JP2024523127A - 特定の薬剤脂質比を有する医薬組成物の抗腫瘍適用 - Google Patents

特定の薬剤脂質比を有する医薬組成物の抗腫瘍適用 Download PDF

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Abstract

薬剤脂質比が低い抗腫瘍化学療法剤リポソーム、およびその適用。抗腫瘍化学療法剤リポソームは、抗腫瘍薬剤、および担体としてリポソームを含み、抗腫瘍薬剤と脂質担体の薬剤脂質比は、０．０１～０．１５である。【選択図】なし

Description

本開示は、医療技術分野に属し、特に、特定の薬剤脂質比を有する医薬組成物の抗腫瘍適用に関する。
薬剤担体としてのリポソーム送達システム技術の適用は、１９６１年にＡｌｅｃ Ｂａｎｇｈａｍにより初めて提唱され、当該技術はゆっくりと成熟してきた。広く使用されているＰＥＧ修飾リポソーム（ステルスリポソーム）は、循環時間を延長させ、ＥＰＲ（受動的標的化）効果により、薬剤を腫瘍組織に蓄積させ、より大きな効果を発揮させる。Ｄｏｘｉｌ（登録商標）はドキソルビシン搭載リポソームであり、世界で市販された最初のリポソーム製品である。中国ではＤｕｏｍｅｉｓｕやＬｉｂａｏｓｕをはじめとする複数のドキソルビシン搭載リポソーム薬剤もある。さらに、例えばパクリタキセル搭載リポソーム、ダウノルビシン搭載リポソーム、ビンクリスチン搭載リポソーム、イリノテカン搭載リポソーム、ミトキサントロン搭載リポソーム、ダウノルビシンとシタラビンの併用搭載リポソーム、およびそれらの組み合わせなど、様々な抗腫瘍薬剤を搭載したリポソームが市販され、または市販が近い状態である。
リポソームが投与される場合、これらの薬剤搭載リポソームの処方における重要なパラメータは、薬剤と脂質分子のモル比であり、質量比またはモル比として表されたり、また薬剤脂質比と省略されたりする場合もある。薬剤脂質比が大きいほど、各リポソームにはより多くの薬剤が搭載されており、薬剤搭載効率も高い。薬剤脂質比は、薬剤の分子量や物理化学的特性の差異に起因して変化する。先行技術におけるドキソルビシン搭載リポソームの薬剤脂質比は０．１７である。先行技術におけるイリノテカン搭載リポソームの薬剤脂質比は０．６であり、例えばビンクリスチンリポソームなどの他の薬剤搭載リポソームの薬剤脂質比は０．２である。二種以上の薬剤を含有するリポソームについては、例えば薬剤脂質比が０．１２であるＶｙｘｅｏｓなどがあるが、薬剤の相乗作用の有効濃度が低下する場合がある。一般的に、薬剤脂質比が高いほど、薬剤送達効率も高くなり、薬剤の有効性も良好となると考えられている。
しかしながら、本発明者らの研究を通じて、本発明者らは、担体リポソームの抗腫瘍活性はむしろ、薬剤脂質比が特定の値を超えたときに低下することを見出した。したがって、薬剤搭載リポソームの薬剤脂質比の範囲を最適化させて、リポソームに搭載される医薬組成物の抗腫瘍活性を改善し、毒性が低く、最適な抗腫瘍効果が得られるようにすることが当分野の緊急の課題である。
本開示の主な目的は、薬剤脂質比の新規の範囲を提供することであり、当該範囲内にあるリポソームに搭載される医薬組成物は、効果的な抗腫瘍活性を有する。特に、本開示は、当業界で普遍的にみられる薬剤脂質比を下回る範囲を提供するものである。すなわち、モル比が０．０１～０．１５であるとき、当該範囲内にある薬剤脂質比を有するリポソームに搭載される医薬組成物は、先行技術の医薬組成物よりも腫瘍細胞に対してより良好な阻害活性を有する。
本開示の第一の態様では、ａ１）抗腫瘍薬剤、ａ２）担体としてのリポソーム、を含む医薬組成物が提供され、当該抗腫瘍薬剤と脂質担体のモル比（薬剤脂質比）は、０．０１～０．１５である。
別の好ましい例では、薬剤脂質比の範囲は、０．０２～０．１、好ましくは０．０２２～０．０８５、例えば０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、または０．０９である。
別の好ましい例では、医薬組成物中の薬剤の封入比は、９０％超、好ましくは９５％超、より好ましくは９８％超である。
別の好ましい例では、医薬組成物の粒径は、６０～１８０ｎｍ、好ましくは８０～１２０ｎｍ、より好ましくは８５ｎｍである。
別の好ましい例では、医薬組成物のＰＤＩは、０．０１～０．２、より好ましくは０．０１～０．１５である。
別の好ましい例では、抗腫瘍薬剤は、以下の群から選択される：アントラサイクリン、白金系薬剤、フルオロウラシル、カンプトテシン、タキサン、免疫調節薬剤、またはそれらの組み合わせ。
別の好ましい例では、抗腫瘍薬剤は、アントラサイクリン、好ましくはドキソルビシンである。
別の好ましい例では、抗腫瘍薬剤は、カンプトテシン、好ましくはイリノテカンである。
別の好ましい例では、抗腫瘍薬剤は、パクリタキセル薬剤、好ましくはパクリタキセルである。
別の好ましい例では、抗腫瘍薬剤は、白金系薬剤、好ましくはシスプラチンである。
別の好ましい例では、抗腫瘍薬剤は、免疫調節薬剤、好ましくはレシキモド（Ｒ８４８）である。
別の好ましい例では、抗腫瘍薬剤がドキソルビシンである場合、薬剤脂質比の範囲は、０．１未満、より好ましくは０．９未満、より好ましくは０．０２２～０．０８５である。
別の好ましい例では、抗腫瘍薬剤がイリノテカンである場合、薬剤脂質比の範囲は、０．２未満、好ましくは０．１～０．２、より好ましくは０．０１５である。
別の好ましい例では、脂質担体は、以下からなる成分の群から選択される：ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、コレステロール、ポリエチレングリコールグリセロール脂肪酸エステル、およびポリエチレングリコールグリセロールホスファチジルエタノールアミン。
別の好ましい例では、脂質担体は、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを含む。
別の好ましい例では、ホスファチジルコリンは、以下の群から選択される：水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、水素化卵ホスファチジルコリン、ジラウリルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、またはそれらの組み合わせ。
別の好ましい例では、脂質担体の構造は、脂質分子二重層によって囲まれた球である。
別の好ましい例では、脂質担体は、注射によって作製される。
別の好ましい例では、脂質担体の作製方法には以下の工程が含まれる：
（ａ）リポソームの原材料と架橋剤をエタノールとともに混合して、脂質原材料のアルコール相溶液を得る工程、
（ｂ）３．５～６．０（好ましくは４．０～５．０）のｐＨを有する酸性水相溶液を提供する工程、
（ｃ）脂質原材料アルコール相溶液を酸性水相溶液に注入し、撹拌および押出し、透析を実施して脂質担体を得る工程。
別の好ましい例では、リポソーム原材料は、コレステロールおよびホスファチジルコリンを含み、当該ホスファチジルコリンは、上述のＨＳＰＣやＳＰＣであることが好ましい。
別の好ましい例では、架橋剤は、ＰＥＧ架橋剤であり、好ましくは１，０００～５，０００の範囲の分子量を有し、より好ましくはＤＳＰＥ－ＭＰＥＧ２０００である。
別の好ましい例では、リポソーム原材料と架橋剤の質量比は、１０～３０：１、好ましくは２０：１である。
別の好ましい例では、ホスファチジルコリンとコレステロールと架橋剤のモル比は、（３０～８０）：（５～４０）：（０．１～１０）である。
別の好ましい例では、工程（ｂ）において、酸性水溶液は、１，３－プロパンジスルホン酸水溶液～１，３－プロパンジスルホン酸トリエチルアミン水溶液から選択される。
別の好ましい例では、脂質原材料アルコール相溶液と酸性水溶液の体積比は、１：８～１２である。
別の好ましい例では、工程（ｃ）において、注入には、固定された流量で、シリンジを使用して、またはポンプ注入を使用して注入することを含む。
別の好ましい例では、工程（ｃ）において、押出には、固定された孔サイズのポリカーボネートフィルター膜を使用して押出することを含む。
別の好ましい例では、脂質担体は、その上にコンジュゲートされた標的化基を有する。
別の好ましい例では、標的化基としては限定されないが、ポリペプチド、タンパク質、および抗体断片が挙げられる。
別の好ましい例では、標的化基は、抗体断片であり、当該抗体は、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体である。
別の好ましい例では、標的化基は、以下の群から選択される：Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ミニボディ、またはそれらの組み合わせ。
本開示の第二の態様において、第一の態様の医薬組成物を作製する方法が提供され、当該方法は、（１）抗腫瘍薬剤溶液と脂質担体分散液を混合およびインキュベートして、医薬組成物を得る工程、または（２）脂質原材料アルコール相溶液または水相溶液に抗腫瘍薬剤を添加して、リポソーム作製中に一工程で医薬組成物を得る工程、が含まれる。
別の好ましい例では、工程（１）において、インキュベーションは、２０～６５℃、好ましくは５０～６０℃で実施される。
別の好ましい例では、工程（１）において、インキュベーション時間は１０分～１時間である。
別の好ましい例では、方法は、以下の工程をさらに含む：得られた薬剤搭載リポソームを改変標的化基と混合およびインキュベートして、標的医薬組成物を得ること。
別の好ましい例では、リポソーム原材料と架橋剤と標的化基のモル比は、（３０～１２０）：（０．１～１０）：（０．０１～０．１）である。
本開示の第三の態様では、ｂ１）腫瘍細胞の増殖を阻害する阻害剤、ｂ２）抗腫瘍薬剤、の作製を目的とした、第一の態様による医薬組成物の使用が提供される。
別の好ましい例では、医薬組成物の剤形は、非経口である。
別の好ましい例では、医薬組成物の剤形は、以下から選択される：錠剤、カプセル、顆粒、懸濁液、丸剤、溶液、シロップ、または注射液。
別の好ましい例では、医薬組成物の剤形は、注射液である。
別の好ましい例では、注射液は、以下から選択される：液体製剤、懸濁液製剤、および注射用凍結乾燥粉末。
別の好ましい例では、注射液の投与様式は、以下から選択される：静脈内注射、皮下注射、およびインサイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）注射。
別の好ましい例では、腫瘍は、以下の群から選択される：乳がん、胃がん、卵巣がん、肝臓がん、黒色腫、結腸直腸がん、またはそれらの組み合わせ。
本開示の第四の態様では、インビトロで腫瘍細胞の増殖を阻害する方法が提供され、当該方法は、以下の工程を含む：第一の態様による医薬組成物の医学的有効量を細胞に投与する工程。
別の好ましい例では、細胞は、ヒト腫瘍細胞である。
別の好ましい例では、細胞は、化学療法剤抵抗性のヒト腫瘍細胞である。
別の好ましい例では、細胞は、以下から選択される：Ｓｋ－Ｂｒ－３、ＢＴ－４７４、ＮＣＩ－Ｎ８７、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＭＣＦ－７、Ａ２７８０、ＭＧＣ－８０３、ＨＵＶＥＣ、およびＭＣＦ－７／Ａｄｒ。
本開示の第五の態様では、腫瘍を予防および／または治療する方法が提供され、当該方法は、以下の工程を含む：第一の態様による医薬組成物の医学的有効量を、その必要のある対象に投与する工程。
本開示の範囲内において、上述の様々な技術的特徴、および以下のセクション（例えば、実施例など）に具体的に記載される様々な技術的特徴は、互いに組み合わせられて、新規、または好ましい技術的解決策を形成し得ることを理解されたい。スペースの制限により、本明細書では詳細には列挙されない。
図１は、ドキソルビシン搭載リポソームの低温電子顕微鏡の画像である。（Ａ）０．１７の薬剤脂質比（高い薬剤脂質比）を有するドキソルビシン搭載リポソーム、（Ｂ）０．０４３の薬剤脂質比（低い薬剤脂質比）を有するドキソルビシン搭載リポソーム。 図２は、高い薬剤脂質比、低い薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソーム、ならびに低い薬剤脂質比を有する抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの、様々な細胞（Ａ）ＳＫ－Ｂｒ－３、（Ｂ）ＮＣＩ－Ｎ８７、（Ｃ）ＢＴ４７４、（Ｄ）ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、（Ｅ）ＭＣＦ－７、（Ｆ）Ａ２７８０、（Ｇ）ＭＧＣ－８０３、（Ｈ）ＨＵＶＥＣ、（Ｉ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１に対する薬理試験を示す。 図３は、高い薬剤脂質比、低い薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソーム、ならびに低い薬剤脂質比を有する抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの、ＭＣＦ－７／Ａｄｒアドリアマイシン耐性乳がん細胞に対する阻害効果を示す。 図４は、高い、中程度、および低い薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームの注射後の血漿濃度曲線を示す。 図５は、高い、中程度、および低い薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームの注射後の血中の薬剤脂質濃度比率における変化を示す。 図６は、ヌードマウスＢＴ４７４乳がん異種移植片モデルにおける、高い薬剤脂質比、低い薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソーム、ならびに低い薬剤脂質比を有する抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの、腫瘍増殖阻害に対する効果を示す。 図７は、投与後のヌードマウスＢＴ４７４乳がん異種移植片モデルにおける、高い薬剤脂質比、低い薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソーム、ならびに低い薬剤脂質比を有する抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの、体重変化に対する効果を示す。 図８は、ＨＥＲ２／ｎｅｕを発現するＮＣＩ－Ｎ８７胃がん異種移植片モデルに対する、低い薬剤脂質比（０．０４３）を有する抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの薬理効果を示す。 図９は、ＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍細胞に対する、様々な薬剤脂質比を有する抗体標的化イリノテカン搭載リポソームの薬力効果を示す。 図１０は、ｈＨＥＲ２－ＭＣ３８結腸直腸がんモデルに対する、低い薬剤脂質比を有するＲ８４８搭載リポソームのインビボ薬理効果を示す。
広範囲かつ詳細な研究を行い、本開示の発明者らは、抗腫瘍薬剤と脂質担体組成物の薬剤脂質比が０．０１～０．１５であったとき、脂質濃度単位での薬剤搭載効率は低下したが、当該薬剤濃度単位での抗腫瘍効果はインビボおよびインビトロで良好で強力な抗腫瘍効果を有することを見出した。この結果に基づき、本発明は完成した。
特に、本開示は、ドキソルビシン搭載リポソーム、イリノテカン搭載リポソーム、パクリタキセル搭載リポソーム、レシキモド搭載リポソーム、およびシスプラチン搭載リポソームが作製され、試験される実施例を提供する。本開示の実施例は、ドキソルビシン搭載リポソームの薬剤脂質比が０．０２～０．０８の範囲内（先行技術の薬剤脂質比は、０．１７）であったとき、薬剤搭載リポソームの有効性が大幅に改善されたことを示し、インビボ薬剤動態データは、低い薬剤脂質比を有するリポソームの循環半減期が延長され、安定性が改善されたことを示した。インビボ抗腫瘍効果も改善された。０．０７５および０．０１５の薬剤脂質比を有するイリノテカン搭載リポソームは療法とも、０．３の薬剤脂質比を有するリポソームよりも優れていた。特に、リポソームの表面が腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とするポリペプチド／タンパク質／抗体分子に連結される場合、低い薬剤脂質比を有する活性標的化リポソームは、ＴＡＡ発現が高い、中程度および低い腫瘍細胞に対して優れた効果を有し、化学療法剤抵抗性の腫瘍細胞に対しても優れた阻害効果を有している。
用語
本明細書で使用される場合、「本開示の医薬組成物」とは、抗腫瘍薬剤とリポソームを含む医薬組成物を指し、当該組成物は、０．０１～０．１５、好ましくは０．０２～０．１の範囲内の薬剤脂質比を有する。
医薬組成物および投与方法
本開示は、ａ１）抗腫瘍薬剤、ａ２）担体としてのリポソーム、を含む医薬組成物を提供し、当該抗腫瘍薬剤とリポソーム担体のモル比（薬剤脂質比）は、０．０１～０．１５である。
本開示の医薬組成物中の抗腫瘍薬剤は、以下の群から選択される：アントラサイクリン、白金系薬剤、フルオロウラシル、カンプトテシン、タキサン、免疫調節薬剤、またはそれらの組み合わせ。
本明細書に記載の医薬組成物中の脂質分子は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、コレステロール、ポリエチレングリコールグリセロール脂肪酸エステル、およびポリエチレングリコールグリセロールホスファチジルエタノールアミンから選択される、当業界で普遍的に使用されるリン脂質および関連する両親媒性分子である。
別の好ましい例では、リポソーム組成物は、脂質分子から自己組織化された二重層によって囲まれた球である。
別の好ましい例では、リポソームは、その上にコンジュゲートされた標的化基を有する。
別の好ましい例では、標的化基としては限定されないが、ポリペプチド、タンパク質、および抗体断片が挙げられる。
別の好ましい例では、標的化基は、以下の群から選択される：Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆａｂ断片、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、ミニボディ、またはそれらの組み合わせ。
本明細書で使用される場合、「有効量」または「有効用量」という用語は、ヒトおよび／または動物に対して機能または活性（すなわち、抗腫瘍活性）を発揮することができ、ヒトおよび／または動物に許容可能な量を指す。
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な」成分という用語は、過剰な有害な副作用（例えば、毒性、刺激、およびアレルギー反応）を伴わず、ヒトおよび／または哺乳動物での使用に適した物質、すなわち、合理的な利益／リスク比を有する物質である。「薬学的に許容可能な担体」という用語は、様々な賦形剤および希釈剤を含む、治療剤の投与のための担体を指す。
本開示の医薬組成物は、安全で有効な量の本開示の活性成分および薬学的に許容可能な担体を含有する。そのような担体としては（限定されないが）、生理食塩水、緩衝液、グルコース、水、およびそれらの組み合わせが挙げられる。一般的に、医薬製剤は、投与様式に合致しなくてはならない。本開示の医薬組成物の剤形は、以下から選択される：錠剤、カプセル、顆粒、懸濁液、丸剤、溶液、シロップ、または注射液。
別の好ましい例では、医薬組成物の剤形は、注射液である。
別の好ましい例では、注射液は、注射液、懸濁液、注射用凍結乾燥粉末から選択される。
別の好ましい例では、注射液の投与様式は、以下から選択される：静脈内注射、皮下注射、およびインサイツ（ｉｎ ｓｉｔｕ）注射。
作製は、生理食塩水、またはグルコースや他のアジュバントを含有する水溶液を用いた従来法によって行われる。医薬組成物は、滅菌条件下で製造されることが好ましい。
本開示の有効成分の有効量は、投与様式、および治療される疾患の重症度によって変化し得る。好ましい有効量の選択は、様々な因子に基づいて、当業者によって（例えば、臨床試験によって）決定され得る。そのような因子としては限定されないが、例えば生体利用効率、代謝、半減期などの有効成分の薬物動態パラメータ、治療される患者の疾患の重症度、患者の体重、患者の免疫状態、投与経路などが挙げられる。概して、本開示の有効成分が、一日当たり約０．００００１ｍｇ～５０ｍｇ／動物体重ｋｇ（好ましくは、０．０００１ｍｇ～１０ｍｇ／動物体重ｋｇ）の用量で投与されるとき、満足のいく効果が得られ得る。例えば、治療シナリオの緊急性に基づき、必要に応じて、いくつかの個別の投与量を毎日与えてもよく、または用量を比例的に減少させてもよい。
典型的には、本開示の医薬組成物が経口投与される場合、６０ｋｇ（ヒト）の体重を有する対象の平均一日用量は、概して、１０～５００ｍｇ、好ましくは２０～３００ｍｇ、より好ましくは５０～２５０ｍｇである。一日用量は、一回、二回またはそれ以上の投与で摂取されてもよい。
本開示の薬学的に許容可能な担体としては（限定されないが）、水、生理食塩水、ナノゲル、またはそれらの組み合わせが挙げられる。担体の選択は、投与様式と適合性がなければならず、これは当業者に公知である。
リポソームおよび薬剤脂質比
薬剤担体としてのリポソーム送達システム技術の適用は、１９６１年にＡｌｅｃ Ｂａｎｇｈａｍにより初めて提唱された。リポソームは脂質二重層を特徴とする小さく球状の小胞であり、リン脂質または両親媒性分子、例えば、ステロール（例えば、コレステロール）からなり、その中に水相を含む。薬剤はリポソームまたは脂質膜の中に搭載され、薬剤の薬剤動態および薬理を変化させる。
これらの薬剤搭載リポソームの規定の中で、重要なパラメータは、薬剤と脂質分子のモル比（薬剤脂質比）であり、先行技術におけるドキソルビシン搭載リポソームとしては、薬剤脂質比が０．１７であるＤｏｘｉｌ、Ｄｕｏｍｅｓｕ、およびＬｉｂａｏｓｕ、薬剤脂質比が０．２７であるＭｙｏｃｅｔ（登録商標）が挙げられる。さらに、イリノテカン搭載リポソームＯｎｉｖｙｄｅ（商標）の薬剤脂質比は０．６である。さらに、（Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ（２０１３）７１：５５５－５６４）に開示されるビンクリスチン搭載リポソームの薬剤脂質比は０．２であり、（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ３９１（２０１０）２４８－２５９）に開示されるＶｙｘｅｏｓ搭載リポソームの総薬剤脂質比は０．１２であり、シスプラチン搭載リポソームの薬剤脂質比は０．２である。
様々な薬剤脂質比を有するビンクリスチン搭載リポソーム製剤が、（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ １７５８（２００６）５５－６４）において評価され、卵スフィンゴミエリン／コレステロール搭載リポソームからのビンクリスチンのインビボ放出半減期Ｔ１／２は、薬剤脂質比が異なると変化することが見出された。半減期は、薬剤脂質比（Ｄ／Ｌ）が０．０２５（ｗｔ／ｗｔ）であったとき、６．１時間、薬剤脂質比（Ｄ／Ｌ）が０．１（ｗｔ／ｗｔ）であったとき、１５．６時間、および薬剤脂質比（Ｄ／Ｌ）が０．６（ｗｔ／ｗｔ）であったとき、１１７時間であった。これは、薬剤脂質比が増加すると、半減期が延長されることを示している。米国特許第５６１６３４１号（Ｈｉｇｈ ｄｒｕｇ：ｌｉｐｉｄ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｌｉｐｏｓｏｍａｌ ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）は、高い薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームおよびビンクリスチン搭載リポソームの作製および適用について開示している。
本開示の主要な利点としては以下が挙げられる：
（ａ）本開示に開示される、薬剤脂質比が低いリポソームの腫瘍細胞に対する抗腫瘍活性は、先行技術の高い薬剤脂質比を有するリポソームの抗腫瘍活性よりも大きい。
（ｂ）同じ用量で、薬剤脂質比が低いリポソームは、体内でより長い時間滞留し、よりゆっくりと薬剤を放出する。
（ｃ）薬剤脂質比が低いリポソームは、より良好なインビボ抗腫瘍効果を有する。
本開示は、具体的な実施例を用いて以下にさらに記述される。これらの実施例は、本開示の解説を目的としてのみ提供されており、本開示の範囲を限定することは意図されないことを理解されたい。以下の実施例において、特定の条件がない実験方法は、典型的には、従来の条件下で、または製造業者によって推奨されるように実施される。別段の記載がない限り、割合パーセントおよび重量分率は、重量パーセントおよび重量部である。
実施例１ ドキソルビシン（アドリアマイシン）を封入するリポソームの作製例
９００ｍｇのＨＳＰＣ、３００ｍｇのコレステロール、および６０ｍｇのＤＳＰＥ－ＭＰＥＧ２０００を計量し、２ｍＬの無水エタノールを添加し、水槽中で６０℃に加熱した。次いで磁気スターラーバーを加えて、完全に溶解するまで攪拌し、透明な液体混合液を得た。同時に、３．３０４ｇの硫酸アンモニウムをガラス瓶に入れ、１００ｍＬの超純水を加え、溶解するまで撹拌し、次いでｐＨを５．０に調整して、２５０ｍＭの濃度の硫酸アンモニウム溶液を得た。この溶液を、使用直前に調製した。溶解した脂質混合物を、シリンジを使用して１９ｍＬの硫酸アンモニウム水溶液に注入し、次いで撹拌し、混合物を六回押出して、ＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ６．８）中、１０ｋＤ透析膜を使用して透析を実施し、ＨＥＰＥＳ溶液の外部水相を有する空のリポソームを得た。
さらに、１０ｍｇ／ｍＬのアドリアマイシン溶液を、上記に設定された薬剤脂質比に従って、上記の空のリポソーム懸濁液に添加した。合計体積を１０ｍＬに調整し、次いで、６０℃で３０分間撹拌しながらインキュベートした。薬剤搭載が完了した後、１００ｋＤ透析膜を使用して遊離薬剤を除去し、アドリアマイシンとＨＳＰＣ、コレステロール、およびＤＳＰＥ－ＭＰＥＧ２０００の含有量を検出し、アドリアマイシン搭載リポソーム中の薬剤分子と総脂質分子のモル比を確認した。
Ｎａｎｏ－Ｓ９０ナノ粒径分析器を検出に使用した。様々な薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームの粒径は約８５ｎｍであり、多分散度指数（ＰＤＩ）は、０．１未満であった。その中で、０．１７の薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソーム製剤、および０．０４３の薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームの低温電子顕微鏡での形態を、図１Ａおよび図１Ｂに示す。リポソームは、ほぼ円形であり、均一なサイズおよび分布を有する。その中で、０．０４３の薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソーム中のドキソルビシン結晶は、０．１７の薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソーム中の血漿よりも微細であった。
実施例２ 様々な薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームにおける有効性試験
本実施例では、実施例１で調製された様々な薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームの腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を評価した。
まず、ＳＫ－Ｂｒ－３、ＮＣＩ－Ｎ８７、ＢＴ４７４、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＭＣＦ－７、ＭＧＣ－８０３、Ａ２７８０、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を含む表１に列挙される腫瘍細胞株、および正常細胞株のＨＵＶＥＣに対して有効性試験が実施された。
様々な薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームの腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｋｉｔを使用して評価した。Ｇｒａｐｈ Ｐｒｉｓｍ ８．０分析ソフトウェアを使用して、細胞毒性曲線を適合させ、それぞれのＩＣ５０値を計算した。結果については、図２および表２を参照のこと。
実験結果から、０．０２２、０．０４３、および０．０８５の薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームは、高い薬剤脂質比（０．１７）を有するドキソルビシン搭載リポソームよりも、細胞毒性が大きいことが示された。
さらに、様々な薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームの、様々な細胞株に対する細胞毒性効果をより完全に検証するために、本発明者らは、様々な薬剤脂質比を有するより多くの実験群を設定し、様々な細胞株に対するそれらのＩＣ５０値を試験した。
試験結果は、表３に示される通りである。結果から、リポソームの薬剤脂質比が低いほど、細胞毒性効果は良好であり、特に０．１未満の薬剤脂質比を有するリポソームが優れていたことが示された。
実施例３ ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの作製、および細胞における性能。３．１ ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの作製
ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームを作製した。脂質組成は、ＨＳＰＣ、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、１，２－ジステアロイル－ｒａｃ－グリセロ－３－ＰＥ－Ｎ－ポリエチレングリコール－２０００（ＤＳＰＥ－ＭＰＥＧ２０００）、およびＨＥＲ／ｎｅｕ抗体断片コンジュゲート脂質分子であった。各構成要素のモル比の範囲は、（３０～８０）：（５～４０）：（０．１～１０）：（０．０１～０．１）であった。ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体断片コンジュゲート脂質は、１，２－ジステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホエタノールアミン－Ｎ－［マレイミド（ポリエチレングリコール）－２０００］－ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体断片（ＨＥＲ２－ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００）であった。ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体断片を、遊離スルフヒドリル基を介して、マレイミド基を含有する脂質分子ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００－ｍａｌと反応させ、チオエーテル結合を形成させた。次いで、ＨＥＲ２－ＤＳＰＥ－ＰＥＧ２０００を、実施例１で作製された０．０４３の薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームと共にインキュベートして、特定のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化薬剤搭載リポソームを得た。
３．２ 腫瘍細胞におけるＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの性能
本実施例では、ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現レベルが様々な腫瘍細胞に対する、実施例３．１で作製されたＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの細胞毒性効果を評価した。
腫瘍細胞株：腫瘍細胞株には、ＳＫ－Ｂｒ－３、ＮＣＩ－Ｎ８７、ＢＴ４７４、ＭＤＡ－ＭＢ－４５３、ＭＣＦ－７、ＭＧＣ－８０３、Ａ２７８０、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１が含まれ、正常細胞株は、ＨＵＶＥＣであり、表４に具体的な細胞ＨＥＲ２／ｎｅｕ発現レベルを示す。
ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの腫瘍細胞に対する細胞毒性効果を、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｋｉｔを使用して評価した。トラスツズマブモノクローナル抗体（トラスツズマブ）を対照として設定した。同時に、０．０４３および０．１７の薬剤脂質比を有する非標的化ドキソルビシン搭載リポソームを比較した。Ｇｒａｐｈ Ｐｒｉｓｍ ８．０分析ソフトウェアを使用して、細胞毒性曲線を適合させ、それぞれのＩＣ５０値を計算した。結果については図５を参照のこと。
結果から、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの薬剤脂質比が低いほど、腫瘍細胞、および標的となるＨＥＲ２／ｎｅｕが陽性の腫瘍に対して、細胞毒性効果が良好であったことが示された。ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現腫瘍細胞における、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの細胞毒性活性は、薬剤脂質比が０．０４３のドキソルビシン搭載リポソームの活性よりも３～１０倍高く、薬剤脂質比が０．１７のドキソルビシン搭載リポソームの活性よりも１０倍超高かった。
３．３ アドリアマイシン耐性腫瘍細胞株における、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの性能
具体的な実施手順については、３．２を参照のこと。アドリアマイシン耐性腫瘍細胞株における、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの性能を調査するために、ＭＣＦ－７／Ａｄｒ アドリアマイシン耐性乳がん株を試験に使用した。細胞毒性の結果から、ＭＣＦ－７／Ａｄｒにおける、０．０４３および０．１７の薬剤脂質比を有するＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソーム、ドキソルビシン搭載リポソーム、ならびにトラスツズマブモノクローナル抗体（トラスツズマブ）のＩＣ５０値は、それぞれ１３．７０μｇ／ｍＬ、４６．４１μｇ／ｍＬ、および１０１．３０μｇ／ｍＬであることが示された（図３に示す）。このことから、ＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームはさらにアドリアマイシン耐性細胞株に対して強力な細胞毒性効果を有していたことが示された。したがって、アドリアマイシン耐性腫瘍の患者の治療における臨床的有効性の可能性を有している。
実施例４ 様々な薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームの薬剤動態性能
様々な薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームのインビボでの薬剤動態プロファイルを、腫瘍担持マウスモデルにおいて試験した。微量の重水素化コレステロール分子マーカーをリポソームに添加して、外部脂質濃度の変化を検出した。
Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスにおける、ＢＴ４７４乳がん異種移植片モデルの構築：体重が約１８ｇで４～５週齢のメス、ＢＭＳグレードのＢａｌｂ／Ｃ－ヌードマウスを購入し、約一週間、動物飼育室において飼育に慣れさせた。ＢＴ４７４細胞を指数関数的増殖期まで増殖させ、細胞をトリプシンで消化した。細胞を遠心分離して回収し、ＰＢＳ緩衝液で二～三回洗浄した。細胞をＰＢＳ緩衝液中に再懸濁し、計数して、細胞密度を１×１０＾８細胞／ｍＬに調整した。マトリゲルを－２０℃の冷凍庫から事前に取り出し、氷上で解凍し、１：１の等体積でマトリゲルと細胞懸濁液を混合した。対応する体積の細胞懸濁液を、５×１０６～１×１０７個の細胞体積に基づいて１ｍＬのシリンジにピペットで移し、細胞懸濁液をヌードマウスの右腋窩に皮下接種した。接種後、注射部位を３０秒間圧縮して、細胞溶液の還流を回避した。接種後、顕著な皮下丘疹が観察された。接種マウスを定期的に観察し、腫瘍増殖をモニタリングした。
投薬：第一の群に、マウスの体重に基づき、０．１７の薬剤脂質比（高い薬剤脂質比）を有するドキソルビシン搭載リポソームを尾静脈内注射によって投与した。薬剤の用量は、５ｍｇ／ｋｇであった。第二の群に、マウスの体重に基づき、０．０８５の薬剤脂質比（中程度の薬剤脂質比）を有するドキソルビシン搭載リポソームを尾静脈注射を介して投与した。薬剤の用量は、５ｍｇ／ｋｇであった。第三の群に、マウスの体重に基づき、０．０４３の薬剤脂質比（低い薬剤脂質比）を有するドキソルビシン搭載リポソームを尾静脈注射によって投与した。薬剤の用量は、５ｍｇ／ｋｇであった。
採血：投与から０．５、１、２、４、６、８、１２、２４、４８、および７２時間で、様々な薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームを投与された四つの異なる群から採血を行った。ＥＤＴＡ抗血液凝固管において採血を行い、氷上において、４℃、３，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。血漿の上層を注意深く、新しくラベルを貼った遠心管にピペットで移し、続いて試験を行うか、または－８０℃の冷凍庫で保管した。
血漿サンプルの前処理：４０μＬの血漿サンプルを遠心分離管に正確に測定した。１６０μＬのアセトニトリル－メタノール（１：１、ｖ／ｖ）を、血漿と有機試薬が１：４の比率に従って添加し、１～２分間ボルテックスして、血漿中のタンパク質を完全に沈殿させ、４℃、１，０００×ｇの回転速度で１０分間遠心分離した。上清を注意深く新しい遠心分離管にピペットで移しながら、この工程でタンパク質層をピペットで吸わないように注意を払った。４℃、１，０００ｘｇの回転速度で１０分間遠心分離した。０．２２μｍの有機フィルターヘッドを使用して溶液を濾過し、５０ｕＬをサンプルバイアルに入れ、ローディングして試験した。
試験：高速液体クロマトグラフィーの条件（中国薬局方を参照）：Ａｔｈｅｎａ Ｃ１８カラム（１２０Å、４．６×１５０ｍｍ、５μｍ）を使用し、多孔質シリカに化学的に結合されたオクタデシルシランを充填剤として使用した。ドデシル硫酸ナトリウム溶液（１．４４ｇのドデシル硫酸ナトリウムおよび０．６８ｍＬのリン酸を取り込み、５００ｍＬの水を加えて溶解させた）－アセトニトリル－メタノール（５００：５００：６０）を移動相として使用した。検出波長は２５４ｎｍであり、検出流量は１．０ｍＬ／分であり、ローディング体積は１０μＬであった。
分析：ラットにおける、様々な薬剤脂質比を有するリポソームの血漿濃度の結果を図４に示す。血液サンプル中の薬剤濃度と重水素化コレステロール濃度の比率における変化を図５に示す。血液中の薬剤濃度と重水素化コレステロール濃度の比率における変化を使用して、リポソームからの薬剤放出プロセスを示した。様々な薬剤脂質比を有するリポソームは、異なるインビボ放出プロセスを有することが観察された。薬剤脂質比が低いリポソームは、放出も遅かった。これは、良好な徐放性を提供するものである。
実施例５ 様々な薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームのインビボ薬理試験
５．１．異種移植片モデルの構築
Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスにおける、ＢＴ４７４乳がん異種移植片モデルの構築：体重が約１８ｇで４～５週齢のメス、ＢＭＳグレードのＢａｌｂ／Ｃ－ヌードマウスを購入し、約一週間、動物飼育室において飼育に慣れさせた。ＢＴ４７４細胞を指数関数的増殖期まで増殖させ、細胞をトリプシンで消化した。細胞を遠心分離して回収し、ＰＢＳ緩衝液で二～三回洗浄した。細胞をＰＢＳ緩衝液中に再懸濁し、計数して、細胞密度を１×１０＾８細胞／ｍＬに調整した。マトリゲルを－２０℃の冷凍庫から事前に取り出し、氷上で解凍し、１：１の等体積でマトリゲルと細胞懸濁液を混合した。対応する体積の細胞懸濁液を、５×１０６～１×１０７個の細胞体積に基づいて１ｍＬのシリンジにピペットで移し、細胞懸濁液をヌードマウスの右腋窩に皮下接種した。接種後、注射部位を３０秒間圧縮して、細胞溶液の還流を回避した。接種後、顕著な皮下丘疹が観察された。接種マウスを定期的に観察し、腫瘍増殖をモニタリングした。
５．２ 用量および有効性の評価：
腫瘍サイズが１００～２００ｍｍ３に達したとき、マウスを三群に無作為に分け、各群には少なくとも六匹のマウスとした。三つの群は、対照群、０．１７の薬剤脂質比のドキソルビシン搭載リポソーム群、０．０４３の薬剤脂質比のドキソルビシン搭載リポソーム、および０．０４３の薬剤脂質比のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシンリポソーム群であった。
グループ分けの後、対照群には尾部静脈内注射により空のリポソームを与えた。０．１７の薬剤脂質比のドキソルビシン搭載リポソーム群には、ヌードマウスの体重に基づき、２ｍｇ／ｋｇの用量で、尾静脈注射によって０．１７の薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームを投与した。０．０４３の薬剤脂質比のドキソルビシン搭載リポソーム群には、ヌードマウスの体重に基づき、２ｍｇ／ｋｇの用量で、尾静脈注射によって０．０４３の薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームを投与した。０．０４３の薬剤脂質比のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソーム群にも、ヌードマウスの体重に基づき、２ｍｇ／ｋｇの用量で、尾静脈注射によって０．０４３の薬剤脂質比を有するＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームを投与した。薬剤は週に一回投与され、合計で五回投与された。マウスの体重および腫瘍増殖の曲線を一日おきに記録し、マウスを投与終了後に安楽死させた。
マウスにおける、乳がんＢＴ４７４異種移植片モデルに対する被験物質の阻害効果を主に試験した。
腫瘍担持マウスの腫瘍体積および体重の測定：一日おきにノギスを使用して測定し、腫瘍体積は、式Ｖ＝０．５ａ×ｂ２を使用して計算した。式中、ａおよびｂは、それぞれ腫瘍の長径および幅を表す。
腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）＝［１－（Ｄｉ－Ｄ０）／（Ｃｉ－Ｃ０）］×１００、式中、Ｄｉ－Ｄ０＞０である。Ｄ０は、投与群（薬剤）における最初の投与時の平均腫瘍体積である。Ｄｉは、投与群における投薬開始後の特定の測定時での平均腫瘍体積である。Ｃ０は、対照群（対照）の最初の投与時の平均腫瘍体積である。Ｃｉは、対照群における投薬開始後の特定の測定時での平均腫瘍体積である。
Ｂａｌｂ／ＣヌードマウスにおけるＢＴ４７４乳がん異種移植片モデルに対する、インビボ薬理試験の結果を、図６および図７に示す。図６に示されるように、投与後１８日目の薬剤脂質比が０．１７のドキソルビシン搭載リポソーム、薬剤脂質比が０．０４３のドキソルビシン搭載リポソーム、および薬剤脂質比が０．０４３のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームの腫瘍増殖阻害率（ＴＧＩ％）は、それぞれ５０．５５％、６０．１２％、および６９．６６％であった。この結果から、薬剤脂質比が０．０４３のドキソルビシン搭載リポソームは、強い腫瘍増殖阻害効果を有し、薬剤脂質比が０．０４３のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームは、さらに優れた腫瘍増殖阻害効果を有していた。図７に示されるように、Ｂａｌｂ／Ｃ－ヌードマウスは投与後に体重減少を経たが、有意な毒性を示さず（体重減少＜１０％）を示さず、マウスの体重は、投与終了時に正常に戻った。
実施例６：薬剤脂質比が低いＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームのインビボ動物薬理試験
６．１．Ｂａｌｂ／Ｃヌードマウスにおける、ＮＣＩ－Ｎ８７乳がん異種移植片モデルの構築
細胞表面上にＨＥＲ２を過剰発現しているＮＣＩ－Ｎ８７胃がん細胞株を使用して、Ｂａｌｂ／Ｃ－ヌードマウスにおいて異種移植片腫瘍モデルを構築した。
体重が約１８ｇで４～５週齢のメス、ＢＭＳグレードのＢａｌｂ／Ｃ－ヌードマウスを購入し、約一週間、動物飼育室において飼育に慣れさせた。ＮＣＩ－Ｎ８７細胞を指数関数的増殖期まで増殖させ、細胞をトリプシンで消化した。細胞を遠心分離して回収し、ＰＢＳ緩衝液で二～三回洗浄した。細胞をＰＢＳ緩衝液中に再懸濁し、計数して、細胞密度を２×１０＾８細胞／ｍＬに調整した。マトリゲルを－２０℃の冷凍庫から事前に取り出し、氷上で解凍し、１：１の等体積でマトリゲルと細胞懸濁液を混合した。対応する体積の細胞懸濁液を、１＊１０＾７個の細胞体積に基づいて１ｍＬのシリンジにピペットで移し、細胞懸濁液をヌードマウスの右腋窩に皮下接種した。接種後、注射部位を３０秒間圧縮して、細胞溶液の還流を回避した。接種後、顕著な皮下丘疹が観察された。接種マウスを定期的に観察し、腫瘍増殖をモニタリングした。
６．２．用量および有効性の評価
腫瘍サイズが１００～２００ｍｍ３に達したとき、マウスを三群に無作為に分け、各群には少なくとも六匹のマウスとした。三つの群は、対照群、０．１７の薬剤脂質比のドキソルビシン搭載リポソーム群、および０．０４３の薬剤脂質比のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシンリポソーム群であった。
グループ分けの後、対照群には尾部静脈内注射により空のリポソームを与えた。０．１７の薬剤脂質比のドキソルビシン搭載リポソーム群には、ヌードマウスの体重に基づき、２ｍｇ／ｋｇの用量で、尾静脈注射によって０．１７の薬剤脂質比を有するドキソルビシン搭載リポソームを投与した。０．０４３の薬剤脂質比のＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソーム群にも、ヌードマウスの体重に基づき、０．５、２、５または１０ｍｇ／ｋｇ（ｍｐｋ）の用量で、尾静脈注射によって０．０４３の薬剤脂質比を有するＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームを投与した。同時に、トラスツズマブモノクローナル抗体を対照として設定し、５ｍｇ／ｋｇを週に一回（ｑｗ）、合計で五回投与した。マウスの体重および腫瘍増殖の曲線を一日おきに記録し、マウスを投与終了後に安楽死させた。
マウスにおけるＮＣＩ－Ｎ８７胃がん異種移植片モデルに対する被験物質の阻害効果、および完全治癒能力を主に試験した。
（１）腫瘍体積測定：一日おきにノギスを使用して測定し、腫瘍体積は、式Ｖ＝０．５ａ×ｂ２を使用して計算した。式中、ａおよびｂは、それぞれ腫瘍の長径および幅を表す。
（２）腫瘍増殖阻害率ＴＧＩ（％）＝［１－（Ｄｉ－Ｄ０）／（Ｃｉ－Ｃ０）］×１００、式中、Ｄｉ－Ｄ０＞０である。Ｄ０は、投与群（薬剤）における最初の投与時の平均腫瘍体積である。Ｄｉは、投与群における投薬開始後の特定の測定時での平均腫瘍体積である。Ｃ０は、対照群（対照）の最初の投与時の平均腫瘍体積である。Ｃｉは、対照群における投薬開始後の特定の測定時での平均腫瘍体積である。
（３）すべての腫瘍担持マウスの体重を一日おきに測定した。同時に、投与後のマウスにおける体重の変化率も計算された：ＲＣＢＷ（％）＝（ＢＷｉ－ＢＷ０）／ＢＷ０×１００。ＢＷｉは、投与開始後の特定の測定時での平均体重であり、ＢＷ０は、最初の投与時の平均体重である。
Ｂａｌｂ／ＣヌードマウスにおけるＮＣＩ－Ｎ８７胃がん異種移植片モデルに対する、インビボ薬理試験の結果を、図８に示す。腫瘍増殖曲線（図８）は、薬剤脂質比が低い（０．０４３）抗体標的化ドキソルビシン搭載リポソームは、ＨＥＲ２／ｎｅｕ過剰発現ＮＣＩ－Ｎ８７胃がん異種移植片モデルに対して優れたインビボ腫瘍増殖阻害効果を有し、用量依存性があった。
実施例７ 様々な薬剤脂質比を有するイリノテカン搭載リポソームの作製
ＨＳＰＣ、コレステロール、およびＤＳＰＥ－ＭＰＥＧ２０００を正確に計量し、ガラス製の平底フラスコに加え、適切な量の無水エタノールを添加し、水槽中で加熱して脂質を完全に溶解させた。３０ｍＬの５００ｍＭ １，３－プロパンジスルホン酸トリエチルアミンを水和媒体として添加し、６５℃で４５分間攪拌して水和反応させた。１００ｎｍおよび８０ｎｍのポリカーボネートフィルター膜を通した連続的な押出によって、均一で小さな単層小胞を形成した。
１０ｍＭ、ｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝液を透析媒体として使用して、リポソームの内部および外部の水相にプロパンジスルホン酸トリエチルアミン勾配を形成した。１０ｍｇ／ｍＬの濃度のイリノテカン溶液を調製し、０．０１、０．０２、０．０４、０．０７５、０．１５、および０．３の薬剤脂質比に従って薬剤を搭載させ、６０℃の水槽中で４５分間加熱およびインキュベートした。次いで１０ｍＭ、ｐＨ７．０のＨＥＰＥＳ緩衝液を透析媒体として使用して、外部水相中の遊離薬剤を除去し、０．０１、０．０２、０．０４、０．０７５、０．１５、および０．３の様々な特定の薬剤脂質比を有するイリノテカン搭載リポソームを得た。
０．０７５、０．１５、および０．３の薬剤脂質比を有するイリノテカン搭載リポソームの物理的パラメータを表６に示す。粒径は類似しており、ＰＤＩ分布は全て０．１未満であり、封入率は全て９５％を超えた。
様々な薬剤脂質比を有するイリノテカン搭載リポソームの細胞毒性を、実施例２による方法を使用して様々な細胞モデルで試験し、得られた結果を表７に示す。結果から、０．１５の薬剤脂質比を有するイリノテカン搭載リポソームが、最良の細胞毒性であったことが示された。
実施例８：様々な薬剤脂質比を有する抗体標的化イリノテカン搭載リポソームの細胞毒性試験
本実施例は、中国科学アカデミーの細胞バンクから購入したＮＣＩ－Ｎ８７腫瘍細胞株を使用した。様々な薬剤脂質比を有する抗体標的化イリノテカン搭載リポソームを調製し、ＮＣＩ－Ｎ８７に対する細胞毒性効果について評価した。試験方法は、実施例２の方法と同じである。すなわち、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ法を使用した。結果は、図９に示されるように、薬剤脂質比が０．１５である抗体標的化イリノテカン搭載リポソームが、ＮＣＩ－Ｎ８７細胞に対して優れた細胞毒性を有していた。
実施例９ 薬剤脂質比が低いＲ８４８搭載リポソームの作製およびインビボ動物薬理試験
９．１ 薬剤脂質比が低いＲ８４８搭載リポソームの作製
２８５．７ｍｇのＨＳＰＣ、９５ｍｇのコレステロール、および１９ｍｇのＤＳＰＥ－ＭＰＥＧ２０００を計量し、１ｍＬの無水エタノールを添加し、水槽中で６０℃に加熱した。次いで磁気スターラーバーを加えて、完全に溶解するまで攪拌し、透明な液体混合液を得た。同時に、６．６０７ｇの硫酸アンモニウムをガラス瓶に入れ、１００ｍＬの超純水を加え、溶解するまで撹拌し、次いでｐＨを５．０に調整して、５００ｍＭの濃度の硫酸アンモニウム溶液を得た。この溶液を、使用直前に調製した。溶解した脂質混合物を、シリンジを使用して９ｍＬの硫酸アンモニウム水溶液に注入し、次いで６０℃で４５分間攪拌して水和させ、１００ｎｍおよび８０ｎｍのポリカーボネートフィルター膜を使用して六回押出を行い、次いでＨＥＰＥＳ緩衝液（１０ｍＭ、０．９％ ＮａＣｌ、ｐＨ５．５）中、１０ｋＤの透析膜を使用して透析を行い、空のリポソームを得た。
さらに、６．２５ｍＬの１ｍｇ／ｍＬ Ｒ８４８溶液を取り、脂質濃度が４０ｍｇ／ｍＬの空のリポソーム、３．７５ｍＬに添加して、総体積１０ｍＬを得た。室温で３０分間撹拌し、薬剤を搭載させた後、１００ｋＤの透析バッグを使用して遊離薬剤を除去し、０．０９の薬剤脂質比を有するＲ８４８搭載リポソーム（Ｒ８４８－Ｌｉｐｏ）を作製した。粒径は７４．８９ｎｍであり、ＰＤＩは、０．０２６未満であった。
９．２ Ｂ－ｈＣＤ３Ｅマウスを使用したＢ－ｈＨＥＲ２ ＭＣ３８結腸がんモデルの確立、および薬剤のインビボ薬理試験
ＰＢＳ中に再懸濁されたＢ－ｈＨＥＲ２ ＭＣ３８細胞を、１×１０６／０．１ｍＬ／マウスで、Ｂ－ｈＣＤ３Ｅマウスの背部の右側に皮下接種した。平均腫瘍体積が約８０～１５０ｍｍ３に達したとき、腫瘍体積およびマウス重量に従って適切なマウスを選択して登録し、対照群と実験群の二つの実験群に無作為に割り当て、各群は六匹のマウスとした。グループ分けの後、対照群に、尾静脈内注射によってＰＢＳを投与し、実験群は、尾静脈内注射によって、マウスの体重に基づき、２ｍｇ／ｋｇの用量で、薬剤脂質比が０．０９のＲ８４８搭載リポソームを投与した。投与は三日に一回、合計で七回行われた。
グループ分けの後、腫瘍体積を、週二回、ノギスを使用して測定し、腫瘍の長径および短径を測定した。体積の計算式は、腫瘍体積＝０．５×長径×短径２であった。
Ｂ－ｈＣＤ３Ｅマウスにおける、Ｂ－ｈＨＥＲ２ ＭＣ３８結腸がんモデルのインビボ薬力試験の結果を図１０に示す。腫瘍増殖曲線は、Ｒ８４８リポソームがインビボでＢ－ｈＨＥＲ２ ＭＣ３８結腸がんの増殖に対し有意な阻害効果を有することを示した。
実施例１０ 様々な薬剤脂質比を有するシスプラチン搭載リポソームの作製および試験
ＨＳＰＣ、コレステロール、およびＤＳＰＥ－ＭＰＥＧ２０００を正確に計量し、ガラス製の平底フラスコに加え、適切な量の無水エタノールを添加し、水槽中で加熱して脂質を完全に溶解させた。溶液を、５０℃、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、および５ｍｇ／ｍＬのシスプラチン溶液に、３０ｍＬ／分の流量で注入し、混合溶液を１００ｎｍおよび８０ｎｍのポリカーボネートフィルター膜を使用して押出し、封入されていない薬剤は透析によって除去して、粒径が約８０ｎｍ、薬剤脂質比が０．０１、０．０５、および０．０８のシスプラチン搭載リポソームを得た。
本開示で言及されるすべての文献は、文献の各部分が参照として個別に引用されているものと同じように、本出願において参照として引用される。また、本開示の内容に関する上記の記述を読んだ後、当業者であれば、本開示に様々な変更または修正を行うことができ、そのような均等も同様に本出願に添付される特許請求の範囲によって定義される範囲と同じ範囲内にあることを理解された。

Claims (18)

  1. ａ１）抗腫瘍薬剤、ａ２）担体としてのリポソーム、を含み、前記抗腫瘍薬剤と脂質担体のモル比（薬剤脂質比）が、０．０１～０．１５であることを特徴とする、医薬組成物。
  2. 前記薬剤脂質比の範囲が、０．０２～０．１、好ましくは０．０２２～０．０８５であることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 前記抗腫瘍薬剤が、アントラサイクリン、白金系薬剤、フルオロウラシル、カンプトテシン、タキサン、またはそれらの組み合わせの群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 前記抗腫瘍薬剤が、免疫調節薬剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  5. 前記抗腫瘍薬剤が、ドキソルビシン、イリノテカン、シスプラチン、パクリタキセル、レシキモド、またはそれらの組み合わせの群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  6. 前記医薬組成物が、
    （１）前記医薬組成物中の前記薬剤が、９０％を超える封入率を有する、
    （２）前記医薬組成物が、６０～１８０ｎｍ、好ましくは８０～１２０ｎｍの粒径を有する、
    （３）前記医薬組成物が、０．０１～０．２、より好ましくは０．０１～０．１５のＰＤＩを有する、の群から選択される特徴を一つ以上有する、請求項１に記載の医薬組成物。
  7. 前記脂質担体が、ホスファチジルコリン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、コレステロール、ポリエチレングリコールグリセロール脂肪酸エステル、およびポリエチレングリコールグリセロールホスファチジルエタノールアミンからなる成分の群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  8. 前記脂質担体が、ホスファチジルコリンおよびコレステロールを含み、前記ホスファチジルコリンは、水素化大豆ホスファチジルコリン（ＨＳＰＣ）、大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）、水素化卵ホスファチジルコリン、ジラウリルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、１－ミリストイル－２－パルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１－パルミトイル－２－ステアロイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１－パルミトイル－２－オレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、１－ステアロイル－２－リノレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、またはそれらの組み合わせの群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  9. 前記脂質担体の作製方法が、
    （ａ）前記リポソームの原材料と架橋剤をエタノールとともに混合して、脂質原材料のアルコール相溶液を得る工程、
    （ｂ）３．５～６．０のｐＨを有する酸性水相溶液を提供する工程、
    （ｃ）脂質原材料アルコール相溶液を酸性水相溶液に注入し、撹拌および押出し、担体としての前記リポソームを得る工程、を含むことを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  10. 前記脂質担体が、その上にコンジュゲートされた標的化基を有することを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
  11. 前記標的化基が、ポリペプチド、タンパク質、抗体断片、好ましくはＨＥＲ２／ｎｅｕ抗体断片の群から選択されることを特徴とする、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 請求項１に記載の医薬組成物を作製する方法であって、
    （１）抗腫瘍薬剤溶液と脂質担体分散液を混合およびインキュベートして、前記医薬組成物を得る工程、または
    （２）抗腫瘍薬剤を、前記脂質原材料アルコール相溶液または水相溶液に添加して、脂質担体の作製中に一工程で前記医薬組成物を得る工程、を含むことを特徴とする、方法。
  13. 前記方法が、得られた薬剤搭載リポソームを改変標的化基と混合およびインキュベートして、標的医薬組成物を得る工程、をさらに含むことを特徴とする、請求項１１に記載の作製方法。
  14. ｂ１）腫瘍細胞の増殖を阻害する阻害剤、ｂ２）抗腫瘍薬剤を作製すること、を目的とすることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物の使用。
  15. 前記医薬組成物の剤形が非経口であることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
  16. 前記腫瘍が、乳がん、胃がん、卵巣がん、肝臓がん、黒色腫、結腸直腸がん、またはそれらの組み合わせの群から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載の使用。
  17. インビトロでの腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、請求項１に記載の医薬組成物の医学的有効量を前記細胞に投与する工程を含むことを特徴とする、方法。
  18. 腫瘍を予防および／または治療する方法であって、請求項１に記載の医薬組成物の医学的有効量を、その必要のある対象に投与する工程を含むことを特徴とする、方法。
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