｆ修飾を含む、Ｓｐブロックである。いくつかの実施形態では、３’－ブロックは、４以上のヌクレオシド単位を含む。いくつかの実施形態では、３’－ブロックは、５以上のヌクレオシド単位を含む。いくつかの実施形態では、３’－ブロックは、６以上のヌクレオシド単位を含む。いくつかの実施形態では、３’－ブロックは、７以上のヌクレオシド単位を含む。
いくつかの実施形態では、本開示の化合物は、ある領域内にあるタイプのヌクレオシドを含むか、またはオリゴヌクレオチドに、特定のタイプのヌクレオチド間連結が続くものであり、それは例えば、天然のホスフェート連結、修飾ヌクレオチド間連結、Ｒｐキラルヌクレオチド間連結、Ｓｐキラルヌクレオチド間連結などである。いくつかの実施形態では、Ａに、Ｓｐが続く。いくつかの実施形態では、Ａに、Ｒｐが続く。いくつかの実施形態では、Ａに、天然のホスフェート連結（ＰＯ）が続く。いくつかの実施形態では、Ｕに、Ｓｐが続く。いくつかの実施形態では、Ｕに、Ｒｐが続く。いくつかの実施形態では、Ｕに、天然のホスフェート連結（ＰＯ）が続く。いくつかの実施形態では、Ｃに、Ｓｐが続く。いくつかの実施形態では、Ｃに、Ｒｐが続く。いくつかの実施形態では、Ｃに、天然のホスフェート連結（ＰＯ）が続く。いくつかの実施形態では、Ｇに、Ｓｐが続く。いくつかの実施形態では、Ｇに、Ｒｐが続く。いくつかの実施形態では、Ｇに、天然のホスフェート連結（ＰＯ）が続く。いくつかの実施形態では、ＣおよびＵに、Ｓｐが続く。いくつかの実施形態では、ＣおよびＵに、Ｒｐが続く。いくつかの実施形態では、ＣおよびＵに、天然のホスフェート連結（ＰＯ）が続く。いくつかの実施形態では、ＡおよびＧに、Ｓｐが続く。いくつかの実施形態では、ＡおよびＧに、Ｒｐが続く。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、標的との、二本鎖内のミスマッチ、またはそれらの組合せを含む。ミスマッチは、オーバーハング領域または二本鎖領域内に生じ得る。塩基対は、解離または融解を促進するその傾向に基づいて格付けされ得る（例えば、特定の対合の会合または解離の自由エネルギーに基づくものであり、最も単純なアプローチとしては、個々の対ごとに対を調べることであるが、次に、隣接するまたは同様の分析も使用可能である）。解離の促進の点では、Ａ：ＵはＧ：Ｃより好ましく、Ｇ：ＵはＧ：Ｃより好ましく、またＩ：ＣはＧ：Ｃより好ましい（Ｉ＝イノシン）。ミスマッチ、例えば、非標準の対合または標準以外の対合（本明細書において別の箇所に記載される）が、標準（Ａ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｃ）の対合より好ましく、またユニバーサル塩基を含む対合が、標準の対合より好ましい。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、Ａ：Ｕ、Ｇ：Ｕ、Ｉ：Ｃの群から独立に選択され得るアンチセンス鎖の５’末端から二本鎖領域内の最初の１、２、３、４または５塩基対、および例えば、非標準の対合または標準以外の対合またはユニバーサル塩基を含む対合であるミスマッチ対のうちの少なくとも一つを含み、二本鎖の５’末端においてアンチセンス鎖の解離を促進する。
いくつかの実施形態では、アンチセンス鎖内の５’末端から二本鎖領域内の１位におけるヌクレオチドは、Ａ、ｄＡ、ｄＵ、ＵおよびｄＴからなる群から選択される。あるいは、アンチセンス鎖の５’末端から二本鎖領域内の最初の１、２または３の塩基対のうち少なくとも一つは、ＡＵ塩基対である。例えば、アンチセンス鎖の５’末端から二本鎖領域内の最初の塩基対は、ＡＵ塩基対である。
一本鎖または二本鎖のオリゴヌクレオチドの任意の位置において、ジヌクレオチドのホスホジエステル（ＰＯ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）またはホスホロジチオエート（ＰＳ２）連結の３’末端に、４’－修飾または５’－修飾のヌクレオチドを導入することで、ヌクレオチド間連結に対する立体効果を発揮させ得、それによってヌクレアーゼに対してそれを保護または安定化させるということがわかった。
いくつかの実施形態では、５’－修飾ヌクレオシドが、一本鎖または二本鎖のｓｉＲＮＡの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、５’－アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖のｓｉＲＮＡの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入できる。リボース糖の５’位にあるアルキル基は、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体であり得る。例示的な５’－アルキル化ヌクレオシドとしては、５’－メチルヌクレオシドがある。５’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、４’－修飾ヌクレオシドが、一本鎖または二本鎖のｓｉＲＮＡの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入される。例えば、４’－アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖のｓｉＲＮＡの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入できる。リボース糖の４’位にあるアルキル基は、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’－アルキル化ヌクレオシドとしては、４’－メチルヌクレオシドがある。４’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。あるいは、４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドを、一本鎖または二本鎖のｓｉＲＮＡの任意の位置において、ジヌクレオチドの３’末端に導入できる。リボース糖の４’－Ｏ－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体であり得る。例示的な４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドとしては、４’－Ｏ－メチルヌクレオシドが挙げられる。４’－Ｏ－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、５’－アルキル化ヌクレオシドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置において導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または向上させる。５’－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な５’－アルキル化ヌクレオシドとしては、５’－メチルヌクレオシドがある。５’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、４’－アルキル化ヌクレオシドが、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置において導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または向上させる。４’－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’－アルキル化ヌクレオシドとしては、４’－メチルヌクレオシドがある。４’－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドは、ｄｓＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖の任意の位置において導入され、このような修飾は、ｄｓＲＮＡの効力を維持または向上させる。５’－アルキルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。例示的な４’－Ｏ－アルキル化ヌクレオシドとしては、４’－Ｏ－メチルヌクレオシドが挙げられる。４’－Ｏ－メチルは、ラセミ体またはキラル的に純粋なＲ異性体もしくはＳ異性体のいずれかであり得る。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、２’－５’連結（２’－Ｈ、２’－ＯＨおよび２’－ＯＭｅを有し、またＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓを有する）を含み得る。例えば、２’－５’連結修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、もしくはセンスのアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用可能であり、またはＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端において使用可能である。
別の実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、Ｌ糖（例えば、２’－Ｈ、２’－ＯＨおよび２’－ＯＭｅを有するＬリボース、Ｌ－アラビノース）を含み得る。例えば、これらＬ糖修飾は、ヌクレアーゼ耐性を促進するために、もしくはセンス鎖のアンチセンス鎖への結合を阻害するために使用可能であり、またはＲＩＳＣによるセンス鎖の活性化を回避するためにセンス鎖の５’末端において使用可能である。
種々の刊行物に多量体ｓｉＲＮＡが記載されており、これらはすべて、本開示のｄｓＲＮＡとともに使用できる。当該公開公報としては、国際公開第２００７／０９１２６９号、米国特許第７８５８７６９号、国際公開第２０１０／１４１５１１号、国際公開第２００７／１１７６８６号、国際公開第２００９／０１４８８７号、および国際公開第２０１１／０３１５２０号が挙げられ、それら各々の内容全体は参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡ分子は、５’リン酸化されるか、または５’プライム末端にホスホリル類似体を含む。５’－リン酸修飾は、ＲＩＳＣ媒介性遺伝子サイレンシングと適合性がある修飾を含む。適切な修飾には、以下が含まれる。５’－一リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－二リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－三リン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－グアノシンキャップ（７－メチル化または非メチル化）（７ｍ－Ｇ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または未修飾ヌクレオチドキャップ構造（Ｎ－Ｏ－５’－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）－Ｏ－５’）、５’－モノチオホスフェート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－Ｓ－５’）、酸素／硫黄置換一リン酸、二リン酸および三リン酸（例えば、５’－アルファ－チオ三リン酸、５’－ガンマ－チオ三リン酸など）の任意の追加の組み合わせ、５’－ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ－ＮＨ－５’、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ－Ｏ－５’）、５’－アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’－、５’－アルケニルホスホネート（すなわち、ビニル、置換ビニル）、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ－５’－ＣＨ２－）、５’－アルキルエーテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２－）、エトキシメチルなど、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）－Ｏ－５’－）。一例では、修飾は、ｄｓＲＮＡ分子のアンチセンス鎖に配置され得る。
Ｆ．リンカー
いくつかの実施形態では、本明細書において記載するコンジュゲートまたはリガンドを、切断可能である場合も切断可能でない場合もある種々のリンカーを用いてｉＲＮＡオリゴヌクレオチドに結合させることができる。
典型的には、リンカーは、直接結合、または酸素もしくは硫黄などの原子、ＮＲ８、Ｃ（Ｏ）、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＳＯ、ＳＯ２、ＳＯ２ＮＨなどのユニット、または原子の鎖であって、例えばこれに限定されるものではないが、置換もしくは非置換アルキル、置換もしくは非置換アルケニル、置換もしくは非置換アルキニル、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロシクリルアルケニル、ヘテロシクリルアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニル、アルキルアリールアルキル、アルキルアリールアルケニル、アルキルアリールアルキニル、アルケニルアリールアルキル、アルケニルアリールアルケニル、アルケニルアリールアルキニル、アルキニルアリールアルキル、アルキニルアリールアルケニル、アルキニルアリールアルキニル、アルキルヘテロアリールアルキル、アルキルヘテロアリールアルケニル、アルキルヘテロアリールアルキニル、アルケニルヘテロアリールアルキル、アルケニルヘテロアリールアルケニル、アルケニルヘテロアリールアルキニル、アルキニルヘテロアリールアルキル、アルキニルヘテロアリールアルケニル、アルキニルヘテロアリールアルキニル、アルキルヘテロシクリルアルキル、アルキルヘテロシクリルアルケニル、アルキルヘレロシクリルアルキニル（ａｌｋｙｌｈｅｒｅｒｏｃｙｃｌｙｌａｌｋｙｎｙｌ）、アルケニルヘテロシクリルアルキル、アルケニルヘテロシクリルアルケニル、アルケニルヘテロシクリルアルキニル、アルキニルヘテロシクリルアルキル、アルキニルヘテロシクリルアルケニル、アルキニルヘテロシクリルアルキニル、アルキルアリール、アルケニルアリール、アルキニルアリール、アルキルヘテロアリール、アルケニルヘテロアリール、アルキニルヘレロアリール（ａｌｋｙｎｙｌｈｅｒｅｒｏａｒｙｌ）など、を含み、一つ以上のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（Ｒ８）、Ｃ（Ｏ）、置換または非置換アリール、置換または非置換ヘテロアリール、置換または非置換複素環によって中断または終結され得、式中、Ｒ８は、水素、アシル、脂肪族、または置換された脂肪族である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１～２４原子、２～２４、３～２４、４～２４、５～２４、６～２４、６～１８、７～１８、８～１８原子、７～１７、８～１７、６～１６、７～１６、または８～１６原子である。
いくつかの実施形態では、本開示のｄｓＲＮＡは、式（ＸＸＸＩ）～（ＸＸＸＩＶ）のいずれかで示される構造の群から選択される二価または三価の分枝リンカーにコンジュゲートされる：
であり、
式中、
ｑ２Ａ、ｑ２Ｂ、ｑ３Ａ、ｑ３Ｂ、ｑ４Ａ、ｑ４Ｂ、ｑ５Ａ、ｑ５Ｂおよびｑ５Ｃは、出現ごとに独立に、０～２０を表し、また繰り返し単位は、同一である場合も、異なる場合もあり、
Ｐ２Ａ、Ｐ２Ｂ、Ｐ３Ａ、Ｐ３Ｂ、Ｐ４Ａ、Ｐ４Ｂ、Ｐ５Ａ、Ｐ５Ｂ、Ｐ５Ｃ、Ｔ２Ａ、Ｔ２Ｂ、Ｔ３Ａ、Ｔ３Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ４Ｂ、Ｔ４Ａ、Ｔ５Ｂ、Ｔ５Ｃは、出現ごとに、独立して、存在しない、ＣＯ、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＯＣ（Ｏ）、ＮＨＣ（Ｏ）、ＣＨ２、ＣＨ２ＮＨ、またはＣＨ２Ｏであり、
Ｑ２Ａ、Ｑ２Ｂ、Ｑ３Ａ、Ｑ３Ｂ、Ｑ４Ａ、Ｑ４Ｂ、Ｑ５Ａ、Ｑ５Ｂ、Ｑ５Ｃは、出現ごとに、独立して、存在しない、アルキレン、置換アルキレンであり、式中、一つ以上のメチレンが、Ｏ、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、ＳＯ２、Ｎ（ＲＮ）、Ｃ（Ｒ’）＝Ｃ（Ｒ’’）、Ｃ≡ＣまたはＣ（Ｏ）のうち一つ以上によって中断または終結され得、
Ｒ２Ａ、Ｒ２Ｂ、Ｒ３Ａ、Ｒ３Ｂ、Ｒ４Ａ、Ｒ４Ｂ、Ｒ５Ａ、Ｒ５Ｂ、Ｒ５Ｃは、出現ごとにそれぞれ独立に、存在しない、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ２、Ｃ（Ｏ）Ｏ、Ｃ（Ｏ）ＮＨ、ＮＨＣＨ（Ｒａ）Ｃ（Ｏ）、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ（Ｒａ）－ＮＨ－、ＣＯ、ＣＨ＝Ｎ－Ｏ、
またはヘテロシクリルであり、
Ｌ２Ａ、Ｌ２Ｂ、Ｌ３Ａ、Ｌ３Ｂ、Ｌ４Ａ、Ｌ４Ｂ、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃはリガンドを表し、すなわち、出現ごとに、それぞれ独立して、単糖（ＧａｌＮＡｃなど）、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、または多糖であり、およびＲａはＨまたはアミノ酸側鎖である。三価コンジュゲートＧａｌＮＡｃ誘導体は、標的遺伝子の発現を阻害するＲＮＡｉ剤と共に使用するのに特に有用であり、例えば以下の式（ＸＸＸＶ）：
、のものなどであり、式中、Ｌ５Ａ、Ｌ５Ｂ、およびＬ５Ｃは、単糖、例えばＧａｌＮＡｃ誘導体を表す。
ＧａｌＮＡｃ誘導体をコンジュゲートする二価および三価の分枝のリンカー基の例としては、これに限定されないが、式ＩＩ、ＶＩＩ、ＸＩ、ＸおよびＸＩＩＩとして上記で列記した構造が挙げられる。
切断可能な連結基とは、細胞の外部で十分に安定であるが、標的細胞内に入ると、切断されて、リンカーが一緒に保持している二つの部分を放出する基である。いくつかの実施形態では、切断可能な連結基は、対象の血液中または第二の参照条件下（例えば、血液または血清中で見られる条件を模倣または表すように選択され得る）よりも、標的細胞中または第一の参照条件下（例えば、細胞内条件を模倣または表すように選択され得る）において、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、またはそれ以上、または少なくとも約１００倍速い速度で切断される。
切断可能な連結基は、切断剤、例えば、ｐＨ、酸化還元電位または分解性分子の存在、の影響を受け易い。概して切断剤は、血清または血液中においてよりも、細胞の内部で、より広範に広がっているかまたはより高いレベルもしくは活性で見られる。このような分解剤の例としては、特定の基質のために選択される、または基質特異性を有さない酸化還元剤、例えば還元によって酸化還元切断可能な連結基を分解できる、細胞中に存在する、例えば、メルカプタンなどの酸化酵素もしくは還元酵素または還元剤や、エステラーゼや、エンドソームまたは酸性環境を作出できる試薬、例えば、五以下のｐＨをもたらす試薬や、一般酸、ペプチダーゼ（基質特異的であり得る）およびホスファターゼとして作用することによって酸切断可能な連結基を加水分解もしくは分解できる酵素が挙げられる。
切断可能な連結基、例えばジスルフィド結合などは、ｐＨの影響を受け易い場合がある。ヒト血清のｐＨは７．４であるが、平均細胞内ｐＨはわずかに低く、約７．１～７．３の範囲である。エンドソームは、５．５～６．０の範囲のより酸性のｐＨであり、またリソソームは、およそ５．０のさらにより酸性のｐＨである。一部のリンカーは、適切なｐＨで切断され、それによって細胞の内部でリガンドから、または細胞の所望のコンパートメント中に、カチオン性脂質を放出するものである、切断可能な連結基を有することとなる。
リンカーは、特定の酵素によって切断可能である切断可能な連結基を含み得る。リンカー中に組み込まれる切断可能な連結基の種類は、標的にする細胞に左右され得る。
概して、候補の切断可能な連結基の適合性は、分解剤が候補連結基を切断する能力（または条件）を試験することによって評価可能である。また、血液中で、または他の非標的組織と接触したときに、切断に抵抗する能力について候補の切断可能な連結基を試験することもまた望ましいであろう。したがって、第一および第二の条件の間での切断に対する相対的な感受性を決定することができるものであり、ここで第一の条件は、標的細胞において切断を示すように選択され、第二の条件は、他の組織または生物学的流体中で、例えば、血液もしくは血清中で、切断を示すように選択される。評価は、無細胞系において、細胞において、細胞培養液において、臓器または組織の培養液において、または動物全身において、実施され得る。無細胞条件または培養条件において最初の評価を行うことおよび動物全身におけるさらなる評価によって確認することが、有用であり得る。いくつかの実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）と比較して、細胞中で（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速い速度で切断される。
ｉ．酸化還元切断可能な連結基
いくつかの実施形態では、切断可能な連結基は、還元または酸化の際に切断される酸化還元切断可能な連結基である。還元的に切断可能な連結基の例としては、ジスルフィド連結基（－Ｓ－Ｓ－）が挙げられる。候補の切断可能な連結基が、適した「還元的に切断可能な連結基」であるか、または例えば、特定のｉＲＮＡ部分および特定のターゲティング剤とともに使用するのに適しているか否かを決定するために、本明細書において記載する方法に目を向けることができる。例えば、細胞中であって、例えば、標的細胞中で観察されるであろう切断の速度を模倣する、当技術分野で公知の試薬を使用してジチオスレイトール（ＤＴＴ）または他の還元剤とともにインキュベートすることによって、候補を評価することができる。候補はまた、血液または血清条件を模倣するように選択された条件下で評価することもできる。ある条件においては、候補化合物は、血液中で最大約１０％切断される。他の実施形態では、有用な候補化合物は、血液中（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞中で（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下で）少なくとも約２、４、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０または約１００倍速い速度で分解される。候補化合物の切断の速度は、細胞内媒体を模倣するように選択された条件下での標準酵素動態アッセイを用いて決定され、細胞外媒体を模倣するように選択された条件と比較され得る。
ｉｉ．ホスフェート系の切断可能な連結基
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ホスフェート系の切断可能な連結基を含む。ホスフェート系の切断可能な連結基は、ホスフェート基を分解または加水分解する試薬により切断される。細胞においてホスフェート基を切断する試薬の例としては、細胞中のホスファターゼなどの酵素がある。ホスフェート系連結基の例としては、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＲｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＲｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｒｋ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｒｋ）－Ｓ－がある。いくつかの実施形態では、ホスフェート系連結基としては、Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｓ－、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｏ、－Ｓ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｏ－、－Ｓ－Ｐ（Ｏ）（Ｈ）－Ｓ－、－Ｏ－Ｐ（Ｓ）（Ｈ）－Ｓ－がある。いくつかの実施形態では、ホスフェート系連結基は、－Ｏ－Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）－Ｏ－である。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。
ｉｉｉ．酸切断可能な連結基
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、酸切断可能な連結基を含む。酸切断可能な連結基は、酸性条件下で切断される連結基である。いくつかの実施形態では、酸切断可能な連結基は、ｐＨが約６．５以下である酸性環境（例えば、約６．０、５．７５、５．５、５．２５、５．０以下）において、または一般酸として作用できる酵素などの薬剤によって、切断される。細胞において、特定の低ｐＨオルガネラ、例えばエンドソームおよびリソソームが、酸切断可能な連結基のための切断環境をもたらすことができる。酸切断可能な連結基の例としては、これに限定されないが、ヒドラゾン、エステルおよびアミノ酸のエステルが挙げられる。酸切断可能な基は、一般式－Ｃ＝ＮＮ－、Ｃ（Ｏ）Ｏ、または－ＯＣ（Ｏ）を有し得る。いくつかの実施形態では、エステルの酸素に結合している炭素（アルコキシ基）は、アリール基、置換アルキル基、または第三級アルキル基、例えばジメチルペンチルもしくはｔ－ブチルである。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。
ｉｖ．エステル系切断可能な連結基
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、エステル系の切断可能な連結基を含む。エステル系の切断可能な連結基は、細胞においてエステラーゼおよびアミダーゼなどの酵素によって切断される。エステル系の切断可能な連結基の例としては、これに限定されないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。エステルの切断可能な連結基は、一般式－Ｃ（Ｏ）Ｏ－または－ＯＣ（Ｏ）－を有する。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。
ｖ．ペプチド系切断可能な連結基
いくつかの実施形態では、切断可能なリンカーは、ペプチド系の切断可能な連結基を含む。ペプチド系の切断可能な連結基は、細胞においてペプチダーゼおよびプロテアーゼなどの酵素によって切断される。ペプチド系の切断可能な連結基は、アミノ酸の間で形成されて、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドが得られるペプチド結合である。ペプチド系の切断可能な基は、アミド基（－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－）を含まない。アミド基は、任意のアルキレン、アルケニレンまたはアルキネレンの間で形成され得る。ペプチド結合は、アミノ酸の間で形成されて、ペプチドおよびタンパク質が得られるアミド結合の特殊な型である。ペプチド系の切断基は、概して、アミノ酸の間で形成されてペプチドおよびタンパク質が得られるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、すべてのアミド官能基を含むものではない。ペプチド系の切断可能な連結基は、一般式－ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）－を有するものであり、式中、ＲＡおよびＲＢは、二つの隣接するアミノ酸のＲ基である。これら候補は、上述のものと類似した方法を使用して評価することができる。ＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許としては、これに限定されないが、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３号、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号、および第５，６８８，９４１号、第６，２９４，６６４号、第６，３２０，０１７号、第６，５７６，７５２号、第６，７８３，９３１号、第６，９００，２９７号、第７，０３７，６４６号、第８，１０６，０２２号が挙げられ、この各々の内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
所与の化合物におけるすべての位置が均一に修飾される必要はなく、実際には、先述の修飾のうち二つ以上が、単一の化合物内に、またはさらにｉＲＮＡ内の単一のヌクレオシドにおいて組み込まれてもよい。本開示はまた、キメラ化合物であるｉＲＮＡ化合物も含む。
本開示の文脈における「キメラ」ｉＲＮＡ化合物または「キメラ」は、二つ以上の化学的に区別される領域を含有する、例えばｄｓＲＮＡｉ剤などのｉＲＮＡ化合物であり、そのそれぞれが少なくとも一つのモノマー単位、すなわちｄｓＲＮＡ化合物の場合にはヌクレオチド、により構成される。これらｉＲＮＡは、典型的には、少なくとも一つの領域であって、そこでＲＮＡが、ｉＲＮＡに対してヌクレアーゼ分解に対する耐性の増大、細胞取り込みの増大および／または標的核酸に対する結合親和性の増大を付与するように修飾されるものである、少なくとも一つの領域を含有する。ｉＲＮＡの追加的な領域は、ＲＮＡ：ＤＮＡまたはＲＮＡ：ＲＮＡの複合型を切断可能である酵素のための基質として機能し得る。例として、リボヌクレアーゼＨは、ＲＮＡ：ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡ鎖を切断する細胞性エンドヌクレアーゼである。したがって、リボヌクレアーゼＨの活性化が、ＲＮＡ標的の切断をもたらし、それによって遺伝子発現のｉＲＮＡ阻害の効率を大きく増強する。結果的に、これに匹敵する結果は、しばしば、同一の標的領域にハイブリダイズするホスホロチオエートデオキシｄｓＲＮＡと比較して、キメラｄｓＲＮＡを使用する場合により短いｉＲＮＡで得ることができる。ＲＮＡ標的の切断は、ゲル電気泳動によって、また必要に応じて、当技術分野で公知の関連する核酸ハイブリダイゼーション技術によって、ごく普通に検出可能である。
特定の例では、ｉＲＮＡのＲＮＡは、非リガンドの基によって修飾できる。ｉＲＮＡの活性、細胞分布または細胞取り込みを増強するために、いくつかの非リガンドの分子がｉＲＮＡにコンジュゲートされてきたので、当該コンジュゲーションを実施するための手順は、科学文献において利用可能である。こうした非リガンドの部分には、脂質部分、例えばコレステロール（Ｋｕｂｏ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，２００７，３６５（１）：５４－６１、Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６：６５５３）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９４，４：１０５３）、チオエーテル、例えば、ヘキシル－Ｓ－トリチルチオール（ｈｅｘｙｌ－Ｓ－ｔｒｉｔｙｌｔｈｉｏｌ）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０：３０６；Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３：２７６５）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２，２０：５３３）、脂肪鎖、例えば、ドデカンジオール残基またはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ－Ｂｅｈｍｏａｒａｓ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１９９１，１０：１１１、Ｋａｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９：３２７、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５：４９）、リン脂質、例えば、ジ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２－ジ－Ｏ－ヘキサデシル－ｒａｃ－グリセロ－３－Ｈ－ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１、Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９０，１８：３７７７）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４：９６９）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６：３６５１）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４：２２９）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ－カルボニル－オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７：９２３）、が含まれてきた。このようなＲＮＡコンジュゲートの調製を教示する代表的な米国特許は、上記で列記している。典型的なコンジュゲーションプロトコルは、配列の一つ以上の位置にアミノリンカーを有するＲＮＡの合成を伴う。次いで、アミノ基が、適切なカップリングまたは活性化試薬を使用してコンジュゲートされている分子と反応する。コンジュゲーション反応は、ＲＮＡがまだ固体支持部に結合している状態で、または溶液相でＲＮＡが切断された後に実施され得る。ＨＰＬＣによるＲＮＡコンジュゲートの精製によって、典型的には、純粋なコンジュゲートが得られる。
Ｖ．ｉＲＮＡの送達
ｉＲＮＡの送達を必要とする対象への送達は、多くの異なる方法で達成することができる。インビボでの送達は、ｉＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡ、を含む組成物を対象に投与することによって直接的に実施することができる。あるいは、送達は、ｉＲＮＡをコードしてその発現を誘導する一つ以上のベクターを投与することによって間接的に実施することができる。これらの選択肢は、以下においてさらに説明される。
Ａ．直接送達
概して、核酸分子を送達する任意の方法は、ｉＲＮＡを用いた使用に適合させることができる（例えば、Ａｋｈｔａｒ Ｓ．ａｎｄ Ｊｕｌｉａｎ ＲＬ．（１９９２）Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２（５）：１３９－１４４および国際公開第９４／０２５９５号を参照、これらは参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。しかしながら、インビボでのｉＲＮＡ分子の成功裏な送達のために考慮すべき重要な三つのファクターとしては、（ａ）送達される分子の生物学的安定性、（２）非特異的な影響の防止、および（３）標的組織内での送達される分子の蓄積、が挙げられる。ｉＲＮＡの非特異的効果は、局所投与によって、例えば組織（非制限的な例として、眼）への直接注入もしくは移植または調製物の局所投与によって最小限に抑えることができる。処置部位への局所投与は、薬剤の局所濃度を最大化して、さもなくば薬剤によって害され得るかまたは薬剤を分解し得る全身組織への薬剤の曝露を制限し、投与しようとするｉＲＮＡ分子のより少ない投与総量を可能にする。いくつかの研究では、ｉＲＮＡが局所的に投与された場合の遺伝子産物のノックダウンの成功が示されている。例えば、カニクイザルにおける硝子体内注射によるＶＥＧＦ ｄｓＲＮＡの眼球内送達（Ｔｏｌｅｎｔｉｎｏ，ＭＪ．ｅｔ ａｌ．，（２００４）Ｒｅｔｉｎａ ２４：１３２－１３８）およびマウスにおける網膜下への注入（Ｒｅｉｃｈ，ＳＪ．ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．９：２１０－２１６）はいずれも、加齢黄斑変性症の実験モデルにおいて、新生血管形成を予防することを示した。加えて、マウスにおけるｄｓＲＮＡの直接の腫瘍内注入が、腫瘍体積を減少させ（Ｐｉｌｌｅ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１１：２６７－２７４）、腫瘍を有するマウスの生存を長引かせることができる（Ｋｉｍ，ＷＪ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：３４３－３５０；Ｌｉ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ（２００７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１５：５１５－５２３）。ＲＮＡ干渉は、直接注入によるＣＮＳへの局所送達によって成功することがわかっており（Ｄｏｒｎ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３２：ｅ４９；Ｔａｎ，ＰＨ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５９－６６；Ｍａｋｉｍｕｒａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ（２００２）ＢＭＣ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．３：１８；Ｓｈｉｓｈｋｉｎａ，ＧＴ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ １２９：５２１－５２８；Ｔｈａｋｋｅｒ，ＥＲ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１０１：１７２７０－１７２７５；Ａｋａｎｅｙａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ．９３：５９４－６０２）、また肺に対しては鼻腔内投与によって成功することがわかっている（Ｈｏｗａｒｄ，ＫＡ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１４：４７６－４８４；Ｚｈａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０６７７－１０６８４；Ｂｉｔｋｏ，Ｖ．，ｅｔ ａｌ（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１１：５０－５５）。疾患の処置のためにｉＲＮＡを全身投与する場合、ＲＮＡを修飾するか、または代替として、薬物送達システムを使用して送達することができ、いずれの方法も、インビボでのエンドヌクレアーゼおよびエクソヌクレアーゼによってｄｓＲＮＡの急速な分解を防ぐように機能する。
ＲＮＡまたは医薬担体の修飾もまた、ｉＲＮＡ組成物の標的組織へのターゲティングを可能にし、望ましくないオフターゲット効果を回避させることができる。ｉＲＮＡ分子は、例えば、本明細書に記載される脂質または炭化水素基への化学的コンジュゲーションによって修飾され得る。そのようなコンジュゲートを使用して、ｉＲＮＡを特定の細胞、例えば、肝細胞などの肝臓の細胞に標的化することができる。例えば、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートまたは脂質（例えば、ＬＮＰ）製剤を使用して、ｉＲＮＡを特定の細胞、例えば、肝細胞などの肝臓の細胞に標的化することができる。
ｉＲＮＡ分子はまた、細胞取り込みを増強し、分解を防ぐように、コレステロールなどの親油性基への化学的コンジュゲーションによって修飾することができる。例えば、親油性コレステロール部分にコンジュゲートされたＡｐｏＢへと誘導されるｉＲＮＡは、マウスに全身的に注射されたところ、結果として肝臓および空腸の両方においてａｐｏＢ ｍＲＮＡのノックダウンを生じた（Ｓｏｕｔｓｃｈｅｋ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ（２００４）Ｎａｔｕｒｅ ４３２：１７３－１７８）。アプタマーへのｉＲＮＡのコンジュゲーションは、前立腺がんのマウスモデルにおいて腫瘍の成長を阻害し、腫瘍縮小を媒介することが分かっている（ＭｃＮａｍａｒａ，ＪＯ．，ｅｔ ａｌ（２００６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：１００５－１０１５）。代替的な実施形態では、ｉＲＮＡは、例えばナノ粒子、デンドリマー、ポリマー、リポソーム、またはカチオン性送達系などである薬剤送達システムを使用して送達可能である。正に荷電したカチオン性の送達系は、ｉＲＮＡ分子（負に荷電した）の結合を促進し、また負に荷電した細胞膜での相互作用も高め、それにより細胞によるｉＲＮＡの効率的な取込みを可能にする。カチオン性脂質、デンドリマー、またはポリマーは、ｉＲＮＡに結合することも、ｉＲＮＡを封入する小胞またはミセルを形成する（例えば、Ｋｉｍ ＳＨ．，ｅｔ ａｌ（２００８）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ １２９（２）：１０７－１１６を参照）ように誘導することも、可能である。小胞またはミセルの形成はさらに、全身投与したときのｉＲＮＡの分解を防止する。カチオン性のｉＲＮＡ複合体を作製および投与する方法は、十分に当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ ３２７：７６１－７６６；Ｖｅｒｍａ，ＵＮ．，ｅｔ ａｌ（２００３）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９：１２９１－１３００；Ａｒｎｏｌｄ，ＡＳ ｅｔ ａｌ（２００７）Ｊ．Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．２５：１９７－２０５を参照、これらは参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。ｉＲＮＡの全身送達に有用な薬剤送達システムのいくつかの非限定的な例としては、ＤＯＴＡＰ（Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，ＤＲ．，ｅｔ ａｌ（２００３）、同上、Ｖｅｒｍａ，ＵＮ，ｅｔ ａｌ．，（２００３）、同上）、オリゴフェクタミン、「固体核酸脂質粒子（ｓｏｌｉｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｌｉｐｉｄ ｐａｒｔｉｃｌｅ）」（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ，ＴＳ，ｅｔ ａｌ．，（２００６）Ｎａｔｕｒｅ ４４１：１１１－１１４）、カルジオリピン（Ｃｈｉｅｎ，ＰＹ，ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：３２１－３２８；Ｐａｌ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，（２００５）Ｉｎｔ Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２６：１０８７－１０９１）、ポリエチレンイミン（Ｂｏｎｎｅｔ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．，（２００８）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．Ａｕｇ １６ Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ、Ａｉｇｎｅｒ，Ａ．（２００６）Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．７１６５９）、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチド（Ｌｉｕ，Ｓ．（２００６）Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．３：４７２－４８７）、およびポリアミドアミン（Ｔｏｍａｌｉａ，ＤＡ，ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．３５：６１－６７、Ｙｏｏ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１７９９－１８０４）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、全身投与のためにシクロデキストリンと複合体を形成する。投与の方法およびｉＲＮＡとシクロデキストリンとによる医薬組成物は、米国特許第７，４２７，６０５号に見出され、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
Ｂ．ベクターにコードされたｉＲＮＡ
別の態様では、ＭＹＯＣを標的とするｉＲＮＡは、ＤＮＡベクターまたはＲＮＡベクターに挿入された転写ユニットから発現され得る（例えば、Ｃｏｕｔｕｒｅ，Ａ，ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ．（１９９６），１２：５－１０；Ｓｋｉｌｌｅｒｎ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．による国際公開第００／２２１１３号、Ｃｏｎｒａｄによる国際公開第００／２２１１４号、およびＣｏｎｒａｄによる米国特許第６，０５４，２９９号を参照）。発現は、使用される特定の構築物および標的組織または細胞型に応じて、一過性的（数時間から数週間ほど）または持続的（数週間から数か月またはそれ以上）であり得る。これら導入遺伝子は、直鎖状の構築物、環状プラスミド、または統合ベクターもしくは非統合ベクターであり得るウイルスベクターとして導入することができる。導入遺伝子は、染色体外プラスミドとして継代されることを可能にするように構築することもできる（Ｇａｓｓｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９５）９２：１２９２）。
ｉＲＮＡの個々の鎖は、発現ベクター上のプロモーターから転写することができる。二つの別々の鎖が、例えば、ｄｓＲＮＡを生成するように発現される場合、二つの別々の発現ベクターを、標的細胞内に同時導入することができる（例えば、トランスフェクションまたは感染によって）。あるいは、ｄｓＲＮＡのそれぞれ個別の鎖を、それらのいずれもが同じ発現プラスミド上に位置するプロモーターによって転写することができる。いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡがステム－アンド－ループ構造を有するようにリンカーポリヌクレオチド配列によって連結された逆方向リピートとして発現される。
ｉＲＮＡ発現ベクターは、典型的にはＤＮＡプラスミドまたはウイルスベクターである。真核細胞に適合性がある発現ベクター、例えば脊椎動物細胞に対して適合性がある発現ベクターを使用することにより、本明細書において記載するｉＲＮＡの発現のための組換え構築物を産生することができる。真核細胞発現ベクターは、当該技術分野で周知であり、多数の商業的供給源から入手可能である。典型的には、かかるベクターは、所望の核酸セグメントの挿入のための便利な制限部位を含有する。ｉＲＮＡ発現ベクターの送達は、例えば静脈内または筋肉内投与によって、患者から取り出された標的細胞への投与とその後の患者への再導入によって、または所望の標的細胞への導入を可能にする任意の他の手段によって、全身的になされ得る。
ｉＲＮＡ発現プラスミドは、カチオン性脂質担体（例えば、オリゴフェクタミン）または非カチオン性脂質系担体（例えば、Ｔｒａｎｓｉｔ‐ＴＫＯＴＭ）との複合体として標的細胞にトランスフェクトされ得る。一週間以上にわたって標的ＲＮＡの異なる領域を標的とするｉＲＮＡ介在性ノックダウンのための複数の脂質トランスフェクションも、本開示によって企図される。宿主細胞へのベクターの成功裏な導入は、様々な公知の方法を使用して観察することができる。例えば、一過性トランスフェクションは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）などの蛍光マーカーなどのレポーターを用いてシグナル伝達することができる。生体外での細胞の安定なトランスフェクションは、ハイグロマイシンＢ耐性などの特定の環境因子（例えば、抗生物質および薬剤）に対する耐性をトランスフェクト細胞に提供するマーカーを使用して確保することができる。
本明細書において記載する方法および組成物と共に用いることができるウイルスベクターシステムとしては、これらに限定されるものではないが、（ａ）アデノウイルスベクター、（ｂ）レトロウイルスベクター、例えばこれに限定されるものではないが、レンチウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルスなど、（ｃ）アデノ随伴ウイルスベクター、（ｄ）単純ヘルペスウイルスベクター、（ｅ）ＳＶ４０ベクター、（ｆ）ポリオーマウイルスベクター、（ｇ）パピローマウイルスベクター、（ｈ）ピコルナウイルスベクター、（ｉ）ポックスウイルスベクター、例えばオルソポックスなどであり、例えば、ワクシニアウイルスベクターなど、またはトリポックスであり、例えば、カナリアポックスもしくは鶏痘など、ならびに（ｊ）ヘルパー依存性アデノウイルスまたはガットレス（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスが挙げられる。複製欠損ウイルスもまた有利であり得る。異なるベクターは、細胞のゲノムの中に組み込まれるようになるかまたは組み込まれるようにならないであろう。当該構築物は、所望の場合、トランスフェクションのためのウイルス配列を含むことができる。あるいは、構築物は、エピソーム複製が可能なベクター内に、例えば、ＥＰＶベクターおよびＥＢＶベクター内に、組み込まれ得る。ｉＲＮＡの組換え発現のための構築物は、概して、標的細胞におけるｉＲＮＡの発現を確実にするために、調節要素を、例えばプロモーター、エンハンサーなどを、必要とするであろう。ベクターおよび構築物を検討するための他の態様を、以下にてさらに記述する。
ｉＲＮＡの送達に有用なベクターには、所望の標的細胞または組織におけるｉＲＮＡの発現に十分な調節要素（プロモーター、エンハンサーなど）が含まれる。調節要素は、構成的または調節／誘導的発現のいずれかを提供するように選択され得る。
ｉＲＮＡの発現は、例えば、特定の生理学的調節因子、例えば、循環グルコースレベル、またはホルモンに感受性のある誘導性調節配列を使用することによって、正確に調節され得る（Ｄｏｃｈｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ ．，１９９４，ＦＡＳＥＢ Ｊ．８：２０－２４）。細胞または哺乳動物におけるｄｓＲＮＡ発現の制御に適した、かかる誘導性発現系としては、例えば、エクジソンによる調節、エストロゲン、プロゲステロン、テトラサイクリン、二量体化の化学誘導物質、およびイソプロピル－β－Ｄ１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）による調節が挙げられる。当業者であれば、ｉＲＮＡ導入遺伝子の意図される使用に基づいて、適切な調節／プロモーター配列を選択することができるであろう。
特定の実施形態では、ｉＲＮＡをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターが使用され得る。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１－５９９（１９９３）参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの統合に必要な構成要素を含有する。ｉＲＮＡをコードする核酸配列は、一つ以上のベクターにクローニングされ、これは患者への核酸の送達を促進する。レトロウイルスベクターについてのより詳細を、例えば、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、ｍｄｒ１遺伝子を造血幹細胞に送達するためのレトロウイルスベクターの使用を記載する、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１－３０２（１９９４）に見出すことができる。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を示す他の参考文献は、以下のとおりである： Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４－６５１（１９９４）；Ｋｉｅｍ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７－１４７３（１９９４）；Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９－１４１（１９９３）；ａｎｄ Ｇｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０－１１４（１９９３）。使用が企図されるレンチウイルスベクターとしては、例えば、米国特許第６，１４３，５２０号、第５，６６５，５５７号、および第５，９８１，２７６号に記載されるＨＩＶベースのベクターが挙げられ、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
アデノウイルスはまた、ｉＲＮＡの送達における使用が企図される。アデノウイルスは、特に、例えば、呼吸上皮に遺伝子を送達するための魅力的なビヒクルである。アデノウイルスは、軽度の疾患を引き起こす呼吸上皮に自然に感染する。アデノウイルスベースの送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９－５０３（１９９３）は、アデノウイルスベースの遺伝子療法のレビューを提示している。Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３－１０（１９９４）は、アデノウイルスベクターを使用して、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を移すことを示した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１－４３４（１９９１）；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ６８：１４３－１５５（１９９２）；Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５－２３４（１９９３）；国際公開第９４／１２６４９号；ａｎｄ Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５－７８３（１９９５）に見出される。本開示で特徴づけられるｉＲＮＡを発現するための好適なＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｘｉａ Ｈ ｅｔ ａｌ．（２００２）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０：１００６－１０１０において記載される。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用も企図される（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９－３００（１９９３）；米国特許第５，４３６，１４６号）。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、Ｕ６もしくはＨ１ ＲＮＡプロモーター、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターのいずれかを有する組換えＡＡＶベクターからの二つの別個の相補的な一本鎖ＲＮＡ分子として発現され得る。本開示で特徴付けられるｄｓＲＮＡを発現するための好適なＡＡＶベクター、組換えＡＶベクターを構築するための方法、およびベクターを標的細胞に送達するための方法は、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８７）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１：３０９６－３１０１、Ｆｉｓｈｅｒ Ｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（１９９６），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０－５３２、Ｓａｍｕｌｓｋｉ Ｒ ｅｔ ａｌ．（１９８９）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２－３８２６、米国特許第５，２５２，４７９号、米国特許第５，１３９，９４１号、国際公開第９４／１３７８８号、および国際公開第９３／２４６４１号に記載されており、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。
別の典型的なウイルスベクターは、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス、例えば、改変ウイルスアンカラ（ＭＶＡ）またはＮＹＶＡＣなどの弱毒化ワクシニア、鶏ポックスまたはカナリアポックスなどのアビポックスである。
ウイルスベクターの指向性は、ベクターをエンベロープタンパク質または他のウイルス由来の表面抗原でシュードタイピングすることによって、または必要に応じて異なるウイルスキャプシドタンパク質を置換することによって、改変することができる。例えば、レンチウイルスベクターは、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、狂犬病、エボラ、モコラなどの表面タンパク質でシュードタイプ化することができる。ＡＡＶベクターは、異なるキャプシドタンパク質血清型を発現するようにベクターを操作することによって、異なる細胞を標的とするように作製することができ、例えば、Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ Ｊ Ｅ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６：７９１－８０１参照、その開示全体は参照により本明細書に組み込まれる。
ベクターの医薬調製物は、許容可能な希釈剤中にベクターを含むことができ、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、完全な遺伝子送達ベクターが、組換え細胞、例えば、レトロウイルスベクターから完全な状態で産生され、医薬調製物は、遺伝子送達システムを生成する一つ以上の細胞を含むことができる。
ＶＩ．ｉＲＮＡを含有する医薬組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書において説明されるようなｉＲＮＡを含有する医薬組成物、および医薬的に許容される担体を提供する。ｉＲＮＡを含有する医薬組成物は、ＭＹＯＣ（例えば、緑内障、例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ））の発現または活性に関連する疾患または障害を治療するのに有用である。こうした医薬組成物は、送達の態様に基づいて製剤化される。いくつかの実施形態では、組成物は、局所的送達、例えば、眼球内送達（例えば、硝子体内投与、例えば、硝子体内注射、経強膜内投与、例えば、経強膜内注射、結膜下投与、例えば、結膜下注射、球後投与、例えば、球後注射、前房内投与、例えば、前房内注射、または網膜下投与、例えば、網膜下注射）のために製剤化され得る。他の実施形態では、組成物は、局所送達のために製剤化され得る。別の実施例では、組成物は、非経口送達を介した、例えば静脈内（ＩＶ）の送達を介した、全身投与のために製剤化され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に提供される組成物（例えば、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートまたはＬＮＰ製剤を含む組成物）は、静脈内送達のために製剤化される。
本明細書で取り上げられる医薬組成物は、ＭＹＯＣの発現を阻害するのに十分な投与量で投与される。概して、ｉＲＮＡの適切な用量は、一日当たりレシピエントの体重一キログラム当たり０．０１～２００．０ミリグラムの範囲である。医薬組成物は、一日一回投与されてもよく、またはｉＲＮＡは、一日を通して適切な間隔で、二回、三回、またはそれ以上の部分用量として投与されてもよく、または徐放性製剤を介した連続注入もしくは送達を使用して投与されてもよい。その場合、各部分用量に含有されるｉＲＮＡは、一日の総投与量を達成するために、対応してより小さくなければならない。投与単位はまた、例えば、数日間にわたるｉＲＮＡの徐放性を提供する従来の徐放性製剤を使用して、数日間にわたる送達のために配合され得る。徐放性製剤は当該技術分野で周知であり、本開示の薬剤と併用できるものなど、特定の部位での薬剤の送達に特に有用である。この実施形態では、投与単位は、対応する一日用量の倍数を含む。
ＭＹＯＣレベルに対する単回用量の効果は、後続用量が３、４、もしくは５日間以下の間隔で、または１、２、３、４、１２、２４、もしくは３６週間以下の間隔で投与されるように、長期間持続し得る。
当業者は、これらに限定されるものではないが、疾患または障害の重症度、過去の治療、対象の健康全般および／または年齢、および存在する他の疾患などの特定のファクターが、対象を効果的に治療するために必要な投薬量およびタイミングに影響を及ぼし得ることを理解するであろう。その上、治療有効量での組成物での対象の治療には、単回治療または一連の治療が含まれ得る。本開示に包含される個々のｉＲＮＡの有効投与量およびインビボ半減期の推定は、従来の方法論を使用して、または好適な動物モデルを使用したインビボ試験に基づいて行うことができる。
好適な動物モデル、例えば、マウスまたはカニクイザル、例えば、ヒトＭＹＯＣを発現する導入遺伝子を含有する動物を使用して、ＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡの治療有効用量および／または有効用量レジメン投与を決定することができる。
本開示はまた、本明細書で特徴付けられるｉＲＮＡ化合物を含む医薬組成物および製剤を含む。本開示の医薬組成物は、局所処置または全身処置のどちらが所望されるか、および処置される領域に応じて、いくつかの方法で投与され得る。投与は、局所的（例えば、眼内注射による）、局所的（例えば、点眼液による）、または非経口であってもよい。非経口投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内の注射または注入、例えば、インプラントデバイスによる皮下への投与、または例えば、実質内、髄腔内、または脳室内の投与による頭蓋内への投与を含む。
局所投与用の医薬組成物および製剤は、経皮パッチ、軟膏剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、点滴剤、坐剤、噴霧剤、溶液剤、および散剤を含み得る。従来の医薬担体、水性、粉末、または油状の基剤、増粘剤なども必要であり得、または望ましくあり得る。コーティングしたコンドーム、手袋なども有用であり得る。好適な局所製剤としては、本開示で取り上げるｉＲＮＡが、局所送達剤、例えば脂質、リポソーム、脂質酸、脂質酸エステル、ステロイド、キレート剤および界面活性剤との混合物となっているものを含める。好適な脂質およびリポソームとしては、中性（例えば、ジオレオイルホスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロリホスファチジル（ｄｉｓｔｅａｒｏｌｙｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌ）コリン）陰性（例えば、ジミリストイルホスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルホスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）が挙げられる。本開示で特徴づけられるｉＲＮＡは、リポソーム内に封入されてもよく、またはリポソーム、特にカチオン性リポソームに対して複合体を形成してもよい。あるいは、ｉＲＮＡは、脂質、特にカチオン性脂質と複合体化することができる。好適な脂肪酸およびエステルとしては、これに限定されるものではないが、アラキドン酸、オレイン酸、エイコサン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、１－モノカプリン酸グリセリル、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはＣ１－２０アルキルエステル（例えば、イソプロピルミリステートＩＰＭ）、モノグリセリド、ジグリセリド、またはそれらの薬学的に許容可能な塩が挙げられる。局所製剤は、米国特許第６，７４７，０１４号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
Ａ．リポソーム製剤
マイクロエマルションに加えて、薬剤の製剤化に研究および使用されている多くの組織化された界面活性剤構造がある。これらには、単層、ミセル、二層、および小胞が含まれる。リポソームなどの小胞は、その特異性および薬剤送達の観点から提供される作用持続時間のために、大きな関心を引き付けた。本開示で使用される場合、「リポソーム」という用語は、球状二重層または二重層に配置された両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。
リポソームは、親油性材料から形成された膜とおよび水性の内部とを有する単層または多層の小胞である。水性部分が、送達される組成物を含む。カチオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるという利点を有する。非カチオン性リポソームは、細胞壁と効率的に融合することができないが、インビボでマクロファージによって取り込まれる。
脂質小胞は、完全な無傷の哺乳動物の皮膚を通過するために、好適な経皮勾配の影響下において、それぞれが５０ｎｍ未満の直径を有する一連の微細孔を通過しなければならない。したがって、高度に変形可能であり、かつこうした微細な細孔を通過することができるリポソームを使用することが望ましい。
リポソームのさらなる利点としては、天然のリン脂質から得られるリポソームが生体適合性および生分解性であること、リポソームは広範囲の水および脂溶性薬物を組み込むことができること、リポソームはそれらの内部コンパートメント内のカプセル化された薬剤を代謝および分解から保護することができること、が挙げられる（Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５）。リポソーム製剤の調製における重要な検討事項は、脂質表面の電荷、小胞のサイズ、およびリポソームの水の量である。
リポソームは、作用部位への活性成分の移送および送達に有用である。リポソーム膜は生物学的膜と構造的に類似しているため、リポソームが組織に塗布されると、リポソームは細胞膜と融合し始め、リポソームと細胞の融合が進行すると、リポソーム内容物は、活性剤が作用し得る細胞内に排出される。
リポソーム製剤は、多くの薬剤の送達様式として広範な調査の焦点となっている。局所投与については、リポソームが他の製剤よりもいくつかの利点を呈するという証拠が増加している。こうした利点としては、投与された薬物の高い体内吸収に関連する副作用の減少、所望の標的での投与された薬物の蓄積の増加、および多種多様な薬剤を皮膚に、親水的におよび疎水的に投与する能力が挙げられる。
いくつかの報告は、高分子量ＤＮＡを含む薬剤を皮膚に送達するリポソームの能力を詳述している。鎮痛剤、抗体、ホルモン、および高分子量ＤＮＡを含む化合物が皮膚に投与されている。適用の大部分が表皮上部の標的化をもたらした
リポソームは、二つの大きな種類に分類される。カチオン性リポソームは、正に帯電したリポソームであって、負に帯電したＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成するリポソームである。正に帯電したＤＮＡ／リポソーム複合体は、負に帯電した細胞表面に結合して、エンドソームに内在化される。エンドソーム内の酸性ｐＨに起因して、リポソームは破裂して、その内容物を細胞質中へと放出する（（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０－９８５）。
ｐＨ感受性であるかまたは負に帯電しているリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するのではなく、ＤＮＡを捕捉する。核酸および脂質の両方が、同様の電荷であるため、複合体形成ではなく反発が生じる。それにもかかわらず、一部のＤＮＡは、これらリポソームの水性内側部分内に捕捉される。チミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを、培養液中の細胞単一層に送達するために、ｐＨ感受性リポソームが使用されてきた。外因性遺伝子の発現が、標的細胞において検出された（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９－２７４）。
リポソーム組成物の主要なタイプの一つは、天然由来のホスファチジルコリン以外のリン脂質を含む。中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物は、概して、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、その一方で、アニオン性融合性リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）から形成され、例えば大豆ＰＣおよび卵ＰＣなどである。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
いくつかの研究では、リポソーム薬物製剤の皮膚への局所送達を評価した。インターフェロンを含有するリポソームのモルモット皮膚への適用は、皮膚ヘルペス疼痛の低減をもたらした一方で、他の手段（例えば、溶液として、またはエマルションとして）を介したインターフェロンの送達は効果がなかった（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５－４１０）。さらに、追加の研究では、リポソーム製剤の一部として投与されたインターフェロンの、水性系を使用したインターフェロンの投与に対する有効性を試験し、リポソーム製剤が水性投与よりも優れていると結論付けた（ｄｕ Ｐｌｅｓｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９－２６５）。
非イオン性リポソーム系は、特に非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含む系は、皮膚への薬物の送達におけるそれらの有用性を判定するためにも試験されてきた。Ｎｏｖａｓｏｍｅ（商標）Ｉ（ジラウリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）およびＮｏｖａｓｏｍｅ（商標）ＩＩ（ジステアリン酸グリセリル／コレステロール／ポリオキシエチレン－１０－ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム製剤が、マウスの皮膚の真皮中にシクロスポリンＡを送達するために使用された。結果として、こうした非イオン性リポソーム系が、皮膚の異なる層中へのシクロスポリンＡの蓄積を促進する際に有効であることが示された（Ｈｕ ｅｔ ａｌ．Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
リポソームはまた、「立体的に安定化した」リポソームも含み、当該用語は、本明細書において使用する場合、一つ以上の特化された脂質を含むリポソームであって、リポソームに組み込まれた場合に、結果として当該特化された脂質を欠くリポソームと比較して循環寿命の向上が生じるような一つ以上の特化された脂質を含むリポソームを指す。立体的に安定化したリポソームの例としては、リポソームの小胞形成脂質部分が（Ａ）例えばモノシアロガングリオシドＧＭ１などの一つ以上の糖脂質を含むか、または（Ｂ）例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの一つ以上の親水性ポリマーで誘導体化されているリポソームである。いかなる特定の理論にも拘束されることを望まないが、少なくとも、ガングリオシド、スフィンゴミエリン、またはＰＥＧ誘導体化脂質を含有する立体的に安定化されたリポソームの場合、これら立体的に安定化されたリポソームの循環半減期の向上は、細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞内への取り込みの減少に由来すると、当技術分野では考えられている（Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９８７，２２３，４２；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９３，５３，３７６５）。
一つ以上の糖脂質を含む様々なリポソームが、当技術分野で公知である。Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ ｅｔ ａｌ．（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８７，５０７，６４）は、モノシアロガングリオシドＧＭ１、硫酸ガラクトセレブロシド、およびホスファチジルイノシトールのリポソームの血液半減期を向上させる能力について報告した。これら知見は、Ｇａｂｉｚｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，（１９８８），８５，：６９４９）によって解説された。Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．による米国特許第４，８３７，０２８号および国際公開第８８／０４９２４号の両方では、（１）スフィンゴミエリンと（２）ガングリオシドＧＭ１またはガラクトセレブロシド硫酸エステルとを含むリポソームが開示されている。米国特許第５，５４３，１５２号（Ｗｅｂｂ ｅｔ ａｌ．）では、スフィンゴミエリンを含むリポソームについて開示している。１，２－ｓｎ－ジミリストイルホスファチジルコリンを含むリポソームが、国際公開第９７／１３４９９号（Ｌｉｍ ｅｔ ａｌ）において開示されている。
一つ以上の親水性ポリマーで誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製方法が当該技術分野で公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７７８）は、ＰＥＧ部分を含有する非イオン性洗剤である２Ｃ１２１５Ｇを含むリポソームを記載している。Ｉｌｌｕｍ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）は、ポリスチレン粒子を高分子グリコールで親水性被覆すると、血中半減期が著しく延長されることに気付いた。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボン酸基の結合によって修飾された合成リン脂質は、Ｓｅａｒｒｓ（米国特許 第４，４２６，３３０号および第４，５３４，８９９号を参照されたい）により記述される。Ｋｌｉｂａｎｏｖ ｅｔ ａｌ．（ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）は、ＰＥＧまたはステアリン酸ＰＥＧで誘導体化されたホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが血液循環半減期の有意な増加を有することを実証する実験を記載している。Ｂｌｕｍｅ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）は、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組み合わせから形成される他のＰＥＧ誘導体化リン脂質、例えばＤＳＰＥ－ＰＥＧに、このような観察を拡張した。その外部表面上に共有結合したＰＥＧ部分を有するリポソームは、Ｆｉｓｈｅｒの欧州特許第ＥＰ ０ ４４５ １３１（Ｂ１）号および国際公開第９０／０４３８４号に記載されている。ＰＥＧで誘導体化された１～２０モルパーセントのＰＥを含有するリポソーム組成物、およびその使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，０１３，５５６号および第５，３５６，６３３号）およびＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（米国特許第５，２１３，８０４号および欧州特許第０ ４９６ ８１３（Ｂ１）号）に記載されている。いくつかの他の脂質ポリマーコンジュゲートを含むリポソームは、国際公開第９１／０５５４５号および米国特許第５，２２５，２１２号（ 両方ともＭａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．）および国際公開第９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙ ｅｔ ａｌ．）に記載されている。ＰＥＧ修飾セラミド脂質を含むリポソームは、国際公開第９６／１０３９１号（Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍａｋｉａｋｉ ｅｔ ａｌ．）および米国特許第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．）は、その表面上の機能性部分でさらに誘導体化され得るＰＥＧ含有リポソームを記載している。
核酸を含む多数のリポソームが当該技術分野で公知である。Ｔｈｉｅｒｒｙ ｅｔ ａｌ．のＷＯ ９６／４００６２は、高分子量核酸をリポソームに封入するための方法を開示している。Ｔａｇａｗａ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，２６４，２２１号は、タンパク質結合リポソームを開示しており、かかるリポソームの内容物がｄｓＲＮＡを含み得ると主張している。Ｒａｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．による米国特許第５，６６５，７１０号は、リポソーム内にオリゴデオキシヌクレオチドを封入する特定の方法を記載している。Ｌｏｖｅ ｅｔ ａｌ．のＷＯ９７／０４７８７は、ｒａｆ遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡを含むリポソームを開示している。
トランスファーソームは、さらに別のタイプのリポソームであり、薬物送達ビヒクルの魅力的な候補である高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、高度に変形可能であるため、液滴より小さい孔を通って容易に通過することができる脂質滴として説明され得る。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応可能であり、例えば、それらは、自己最適化（皮膚における孔の形状に順応性のある）し、自己修復し、断片化することなくそれらの標的に頻繁に到達し、また多くの場合自己負荷的である。トランスファーソームを作製するために、表面エッジ活性化剤、通常は界面活性剤、を標準リポソーム組成物に加えることができる。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するために使用されてきた。血清アルブミンのトランスファーソーム媒介性送達は、血清アルブミンを含有する溶液の皮下注射と同じくらい有効であることが分かっている。
界面活性剤は、エマルション（マイクロエマルションを含む）およびリポソームなどの製剤において、広い応用が見出される。天然および合成の、多くの異なるタイプの界面活性剤の特性を分類および格付けする最もよくある手法としては、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）を使用するものがある。親水性基（「頭」としても知られる）の性質が、製剤中で使用される様々な界面活性剤を分類するのに最も有用な手段となる（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
界面活性剤分子がイオン化されない場合、それらは、非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤は、医薬品および化粧製品において広い応用が見出され、広範囲のｐＨ値にわたって使用可能である。概して、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２から約１８の範囲である。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えばエチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシ化エステルが挙げられる。例えば脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシ化アルコールおよびエトキシ化／プロポキシ化ブロックポリマーなどである非イオン性のアルカノールアミドおよびエーテルもまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のクラスの最も普及した要素である。
水に溶解または分散されたときに、界面活性剤分子が負電荷を保持する場合、界面活性剤は、アニオン性として分類される。アニオン性界面活性剤としては、例えばセッケンなどであるカルボン酸エステル、アシル乳酸エステル、アミノ酸のアシルアミド、例えばアルキル硫酸エステルおよびエトキシ化アルキル硫酸エステルなどである硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホン酸エステルなどであるスルホン酸エステル、アシルイセチオン酸エステル、アシルタウリン酸塩、およびスルホコハク酸塩、およびリン酸塩が挙げられる。アニオン性界面活性剤のクラスの最も重要な要素は、アルキル硫酸エステルおよびセッケンである。
水に溶解または分散されたときに、界面活性剤分子が正電荷を保持する場合、界面活性剤は、カチオン性として分類される。カチオン性界面活性剤としては、第四級アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが挙げられる。第四級アンモニウム塩は、このクラスの最も使用される要素である。
界面活性剤分子が、正電荷または負電荷のどちらかを保持する能力を有する場合、界面活性剤は、両性として分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ－アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。
薬品、製剤、およびエマルション中での界面活性剤の使用は、概説されている（Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
Ｂ．核酸脂質粒子
いくつかの実施形態では、本開示に特徴付けられるＭＹＯＣ ｄｓＲＮＡは、脂質製剤中に完全に封入され、例えば、ＳＰＬＰ、ｐＳＰＬＰ、ＳＮＡＬＰ、または他の核酸脂質粒子を形成する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、および粒子の凝集を防ぐ脂質（例えば、ＰＥＧ－脂質コンジュゲート）を含有する。ＳＮＡＬＰおよびＳＰＬＰは、静脈（ｉ．ｖ．）注射後に循環寿命の延長を呈し、遠位部位（例えば、投与部位から物理的に離れた部位）において蓄積するため、全身投与に極めて有用である。ＳＰＬＰは、「ｐＳＰＬＰ」を含み、それは国際公開第００／０３６８３号に記載されるようなカプセル化された縮合剤－核酸複合体を含む。本開示の粒子は、典型的には、平均粒径が約５０ｎｍ～約１５０ｎｍであり、より典型的には約６０ｎｍ～約１３０ｎｍ、より典型的には約７０ｎｍ～約１１０ｎｍであり、最も典型的には約７０ｎｍ～約９０ｎｍであり、また実質的には無毒性である。加えて、核酸は、本開示の核酸－脂質粒子中に存在する場合、水溶液中において、ヌクレアーゼによる分解に対して抵抗性を有する。核酸－脂質粒子およびその調製方法は、例えば、米国特許第５，９７６，５６７号、第５，９８１，５０１号、第６，５３４，４８４号、第６，５８６，４１０号、第６，８１５，４３２号、および国際公開第９６／４０９６４号において開示されている。
いくつかの実施形態では、薬物に対する脂質の比（質量／質量比）（例えば、ｄｓＲＮＡに対する脂質の比）は、約１：１から約５０：１、約１：１から約２５：１、約３：１から約１５：１、約４：１から約１０：１、約５：１から約９：１、または約６：１から約９：１の範囲とすることとなる。
カチオン性脂質は、例えばＮ、Ｎ－ジオレイル－Ｎ、Ｎ－ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ－ジステアリル－Ｎ、Ｎ－ジメチルアンモニウム臭化物（ＤＤＡＢ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ－（Ｉ－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、Ｎ，Ｎ－ジメチル－２，３－ジオレイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｅｎＤＭＡ）、１，２－ジリノレイルカルバモイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｃ－ＤＡＰ）、１，２－ジリノレイオキシ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｏｘｙ）－３－（ジメチルアミノ）アセトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＤＡＣ）、１，２－ジリノルール（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－ＭＡ）、１，２－ジリノルール（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２－ジリノール酸－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－Ｓ－ＤＭＡ）、１－リノールオイル－２－リノレイルオキシ－３－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎ－２－ＤＭＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＭＡ．Ｃｌ）、１，２－ジリノルール（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｏｙｌ）－３－トリメチルアミノプロパンクロリド塩（ＤＬｉｎ－ＴＡＰ．Ｃｌ）、１，２－ジリノレイルオキシ－３－（Ｎ－メチルピペラジノ）プロパン（ＤＬｉｎ－ＭＰＺ）、または３－（Ｎ、Ｎ－ジリノレイルアミノ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌａｍｉｎｏ））－１，２－プロパンジオール（ＤＬｉｎＡＰ）、３－（Ｎ，Ｎ－ジオレイルアミノ）－１，２－プロパンジオ（ＤＯＡＰ）、１，２－ジリノレイルオキソ（Ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｏ）－３－（２－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ）エトキシプロパン（ＤＬｉｎ－ＥＧ－ＤＭＡ）、ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノメチル－［１，３］－ジオキソラン（ＤＬｉｎ－Ｋ－ＤＭＡ）またはその類似体、（３ａＲ，５ｓ，６ａＳ）－Ｎ、Ｎ－ジメチル－２，２－ジ（（９Ｚ、１２Ｚ）－オクタデカ－９，１２－ジエニル）テトラヒドロ－３ａＨ－シクロペンタ［ｄ］［１，３］ジオキソル（ｄｉｏｘｏｌ）－５－アミン（ＡＬＮ１００）、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル４－（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＭＣ３）、１，１’－（２－（４－（２－（（２－（ビス（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）（２－ヒドロキシドデシル）アミノ）エチル）ピペラジン－１－イル）エチルアザンジイル）ジドデカン－２－オール（Ｔｅｃｈ Ｇ１）、またはその混合物であり得る。カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約２０モル％～約５０モル％、または約４０モル％を含み得る。
いくつかの実施形態では、化合物２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランを使用して、脂質－ｓｉＲＮＡナノ粒子を調製することができる。２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソランの合成は、２００８年１０月２３日に出願された米国仮特許出願第６１／１０７，９９８号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
いくつかの実施形態では、脂質－ｓｉＲＮＡ粒子は、４０％の２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン：１０％ＤＳＰＣ：４０％コレステロール：６３．０±２０ｎｍの粒子サイズおよび０．０２７ｓｉＲＮＡ／脂質比を有する１０％ＰＥＧ－Ｃ－ＤＯＭＧ（モルパーセント）、を含む。
非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン（ＰＯＰＣ）、パルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、ジオレオイル－ホスファチジルエタノールアミン４－（Ｎ－マレイミドメチル）－シクロヘキサン－ｌ－カルボキシレート（ＤＯＰＥ－ｍａｌ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイル－ホスファチジル－エタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１６－Ｏ－モノメチルＰＥ、１６－Ｏ－ジメチルＰＥ、１８－１－トランスＰＥ、１－ステアロイル－２－オレオイル－ホスファチジエタノールアミン（ＳＯＰＥ）、コレステロール、またはその混合物を、含むアニオン性脂質、または中性脂質であり得るが、これらに限定されない。非カチオン性脂質は、粒子中に存在する総脂質の約５モル％～約９０モル％、約１０モル％、またはコレステロールが含まれる場合、約５８モル％であり得る。
粒子の凝集を阻害するコンジュゲート脂質は、例えば、ＰＥＧ－ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）、ＰＥＧ－ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ－リン脂質、ＰＥＧ－セラミド（Ｃｅｒ）、またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）脂質であってもよい。ＰＥＧ－ＤＡＡコンジュゲートは、例えば、ＰＥＧ－ジラウリルオキシプロピル（Ｃｉ２）、ＰＥＧ－ジミリスチルオキシプロピル（ｄｉｍｙｒｉｓｔｙｌｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）（Ｃｉ４）、ＰＥＧ－ジパルミチルオキシプロピル（Ｃｉ６）、またはＰＥＧ－ジステアリルオキシプロピル（Ｃ］８）であり得る。粒子の凝集を防止するコンジュゲートされた脂質は、粒子中に存在する総脂質の０モル％～約２０モル％、または約２モル％であってもよい。
いくつかの実施形態では、核酸脂質粒子は、例えば、粒子中に存在する総脂質の約１０モル％～約６０モル％、または約４８モル％のコレステロールをさらに含む。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中で製剤化される。
ＬＮＰ０１
いくつかの実施形態では、リピドイドＮＤ９８－４ＨＣｌ（ＭＷ １４８７）（参照により本明細書に組み込まれる３／２６／２００８にて出願の米国特許出願第１２／０５６，２３０号を参照）、コレステロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）を使用して、脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子（例えば、ＬＮＰ０１粒子）を調製することができる。エタノール中の各ストック溶液を以下のとおり調製することができる。ＮＤ９８、１３３ｍｇ／ｍｌ；コレステロール、２５ｍｇ／ｍｌ、ＰＥＧ－セラミドＣ１６、１００ｍｇ／ｍｌ。次いで、ＮＤ９８、コレステロール、およびＰＥＧ－セラミドＣ１６ストック溶液を、例えば、４２：４８：１０のモル比で組み合わせることができる。組み合わせた脂質溶液は、最終エタノール濃度が約３５～４５％であり、最終酢酸ナトリウム濃度が約１００～３００ｍＭであるように、ｄｓＲＮＡ水溶液（例えば、酢酸ナトリウムｐＨ５）と混合することができる。脂質－ｄｓＲＮＡナノ粒子は、典型的には、混合時に自発的に形成される。望ましい粒子サイズ分布に応じて、得られたナノ粒子混合物は、例えば、Ｌｉｐエクストルーダー（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）などのサーモバレルエクストルーダーを使用して、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍカットオフ）を通して押し出され得る。一部の事例では、押出工程を省略することができる。エタノール除去と同時の緩衝液交換は、例えば、透析または接線流濾過によって達成され得る。緩衝液は、例えば、約ｐＨ７、例えば、約ｐＨ６．９、約ｐＨ７．０、約ｐＨ７．１、約ｐＨ７．２、約ｐＨ７．３、または約ｐＨ７．４でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と交換することができる。
ＬＮＰ０１製剤は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際出願公開第ＷＯ２００８／０４２９７３号に記載されている。
さらなる例示的な脂質－ｄｓＲＮＡ製剤が、下記の表で提供される
表４：例示的な脂質製剤
ＤＳＰＣ：ジステアロイルホスファチジルコリン
ＤＰＰＣ：ジパルミトイルホスファチジルコリン
ＰＥＧ－ＤＭＧ：ＰＥＧ－ジジミリストイルグリセロール（Ｃ１４－ＰＥＧ、またはＰＥＧ－Ｃ１４）（平均分子量２０００のＰＥＧ）
ＰＥＧ－ＤＳＧ：ＰＥＧ－ジスチリルグリセロール（Ｃ１８－ＰＥＧ、またはＰＥＧ－Ｃ１８）（平均分子量２０００のＰＥＧ）
ＰＥＧ－ｃＤＭＡ：ＰＥＧ－カルバモイル－１，２－ジミリスチルオキシプロピルアミン（平均分子量２０００のＰＥＧ）
製剤を含むＳＮＡＬＰ（ｌ，２－ジリノレニルオキシ－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ））は、２００９年４月１５日に出願された国際公開第２００９／１２７０６０号に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
製剤を含むＸＴＣは、例えば、２００９年１月２９日に出願された米国特許仮出願第６１／１４８，３６６号、２００９年３月２日に出願された米国特許仮出願第６１／１５６，８５１号、２００９年６月１０日に出願された米国特許仮出願第６１／１８５，７１２号、２００９年７月２４日に出願された米国特許仮出願第６１／２２８，３７３号、２００９年９月３日に出願された米国特許仮出願第６１／２３９，６８６号、および２０１０年１月２９日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１０／０２２６１４号に記載されており、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。
製剤を含むＭＣ３は、例えば、２００９年９月２２日に出願された米国特許仮出願第６１／２４４，８３４号、２００９年６月１０日に出願された米国特許仮出願第６１／１８５，８００号、および２０１０年６月１０日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／２８２２４号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
製剤を含むＡＬＮＹ－１００は、例えば、２００９年１１月１０日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０９／６３９３３号に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
製剤を含むＣ１２－２００は、２００９年５月５日に出願された米国特許仮出願第６１／１７５，７７０号、および２０１０年５月５日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１０／３３７７７号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。
Ｃ．カチオン性脂質の合成
本開示に特徴づけられる核酸脂質粒子に使用される化合物、例えば、カチオン性脂質などのいずれかは、公知の有機合成技術によって調製され得る。すべての置換基は、別段の示唆がない限り、以下に定義されるとおりである。
「アルキル」は、１～２４個の炭素原子を含有する直鎖状または分枝状の非環式または環式の飽和脂肪族炭化水素を意味する。代表的な飽和直鎖アルキルとしては、メチル、エチル、ｎ－プロピル、ｎ－ブチル、ｎ－ペンチル、ｎ－ヘキシルなどが挙げられ、一方で飽和分岐アルキルとしては、イソプロピル、ｓｅｃ－ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、イソペンチルなどが挙げられる。代表的な飽和環式アルキルとしては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルなどが挙げられ、不飽和環式アルキルとしては、シクロペンテニルおよびシクロヘキセニルなどが挙げられる。
「アルケニル」は、上記に定義される通り、隣接する炭素原子間に少なくとも一つの二重結合を含有するアルキルを意味する。アルケニルは、シスおよびトランス異性体の両方を含む。代表的な直鎖状および分岐状アルケニルとしては、エチレニル、プロピレニル、１－ブテニル、２－ブテニル、イソブチレニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、３－メチル－１－ブテニル、２－メチル－２－ブテニル、２，３－ジメチル－２－ブテニルなどが挙げられる。
「アルキニル」とは、上記で定義される通り、隣接する炭素間に少なくとも一つの三重結合を追加で含む任意のアルキルまたはアルケニルを意味する。代表的な直鎖状および分枝状アルキニルとしては、アセチルエニル、プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、３－メチル－１ブチニルなどが挙げられる。
「アシル」とは、以下に定義されるように、結合点における炭素がオキソ基で置換されている、任意のアルキル、アルケニル、またはアルキニルを意味する。例えば、－Ｃ（＝Ｏ）アルキル、－Ｃ（＝Ｏ）アルケニル、および－Ｃ（＝Ｏ）アルキニルは、アシル基である。
「複素環」は、飽和、不飽和、または芳香族のいずれかであり、窒素、酸素、および硫黄から独立して選択される１個または２個のヘテロ原子を含有する、５～７員の単環、または７～１０員の二環の複素環式環を意味し、窒素および硫黄ヘテロ原子は随意に酸化され得、窒素ヘテロ原子は随意に四級化され得、上記の複素環のいずれかがベンゼン環に縮合される二環式環を含む。複素環は、任意のヘテロ原子または炭素原子を介して結合されてもよい。複素環は、以下に定義されるヘテロアリールを含む。複素環としては、モルホリニル、ピロリジノニル、ピロリジニル、ピペリジニル、ピペリジニル（ｐｉｐｅｒｉｚｙｎｙｌ）、ヒダントイニル、バレロラクタミル、オキシラニル、オキセタニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロピリジニル、テトラヒドロプリミジニル（ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｒｉｍｉｄｉｎｙｌ）、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニル、テトラヒドロピリミジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロチオピラニルなどが挙げられる。
「随意に置換されるアルキル」、「随意に置換されるアルケニル」、「随意に置換されるアルキニル」、「随意に置換されるアシル」、および「随意に置換される複素環」という用語は、置換されたとき、少なくとも一つの水素原子が置換基で置換されることを意味する。オキソ置換基（＝Ｏ）の場合、二つの水素原子が置換される。この点に関して、置換基としては、オキソ、ハロゲン、複素環、－ＣＮ、－ＯＲｘ、‐ＮＲｘＲｙ、‐ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ 、‐ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、‐Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、‐Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、‐Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎＲｘおよび‐ＳＯｎＮＲｘ Ｒｙが挙げられ、式中、ｎは０、１または２であり、ＲｘおよびＲｙは、同一であるかまたは異なり、かつ独立して水素、アルキルまたは複素環であり、ならびに先述のアルキルおよび複素環置換基の各々は、オキソ、ハロゲン、－ＯＨ、－ＣＮ、アルキル、－ＯＲｘ、複素環、‐ＮＲｘＲｙ、‐ＮＲｘＣ（＝Ｏ）Ｒｙ 、－ＮＲｘＳＯ２Ｒｙ、‐Ｃ（＝Ｏ）Ｒｘ、‐Ｃ（＝Ｏ）ＯＲｘ、‐Ｃ（＝Ｏ）ＮＲｘＲｙ、－ＳＯｎ Ｒｘおよび‐ＳＯｎ ＮＲｘ Ｒｙのうちの一つ以上でさらに置換されてもよい。
「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを意味する。
いくつかの実施形態では、本開示に特徴付けられる方法は、保護基の使用を必要とし得る。保護基の方法論は、当業者に周知である（例えば、ＰＲＯＴＥＣＴＩＶＥ ＧＲＯＵＰＳ ＩＮ ＯＲＧＡＮＩＣ ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ，Ｇｒｅｅｎ，Ｔ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｃｉｔｙ，１９９９を参照）。簡潔に述べると、本開示の文脈内の保護基は、官能基の望ましくない反応性を低減または除去する任意の基である。保護基は、特定の反応中にその反応性を隠すために官能基に添加され、次いで除去されて元の官能基を明らかにすることができる。いくつかの実施形態では、「アルコール保護基」が使用される。「アルコール保護基」は、アルコール官能基の望ましくない反応性を低減または除去する任意の基である。保護基は、当該技術分野で周知の技術を使用して添加および除去することができる。
式Ａの合成
いくつかの実施形態では、本開示で特徴づけられる核酸脂質粒子は、式Ａ：
のカチオン性脂質を使用して製剤化され、
式中、Ｒ１およびＲ２は独立して、アルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、各々は随意に置換され得、Ｒ３およびＲ４は独立して、より低いアルキルであるか、またはＲ３およびＲ４は一緒になって、随意に置換された複素環式環を形成することができる。いくつかの実施形態では、カチオン性脂質は、ＸＴＣ（２，２－ジリノレイル－４－ジメチルアミノエチル－［１，３］－ジオキソラン）である。概して、上記の式Ａの脂質は、以下の反応スキーム１または２によって作製されてもよく、すべての置換基は、別段の示唆がない限り、上記に定義したとおりである。
スキーム１
Ｒ１およびＲ２が独立してアルキル、アルケニル、またはアルキニルであり、各々が随意に置換され得、Ｒ３およびＲ４が独立して低いアルキルであるか、またはＲ３およびＲ４が一緒になって、随意に置換された複素環を形成することができる脂質Ａは、スキーム１に従って調製され得る。ケトン１および臭化物２は、当業者に公知の方法に従って購入または調製することができる。１および２の反応により、ケタール３が得られる。ケタール３をアミン４で処理すると、式Ａの脂質が得られる。式Ａの脂質は、式５の有機塩を有する対応するアンモニウム塩に変換することができ、式中、Ｘはハロゲン、水酸化物、ホスフェート、スルフェートなどから選択されるアニオン対イオンである。
スキーム２
あるいは、ケトン１出発材料は、スキーム２に従って調製することができる。グリニャール試薬６およびシアニド７は、当業者に公知の方法に従って購入または調製することができる。６および７の反応により、ケトン１が得られる。ケトン１から式Ａの対応する脂質への変換は、スキーム１に記載されるとおりである。
ＭＣ３の合成
ＤＬｉｎ－Ｍ－Ｃ３－ＤＭＡ（例えば、（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－イル－４－（ジメチルアミノ）ブタノエート）の調製は以下の通りである。ジクロロメタン（５ｍＬ）中の（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）－ヘプタトリアコンタ－６，９，２８，３１－テトラエン－１９－オール（０．５３ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノ酪酸塩酸塩（０．５１ｇ）、４－Ｎ，Ｎ－ジメチルアミノピリジン（０．６１ｇ）および１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（０．５３ｇ）の溶液を室温で一晩撹拌した。溶液を希塩酸で洗浄し、続いて、希炭酸水素ナトリウム水溶液で洗浄した。有機画分を無水硫酸マグネシウムで乾燥させ、濾過し、溶媒をロトバップ上で除去した。残留物を、１～５％メタノール／ジクロロメタン溶出勾配を使用してシリカゲルカラム（２０ｇ）に通した。精製生成物を含む画分を合わせ、溶媒を除去して、無色の油（０．５４ｇ）を得た。
ＡＬＮＹ－１００の合成
ケタール５１９［ＡＬＮＹ－１００］の合成を、以下のスキーム３を使用して行った。
５１５の合成：
二首ＲＢＦ（１Ｌ）中の２００ｍｌの無水ＴＨＦ中のＬｉＡｌＨ４（３．７４ｇ、０．０９８５２ｍｏｌ）の撹拌懸濁液に、窒素雰囲気下で０ ０Ｃで７０ｍＬのＴＨＦ中の５１４（１０ｇ、０．０４９２６ｍｏｌ）の溶液を緩徐に添加した。完全に添加した後、反応混合物を室温まで加温し、次いで４時間加熱還流した。反応の進行をＴＬＣによって観察した。反応の完了後（ＴＬＣによる）、混合物を０°Ｃに冷却し、飽和Ｎａ２ＳＯ４溶液を慎重に添加してクエンチした。反応混合物を室温で４時間撹拌し、濾過した。残渣をＴＨＦでよく洗浄した。濾液および洗浄液を混合し、４００ｍＬのジオキサンおよび２６ｍＬの濃縮（ｃｏｎｃ．）ＨＣＩで希釈し、室温で２０分間撹拌した。揮発性物質を真空下で除去して、白色固体として５１５の塩酸塩を得た。収率：７．１２ｇ １Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：δ＝９．３４（ブロード，２Ｈ），５．６８（ｓ，２Ｈ），３．７４（ｍ，１Ｈ），２．６６－２．６０（ｍ，２Ｈ），２．５０－２．４５（ｍ，５Ｈ）。
５１６の合成：
２５０ｍＬの二首ＲＢＦ中の１００ｍＬの乾燥ＤＣＭ中の化合物５１５の撹拌溶液に、ＮＥｔ３（３７．２ｍＬ、０．２６６９ｍｏｌ）を添加し、窒素雰囲気下で０°Ｃに冷却した。５０ｍＬの乾燥ＤＣＭ中のＮ－（ベンジルオキシ－カルボニルオキシ）－スクシンイミド（２０ｇ、０．０８００７ｍｏｌ）を緩徐に添加した後、反応混合物を室温まで加温した。反応完了後（ＴＬＣにより２～３時間）、混合物を１Ｎ ＨＣｌ溶液（１×１００ｍＬ）および飽和ＮａＨＣＯ３溶液（１×５０ｍＬ）で連続的に洗浄した。次いで、有機層を無水 Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて粗物質を得、これをシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製して、５１６を粘着性の塊として得た。収量：１１ｇ（８９％）。１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３， ４００ＭＨｚ）：δ＝７．３６－７．２７（ｍ，５Ｈ），５．６９（ｓ，２Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），４．９６（ｂｒ．，１Ｈ）２．７４（ｓ，３Ｈ），２．６０（ｍ，２Ｈ），２．３０－２．２５（ｍ，２Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］－２３２．３（９６．９４％）。
５１７Ａおよび５１７Ｂの合成：
シクロペンテン５１６（５ｇ、０．０２１６４ｍｏｌ）を、単一首５００ｍＬのＲＢＦ中の２２０ｍＬのアセトンおよび水（１０：１）の溶液中に溶解させ、それにＮ－メチルモルホリン－Ｎ－オキシド（７．６ｇ、０．０６４９２ｍｏｌ）、続いて、４．２ｍＬのＯｓＯ４（０．２７５ｇ、０．００１０８ｍｏｌ）の７．６％のｔｅｒｔ－ブタノール溶液を室温で添加した。反応が完了した後（約３時間）、固体Ｎａ２ＳＯ３を添加して混合物をクエンチし、得られた混合物を室温で１．５時間撹拌した。反応混合物をＤＣＭ（３００ｍＬ）で希釈し、水（２×１００ｍＬ）、続いて飽和ＮａＨＣＯ３（１×５０ｍＬ）溶液、水（１×３０ｍＬ）、最後にブライン（１×５０ｍＬ）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、溶媒を真空中で除去した。粗材料のシリカゲルカラムクロマトグラフィー精製により、ジアステレオマーの混合物を得、これを分取ＨＰＬＣにより分離した。収量：－６ｇ粗
５１７Ａ－Ｐｅａｋ－１（白色固体）、５．１３ｇ（９６％）。１Ｈ－ＮＭＲ（ＤＭＳＯ，４００ＭＨｚ）：δ＝７．３９－７．３１（ｍ，５Ｈ），５．０４（ｓ，２Ｈ），４．７８－４．７３（ｍ，１Ｈ），４．４８－４．４７（ｄ，２Ｈ），３．９４－３．９３（ｍ，２Ｈ），２．７１（ｓ，３Ｈ），１．７２－１．６７（ｍ，４Ｈ）。ＬＣ－ＭＳ－［Ｍ＋Ｈ］－２６６．３、［Ｍ＋ＮＨ４＋］－２８３．５存在、ＨＰＬＣ－９７．８６％。Ｘ線検査により立体化学が確認された。
５１８の合成：
化合物５０５の合成について記載した手順と類似の手順を使用して、化合物５１８（１．２ｇ、４１％）を無色の油として得た。１Ｈ－ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３， ４００ＭＨｚ）：δ＝７．３５－７．３３（ｍ，４Ｈ），７．３０－７．２７（ｍ，１Ｈ），５．３７－５．２７（ｍ，８Ｈ），５．１２（ｓ，２Ｈ），４．７５（ｍ，１Ｈ），４．５８－４．５７（ｍ，２Ｈ），２．７８－２．７４（ｍ，７Ｈ），２．０６－２．００（ｍ，８Ｈ），１．９６－１．９１（ｍ，２Ｈ），１．６２（ｍ，４Ｈ），１．４８（ｍ，２Ｈ），１．３７－１．２５（ｂｒ ｍ，３６Ｈ），０．８７（ｍ，６Ｈ）。ＨＰＬＣ－９８．６５％。
化合物５１９の合成についての一般的手順：
ヘキサン（１５ｍＬ）中の化合物５１８（１当量）の溶液を、ＴＨＦ（１Ｍ、２当量）中のＬＡＨの氷冷溶液に滴下様式で添加した。完全添加後、混合物を０．５時間にわたって４０ｏＣで加熱し、次いで氷浴上で再び冷却した。混合物を飽和Ｎａ２ＳＯ４水溶液で慎重に加水分解し、次いでセライトを通して濾過し、油に還元した。カラムクロマトグラフィーは、純粋な５１９（１．３ｇ、６８％）を提供し、これを無色の油として得た。１３Ｃ ＮＭＲ＝１３０．２， １３０．１（ｘ２），１２７．９（ｘ３），１１２．３， ７９．３， ６４．４， ４４．７， ３８．３， ３５．４， ３１．５， ２９．９（ｘ２）， ２９．７， ２９．６（ｘ２）， ２９．５（ｘ３）， ２９．３（ｘ２），２７．２（ｘ３），２５．６， ２４．５， ２３．３， ２２６， １４．１；エレクトロスプレーＭＳ（＋ｖｅ）：Ｃ４４Ｈ８０ＮＯ２の分子量（Ｍ＋Ｈ）＋計算値６５４．６、実測値６５４．６。
標準的な方法または押出し成形のない方法のいずれかによって調製された製剤は、同様の様式で特徴付けられ得る。例えば、製剤は通常、目視検査によって特徴付けられる。これらは、凝集体または沈殿物を含まない、白っぽい半透明の溶液であるべきである。脂質ナノ粒子の粒子径および粒子径の分布は、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ，ＵＳＡ）を使用した光散乱によって測定することができる。粒子は、例えば４０～１００ｎｍのサイズなど、約２０～３００ｎｍであるべきである。粒子径の分布は、単峰性であるべきである。製剤中の総ｄｓＲＮＡ濃度、ならびに閉じ込められた画分を、色素排除アッセイを使用して推定する。製剤化されたｄｓＲＮＡの試料は、製剤破壊界面活性剤、例えば、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００の存在下または非存在下で、リボグリーン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）などのＲＮＡ結合染料とインキュベートすることができる。製剤中の総ｄｓＲＮＡは、標準曲線に対する、界面活性剤を含有する試料からのシグナルによって決定することができる。閉じ込められた画分は、総ｄｓＲＮＡ含有量から「遊離」ｄｓＲＮＡ含有量（界面活性剤の非存在下でシグナルによって測定される）を減算することによって決定される。閉じ込められたｄｓＲＮＡの割合は、典型的には＞８５％である。ＳＮＡＬＰ製剤の場合、粒子径は、少なくとも３０ｎｍ、少なくとも４０ｎｍ、少なくとも５０ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも７０ｎｍ、少なくとも８０ｎｍ、少なくとも９０ｎｍ、少なくとも１００ｎｍ、少なくとも１１０ｎｍ、および少なくとも１２０ｎｍである。好適な範囲は、典型的には、少なくとも約５０ｎｍ～少なくとも約１１０ｎｍ、少なくとも約６０ｎｍ～少なくとも約１００ｎｍ、または少なくとも約８０ｎｍ～少なくとも約９０ｎｍである。
経口投与のための組成物および製剤には、粉末または顆粒、微粒子、ナノ粒子、水または非水性媒体中の懸濁剤または溶液、カプセル剤、ゲルカプセル剤、サシェ剤、錠剤またはミニ錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が、望ましい場合がある。いくつかの実施形態では、経口製剤は、本開示において取り上げるｄｓＲＮＡが一つ以上の浸透促進剤、界面活性剤、およびキレート化剤と共に投与される製剤である。好適な界面活性剤としては、脂肪酸および／またはエステルもしくはその塩、胆汁酸および／またはその塩が挙げられる。好適な胆汁酸／塩としては、ケノデオキシコール酸（ＣＤＣＡ）およびウルソデオキシケノデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、コール酸、デヒドロコール酸、デオキシコール酸、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、グリコデオキシコール酸、タウロコール酸、タウロデオキシコール酸、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウムおよびグリコジヒドロフシジン酸ナトリウムが挙げられる。好適な脂肪酸としては、アラキドン酸、ウンデカン酸、オレイン酸、ラウリン酸、カプリル酸、カプリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン、ジラウリン、１－モノカプリン酸グリセリル、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、またはモノグリセリド、ジグリセリド、またはその薬学的に許容可能な塩（例えば、ナトリウム）が挙げられる。いくつかの実施形態では、浸透促進剤の組合せが用いられ、例えば、胆汁酸／塩と組み合わせた脂肪酸／塩である。例示的な組み合わせの一つには、ラウリン酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩がある。さらに、浸透促進剤としては、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン－２０－セチルエーテルが挙げられる。本開示において取り上げるｄｓＲＮＡは、噴霧された乾燥粒子などの粒状形態で、経口で送達することができ、またはマイクロ粒子またはナノ粒子を形成するために複合体化することができる。ｄｓＲＮＡ複合体化薬剤としては、ポリ－アミノ酸、ポリイミン、ポリアクリレート、ポリアルキルアクリレート、ポリオキシエタン、ポリアルキルシアノアクリレート、カチオン化ゼラチン、アルブミン、デンプン、アクリレート、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびデンプン、ポリアルキルシアノアクリレート、ＤＥＡＥ誘導ポリイミン、プルラン（ｐｏｌｌｕｌａｎ）、セルロースおよびデンプンが挙げられる。好適な複合体化薬剤としては、キトサン、Ｎ－トリメチルキトサン、ポリ－Ｌ－リシン、ポリヒスチジン、ポリオルニチン、ポリスペルミン、プロタミン、ポリビニルピリジン、ポリチオジエチルアミノメチルエチレンＰ（ＴＤＡＥ）、ポリアミノスチレン（例えば、ｐ－アミノ）、ポリ（メチルシアノアクリレート）、ポリ（エチルシアノアクリレート）、ポリ（ブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソブチルシアノアクリレート）、ポリ（イソヘキシルシアノアクリレート）、ＤＥＡＥ－メタクリレート、ＤＥＡＥ－ヘキシルアクリレート、ＤＥＡＥ－アクリルアミド、ＤＥＡＥ－アルブミン、およびＤＥＡＥデキストラン、ポリメチルアクリレート、ポリヘキシルアクリレート、ポリ（Ｄ，Ｌ－乳酸）、ポリ（ＤＬ－乳酸－コ－グリコール酸（ＰＬＧＡ）、アルギン酸塩、およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられる。ｄｓＲＮＡの経口製剤およびその調製は、米国特許第６，８８７，９０６号、米国特許出願公開第２００３００２７７８０号、および米国特許第６，７４７，０１４号に詳細に記載されており、その各々は参照により本明細書に組み込まれる。
非経口、実質内（脳内へ）、髄腔内、硝子体内、網膜下、経強膜内、結膜下、球後、前房内、脳室内、または肝内への投与のための組成物および製剤は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤、例えばこれらに限定されるものではないが、浸透促進剤、担体化合物、および他の薬学的に許容可能な担体または賦形剤などを含むことができる滅菌水溶液を含むことができる。
本開示の医薬組成物は、これに限定されるものではないが、溶液、エマルション、およびリポソームを含有する製剤を含む。これら組成物は、予め形成した液体、自己乳化型固体、および自己乳化型半固体を含めるがこれらに限定されない様々な構成要素から生成され得る。
本開示において特徴づけられる医薬製剤は、単位剤形において簡便にもたらされ得、製薬産業において周知の従来技術に従って調製することができる。こうした技術としては、活性成分を医薬担体または賦形剤と会合させる工程を含む。概して、製剤は、有効成分を液体担体または微粉化された固体担体またはその両方と均一にかつ密接に混合し、次いで、必要であれば、生成物を成形することによって調製される。
本開示において特徴づけられる組成物は、例えば、これらに限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、ゲルカプセル剤、液体シロップ剤、軟質ゲル剤、坐剤、および浣腸剤などの多くの可能な剤形のいずれかへと製剤化され得る。組成物は、水性媒体、非水性媒体、または混合媒体中の懸濁剤として製剤化することもできる。水性懸濁剤は、懸濁剤の粘度を増加させる物質を、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランなどをさらに含有し得る。懸濁剤はまた、安定剤を含有し得る。
Ｄ．さらなる製剤
ｉ．エマルション
本開示の組成物は、エマルションとして調製および製剤化されてもよい。エマルションは、典型的には、一方の液体が、もう一方の液体中に分散した不均一系であり、通常直径０．１μｍを超える液滴の形態である（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ ２，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１を参照）。エマルションは、多くの場合、互いに密に混合し分散した二つの不混和性液相を含む二相系である。概して、エマルションは、油中水型（ｗ／ｏ）または水中油型（ｏ／ｗ）のいずれかのものであり得る。水相が、細かく分かれて微細な液滴として大量の油相中に分散している場合、その結果として得られる組成物を、油中水型（ｗ／ｏ）エマルションと呼ぶ。あるいは、油相が、細かく分かれて微細な液滴として大量の水相中に分散している場合、その結果として得られる組成物を、水中油型（ｏ／ｗ）エマルションと呼ぶ。エマルションは、分散相と、水相、油相、または別個の相としてのそれ自体のいずれかの中に溶液として存在し得る活性薬物とに加えて、追加的な成分を含有し得る。乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤などの医薬賦形剤も、必要に応じてエマルション中に存在していてもよい。医薬エマルションは、例えば、油中水中油型（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水型（ｗ／ｏ／ｗ）エマルションの場合などで、二相以上で構成される多相エマルションでもあってもよい。こうした複合剤形によれば、多くの場合、単純な二相エマルションでは与えられない一定の利点がもたらされる。ｗ／ｏ／ｗエマルションは、ｏ／ｗエマルションの個々の油滴が小水滴を封入する多相エマルションにより構成される。同様に、ｏ／ｗ／ｏエマルションは、連続油相中で安定化した水の小滴中に封入された油滴の系によりもたらされる。
エマルションは、熱力学的安定性がほとんどないかまたは全くないことが特徴である。多くの場合、エマルションの分散相または不連続相は、外部相または連続相中に良好に分散しており、乳化剤によって、または製剤の粘度によってこの形態で維持される。エマルション形態の軟膏基剤およびクリーム剤の場合と同様に、エマルションの相のいずれかは、半固体または固体であり得る。エマルションを安定化させる他の手段としては、該エマルションのいずれかの相に組み込まれ得る乳化剤の使用を必要とする。乳化剤は、以下の四つのカテゴリ、合成界面活性剤、天然乳化剤、吸収基剤、および微細分散固体、に大きく分類することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。
表面活性剤としても知られる合成界面活性剤は、エマルションの剤形において広い適用可能性が見出されており、文献において検討されてきている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。界面活性剤は、典型的には両親媒性であり、親水性部分および疎水性部分を含む。界面活性剤の疎水性に対する親水性の比は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と命名されており、製剤の調製において界面活性剤を分類および選択する際の有益なツールである。界面活性剤は、親水性基の性質に基づいて以下の異なるクラス、非イオン性、アニオン性、カチオン性、および両性に分類することができる（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ Ｒｉｅｇｅｒ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２８５を参照）。
エマルション製剤において使用される天然の乳化剤としては、ラノリン、蜜蝋、ホスファチド、レシチン、およびアカシアが挙げられる。吸収基剤は、親水特性を有するため、それらは水を吸収してｗ／ｏエマルションを形成し、それでもなおそれらの半固体の稠度を維持することができるものであり、例えば無水ラノリンおよび親水ワセリンなどである。微粒子となった固体も、とりわけ界面活性剤との併用で、および粘性調製物として、良好な乳化剤として使用されている。これらとしては、例えば重金属水酸化物などである極性無機固体、非膨潤性粘土、例えばベントナイト、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モンモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウムおよびコロイド状ケイ酸アルミニウムマグネシウムなど、顔料、および非極性固体、例えば炭素またはトリステアリン酸グリセリルなどが挙げられる。
非常に多様な非乳化材料もまた、エマルション製剤に含まれて、エマルションの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪アルコール、脂肪酸エステル、湿潤剤、親水性コロイド、防腐剤、および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９）。
親水性コロイドまたはハイドロコロイドとしては、天然ゴムおよび合成ポリマー、例えば多糖（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラゲナン、グアーガム、カラヤガム、およびトラガント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロースおよびカルボキシプロピルセルロース）、および合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエステル、およびカルボキシビニルポリマー）が挙げられる。これらは水中で分散または膨潤して、コロイド状溶液を形成し、それが、分散相液滴の周囲に強力な界面膜を形成することと、外側相の粘度を増加させることとによって、エマルションを安定化する。
エマルションは、多くの場合、微生物の増殖を容易に支援することができる多くの成分、例えば炭水化物、タンパク質、ステロールおよびホスファチドなどを含有し、これら製剤はしばしば、防腐剤を組み込んでいる。エマルション製剤に含まれる通常使用される防腐剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンザルコニウム、ｐ－ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。製剤の劣化を防止するために、通常、抗酸化剤もエマルション製剤に加えられる。使用される抗酸化剤は、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンなどであるフリーラジカル捕捉剤、またはアスコルビン酸およびメタ重亜硫酸ナトリウムなどである還元剤、ならびにクエン酸、酒石酸およびレシチンなどである酸化防止共力薬であり得る。
経皮、経口、および非経口経路によるエマルション製剤の適用ならびにそれらの製造方法は、文献において検討されてきている（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。経口送達用のエマルション製剤は、製剤化の容易さ、ならびに吸収およびバイオアベイラビリティの見地からの有効性を理由に、非常に広く使用されてきた（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．１９９を参照）。ｏ／ｗエマルションとして通常は経口投与されている材料の中には、鉱油系の緩下剤、脂溶性ビタミン、および高脂肪栄養製剤がある。
本開示のいくつかの実施形態では、ｉＲＮＡよび核酸の組成物は、マイクロエマルションとして製剤化される。マイクロエマルションは、単一の、光学的等方性で熱力学的に安定した液体溶液である、水、油、および両親媒性物質の系として規定され得る（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５を参照）。典型的には、マイクロエマルションは、はじめに油を界面活性剤水溶液に分散させ、次いで十分な量の第四の成分、概して中鎖のアルコール、を加えて透明な系を形成することによって調製される系である。したがって、マイクロエマルションはまた、表面活性分子の界面膜によって安定化される、二つの不混和性液体の熱力学的に安定で同位体的に透明な分散液として説明されてもいる（Ｌｅｕｎｇ ａｎｄ Ｓｈａｈ，ｉｎ： Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ： Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ Ａｇｇｒｅｇａｔｅ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，Ｅｄ．，１９８９，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐａｇｅｓ １８５－２１５）。マイクロエマルションは、通常、油、水、界面活性剤、コサーファクタント、および電解質を含めた三から五の成分を組み合わせることによって調製される。マイクロエマルションが油中水（ｗ／ｏ）型または水中油（ｏ／ｗ）型のいずれであるかは、使用する油および界面活性剤の特性ならびに界面活性剤分子の極性の頭と炭化水素の尾との構造および幾何学的パッキングに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，ｉｎ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
状態図を利用する現象学的アプローチが、広く研究されており、それはマイクロエマルションをどのようにして製剤化するかの包括的な知識を当業者に与えた（例えば、Ａｎｓｅｌ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｌｌｅｎ，ＬＶ．，Ｐｏｐｏｖｉｃｈ ＮＧ．，ａｎｄ Ａｎｓｅｌ ＨＣ．，２００４，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ（８ｔｈ ｅｄ．），Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｒｏｓｏｆｆ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ，ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ ａｎｄ Ｂａｎｋｅｒ（Ｅｄｓ．），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，ｖｏｌｕｍｅ １，ｐ．３３５を参照）。従来のエマルションと比較して、マイクロエマルションは、水不溶性薬物を、自発的に形成された熱力学的に安定な液滴の製剤中で可溶化するという利点を提供する。
マイクロエマルションの調製において使用される界面活性剤としては、これらに限定されるものではないが、単独での、またはコサーファクタントと組み合わせた、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テ トラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ｄｅｃａｇｌｙｃｅｒｏｌ ｍｏｎｏｃａｐｒａｔｅ）（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセキオリエート（ｄｅｃａｇｌｙｃｅｒｏｌ ｓｅｑｕｉｏｌｅａｔｅ）（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が挙げられる。コサーファクタントは、通常、エタノール、１－プロパノールおよび１－ブタノールなどである単鎖アルコールであり、界面活性剤フィルムに浸透して、その結果界面活性剤分子の間で生じる空間を理由に乱れた膜が生じることによって、界面の流動性を増大させる働きをする。しかしながらマイクロエマルションは、コサーファクタントを用いずに調製することもでき、アルコールを含まない自己乳化性マイクロエマルション系は、当技術分野で公知である。水相は、典型的には、これらに限定されるものではないが、水、薬物の水溶液、グリセリン、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得る。油相としては、これらに限定されるものではないが、Ｃａｐｔｅｘ ３００、Ｃａｐｔｅｘ ３５５、Ｃａｐｍｕｌ ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８～Ｃ１２）モノ、ジ、およびトリグリセリド、ポリオキシエチル化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８～Ｃ１０グリセリド、植物油およびシリコーン油が挙げられ得る。
マイクロエマルションは、薬物可溶化および薬物吸収の向上の見地から、特に興味深い。脂質系マイクロエマルション（ｏ／ｗおよびｗ／ｏいずれも）は、薬物の経口バイオアベイラビリティを向上するために提案されてきたものであり、ペプチドが挙げられる（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号、第７，０６３，８６０号、第７，０７０，８０２号、第７，１５７，０９９号、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５－１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５を参照）。マイクロエマルションは、薬物の可溶化の向上、酵素加水分解からの薬物の保護、界面活性剤によって誘導される膜流動性および浸透性の変化に起因する薬物吸収の可能な増強、調製の容易さ、固体剤形よりも経口投与が容易であること、臨床効力の向上、および毒性の減少という利点をもたらす（例えば、米国特許第６，１９１，１０５号、第７，０６３，８６０号、第７，０７０，８０２号、第７，１５７，０９９号、Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８－１４３を参照）。多くの場合、マイクロエマルションは、それらの成分が周囲温度において一緒にされたときに自然発生的に形成され得る。これは、熱的不安定性の薬物であるペプチドまたはｉＲＮＡを製剤化する場合に、特に有利であり得る。さらにマイクロエマルションは、美容および医薬的な用途の両方で、活性成分の経皮送達にとっても有効であるとされている。本開示のマイクロエマルション組成物および製剤は、胃腸管からのｉＲＮＡおよび核酸の全身吸収の増加を促進し、ならびにｉＲＮＡおよび核酸の局所的な細胞取り込みの向上することとなることが予想される。
本開示のマイクロエマルションは、製剤の性質を向上させるため、および本開示のｉＲＮＡおよび核酸の吸収を高めるために、追加の成分および添加剤、例えばモノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ ３）、ラブラソール（Ｌａｂｒａｓｏｌ）、および浸透促進剤なども含有することができる。本開示のマイクロエマルションにおいて使用される浸透促進剤は、五つの広いカテゴリ、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤のうちの一つに属するとして分類され得る（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらクラスのそれぞれは、上記で説明している。
ｉｉ．浸透促進剤
いくつかの実施形態では、本開示は、核酸の、特にｉＲＮＡの、動物の皮膚への効率的な送達を有効にするために、様々な浸透促進剤を採用する。大部分の薬物は、イオン化形態および非イオン化形態の両方で溶液中に存在する。しかしながら、通常、脂溶性または親油性の薬剤のみが、細胞膜を容易に横断する。横断しようとする膜が、浸透促進剤で処理されていれば、非親油性薬剤であっても細胞膜を横断し得ることが分かっている。浸透促進剤はまた、非親油性薬剤が細胞膜を横断して拡散するのを補助することに加えて、親油性薬剤の透過性も高める。
浸透促進剤は、五つの広いカテゴリ、すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁塩、キレート剤、および非キレート非界面活性剤、のうちの一つに属するものとして分類することができる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）。浸透促進剤の上述のクラスのそれぞれについては、以下においてより詳細に説明される。
界面活性剤：本開示に関連して、界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液中に溶解されたとき、溶液の表面張力または水溶液と別の液体との間の界面張力を減少させ、結果として、粘膜を通過するｉＲＮＡの吸収を高める化学物質である。胆汁塩および脂肪酸に加えて、これら浸透促進剤としては、例えばラウリル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン－２０－セチルエーテル）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２を参照）、および過フルオロ化合物エマルション、例えばＦＣ－４３など Ｔａｋａｈａｓｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）、が挙げられる。
脂肪酸：浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸およびそれらの誘導体としては、例えばオレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（Ｎ－デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン（１－モノオレオイル－ｒａｃ－グリセリン）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、１－モノカプリン酸グリセリン、１－ドデシルアザシクロヘプタン－２－オン、アシルカルニチン、アシルコリン、そのＣ１－２０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ－ブチル）、およびそのモノ－グリセリドおよびジ－グリセリド（すなわち、オレイン酸塩、ラウホスフェート、カプホスフェート、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアホスフェート、リノール酸塩など）が挙げられる（例えば、Ｔｏｕｉｔｏｕ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｅｌ Ｈａｒｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１－６５４を参照）。
胆汁塩：胆汁の生理的役割としては、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が挙げられる（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｂｒｕｎｔｏｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３８ ｉｎ： Ｇｏｏｄｍａｎ ＆ Ｇｉｌｍａｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，９ｔｈ Ｅｄ．，Ｈａｒｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４－９３５を参照）。様々な天然の胆汁塩、およびそれらの合成誘導体が、浸透促進剤としての役割を果たす。したがって、用語「胆汁塩」は、胆汁の天然に存在する成分のいずれか、ならびにそれらの合成誘導体のいずれかを包含する。適切な胆汁塩としては、例えばコール酸（またはその薬学的に許容可能なナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（ｇｌｕｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（ｇｌｙｃｈｏｌｉｃ ａｃｉｄ）（グリココール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ－２４，２５－ジヒドロ－フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウムおよびポリオキシエチレン－９－ラウリルエーテル（ＰＯＥ）（例えば、Ｍａｌｍｓｔｅｎ，Ｍ．Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ ａｎｄ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｉｎｆｏｒｍａ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ，２００２；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ ３９ Ｉｎ： Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐａｇｅｓ ７８２－７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９－５８３を参照）が挙げられる。
キレート剤：キレート剤は、本開示に関連して使用する場合、金属イオンとの複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、結果として粘膜を通るｉＲＮＡの吸収を高める化合物として定義され得る。本開示における浸透促進剤としての使用に関して、ほとんどの特徴的なＤＮＡヌクレアーゼは、触媒作用のために二価金属イオンを必要とし、結果としてキレート剤によって阻害されるため、キレート剤は、ＤＮＡＳｅ阻害剤としても機能するさらなる利点を有する（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５－３３９）。好適なキレート剤としては、これらに限定されるものではないが、エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５－メトキシサリチレートおよびホモバニレート）、コラーゲンのＮ－アシル誘導体、β－ジケトンのラウレス－９およびＮ－アミノアシル誘導体（エナミン）が挙げられる（例えば、Ｋａｔｄａｒｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｆｏｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，２００６；Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３；Ｂｕｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３－５１を参照）。
非キレート非界面活性剤：本明細書で使用する場合、非キレート非界面活性剤である浸透促進剤は、キレート剤としてまたは界面活性剤として有意でない活性を示すが、それでもなお消化器粘膜を介したｉＲＮＡの吸収を増強する化合物として定義され得る（例えば、Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１－３３を参照）。この浸透促進剤の分類は、例えば不飽和環状尿素、１－アルキル－および１－アルケニルアザシクロ－アルカノン誘導体（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｃｒｉｔｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐａｇｅ ９２）、ならびに非ステロイド性抗炎症剤、例えばジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾンなど（Ｙａｍａｓｈｉｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１－６２６）が挙げられる。
細胞レベルでのｉＲＮＡの取り込みを増強する薬剤も、本開示の医薬組成物および他の組成物に加えることができる。例えば、カチオン性脂質、例えばリポフェクチンなど（Ｊｕｎｉｃｈｉ ｅｔ ａｌ、米国特許第５，７０５，１８８号）、カチオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子、例えばポリリジンなど（Ｌｏｌｌｏ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９７／３０７３１号）も、ｄｓＲＮＡの細胞取り込みを増強することが知られている。市販のトランスフェクション試薬の例としては、例えば、とりわけ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＤＭＲＩＥ－Ｃ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００ ＣＤ（商標）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（商標）、ＲＮＡｉＭＡＸ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ Ｑ２トランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ；Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＴＡＰリポソームトランスフェクション試薬（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＤＯＳＰＥＲリポソームトランスフェクション試薬（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、またはＦｕｇｅｎｅ（Ｇｒｅｎｚａｃｈｅｒｓｔｒａｓｓｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（登録商標）試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔ（商標）トランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－２０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ；Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）、Ｔｆｘ（商標）－５０試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社；マディソン ＷＩ）、ＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、ＥｃｏＴｒａｎｓｆｅｃｔ（ＯＺ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ；Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）、Ｔｒａｎｓｐａｓｓａ Ｄ１トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ；Ｉｐｓｗｉｃｈ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＬｙｏＶｅｃ（商標）／ＬｉｐｏＧｅｎ（商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＰｅｒＦｅｃｔｉｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＮｅｕｒｏＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＰＯＲＴＥＲ ２トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、サイトフェクチントランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＢａｃｕｌｏＰＯＲＴＥＲトランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＴｒｏｇａｎＰＯＲＴＥＲ（商標）トランスフェクション試薬（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＲｉｂｏＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＰｌａｓＦｅｃｔ（Ｂｉｏｌｉｎｅ；Ｔａｕｎｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）、ＵｎｉＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＳｕｒｅＦＥＣＴＯＲ（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＨｉＦｅｃｔ（商標）（Ｂ－Ｂｒｉｄｇｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）、が挙げられる。
投与された核酸の浸透を高めるために、他の薬剤が利用され得、他の薬剤としては、例えばグリコール、例えばエチレングリコールおよびプロピレングリコールなど、ピロール、例えば２－ピロールなど、アゾン、およびテルペン、例えばリモネンおよびメントンなどが挙げられる。
ｉｉｉ．担体
本開示の特定の組成物はまた、製剤中に担体化合物を組み込む。本明細書で使用される場合、「担体化合物」は、不活性（すなわち、それ自体は生物学的活性を有しない）であるが、例えば、生物学的に活性な核酸を分解するか、または循環からのその除去を促進することによって、生物学的活性を有する核酸の生物学的利用能を減少させるインビボプロセスによって核酸として認識される、核酸またはその類似体を指すことができる。核酸と担体化合物との、通常は後者の物質が過剰である同時投与は、おそらくは共通受容体についての担体化合物と核酸との間の競合に起因して、肝臓、腎臓、または他の循環外貯蔵部に回収される核酸の量の大幅な減少をもたらし得る。例えば、肝組織における部分ホスホロチオエートｄｓＲＮＡの回収は、ポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジン酸、または４－アセトアミド－４’イソチオシアノ－スチルベン－２，２’－ジスルホン酸と同時投与される場合に、低減され得る（Ｍｉｙａｏ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５－１２１；Ｔａｋａｋｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＤｓＲＮＡ ＆ Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７－１８３）。
ｉｖ．賦形剤
担体化合物とは対照的に、医薬担体または賦形剤は、例えば、一つ以上の核酸を動物に送達するための、薬学的に許容可能な溶媒、懸濁剤またはその他の薬理学的に不活性なビヒクルを含む。賦形剤は、液体または固体であり得、また核酸および所定の医薬組成物を他の成分と併用される場合に、所望の体積、稠度などをもたらするように計画された投与の様式を念頭において選択される。典型的な医薬担体としては、これらに限定されるものではないが、結合剤（例えば、予めゼラチン化されたトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、金属ステアリン酸塩、硬化植物油、コーンスターチ、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、デンプングリコール酸ナトリウムなど）、および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられる。
核酸と有害に反応しない、経口投与にとって好適な薬学的に許容可能な有機または無機の賦形剤も、本開示の組成物を製剤化するために使用することができる。好適な薬学的に許容可能な担体としては、これらに限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
核酸の局所投与用の製剤は、滅菌および非滅菌水溶液、アルコールなどの通常の溶媒中の非水溶液、または液体もしくは固体油基剤中の核酸の溶液を含み得る。溶液は、緩衝剤、希釈剤、および他の好適な添加剤も含有し得る。核酸と有害に反応しない、経口投与にとって好適な薬学的に許容可能な有機または無機の賦形剤を、使用することができる。
好適な薬学的に許容可能な賦形剤としては、これらに限定されるものではないが、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。
ｖ．他の成分
本開示の組成物は、医薬組成物中に従来見られる他の補助成分を、当技術分野において確立されたそれらの使用レベルにおいて、さらに含有し得る。したがって、例えば、組成物は、追加の適合性の、薬学的に活性な材料、例えば止痒剤、収斂剤、局部麻酔薬、もしくは抗炎症剤などを含有することができ、または本開示の組成物の様々な剤形を物理的に製剤化する際に有用な追加の材料、例えば色素、香味剤、防腐剤、酸化防止剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤などを含有することができる。ただし、そのような材料は、添加したときに本開示の組成物の成分の生物活性を過度に妨害すべきではない。製剤は、滅菌され、また所望により、例えば潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝剤、着色剤、香味剤、および／または芳香物質などである、製剤の核酸と有害に相互作用しない補助剤と混合され得る。
水性懸濁剤は、懸濁剤の粘度を増加させる物質を、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランなどを含有し得る。懸濁剤はまた、安定剤を含有し得る。
いくつかの実施形態では、本開示において取り上げられる医薬組成物は、（ａ）一つ以上のＲＮＡｉ化合物、および（ｂ）非ＲＮＡｉ機序で機能する一つ以上の生物剤を含む。こうした生物剤の例としては、ＭＹＯＣおよび少なくとも一つのＭＹＯＣ結合パートナーとの相互作用を妨げる薬剤が挙げられる。
こうした化合物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に致死的である用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に治療的に有効である用量）を決定するために、細胞培養物または実験動物における標準的な薬学的手順によって決定することができる。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数となり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す化合物が典型的である。
細胞培養アッセイおよび動物試験から得たデータは、ヒトにおける使用のための範囲の投与量を製剤化する際に使用することができる。本開示における本明細書において取り上げる組成物の投与量は、概して、ほとんど毒性がないかまたは毒性が全くないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、用いる剤形および利用する投与経路に応じて、この範囲内で変動し得る。本開示において取り上げる方法で使用する任意の化合物に対して、最初に、細胞培養アッセイから治療有効用量を見積もることができる。細胞培養において決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半量の阻害を達成する被験化合物の濃度）を含む、化合物、または適切な場合には、標的配列のポリペプチド産物の循環血漿濃度範囲を達成する（例えば、ポリペプチドの濃度減少を達成する）ように、ある用量を動物モデルにおいて製剤化することができる。こうした情報は、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって、測定することができる。
それらの投与に加えて、上述のように、本開示で特徴付けられるｉＲＮＡは、ＭＹＯＣ発現に関連する疾患または障害（例えば、緑内障、例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ））の治療に有効な他の公知の薬剤と組み合わせて投与することができる。いずれにしても、投与する医師は、当技術分野で公知であるかまたは本明細書で記載した、有効性の標準的尺度を使用して観察された結果に基づいて、ｉＲＮＡ投与の量およびタイミングを調整することができる。
ＶＩＩ．ＭＹＯＣの発現に関連する障害を治療する方法
本開示は、ＭＹＯＣ発現を阻害するための、および／またはＭＹＯＣ発現に関連する疾患、障害、もしくは病理学的プロセス（例えば、緑内障、例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ））を治療するための、ＭＹＯＣを標的とするｉＲＮＡの使用に関する。
一部の態様では、ＭＹＯＣの発現に関連する障害の治療方法が提供され、方法は、本明細書に開示されるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）を、それを必要とする対象に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、ＭＹＯＣ発現を阻害する（減少させる）。
いくつかの実施形態では、対象は、ＭＹＯＣ発現に関連する障害、例えば、緑内障、例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）のモデルとしての役割を果たす動物である。
Ａ．緑内障
いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣ発現に関連する障害は、緑内障である。本明細書に記述する方法を使用して治療可能な緑内障の非限定的な例は、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）を含む。
緑内障の臨床的および病理学的特徴には、視力喪失、視力の減少（例えば、光およびぼやけの周りのハロ））、および眼からの房水の漏出の減少が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、緑内障を有する対象は、１８歳未満である。いくつかの実施形態では、緑内障を有する対象は成人である。いくつかの実施形態では、緑内障を有する対象は、６０歳超である。いくつかの実施形態では、対象は、参照レベルと比較して、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルが上昇している、または上昇していると特定される（例えば、参照レベルよりも大きいＭＹＯＣのレベル）。
いくつかの実施形態では、緑内障は、対象からの試料（例えば、水性眼液試料）の分析を使用して診断される。いくつかの実施形態では、試料は、蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、免疫組織化学検査、ＭＹＯＣイムノアッセイ、電子顕微鏡、レーザー顕微解剖、および質量分析のうちの一つ以上から選択される方法を使用して分析される。いくつかの実施形態では、緑内障は、例えば、Ｇｏｌｄｍａｎｎ 圧平眼圧計、中心角膜厚（ＣＣＴ）の測定、自動静的閾値視野測定（例えば、ハンフリー視野分析）、ファン・ヘリック法、隅角鏡検査法、超音波生体顕微鏡検査および前部セグメント光干渉断層撮影（ＡＳ－ＯＣＴ）、血管造影（例えば、蛍光眼底血管造影またはインドシアニングリーン蛍光管造影）、網膜電図記録法 超音波検査法、パキメトリ、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）、コンピューター断層撮影（ＣＴ）および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、眼圧測定法、色覚検査法、視野検査法、細隙灯検査法、検眼鏡検査法、および身体検査（例えば、視力の評価（例えば、眼底検査または光干渉断層撮影（ＯＣＴ）による）などの、任意の適切な診断検査または技法を使用して診断される。。
Ｂ．併用療法
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｉＲＮＡ（例えば、ｄｓＲＮＡ）は、ＭＹＯＣ発現に関連する障害（緑内障、例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ））またはそのような障害の症状の治療に有効であることが知られている第二の療法（例えば、一つ以上の追加の療法）と組み合わせて投与される。ｉＲＮＡは、第二の療法の前、後、または同時に投与されてもよい。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、第二の療法の前に投与される。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、第二の療法の後に投与される。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、第二の療法と同時に投与される。
第二の療法は、追加の治療剤であってもよい。ｉＲＮＡおよび追加の治療剤は、同じ組成物中で組み合わせて投与することができ、または追加の治療剤は、別個の組成物の一部としても投与することができる。
いくつかの実施形態では、第二の療法は、障害または障害の症状を治療するのに有効な非ｉＲＮＡ治療剤である。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、療法と同時に投与される。
例示的な併用療法には、レーザー線維柱帯形成術、線維柱帯切除術、低侵襲性緑内障手術、眼への排液管の配置、経口薬または点眼薬が含まれるが、これらに限定されない。
投与量、経路、およびタイミング
対象（例えば、ヒト対象、例えば、患者）には、ｉＲＮＡの治療量を投与することができる。治療量は、例えば、０．０５～５０ｍｇ／ｋｇであり得る。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、標的器官、例えば、眼への送達のために製剤化される。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、脂質製剤、例えば、本明細書に記載されるＬＮＰ製剤として製剤化される。一部のこうした実施形態では、治療量は、０．０５～５ｍｇ／ｋｇのｄｓＲＮＡである。いくつかの実施形態では、脂質製剤、例えば、ＬＮＰ製剤は、静脈内投与される。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、例えば、本明細書に記載されるＧａｌＮＡｃコンジュゲートの形態である。一部のこうした実施形態では、治療量は、０．５～５０ｍｇのｄｓＲＮＡである。いくつかの実施形態では、例えば、ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、皮下投与される。
いくつかの実施形態では、投与は、例えば、毎日、隔週（すなわち、二週間ごと）など定期的に、一ヶ月、二ヶ月、三ヶ月、四ヶ月、六ヶ月、またはそれ以上の間、繰り返される。初回治療レジメンの後、治療は、より少ない頻度で施与することができる。例えば、隔週で三ヶ月間の投与後、投与は月に一回、六ヶ月間、または一年、またはそれ以上の期間、繰り返すことができる。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、二回以上の用量で投与される。いくつかの実施形態では、後続用量の数または量は、例えば、（ａ）ＭＹＯＣの発現もしくは活性を阻害もしくは低減する、（ｂ）ミスフォールドされたＭＹＯＣタンパク質のレベルを低減する、（ｃ）小柱網細胞死を低減する、（ｄ）眼圧を低減する、または（ｅ）視力を増加させる、などの所望の効果の達成に依存する、または例えば、障害に関連する一つ以上の症状の低減もしくは予防などの治療的もしくは予防的効果の達成に依存する。
いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、スケジュールに従って投与される。例えば、ｉＲＮＡ剤は、週一回、週二回、週三回、週四回、または週五回投与されてもよい。いくつかの実施形態では、スケジュールは、規則的に間隔を置いた投与、例えば、毎時、四時間毎、六時間毎、八時間毎、十二時間毎、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、５日毎、毎週、隔週、または毎月を含む。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、所望の効果を達成するために必要な頻度で投与される。
いくつかの実施形態では、スケジュールは、薬剤が投与されないより長い期間が続く、密接に間隔を置いた投与を伴う。例えば、スケジュールは、比較的短い期間（例えば、約６時間毎、約１２時間毎、約２４時間毎、約４８時間毎、または約７２時間毎）で投与され、その後、ｉＲＮＡ薬剤が投与されないより長い期間（例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、または約８週間）で投与される用量の初期セットを伴い得る。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、最初は一時間毎に投与され、その後、より長い間隔（例えば、毎週、隔週、または毎月）で投与される。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡ剤は、最初は毎日投与され、その後、より長い間隔（例えば、毎週、隔週、または毎月）で投与される。特定の実施形態では、より長い間隔は、経時的に増加するか、または所望の効果の達成に基づいて決定される。
ｉＲＮＡの全用量の投与の前に、患者は、より少ない用量で、例えば５％の注入用量で投与され、そして有害作用を、例えばアレルギー反応を、脂質のレベルや血圧の上昇について観察され得る。別の実施例では、患者は、望ましくない効果について監視され得る。
ＶＩＩＩ．ＭＹＯＣの発現を調節する方法
一部の態様では、本開示は、例えば、細胞、組織、または対象におけるＭＹＯＣの発現を調節する（例えば、阻害または活性化する）ための方法を提供する。いくつかの実施形態では、細胞または組織は、生体外、インビトロ、またはインビボである。いくつかの実施形態では、細胞または組織は、眼（例えば、小柱網組織、毛体様、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、網膜組織、星状細胞、周皮細胞、ミュラー細胞、神経節細胞、内皮細胞、光受容体細胞、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）、または例えば、脈絡膜血管などの脈絡膜組織）にある。いくつかの実施形態では、細胞または組織は、対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）にある。いくつかの実施形態では、対象（例えば、ヒト）は、本明細書に記載されるように、ＭＹＯＣ発現の発現に関連する障害のリスクがあるか、または障害があると診断される。
いくつかの実施形態では、方法は、細胞におけるＭＹＯＣの発現を減少させるのに有効な量で、細胞を本明細書に記載のｉＲＮＡと接触させることを含む。いくつかの実施形態では、細胞をＲＮＡｉ剤と接触させることは、細胞をインビトロでＲＮＡｉ剤と接触させること、または細胞をインビボでＲＮＡｉ剤と接触させることを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡｉ剤は、方法を実施する個人によって、細胞と物理的に接触するように置かれる、またはＲＮＡｉ剤は、その後に細胞と接触することを可能にするまたは引き起すであろう状況に置かれ得る。細胞をインビトロで接触させることは、例えば、細胞をＲＮＡｉ剤と共にインキュベートすることによって行われ得る。インビボで細胞を接触させることは、例えば、ＲＮＡｉ剤を細胞が位置する組織内またはその近くに注入することによって、またはＲＮＡｉ剤を別の領域、例えば、眼組織に注入することによって行われてもよい。例えば、ＲＮＡｉ剤は、目的の部位にＲＮＡｉ剤を向かわせるかまたはそうでなければ安定化させるリガンド、例えば、下記において説明され、例えば参照によりその全文が、親油性部分についての記載を含めて、本明細書に組み込まれる国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３１１７０号においてさらに詳述される親油性部分、を含み得るかまたはそれにカップリングされ得る。インビトロおよびインビボでの接触方法の組合せもまた可能である。例えば、細胞をインビトロにおいてＲＮＡｉ剤と接触させて、その後に対象に移してもよい。
ＭＹＯＣの発現は、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、ＭＹＯＣタンパク質の発現レベル、またはＭＹＯＣの発現レベルに機能的に連結された別のパラメータのレベルに基づいて評価され得る。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣの発現は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％阻害される。いくつかの実施形態では、ｉＲＮＡは、０．００１～０．０１ｎＭ、０．００１～０．１０ｎＭ、０．００１～１．０ｎＭ、０．００１～１０ｎＭ、０．０１～０．０５ｎＭ、０．０１～０．５０ｎＭ、０．０２～０．６０ｎＭ、０．０１～１．０ｎＭ、０．０１～１．５ｎＭ、０．０１～１０ｎＭの範囲内のＩＣ５０を有する。ＩＣ５０値は、適切な制御値、例えば、非標的化ｉＲＮＡのＩＣ５０に対して正規化され得る。
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載されるｉＲＮＡを細胞または組織に導入することと、ＭＹＯＣのｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間、細胞または組織を維持し、それによって、細胞または組織におけるＭＹＯＣの発現を阻害することと、を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載される組成物、例えば、ＭＹＯＣに結合するｉＲＮＡを含む組成物を、標的ＭＹＯＣの発現が、例えば、少なくとも二、三、四日、またはそれ以上、例えば、一週間、二週間、三週間、または四週間またはそれ以上など、長期間減少するように、哺乳動物に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣの発現の減少は、第一の投与の１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、または２４時間以内に検出可能である。
いくつかの実施形態では、方法は、標的ＭＹＯＣの発現が、例えば、未処理の動物と比較して少なくとも１０％増加するように、本明細書に記載の組成物を哺乳動物に投与することを含む。いくつかの実施形態では、ＭＹＯＣの活性化は、長期間、例えば、少なくとも二、三、四日またはそれ以上、例えば、一週間、二週間、三週間、四週間、またはそれ以上にわたって起こる。理論に束縛されることを望むものではないが、ｉＲＮＡは、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ転写物を安定化させるか、ゲノム中のプロモーターと相互作用させるか、またはＭＹＯＣ発現の阻害剤を阻害することによって、ＭＹＯＣ発現を活性化することができる。
本開示において特徴付けられる方法および組成物にとって有用なｉＲＮＡは、ＭＹＯＣのＲＮＡ（一次またはプロセシングされた）を特異的に標的とする。ｉＲＮＡを使用してＭＹＯＣの発現を阻害する組成物および方法は、本明細書の他の箇所で記載するように調製および実施され得る。
いくつかの実施形態では、方法は、ｉＲＮＡを含有する組成物を投与することを含み、ｉＲＮＡは、対象のＭＹＯＣのＲＮＡ転写物の少なくとも一部、例えば、治療される哺乳動物、例えば、ヒトに相補的であるヌクレオチド配列を含む。組成物は、眼（例えば、眼内）、局所、および静脈内投与を含むが、これらに限定されない、当技術分野で公知の任意の適切な手段によって投与され得る。
特定の実施形態では、組成物は、眼内で（例えば、硝子体内投与、例えば、硝子体内注射、経強膜内投与、例えば、経強膜内注射、結膜下投与、例えば、結膜下注射、球後投与、例えば、球後注射、前房内投与、例えば、前房内注射、または網膜下投与、例えば、網膜下注射によって）される。他の実施形態では、組成物は局所投与される。他の実施形態では、組成物は、静脈内への注入または注射によって投与される。
特定の実施形態では、組成物は、静脈内への注入または注射によって投与される。一部のこうした実施形態では、組成物は、静脈内注入用の脂質製剤化ｓｉＲＮＡ（例えば、ＬＮＰ１１製剤などのＬＮＰ製剤）を含む。
別段の定義がない限り、本明細書において使用するすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと類似または同等の方法および材料を、本開示において取り上げるｉＲＮＡおよび方法の実施または試験において使用できるが、適した方法および材料を以下に記載する。本明細書において言及する全ての公開公報、特許出願、特許および他の参考文献は、それらの全体が参照により組み込まれる。矛盾する場合には、定義を含めて、本明細書が統制することとなる。さらに、材料、方法および実施例は、単に例示的なものであり、限定することを意図するものではない。
具体的な実施形態
１．ミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、アンチセンス鎖内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的であるように、センス鎖は、ヒトＭＹＯＣのコード鎖の一部の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、アンチセンス鎖は、ヒトＭＹＯＣの非コード鎖の対応する部分の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、ｄｓＲＮＡ剤。
２．ヒトＭＹＯＣのコード鎖が、配列番号１の配列を含む、実施形態１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
３．ヒトＭＹＯＣの非コード鎖が、配列番号２の配列を含む、実施形態１または２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
４．ＭＹＯＣの発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、センス鎖が、アンチセンス鎖内の少なくとも１５個の連続するヌクレオチドに相補的であるように、アンチセンス鎖は、配列番号２のヌクレオチド配列の一部の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、ｄｓＲＮＡ剤。
５．センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の、０、または１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
５ａ．アンチセンス鎖は、二本鎖ＡＤ－１５６５８０４のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列と０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、二本鎖ＡＤ－１５６５８０４のセンス鎖ヌクレオチド配列と０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１～５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
５ｂ．アンチセンス鎖は、二本鎖ＡＤ－１５６５８３７のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列と０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、センス鎖は、二本鎖ＡＤ－１５６５８３７のセンス鎖ヌクレオチド配列と０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１～５ａのいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
６．ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、センス鎖がアンチセンス鎖中の少なくとも１７個の連続するヌクレオチドに相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列の一部の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１７個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１～５ｂのいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
７．センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の、０、または１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１７個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
８．ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、センス鎖がアンチセンス鎖中の少なくとも１９個の連続するヌクレオチドに相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列の一部の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１～７のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
９．センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
１０．ｄｓＲＮＡ剤は、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み、アンチセンス鎖は、センス鎖がアンチセンス鎖中の少なくとも２１個の連続するヌクレオチドに相補的であるように、配列番号２のヌクレオチド配列の一部の、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１～９のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１１．センス鎖が、配列番号１のヌクレオチド配列の対応する部分の、０、または１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１０に記載のｄｓＲＮＡ剤。
１２．センス鎖の部分が、表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つのセンス鎖内の部分である、実施形態１～１１のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１３．アンチセンス鎖の部分が、表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つのアンチセンス鎖内の部分である、実施形態１～１２のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１４．アンチセンス鎖が、表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるアンチセンス配列のうちの一つと、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１３のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１５．センス鎖が、アンチセンス配列に対応する表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるセンス配列と、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１４のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１６．アンチセンス鎖が、表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるアンチセンス配列のうちの一つと、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１７個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１７．センス鎖が、アンチセンス配列に対応する表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるセンス配列と、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１７個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１６のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１８．アンチセンス鎖が、表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるアンチセンス配列のうちの一つと、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１７のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１９．センス鎖が、アンチセンス配列に対応する表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるセンス配列と、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも１９個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１８のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
２０．アンチセンス鎖が、表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるアンチセンス配列のうちの一つと、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１～１９のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
２１．センス鎖が、アンチセンス配列に対応する表２Ａおよび２Ｂのうちのいずれか一つに列記されるセンス配列と、０、１、２、または３つのミスマッチを有する少なくとも２１個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、実施形態１～２０のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
２２．センス鎖が、少なくとも２３個のヌクレオチドの長さ、例えば、２３～３０個のヌクレオチドの長さである、実施形態１～２１のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
２３．センス鎖およびアンチセンス鎖のうちの少なくとも一つが、一つ以上の親油性部分にコンジュゲートされる、実施形態１～２２のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
２４．親油性部分が、ｄｓＲＮＡ剤の二本鎖領域における一つ以上の位置にコンジュゲートされる、実施形態２３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
２５．親油性部分が、リンカーまたは担体を介してコンジュゲートされる、実施形態２３または２４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
２６．親油性部分の親油性が、ｌｏｇＫｏｗによって測定され、０を超える、実施形態２３～２５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
２７．二本鎖ＲＮＡｉ剤の血漿タンパク質結合アッセイにおける非結合画分で測定された二本鎖ＲＮＡｉ剤の疎水性が、０．２を超える、実施形態１～２６のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
２８．血漿タンパク質結合アッセイが、ヒト血清アルブミンタンパク質を使用する電気泳動移動度シフトアッセイである、実施形態２７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
２９．ｄｓＲＮＡ剤が、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む、実施形態１～２８のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
３０．センス鎖のヌクレオチドの五個以下およびアンチセンス鎖のヌクレオチドの五個以下が、未修飾ヌクレオチドである、実施形態２９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
３１．センス鎖のすべてのヌクレオチドおよびアンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが、修飾を含む、実施形態２９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
３２．修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも一つが、デオキシ－ヌクレオチド、３’－末端デオキシ－チミジン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束されたエチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、ヌクレオチドを含む非天然の塩基、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、５’－ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド、および２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド、およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、実施形態２９～３１のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
３３．センス鎖ヌクレオチドのうちの五個以下、およびアンチセンス鎖のヌクレオチドのうちの五個以下が、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、アンロック核酸（ＵＮＡ）、またはグリセロール核酸（ＧＮＡ）以外の修飾を含む、実施形態２９～３１のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
３４．センス鎖の連続する二つのヌクレオチドの間、またはアンチセンス鎖の連続する二つのヌクレオチドの間に、非ヌクレオチドスペーサー（随意に、非ヌクレオチドスペーサーは、Ｃ３－Ｃ６アルキルを含む）を含む、実施形態１～３３のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
３５．各鎖が、３０ヌクレオチド以下の長さである、実施形態１～３４のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
３６．少なくとも一方の鎖が、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、実施形態１～３５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
３７．少なくとも一方の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、実施形態１～３６のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
３８．二本鎖領域が、１５～３０ヌクレオチド対の長さである、実施形態１～３７のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
３９．二本鎖領域が、１７～２３ヌクレオチド対の長さである、実施形態３８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
４０．二本鎖領域が、１７～２５ヌクレオチド対の長さである、実施形態３８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
４１．二本鎖領域が、２３～２７ヌクレオチド対の長さである、実施形態３８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
４２．二本鎖領域が、１９～２１ヌクレオチド対の長さである、実施形態３８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
４３．二本鎖領域が、２１～２３ヌクレオチド対の長さである、実施形態３８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
４４．各鎖が、１９～３０ヌクレオチドを有する、実施形態１～４３のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
４５．各鎖が、１９～２３ヌクレオチドを有する、実施形態１～４４のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
４６．各鎖が、２１～２３ヌクレオチドを有する、実施形態１～４５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
４７．薬剤が、少なくとも一つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を含む、実施形態１～４６のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
４８．ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、一方の鎖の３’末端にある、実施形態４７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
４９．鎖が、アンチセンス鎖である、実施形態４８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
５０．鎖が、センス鎖である、実施形態４８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
５１．ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合が、一方の鎖の５’末端にある、実施形態４７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
５２．鎖が、アンチセンス鎖である、実施形態５１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
５３．鎖が、センス鎖である、実施形態５１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
５４．一方の鎖の５’末端および３’末端の各々が、ホスホロチオエートまたはメチルホスホネートのヌクレオチド間連結を含む、実施形態４７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
５５．鎖が、アンチセンス鎖である、実施形態５４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
５６．二本鎖のアンチセンス鎖の５’末端の１位における塩基対が、ＡＵ塩基対である、実施形態１～５５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
５７．センス鎖は、合計２１のヌクレオチドを有し、アンチセンス鎖は、合計２３のヌクレオチドを有する、実施形態５４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
５８．一つ以上の親油性部分が、少なくとも一方の鎖上の一つ以上の内側位置にコンジュゲートされる、実施形態２３～５７のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
５９．一つ以上の親油性部分が、リンカーまたは担体を介して、少なくとも一方の鎖上の一つ以上の内側位置にコンジュゲートされる、実施形態５８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
６０．内側位置が、少なくとも一方の鎖の各末端から末端の二つの位置を除く全ての位置を含む、実施形態５９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
６１．内側位置が、少なくとも一方の鎖の各末端から末端の三つの位置を除く全ての位置を含む、実施形態５９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
６２．内側位置が、センス鎖の切断部位領域を除く、実施形態５９～６１のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
６３．内側位置が、センス鎖の５’末端から数えて９～１２位を除く全ての位置を含む、実施形態６２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
６４．内側位置が、センス鎖の３’末端から数えて１１～１３位を除く全ての位置を含む、実施形態６２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
６５．内側位置が、アンチセンス鎖の切断部位領域を除く、実施形態５９～６１のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
６６．内側位置が、アンチセンス鎖の５’末端から数えて１２～１４位を除く全ての位置を含む、実施形態６５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
６７．内側位置が、３’末端から数えてセンス鎖上の１１～１３位および５’末端から数えてアンチセンス鎖上の１２～１４位を除く全ての位置を含む、実施形態５９～６１のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
６８．一つ以上の親油性部分が、各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の４～８位および１３～１８位ならびにアンチセンス鎖上の６～１０位および１５～１８位からなる群から選択される一つ以上の内側位置にコンジュゲートされる、実施形態２３～６７のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
６９．一つ以上の親油性部分が、各鎖の５’末端から数えて、センス鎖上の５、６、７、１５および１７位ならびにアンチセンス鎖上の１５および１７位からなる群から選択される一つ以上の内側位置にコンジュゲートされる、実施形態６８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
７０．二本鎖領域における位置が、センス鎖の切断部位領域を除く、実施形態２４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
７１．センス鎖は、２１ヌクレオチドの長さであり、アンチセンス鎖は、２３ヌクレオチドの長さであり、また親油性部分は、センス鎖の２１位、２０位、１５位、１位、７位、６位もしくは２位、またはアンチセンス鎖の１６位にコンジュゲートされる、実施形態２３～７０のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
７２．親油性部分が、センス鎖の２１位、２０位、１５位、１位、または７位にコンジュゲートされる、実施形態７１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
７３．親油性部分が、センス鎖の２１位、２０位、または１５位にコンジュゲートされる、実施形態７１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
７４．親油性部分が、センス鎖の２０位、または１５位にコンジュゲートされる、実施形態７１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
７５．親油性部分が、アンチセンス鎖の１６位にコンジュゲートされる、実施形態７１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
７６．親油性部分が、センス鎖の５’末端から数えて、６位にコンジュゲートされる、実施形態７１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
７７．親油性部分が、脂肪族化合物、脂環式化合物、または多脂環式化合物である、実施形態２３～７６のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
７８．親油性部分が、脂質、コレステロール、レチノイン酸、コール酸、アダマンタン酢酸、１－ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３－ビス－Ｏ（ヘキサデシル）グリセロール、ゲラニルオキシヘキサノール、ヘキサデシルグリセロール、ボルネオール、メンソール、１，３－プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３－（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３－（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジンからなる群から選択される、実施形態７７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
７９．親油性部分が、飽和または不飽和Ｃ４～Ｃ３０炭化水素鎖と、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、スルホネート、ホスフェート、チオール、アジド、およびアルキンからなる群から選択される任意の官能基と、を含有する、実施形態７８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
８０．親油性部分が、飽和または不飽和Ｃ６～Ｃ１８炭化水素鎖を含有する、実施形態７９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
８１．親油性部分が、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有する、実施形態７９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
８２．親油性部分が、内側位置または二本鎖領域における一つ以上のヌクレオチドに置き換わる担体を介してコンジュゲートされる、実施形態２３～８１のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
８３．担体が、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される環式基であるか、またはセリノール骨格またはジエタノールアミン骨格系の非環式部分である、実施形態８２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
８４．親油性部分が、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド連結、クリック反応の生成物、またはカルバメートを含有するリンカーを介して二本鎖ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされる、実施形態２３～８１のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
８５．親油性部分が、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間連結にコンジュゲートされる、実施形態２３～８４のいずれか一つに記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
８６．親油性部分が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ジスルフィド、アミド、およびガラクトサミン、グルコサミン、グルコース、ガラクトース、マンノースの官能化された単糖またはオリゴ糖、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される生物切断可能なリンカーを介してコンジュゲートされる、実施形態２３～８５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
８７．センス鎖の３’末端は、アミンを有する環状基であるエンドキャップを介して保護され、環状基は、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、［１，３］ジオキソラニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルホリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフラニル、およびデカリニルからなる群から選択される、実施形態２３～８６のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
８８．例えば、眼組織または肝組織を標的とするリガンドなどの、標的化リガンドをさらに含む、実施形態２３～８７のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
８９．リガンドが、センス鎖にコンジュゲートされる、実施形態８８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
９０．リガンドが、センス鎖の３’末端または５’末端にコンジュゲートされる、実施形態８８または８９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
９１． リガンドが、センス鎖の３’末端にコンジュゲートされる、実施形態８８または８９に記載のｄｓＲＮＡ剤。
９２． 眼組織が、小柱網組織、毛体様、網膜組織、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管である、実施形態８８～９１のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
９３．標的化リガンドが、Ｎ－アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含む、実施形態８８～９１のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
９４． 標的化リガンドが、一つ以上のＧａｌＮＡｃコンジュゲートまたは一つ以上のもしくはＧａｌＮＡｃ誘導体である、実施形態８８～９１のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
９５．一つ以上のＧａｌＮＡｃコンジュゲートまたは一つ以上のＧａｌＮＡｃ誘導体が、一価のリカー、または二価、三価、または四価の分枝リンカーを介して結合する、実施形態９４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
９６．リガンドが、以下のものである、実施形態９４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
９７．ｄｓＲＮＡ剤が、以下の図に示すようにリガンドにコンジュゲートし、
式中、ＸＯまたはＳである、実施形態９６に記載のｄｓＲＮＡ剤。
９８．Ｘが、Ｏである、実施形態９７に記載のｄｓＲＮＡ剤。
９９．アンチセンス鎖の３’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＳｐ配置である、末端のキラル修飾と、
アンチセンス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＲｐ配置である、末端のキラル修飾と、
センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＲｐ配置またはＳｐ配置のいずれかである、末端のキラル修飾と、をさらに含む、実施形態１～９８のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１００．アンチセンス鎖の３’末端における第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＳｐ配置である、末端のキラル修飾と、
アンチセンス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＲｐ配置である、末端のキラル修飾と、
センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＲｐ配置またはＳｐ配置のいずれかである、末端のキラル修飾と、をさらに含む、実施形態１～９８のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１０１．アンチセンス鎖の３’末端における第一、第二および第三のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＳｐ配置である、末端のキラル修飾と、
アンチセンス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＲｐ配置である、末端のキラル修飾と、
センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＲｐ配置またはＳｐ配置のいずれかである、末端のキラル修飾と、をさらに含む、実施形態１～９８のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１０２．アンチセンス鎖の３’末端における第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＳｐ配置である、末端のキラル修飾と、
アンチセンス鎖の３’末端における第三のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＲｐ配置である、末端のキラル修飾と、
アンチセンス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＲｐ配置である、末端のキラル修飾と、
センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＲｐ配置またはＳｐ配置のいずれかである、末端のキラル修飾と、をさらに含む、実施形態１～９８のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１０３．アンチセンス鎖の３’末端における第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＳｐ配置である、末端のキラル修飾と、
アンチセンス鎖の５’末端における第一および第二のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＲｐ配置である、末端のキラル修飾と、
センス鎖の５’末端における第一のヌクレオチド間連結において生じる末端のキラル修飾であって、連結リン原子がＲｐ配置またはＳｐ配置のいずれかである、末端のキラル修飾と、をさらに含む、実施形態１～９８のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１０４．アンチセンス鎖の５’末端においてホスフェートまたはホスフェート模倣体をさらに含む、実施形態１～１０３のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤。
１０５．ホスフェート模倣体が、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である、実施形態１０４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
１０６．実施形態１～１０５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤を含有する、細胞。
１０７．例えば、他の点では類似した未処理の細胞と比較して、低減されたＭＹＯＣ ｍＲＮＡのレベルまたはＭＹＯＣタンパク質のレベルを含むヒト眼細胞（小柱網の細胞、毛体様の細胞、ＲＰＥ細胞、星状細胞、周皮細胞、ミュラー細胞、神経節細胞、内皮細胞、または光受容体細胞）であって、随意に、レベルが、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％低減される、ヒト眼細胞。
１０８． ヒト細胞を実施形態１～９４のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤と接触させることを含むプロセスによって産生された、実施形態１０７に記載のヒト細胞。
１０９．実施形態１～１０５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤を含む、ＭＹＯＣの発現を阻害する医薬組成物。
１１０．実施形態１～１０５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤と脂質製剤とを含む、医薬組成物。
１１１．細胞においてＭＹＯＣの発現を阻害する方法であって、方法が、
（ａ）細胞を、実施形態１～１０５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤、または実施形態１０９または１１０に記載の医薬組成物と接触させることと、
（ｂ）工程（ａ）で産生された細胞を、ＭＹＯＣのｍＲＮＡ転写物の分解を得るのに十分な時間維持し、それによって細胞におけるＭＹＯＣの発現を阻害することと、を含む、方法。
１１２．細胞においてＭＹＯＣの発現を阻害する方法であって、方法が、
（ａ）細胞を、実施形態１～１０５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤、または実施形態１０９または１１０に記載の医薬組成物と接触させることと、
（ｂ）工程（ａ）で産生された細胞を、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、ＭＹＯＣタンパク質、またはＭＹＯＣ ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルを低減するのに十分な時間維持し、それによって細胞におけるＭＹＯＣの発現を阻害することと、を含む、方法。
１１３．細胞が、対象内にある、実施形態１１１または１１２に記載の方法。
１１４．対象が、ヒトである、実施形態１１３に記載の方法。
１１５．ＭＹＯＣ ｍＲＮＡのレベルが、少なくとも５０％阻害される、実施形態１１１～１１４のいずれか一つに記載の方法。
１１６．ＭＹＯＣタンパク質のレベルが、少なくとも５０％阻害される、実施形態１１１～１１４のいずれか一つに記載の方法。
１１７．ＭＹＯＣの発現を阻害することが、対象からの生体試料（例えば、水性眼液試料）中のＭＹＯＣタンパク質レベルを少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％減少させる、実施形態１１４～１１６に記載の方法。
１１８．対象が、ＭＹＯＣ関連障害、例えば、緑内障、例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）と診断されている、実施形態１１４～１１７のいずれか一つに記載の方法。
１１９．眼細胞または組織においてＭＹＯＣの発現を阻害する方法であって、方法が、
（ａ）細胞または組織を、ＭＹＯＣに結合するｄｓＲＮＡ剤と接触させることと、
（ｂ）工程（ａ）で産生された細胞または組織を、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、ＭＹＯＣタンパク質、またはＭＹＯＣ ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルを低減するのに十分な時間維持し、それによって細胞または組織におけるＭＹＯＣの発現を阻害することと、を含む、方法。
１２０．眼細胞または組織が、小柱網組織、毛体様、ＲＰＥ細胞、網膜組織、星状細胞、周皮細胞、ミュラー細胞、神経節細胞、内皮細胞、光受容体細胞、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）、または例えば、脈絡膜血管などの脈絡膜組織、を含む、実施形態１１９に記載の方法。
１２０ａ．対象における眼圧を低減する方法であって、治療有効量の実施形態１～１０５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤または実施形態１０９もしくは１１０に記載の医薬組成物を対象に投与し、それによって対象における眼圧を低減することを含む、方法。
１２０ｂ．対象における眼圧の増加を制限するか、または一定の眼圧を維持する方法であって、治療有効量の実施形態１～１０５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤または実施形態１０９もしくは１１０に記載の医薬組成物を対象に投与し、それによって、対象における眼圧の増加を制限するか、または一定の眼圧を維持することを含む、方法。
１２１．ＭＹＯＣ関連障害を有する、または有すると診断された対象を治療する方法であって、治療有効量の実施形態１～１０５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤または実施形態１０９もしくは１１０に記載の医薬組成物を対象に投与し、それによって、障害を治療することを含む、方法。
１２２．ＭＹＯＣ関連障害が、緑内障である、実施形態１１８または１２１に記載の方法。
１２２ａ．緑内障を有する対象を治療する方法であって、治療有効量の実施形態１～１０５のいずれか一つに記載のｄｓＲＮＡ剤または実施形態１０９もしくは１１０に記載の医薬組成物を対象に投与し、それによって、緑内障を治療することを含む、方法。
１２３．緑内障が、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）からなる群から選択される、実施形態１２２または１２２ａに記載の方法。
１２４．治療することが、障害の少なくとも一つの兆候または症状の改善を含む、実施形態１２１～１２３のいずれか一つに記載の方法。
１２５．緑内障の少なくとも一つの徴候または症状が、視神経損傷、視力喪失、視野狭窄、かすみ目、眼の痛みまたは存在、レベル、またはＭＹＯＣ活性（例えば、ＭＹＯＣ遺伝子、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、またはＭＹＯＣタンパク質）のうちの一つ以上の尺度を含む、実施形態１２４に記載の方法。
１２６．治療することが、障害の進行の予防を含む、実施形態１２１～１２３のいずれか一つに記載の方法。
１２７．治療が、（ａ）ＭＹＯＣの発現もしくは活性を阻害もしくは低減すること、（ｂ）ミスフォールドされたＭＹＯＣタンパク質のレベルを低減すること、（ｃ）小柱網細胞死を低減すること、（ｄ）眼圧を低減すること、または（ｅ）視力を増加させること、のうちの一つ以上を含む、実施形態１２４～１２６のいずれか一つに記載の方法。
１２８．治療が、小柱網組織、毛体様、網膜、ＲＰＥ、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）、または例えば、脈絡膜血管などの脈絡膜組織におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡのベースラインから少なくとも平均３０％の減少をもたらす、実施形態１２７に記載の方法。
１２９．治療が、小柱網組織、毛体様、網膜、ＲＰＥ、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）、または例えば、脈絡膜血管などの脈絡膜組織におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡのベースラインから少なくとも平均６０％の減少をもたらす、実施形態１２８に記載の方法。
１３０．治療が、小柱網組織、毛体様、網膜、ＲＰＥ、網膜血管（例えば、内皮細胞および血管平滑筋細胞を含む）、または例えば、脈絡膜血管などの脈絡膜組織におけるＭＹＯＣ ｍＲＮＡのベースラインから少なくとも平均９０％の減少をもたらす、実施形態１２９に記載の方法。
１３１．治療後、対象が、網膜におけるＭＹＯＣタンパク質によって評価されるｄｓＲＮＡの単回投与後に少なくとも８週間のノックダウン期間を経験する、実施形態１２４～１２９のいずれか一つに記載の方法。
１３２．治療が、網膜におけるＭＹＯＣタンパク質によって評価されるｄｓＲＮＡの単回投与後に少なくとも１２週間のノックダウン期間をもたらす、実施形態１３１に記載の方法。
１３３．治療が、網膜におけるＭＹＯＣタンパク質によって評価されるｄｓＲＮＡの単回投与後に少なくとも１６週間のノックダウン期間をもたらす、実施形態１３２に記載の方法。
１３４．対象が、ヒトである、実施形態１１３～１３３のいずれか一つに記載の方法。
１３５．ｄｓＲＮＡ剤が、約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約５０ｍｇ／ｋｇの用量で投与される、実施形態１１４～１３４のいずれか一つに記載の方法。
１３６．ｄｓＲＮＡ剤が、対象に眼内、静脈内、または局所投与される、実施形態１１４～１３５のいずれか一つに記載の方法。
１３７．眼内投与が、硝子体内投与（例えば、硝子体内注射）、経強膜内投与（例えば、経強膜内注射）、結膜下投与（例えば、結膜下注射）、球後投与（例えば、球後注射）、前房内投与（例えば、前房内注射）、または網膜下投与（例えば、網膜下注射）を含む、実施形態１３６に記載の方法。
１３８．対象におけるＭＹＯＣ（例えば、ＭＹＯＣ遺伝子、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、またはＭＹＯＣタンパク質）のレベルを測定することをさらに含む、実施形態１１４～１３７のいずれか一つに記載の方法。
１３９．対象におけるＭＹＯＣのレベルを測定することが、対象からの生体試料（例えば、水性眼液試料）におけるＭＹＯＣ遺伝子、ＭＹＯＣタンパク質、またはＭＹＯＣｍＲＮＡのレベルを測定することを含む、実施形態１３８に記載の方法。
１４０．血液試験、撮像試験、または水性眼液生検を実施することをさらに含む、実施形態１１４～１３９のいずれか一つに記載の方法。
１４１．対象におけるＭＹＯＣ（例えば、ＭＹＯＣ遺伝子、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、またはＭＹＯＣタンパク質）のレベルの測定が、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物での治療の前に実施される、実施形態１３８～１４０のいずれか一つに記載の方法。
１４２．対象が参照レベルよりも大きいＭＹＯＣ（例えば、ＭＹＯＣ遺伝子、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、またはＭＹＯＣタンパク質）レベルを有すると決定されると、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物が対象に投与される、実施形態１４１に記載の方法。
１４３．対象におけるＭＹＯＣ（例えば、ＭＹＯＣ遺伝子、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、またはＭＹＯＣタンパク質）のレベルの測定が、ｄｓＲＮＡ剤または医薬組成物での治療の後に実施される、実施形態１３９～１４２のいずれか一つに記載の方法。
１４４．ＭＹＯＣ関連疾患の治療または予防に好適な追加的な薬剤および／または療法を対象に投与することをさらに含む、実施形態１２１～１４３のいずれか一つに記載の方法。
１４５．追加の薬剤および／または療法が、光線力学的療法、光凝固療法、ステロイド、非ステロイド性抗炎症剤、抗ＭＹＯＣ剤、および／または硝子切除術のうちの一つ以上を含む、実施形態１４４に記載の方法。
実施例１．ＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ
本明細書に提供される核酸配列は、標準的な命名法を使用して表される。表１の略称を参照されたい。
表１．核酸配列の表現で使用されるヌクレオチドモノマーの略称。
これらのモノマーは、オリゴヌクレオチド中に存在する場合、５’－３’－ホスホジエステル結合によって相互に連結されることが理解されよう。
１Ｌ９６の化学構造は以下のとおりである。
実験方法
バイオインフォマティクス
転写物
ヒトＭＹＯＣ、「ミオシリン」を標的とするｓｉＲＮＡの四つのセット（ヒト：ＮＣＢＩ ｒｅｆｓｅｑＩＤ ＮＭ＿０００２６１．２；ＮＣＢＩ ＧｅｎｅＩＤ：４６５３）を作成した。ヒトＮＭ＿０００２６１．２ ＲＥＦＳＥＱ ｍＲＮＡは、長さが２１００塩基である。オリゴの対を、バイオインフォマティクス法を使用して作成し、ランク付けし、オリゴの例示的な対を表２Ａおよび表２Ｂに示す。修飾された配列を表２Ａに示す。未修飾配列を表２Ｂに示す。
表２Ａ：例示的なヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ修飾単鎖および二本鎖配列
１列目は二本鎖名を示し、二本鎖名称の十進点に続く数字はバッチ製造番号を指すに過ぎない。２列目は、センス配列の名称を示す。３列目は、４列目の配列の配列番号を示す。４列目は、本明細書に記載の二本鎖での使用に適したセンス鎖の修飾された配列を提供する。５列目は、アンチセンス配列名を示す。６列目は、７列目の配列の配列番号を示す。７列目は、本明細書に記載の二本鎖、例えば、表の同じ行にセンス配列を含む二本鎖での使用に適した修飾アンチセンス鎖の配列を提供する。８列目は、７列目のアンチセンス鎖に相補的である標的ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０００２６１．２）中の位置を示す。９列目は、８列目の配列の配列番号を示す。
表２Ｂ：例示的なヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ未修飾単鎖および二本鎖配列
１列目は二本鎖名を示し、二本鎖名称の十進点に続く数字はバッチ製造番号を指すに過ぎない。２列目は、センス配列名を示す。３列目は、４列目の配列の配列番号を示す。４列目は、本明細書に記載の二本鎖での使用に適したセンス鎖の未修飾の配列を提供する。５列目は、４列目のセンス鎖の標的ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０００２６１．２）における位置を提供する。６列目は、アンチセンス配列名を示す。７列目は、８列目の配列の配列番号を示す。８列目は、本明細書に記載の二本鎖での使用に適したアンチセンス鎖の配列を、化学修飾を特定することなしに、提供する。９列目は、８列目のアンチセンス鎖に相補的である標的ｍＲＮＡ（ＮＭ＿０００２６１．２）中の位置を示す。
実施例２．ＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡのインビトロスクリーニング
実験方法
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト小柱網細胞（ＨＴＭＣ）細胞トランスフェクション
ＨＴＭＣ細胞（ＡＴＣＣ）を、３８４ウェルプレートに、ウェル当たり４．９μｌのＯｐｔｉ－ＭＥＭと０．１μｌのＲＮＡｉＭＡＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ．カタログ番号１３７７８－１５０）を、ウェル当たり５μｌのｓｉＲＮＡ二本鎖に加えることにより、各ｓｉＲＮＡ二本鎖を４回複製して、トランスフェクトし、室温で１５分間インキュベートした。約５×１０３個の細胞を含有する４０μＬのＤＭＥＭ：Ｆ１２倍地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をｓｉＲＮＡトランスフェクション混合物に添加した。細胞を２４時間インキュベートし、その後ＲＮＡの精製を行った。実験を、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭで実施した。
ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ ｍＲＮＡ単離キットを使用した全ＲＮＡの単離
ＤＹＮＡＢＥＡＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号６１０１２）を使用するＢｉｏＴｅｋ－ＥＬ４０６プラットフォームの自動化プロトコルを使用し、ＲＮＡを単離した。簡潔には、細胞を含んだプレートに、７０μｌの溶解／結合バッファー、および３μｌの磁性ビーズを含有する１０μｌの溶解バッファーを添加した。プレートを、電磁振とう機上で室温にて１０分間インキュベートし、次いで磁性ビーズを捕捉して上清を除去した。次いでビーズに結合したＲＮＡを、１５０μｌの洗浄バッファーＡで２回、洗浄バッファーＢで一回洗浄した。次いでビーズを、１５０μｌの溶出バッファーで洗浄し、再捕捉し、上清を除去した。
ＡＢＩ Ｈｉｇｈ ｃａｐａｃｉｔｙ ｃＤＮＡ逆転写キット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ、カタログ番号＃４３６８８１３）を用いたｃＤＮＡ合成
一反応当たり、１μｌの１０×バッファー、０．４μｌの２５×ｄＮＴＰ、１μｌの１０×ランダムプライマー、０．５μｌの逆転写酵素、０．５μｌのリボヌクレアーゼ阻害剤および６．６μｌのＨ２Ｏを含有するマスターミックス１０μｌを、上記で単離したＲＮＡに加えた。プレートを密封し、混合し、電磁振とう機上で、室温で１０分間インキュベートし、その後３７℃で２時間インキュベートした。
リアルタイムＰＣＲ
２μｌのｃＤＮＡおよび５μｌのＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ ４８０プローブマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ、カタログ番号＃ ０４８８７３０１００１）を、３８４ウェルプレート（Ｒｏｃｈｅ社カタログ番号＃ ０４８８７３０１００１）において、１ウェル当たり、０．５μｌのヒトＧＡＰＤＨ ＴａｑＭａｎプローブ（４３２６３１７Ｅ）および０．５μｌのＭＹＯＣヒトプローブのいずれかに添加した。リアルタイムＰＣＲを、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０リアルタイムＰＣＲシステム（Ｒｏｃｈｅ）にて実施した。各二本鎖を、少なくとも二回試験し、データを、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞に対して正規化した。相対倍数変化を算出するために、ΔΔＣｔ法を使用してリアルタイムデータを分析し、非標的化対照ｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞を用いて実施されたアッセイに対して正規化した。
結果
例示的なヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡを用いたヒト小柱網細胞（ＨＴＭＣ）における複数回投与スクリーニングの結果を表３に示す（表２ＡのｓｉＲＮＡに対応）。複数回投与実験は、１０ｎＭ、１ｎＭ、および０．１ｎＭの最終二本鎖濃度で実施され、データは、非標的化対照と比較して残存するパーセントメッセージとして表される。
以下の表３で評価した例示的なｓｉＲＮＡ二本鎖のうち、１０ｎＭの濃度で投与されたときに、ＨＴＭＣ細胞において、１７４個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧９０％を達成し、３４７個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧７０％を達成し、３９２個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧５０％を達成し、４２４個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧２０％を達成し、および４３３個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧１０％を達成した。
以下の表３で評価した例示的なｓｉＲＮＡ二本鎖のうち、１ｎＭの濃度で投与されたときに、ＨＴＭＣ細胞において、１４２個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧９０％を達成し、３４１個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧７０％を達成し、３９１個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧５０％を達成し、４２４個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧２０％を達成し、および４３１個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧１０％を達成した。
以下の表３で評価した例示的なｓｉＲＮＡ二本鎖のうち、０．１ｎＭの濃度で投与されたときに、ＨＴＭＣ細胞において、５７個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧９０％を達成し、２７７個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧７０％を達成し、３６１個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧５０％を達成し、４１６個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧２０％を達成し、および４２５個は、ＭＹＯＣのノックダウン≧１０％を達成した。
以下の表３で評価した例示的なｓｉＲＮＡ二本鎖のうち、ＡＤ－１５６５４４８．１、ＡＤ－１１９３１７５．５、ＡＤ－１５６５７９８．１、ＡＤ－１５６５４５２．１、ＡＤ－１５６５４５３．１、ＡＤ－１５６５４５４．１、ＡＤ－１５６５４５６．１、ＡＤ－１５６５４９２．１、ＡＤ－１５６５４９３．１、ＡＤ－１５６５５０３．１、ＡＤ－１０７３４１８．５、ＡＤ－１５６５８０４．１、ＡＤ－１５６５８０６．１、ＡＤ－１２４４３６６．３、ＡＤ－１５６５５８９．１、ＡＤ－１５６５８３７．１、ＡＤ－１５６５６２４．１、ＡＤ－１５６５６２６．１が、ＨＴＭＣ細胞において、優れたＭＹＯＣのノックダウンを示した。
表３．例示的なヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡの一セットを含むＭＹＯＣ内因性インビトロ複数回投与スクリーニング（＊二本鎖名称の十進点に続く数は、バッチ製造番号を指すに過ぎない）
実施例３．マウス緑内障モデルにおけるヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡの検証
ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡをインビボで試験するために、Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ座位を含む相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）マウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス）である緑内障マウスモデルを使用した。これらのマウスでは、ＭＹＯＣプロモーターを標的とするＳＡＭガイドＲＮＡ（ＳＡＭ ｇＲＮＡ）を使用することにより、Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣの発現を増加させ、眼圧（ＩＯＰ）の増加をもたらすことができる。ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスは、内因性Ｒｏｓａ２６プロモーター（米国特許出願公開第２０１９／０２８４５７２号および国際公開第２０１９／１８３１２３号に記載、その各々は参照により本明細書に組み込まれる）によって駆動される一つの転写物として、ゲノムに組み込まれたｄＣａｓ９相乗的活性化メディエーター（ＳＡＭ）システム構成要素（ｄＣａｓ９－ＶＰ６４およびＭＣＰ－ｐ６５－ＨＳＦ１）を含むマウスを、Ｙ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ座位を含むマウスと交配させることによって生成された。これらのマウスでは、開始コドンから終止コドンまでのマウスＭｙｏｃ配列を、対応するヒトＭＹＯＣ配列で置換した。挿入されたヒトＭＹＯＣ配列は、Ｙ４３７Ｈ変異を含み、これは、ＩＯＰの上昇および緑内障の発症に関連する変異である。ＭＹＯＣプロモーターを標的とするＳＡＭガイドＲＮＡをコードするＡＡＶ２．Ｙ３Ｆまたはレンチウイルスの注射は、輪部リング（小柱網（ＴＭ）、虹彩、および毛体様（ＣＢ））におけるヒト化ＭＹＯＣ Ｙ４３７Ｈ発現の増加をもたらし、これはＩＯＰの増加と相関し、ＩＯＰの増加を伴う好適なＭＹＯＣ疾患モデルとしてＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスを検証した（データは示さず）。
ヒトＭＹＯＣを標的とするｓｉＲＮＡを試験して、ＳＡＭ ｇＲＮＡを用いた処置後にＹ４３７Ｈ変異を含むヒト化ＭＹＯＣ座位を含むＳＡＭマウス（ＳＡＭ－ＭＹＯＣマウス）で観察される高い眼圧（ＩＯＰ）を低下させることができるかを判定した。実験セットアップを図１Ａに示す。ＳＡＭ ｇＲＮＡを０日目に前房内（ＩＣ）注射により投与し、ベースラインＩＯＰを測定した。ＩＯＰを、その後五週間にわたって測定した。五週目に、ＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－８２２８９９（１μＬ、１５μｇ用量）を硝子体内（ＩＶＴ）注射を介して投与し、ＩＯＰをその後の数週間にわたって様々な時点で測定した。（１）ナイーブ対照マウス、（２）ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡで処置したＳＡＭ－ｇＲＮＡ処置マウス、および（３）ルシフェラーゼｓｉＲＮＡで処置したＳＡＭ－ｇＲＮＡ処置マウスの三つの処置群があった。図１Ｂに示されるように、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡは、ＳＡＭ ｇＲＮＡで処置したＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスにおいてＩＯＰを低下させ、ｓｉＲＮＡ注射後Ｄ７から開始してＩＯＰをベースラインレベルに逆転させ、戻す一方で、ルシフェラーゼｓｉＲＮＡはＩＯＰに影響を及ぼさなかった。
次いで、ヒトＭＹＯＣを標的とするいくつかの追加のｓｉＲＮＡを低用量で試験し、レンチウイルスＳＡＭ ｇＲＮＡを用いた処置後にＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスで観察されたＩＯＰを低下させることができるかどうかを判定した。マウスにＳＡＭ ｇＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを両側に注射した。実験セットアップを図２Ａに示す。ＳＡＭ ｇＲＮＡを０日目に前房内（ＩＣ）注射により投与し、ベースラインＩＯＰを測定した。ＩＯＰを、その後五週間にわたって測定した。五週目に、ＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－８２２８９９、ＡＤ－１５６５８０４、ＡＤ－１５６５８３７、ＡＤ－１１９３１７５、またはＡＤ－１５６５５０３（１μＬ、７．５μｇ用量）を、硝子体内（ＩＶＴ）注射を介して投与し、ＩＯＰを、その後の数週にわたって様々な時点で測定した。輪部リングにおけるｍＲＮＡノックダウンをｑＰＣＲによって試験し、ＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）分析を行った。対照群には、ナイーブ対照マウス、ＰＢＳ処置マウス、およびＬＶ－ＳＡＭ ｇＲＮＡ処置マウスが含まれた。図２Ｂに示されるように、各ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡは、ＳＡＭ ｇＲＮＡで処置したＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスにおいてＩＯＰを低下させ、ｓｉＲＮＡ注射直後にＩＯＰを逆転させ、ベースラインレベルに戻した。図２Ｃに示されるように、各ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡは、輪部リングからの試料中のｑＰＣＲによって測定されるＬＶ－ＳＡＭ－ｇＲＮＡ群と比較して、ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現を減少させた。ＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）分析により、ｓｉＲＮＡがＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスにおいてヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡのノックダウンを媒介したことが確認された（図２Ｄ）。
次いで、ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－１５６５８０４またはＡＤ－１５６５８３７をさらに低用量で試験し、レンチウイルスＳＡＭ－ｇ４を用いた処置後にＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスにて観察されるＩＯＰを低下させることができるかどうかを判定した。マウスにＳＡＭ ｇＲＮＡおよびｓｉＲＮＡを両側に注射した。実験セットアップを図３Ａに示す。ＳＡＭ－ｇ４を０日目に前房内（ＩＣ）注射により投与し、ベースラインＩＯＰを測定した。ＩＯＰを、その後五週間にわたって測定した。五週目に、ＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡ ＡＤ－１５６５８０４またはＡＤ－１５６５８３７（１μＬ、３．７５μｇ用量または１．８７μｇ用量）を、硝子体内（ＩＶＴ）注射を介して投与し、ＩＯＰを、その後の数週にわたって様々な時点で測定した。輪部リングにおけるｍＲＮＡノックダウンをｑＰＣＲによって試験し、ＲＮＡＳＣＯＰＥ（登録商標）分析を行った。対照群には、ナイーブ対照マウス、ＰＢＳ処置マウス、およびＬＶ－ＳＡＭ－ｇＲＮＡ処置マウスが含まれた。図３Ｂに示されるように、各ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡは、試験した各用量でＳＡＭ ｇＲＮＡで処置したＳＡＭ－ＭＹＯＣマウスにおいてＩＯＰを低下させ、ｓｉＲＮＡ注射直後にＩＯＰを反転させ、ベースラインレベルに戻した。図３Ｃに示されるように、各ヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡは、試験された各用量での輪部リングからの試料におけるｑＰＣＲによって測定されるＬＶ－ＳＡＭ ｇＲＮＡ群と比較して、ヒトＭＹＯＣ ｍＲＮＡ発現を減少させた。
実施例４．非ヒト霊長類（ＮＨＰ）緑内障モデルにおけるヒトＭＹＯＣ ｓｉＲＮＡの検証
ＭＹＯＣを標的とするｓｉＲＮＡを試験して、非ヒト霊長類（ＮＨＰ）緑内障モデルで観察された高い眼圧（ＩＯＰ）を低下させることができるかどうかを判定した。試験デザインを表４に示す。動物は、ＰＢＳ対照または様々な用量の二本鎖ＡＤ－１５６５８３７または二本鎖ＡＤ－１５６５８０４を受けた。
ＯＥおよび眼圧（ＩＯＰ）を、試験前、３、８、１５、２９、および５７日目に、ならびに１２週目に一回測定した。網膜電図記録法（ＥＲＧ）を、試験前、試験中（６週目）、および終了時（１２週目）に行った。房水（ＡＨ）を、投与前、４週目、８週目、および終了時に収集した。終了時に、右眼から以下の眼サンプルを採取した：ＡＨ、硝子体液（ＶＨ）、角膜、虹彩、小柱網（ＴＭ）、毛体様（ＣＢ）、強膜（ＴＭを含まない輪部リング）、網膜、および眼の後部セグメントに残っているすべての組織。投与前および終了時に血液を二回採取した。血液学的、凝固、および臨床化学的検査を血液サンプルに対して実施した。
組織を、病理組織のために終了時に採取した。これには、右目、視
神経組織および眼外組織および眼組織：脳、右（大脳半球）；食道 、近位；胃、食道－胃接合部；まぶた、眼瞼結膜上部、右；まぶた、眼瞼結膜下部、右；心臓頂部；空腸；腎臓、右皮質；肝臓、右中葉；Ｌａｃｒｉｍａｌ Ｇｌ、右；深い子宮頸部、リンパ節、右；下顎、リンパ節、右；座骨神経、右；筋肉、大腿直筋；筋肉、横隔膜；筋肉、眼球外（外側直筋および内側直筋、右）；卵巣、右；下顎唾液腺、右；脊髄、頚部；脊髄、胸部；脊髄 腰部；甲状腺、右；舌；扁桃腺、右；気管；および子宮が含まれる。
表４：ＮＨＰ ＤＣ選択研究設計
＊最高用量で処置された動物：両方の眼を病理組織学的読み出しで調べる。
ＴＭにおけるＭＹＯＣタンパク質ノックダウンを、８５日目に分析した。ノックダウン結果を図４に示す。ＴＭにおけるＭＹＯＣタンパク質の約５０％の低減がＡＤ－１５６５８３７二本鎖で見られ、一方で最小限のノックダウンがＡＤ－１５６５８０４二本鎖では観察された。房水中のＭＹＯＣタンパク質を、－３５日目、２２日目、５０日目、および８５日目（最終収集）で分析した。図５に示されるように、約５０％のＭＹＯＣタンパク質ノックダウンが５０日目に観察されたが、８５日目には観察されなかった。硝子体液、虹彩、毛体様、および強膜におけるＭＹＯＣタンパク質ノックダウンを、８５日目（最終収集）に分析した。結果を、硝子体液および毛体様について図６Ａに、虹彩および強膜について図６Ｂに示す。８５日目では、評価したいずれの二本鎖についても、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡにノックダウンは観察されなかった（図７）。

Claims (41)

  1. ミオシリン（ＭＹＯＣ）の発現を阻害するための二本鎖リボ核酸（ｄｓＲＮＡ）剤であって、前記ｄｓＲＮＡ剤は、二本鎖領域を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含み、前記アンチセンス鎖は、表２Ａおよび２Ｂのいずれか一つに列記されるアンチセンス配列のうちの一つと０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖は、前記アンチセンス配列に対応する表２Ａおよび２Ｂのいずれか一つに列記されるセンス配列と０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、ｄｓＲＮＡ剤。
  2. 前記アンチセンス鎖は、二本鎖ＡＤ－１５６５８０４のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列と０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖は、二本鎖ＡＤ－１５６５８０４のセンス鎖ヌクレオチド配列と０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  3. 前記アンチセンス鎖は、二本鎖ＡＤ－１５６５８３７のアンチセンス鎖ヌクレオチド配列と０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含み、前記センス鎖は、二本鎖ＡＤ－１５６５８３７のセンス鎖ヌクレオチド配列と０、１、２、または３つのミスマッチを有する、少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  4. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖のうちの少なくとも一つが、一つ以上の親油性部分にコンジュゲートされる、請求項１～３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  5. 前記親油性部分が、リンカーまたは担体を介してコンジュゲートされる、請求項４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  6. 一つ以上の親油性部分が、少なくとも一方の鎖上の一つ以上の内側位置にコンジュゲートされる、請求項４または５に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  7. 前記センス鎖および前記アンチセンス鎖のうちの少なくとも一つが、アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）－ペプチドまたはＲＧＤペプチド模倣体の一つ以上にコンジュゲートされる、請求項１～３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  8. 前記親油性部分が、脂肪族化合物、脂環式化合物、または多脂環式の化合物である、請求項４～６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  9. 前記親油性部分が、飽和または不飽和Ｃ１６炭化水素鎖を含有する、請求項８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  10. 前記親油性部分が、前記内側位置または前記二本鎖領域において一つ以上のヌクレオチドを置換する担体を介してコンジュゲートされる、請求項４～６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  11. 前記親油性部分が、エーテル、チオエーテル、尿素、カーボネート、アミン、アミド、マレイミド－チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、スルホンアミド連結、クリック反応の生成物、またはカルバメートを含有するリンカーを介して二本鎖ｉＲＮＡ剤にコンジュゲートされる、請求項４～６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  12. 前記親油性部分が、核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間連結にコンジュゲートされる、請求項４～６のいずれか一項に記載の二本鎖ｉＲＮＡ剤。
  13. 前記ｄｓＲＮＡ剤が、少なくとも一つの修飾ヌクレオチドを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  14. 前記センス鎖のヌクレオチドの五個以下および前記アンチセンス鎖のヌクレオチドの五個以下が、未修飾ヌクレオチドである、請求項１３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  15. 前記センス鎖のすべてのヌクレオチドおよび前記アンチセンス鎖のすべてのヌクレオチドが、修飾を含む、請求項１３に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  16. 前記修飾ヌクレオチドのうちの少なくとも一つが、デオキシ－ヌクレオチド、３’－末端デオキシ－チミジン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’－Ｏ－メチル修飾ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾ヌクレオチド、２’－デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックヌクレオチド、アンロックヌクレオチド、立体配座的に制限されたヌクレオチド、拘束されたエチルヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’－アミノ修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アリル修飾ヌクレオチド、２’－Ｃ－アルキル修飾ヌクレオチド、２’－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、２’－Ｏ－アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホルアミデート、ヌクレオチドを含む非天然の塩基、テトラヒドロピラン修飾ヌクレオチド、１，５－アンヒドロヘキシトール修飾ヌクレオチド、シクロヘキセニル修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート基を含むヌクレオチド、メチルホスホネート基を含むヌクレオチド、５’－ホスフェートを含むヌクレオチド、５’－ホスフェート模倣体を含むヌクレオチド、グリコール修飾ヌクレオチド、および２－Ｏ－（Ｎ－メチルアセトアミド）修飾ヌクレオチド、およびそれらの組み合わせ、からなる群から選択される、請求項１３～１５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  17. 少なくとも一方の鎖が、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバーハングを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  18. 前記二本鎖領域が、１５～３０ヌクレオチド対の長さである、請求項１～１７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  19. 前記二本鎖領域が、１７～２３ヌクレオチド対の長さである、請求項１８に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  20. 各鎖が、１９～３０ヌクレオチドを有する、請求項１～１９のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  21. 前記剤が、少なくとも一つのホスホロチオエートまたはメチルホスホネートヌクレオチド間結合を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  22. 例えば、眼組織を標的化するリガンドなどの標的化リガンドをさらに含む、請求項４～２１のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  23. 前記眼組織が、小柱網組織、毛体様、網膜組織、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、または脈絡膜組織、例えば、脈絡膜血管である、請求項２２に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  24. 前記アンチセンス鎖の５’末端においてホスフェートまたはホスフェート模倣体をさらに含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  25. 前記ホスフェート模倣体が、５’－ビニルホスホネート（ＶＰ）である、請求項２４に記載のｄｓＲＮＡ剤。
  26. 前記ｄｓＲＮＡ剤が、ＭＹＯＣをコードするｍＲＮＡのホットスポット領域を標的とする、請求項１～２５のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ。
  27. ミオシリン（ＭＹＯＣ）ｍＲＮＡのホットスポット領域を標的とするｄｓＲＮＡ剤。
  28. 請求項１～２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含有する細胞。
  29. 請求項１～２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤を含む、ＭＹＯＣの発現を阻害するための医薬組成物。
  30. 細胞においてＭＹＯＣの発現を阻害する方法であって、前記方法が、
    （ａ）前記細胞を、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤、または請求項２９に記載の医薬組成物と接触させることと、
    （ｂ）工程（ａ）で産生された前記細胞を、ＭＹＯＣ ｍＲＮＡ、ＭＹＯＣタンパク質、またはＭＹＯＣ ｍＲＮＡおよびタンパク質の両方のレベルを低減するのに十分な時間維持し、それによって前記細胞におけるＭＹＯＣの発現を阻害することと、を含む、方法。
  31. 前記細胞が、対象内にある、請求項３０に記載の方法。
  32. 前記対象が、ヒトである、請求項３１に記載の方法。
  33. 前記対象が、ＭＹＯＣ関連障害、例えば、緑内障（例えば、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）、閉塞隅角緑内障、先天性緑内障、および続発性緑内障）と診断されている、請求項３２に記載の方法。
  34. ＭＹＯＣ関連障害と診断された対象を治療する方法であって、請求項１～２７のいずれか一項に記載のｄｓＲＮＡ剤または請求項２９に記載の医薬組成物の治療有効量を前記対象に投与し、それによって前記障害を治療することを含む、方法。
  35. 前記ＭＹＯＣ関連障害が、緑内障である、請求項３４に記載の方法。
  36. 緑内障が、原発性開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）である、請求項３５に記載の方法。
  37. 治療することが、前記障害の少なくとも一つの兆候または症状の改善を含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の方法。
  38. 前記治療することが、（ａ）ＭＹＯＣの発現もしくは活性を阻害もしくは低減すること、（ｂ）ミスフォールドされたＭＹＯＣタンパク質のレベルを低減すること、（ｃ）小柱網細胞死を低減すること、（ｄ）眼圧を低減すること、または（ｅ）視力を増加させること、を含む、請求項３４～３７のいずれか一項に記載の方法。
  39. 前記ｄｓＲＮＡ剤が、前記対象に眼内、静脈内、または局所投与される、請求項３１～３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記眼内投与が、硝子体内投与（例えば、硝子体内注射）、経強膜内投与（例えば、経強膜内注射）、結膜下投与（例えば、結膜下注射）、球後投与（例えば、球後注射）、前房内投与（例えば、前房内注射）、または網膜下投与（例えば、網膜下注射）を含む、請求項３９に記載の方法。
  41. ＭＹＯＣ関連障害の治療または予防に適した追加の薬剤または療法（例えば、レーザー線維柱帯形成術、線維柱帯切除術、低侵襲性緑内障手術、眼への排液管の配置、経口薬、または点眼薬）を前記対象に投与することをさらに含む、請求項３１～４０のいずれか一項に記載の方法。
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